HEMOGLOBINAS ELETROFORESES E OUTRAS METODOLOGIAS

PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DE GOIS CBB-BIOMEDICINA Prof.Luiz Murilo Martins de Arajo

PERFIL DAS HEMOGLOBINAS MAIS COMUNS

Hb A - 2 2

% ADULTO 96 - 98

% FETO TRAOS TRAOS 99

Hb A2 - 2 2 AT 3.5-4.0 Hb F - 2 2 TRAOS

HEMOGLOBINAS ANORMAIS MAIS FREQENTES

Hb S - 2 2(6: GLU VAL)
Hb C - 2 2(6: GLU LIS)

Hb DLos Angeles-Punjab - 2 2(121: GLU GLN)

Hb MBOSTON - 2(58:HIS TIR) 2 (Metahemoglobina)

Hb H - 4

Hb BARTS - 4

HEMOGLOBINAS ANORMAIS MAIS FREQENTES

Hb Lepore - Pareamento no homologo entre os genes e (Hbrido -, sendo a parte inicial, amino terminal semelhante a gama e a terminal, carboxila, semelhante a beta) Hemoglobinas Instveis: Hb Torino - 2(43:PHE VAL) 2 Hb Koln - 2 2(98:VAL MET)

OUTRAS HEMOGLOBINAS ANORMAIS

Hb E - 2 2(26: GLU LYS) Hb J Baltimore - 2 2(16: GLY ASP) Hb N Baltimore - 2 2(95: LYS GLU) Hb O Arbica - 2 2(121: GLU LYS) Hb Porto Alegre- 2 2(9: SER CIS) Hb K Woolwich - 2 2(132: LYS GLN)

OUTRAS HEMOGLOBINAS INSTVEIS

Hb Rio Claro - 2 2(34: VAL MET) Hb Zurich - 2 2(63: HIS ARG) Hb Santa Ana - 2 2(88: LEU PRO) Hb Niteroi - 2 2(42-44:PHE/GLU/SER 0) HB Koln - 2 2(98: VAL MET) Hb Camperdown - 2 2(104: ARG MET)

OUTRAS HEMOGLOBINAS VARIANTES

Hb G Philadelphia Hb I Hb J Oxford Hb J Rovigo Hb Constant Spring - 2 68: ASN LIS 2 - 2 16: LYS GLU 2 - 2 15: GLY ASP 2 - 2 53: ALA ASP 2 - 2 142: STOP GLN 2

OUTRAS HEMOGLOBINAS INSTVEIS

Hb Hasharon Hb Stanleyville II Hb G Pest Hb Kurosaki Hb Westmead Hb Campinas 2 47: ASP HIS 2 2 78: ASN LIS 2 2 74: ASP ASN 2 2 7 : LYS GLU 2 2 122: HIS GLN 2 2 26: ALA VAL 2

Prevalncia de hemoglobinopatias em 238 amostras coletadas para estudo eletrofortico de hemoglobinas no

Laboratrio lmina-Rj, no ano de 2000.
61 FITAS(25,6%) APRESENTARAM HEMOGLOBINAS ANMALAS:

Talassemia Alf a : 6/61 Talassemia Beta : 23/61 Hemoglobinopatia AS: 22/61 Hemoglobinopatia AC: 3/61 Hemoglobinopatia AD: 1/61 Hemoglobinopatia SS: 1/61 Persistncia Hereditria de Hemoglobina Fetal: 5/61

10% 38 % 36% 5% 1.5% 1.5%

8%

DOS TALASSMICOS: Talassemia Minor : 19/23 Talassemia Intermedia : 4/ 23

82% 18%

Ricardo P. Ducatti

LEPAH-CBB-UCG

ELETROFORESE EM PH ALCALINO

ELETROFORESE
definido como sendo a migrao de espcies carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas so dissolvidas ou suspensas em um eletrlito, atravs do qual uma corrente eltrica aplicada. Esta tcnica de separao foi desenvolvida pelo qumico Arne Tiselius para o estudo de protenas em soro e por este trabalho ele ganhou o prmio Nobel em 1948.

SEQUNCIA BSICA DA ELETROFORESE DE HEMOGLOBINAS EM pH alcalino

(-)
O R L E Bu

(+)

A2 G S K F A B H J I A R C D T s E D
Los Angeles-Punjab
Lepore

ELETROFORESE DE Hb BARTS E Hb H

A F

S/D
A2/C/E

PERFS ELETROFORTICOS
- A : NORMAL - S : Trao Falciforme (Banda A e S) - S : Anemia Falciforme (Banda S) - C : Falciforme/ Hb C (Banda S e C) - Tal : Micro-Drepanocitose (Banda S e aumento de A2 e F) S - Tal : Banda S e Hb H A - C : Hetereozigoto para Hemoglobina C C - C : Homozigoto para Hemoglobina C A A S S S

SC

AA

A F S D
A2 C E

Trao talassmico

Hb A2 = 5,5%

A2 D
Hb F = 9%

Persistncia hereditria de Hb fetal

A2 D

B A R T S

Doena da Hemoglobina H e BARTS

A2

D
LEPORE

Hemoglobina Lepore (10 %)

ALTERAES NA ESTRUTURA QUMICA DA MOLCULA POR TROCA DE AMINOCIDOS

Hb A- pI 6.8

HbS - pI 6.85 HbG - pI 6.90

HbC - pI 6.95
Hb S: Glu (-) Val (o): pI 6.85

Hb G: Asn (o) Lis (+): pI 6.90 Hb C: Glu (-) Lis (+): pI 6.95
P.C.NAOUM, 2001

ELETROFORESE EM pH ALCALINO, COM HEMOLISADO COM SAPONINA

ELETROFORESE EM PH ACIDO

ELETROFORESE GAR-CIDO

ELETROFORESE GARCIDO

ELETROFORESE COM ISOFOCALIZAO

ELETROFORESE CAPILAR

ELETROFORESE MICROCAPILAR

ELETROFORESE CAPILAR
Tcnica que foi introduzida em 1981, por Jorgenson e Lukacs e tem sido aceita cada vez mais, como um importante mtodo analtico. Em sua forma mais simples uma aproximao da tcnica original, descrita por Tiselius, porm emprega-se um tubo capilar, preenchido com um eletrlito, conforme o prprio nome sugere.

 Pode ser usada na determinao de hidrocarbonetos aromticos, vitaminas hidro e lipossolveis, aminocidos, ons inorgnicos, cidos orgnicos, frmacos, catecolaminas, substncias quirais, protenas, peptdeos, etc.

Sonia Claudia do Nascimento de Queiroz Isabel Cristina Sales Fontes Jardim (Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Qumica), http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/elecap_4/elecap_4.htm

 Uma caracterstica a sua capacidade nica para separar macromolculas carregadas eletricamente de interesse tanto em indstrias de biotecnologia quanto em pesquisas biolgicas. No projeto Genoma Humano foi necessrio distinguir os diversos polinucleotdeos, com massas molares, por volta de 200 a 500 Daltons (Dalton = u.m.a.) que diferiam entre si por um nico nucleotdeo.

 Somente a EC tem resoluo suficiente para este tipo de separao. Alm disso, o DNA humano contm cerca de 3 bilhes de nucleotdeos e as altas velocidades de anlises, obtidas pela EC, permitiram que milhares de nucleotdeos fossem seqenciados em um nico dia

 O funcionamento do equipamento envolve a aplicao de alta voltagem, tipicamente 5 a 30 kV em um capilar de dimetro reduzido gerando correntes na faixa de 10 a 100 mA. O uso do capilar apresenta vrias vantagens, particularmente com respeito ao aquecimento Joule.

 A alta resistncia eltrica do capilar permite a aplicao de campos eltricos altos pois gera um aquecimento mnimo. Alm disso o formato de capilar propicia uma dissipao eficiente do calor gerado. O uso de campos eltricos altos resulta em tempo de anlise curto, alta eficincia e resoluo.

 O capilar preenchido com uma soluo tampo e suas extremidades so mergulhadas em recipientes, que contm a soluo tampo, e onde aplicado um campo eltrico, que gera uma corrente no interior do capilar. Os eletrodos so feitos de um material inerte, tal como, platina, e so tambm mergulhados na soluo para fechar o circuito.

 O capilar passa atravs de um detector, usualmente um detector espectrofotomtrico de absoro no UV/Vis

VANTAGENS
Rapidez Versatilidade Baixo custo por anlise Alto poder se separao (resoluo) Consumo mnimo de amostras, reagentes e solventes. Possibilidade de automao e deteco on-line.

DESVANTAGENS
No adequada para a determinao de compostos volteis, no-polares e de massa molar baixa, os quais so melhores determinados por cromatografia gasosa. Tambm no muito adequada para a anlise de polmeros no inicos de massa molar alta No to sensvel quanto a cromatografia lquida de alta performace

HPLC
Metodologia automatizada que a partir da cromatografia por troca inica permite separar e definir a porcentagem de diferentes hemoglobinas de uma forma precisa e rpida.

GEL CENTRIFUGAO PARA Hb S ID FALCIFORME, DIAMED

 TESTE DE FALCIZAO

SOLUBILIDADE DA HEMOGLOBINA

EM TUBO E PAPEL

6.2
8.2

AMPLIFICAO GNICA PELA PCR

Bio-Rad