Identificacin de la clase reptilita utilizando COI-5P como marcador molecular

Identificacin Biolgica usando marcadores moleculares

Camino Jos, Serralta Laura, Serrano Mnica, Mezquita Guadalupe.

Identificacin de la clase reptilita utilizando COI-5P como marcador molecular

Desde el descubrimiento por parte de Watson y Crick de la cadena de ADN, la ciencia que se encarga del estudio de los genes en los organismos vivos ha evolucionado en gran manera. Esta evolucin ha permitido el avance de nuevas tecnologas en las identificaciones genmicas de organismos. ADN, Genes, Genomas, Gentica, etc son trminos que se han vuelto bastante comunes en nuestro tiempo, se pueden leer en los peridicos, escuchar en las noticias, son trminos que se han vuelto cotidianos gracias a los avance de la ciencia. Pero muy pocas personas saben lo que significan esos trminos. Pero porque estudiar los genes? conocer de dnde viene un organismo, y su evolucin, es algo que la ciencia quiere conseguir la identificacin de la historia de un organismo. Todo esto gracias a que hay secuencias de genes que se han mantenido y estn presentes en varias especies. Ramas de las ciencias biolgicas como la gentica y la biologa molecular han ayudado a contestar esta pregunta es decir la importancia del estudio de la genmica de un organismo. Gracias a la conservacin de genes que codifican para una protena especifica o una secuencia nica de algn organismo de inters cientfico. Para lograr la identificacin de estas secuencias del genoma nicas existen distintas tcnicas que varan en precios facilidad y exactitud (IPGRI y Cornell University, 2003). En un principio se usaban los bacterifagos T4 y T3 para la amplificacin de una secuencia de ADN especifica insertada en el genoma de la bacteria Escherichia coli, hasta en la actualidad el uso de tcnicas como el PCR (inventada en 1983 por Kary Mulls) que ha ayudado a tener resultados en menos tiempo en la obtencin y ampliacin de secuencias de genes, en esta ampliacin es necesario solo ampliar la cadena de inters ya que es la que se sabe que es un marcador molecular por lo que en el proceso de la PCR se le agregan enzimas que cortan la secuencia deseada a ampliar. Al terminar el proceso de ampliacin se realiza una electroforesis para pesar los genes y as poder identificar los genes dominantes o codominantes de un espcimen y poder decir si pertenece o no a la poblacin o especie que se trata de identificar. Las diferentes tcnicas que varan en el uso de Enzimas y secuencias a ampliar son muy diversas las ms usadas son: Isoenzimas/aloenzimas, RAPDs, Microsatelites, ISSRs RFLPs, AFLPs, la secuenciacin de ADN, los Micro arreglos entre otros (Alcntara, 2007). Gracias a que plantas, animales, hongos, protistas, bacterias, etc tienen genomas que se mantienen a largo de sus generaciones. Se han logrado obtener marcadores que identifiquen poblaciones una de otra, estos marcadores denominados marcadores moleculares son secuencias del genoma que permanecen intactas en cada poblacin y que los hacen nicos (Cabrerizo y Prez, 2008). Los marcadores pueden ser de 2 tipos: Morfolgicos: fueron los primeros marcadores que el hombre uso, que se basa de los rasgos morfolgicos de una especie para ordenarla as en grupos de caractersticas comunes.

Moleculares: corresponden a cualquier gen que tenga una expresin cuantificable u observable que en la mayora de los casos se puede identificar fcilmente de los cuales se pueden encontrar de 2 tipos 1. Bioqumicos: se basan en la expresin de un gen atraves de una Isoenzimas la gran desventaja que presenta esta tcnica es la falta de exactitud en conocer las mutaciones de un gen (ya que no todas las mutaciones cambian la expresin de un gen y no puede identificar secuencias de ADN no codificante). 2. De ADN: solucionaron el problema de las Isoenzimas siendo este mtodo ms exacto y rpido (Ramos y Torres, 2005) Estos marcadores han permitido la creacin de bancos de genes donde con una secuencia de algn organismo se pueda comparar e identificar la especie, sus familias ms cercanas y su antepasado algo as como un cdigo de barras usado en las compaas actuales en la identificacin de algn producto (Stoeckle, 2004). La utilidad que presenta el manejar secuencias genmicas en forma de cdigos de barras es muy amplia. Estas pueden ser como: El trabajar secuencias cortas de ADN es decir de una pequea muestra de ADN se puede saber la especie y la identificacin rpida de especies comerciales o en peligro de extincin en las aduanas. Se tiene una gua rpida de que marcador usar para cada poblacin de la que se quiera saber su historia evolutiva, evitando as la laboriosa tarea de identificar un locus en especial para la poblacin de inters. Se puede identificar una especie sin importar el estado de vida biolgico en el que se encuentre, es decir desde una larva se puede saber que especie es, esto proporciona un beneficio en la identificacin de especies. Al utilizar cdigos de barras se puede distinguir entre especies morfolgicamente muy parecidas lo que permite una clara identificacin y colocacin taxonmica. Puede permitir la rpida identificacin de una nueva especie al no encontrarse su cdigo de barras (esto se espera al tener todas las especies registradas en el barcode). Se abre el uso de nuevas tecnologas que como por ejemplo con un solo pelo se pueda conocer que especie es de una manera rpida y concisa teniendo as una gua por igual de las especies en nuestro planeta. Los cdigos de barras pueden permitir (y han permitido en varios organismos de difcil clasificacin) una mayor exactitud en la creacin de rboles evolutivos al medir como los nucletidos van cambiando de posicin entre generaciones. Se puede generar un museo de los genomas de los organismos que se tienen en la actualidad, al igual que la generacin de enciclopedias de la vida que permitan la rpida identificacin a futuro para estudiantes, profesores, cientficos etc (Stoeckle, 2004).

Como ejemplo del uso de los marcadores podemos la importancia en la identificacin y clasificacin de los reptiles, puesto que estos representan los antepasados de los mamferos y las aves y por ende del humano. Por lo cual resulta importante la secuenciacin de los reptiles; y la creacin de cdigos de barra para esta clase. Los reptiles tienen una importancia ecolgica y evolutiva muy grande en nuestro planeta, son creaturas maravillosas que representan los primeros en dejar la dependencia a ambientes completamente o parcialmente acuticos para volverse terrestres. Por ende la ciencia se ha interesado en la secuenciacin de esta clase. En esta clase existen alrededor de 8238 especies en el mundo (aunque se cree pueda haber an mas) lo cual representa ms del 9% de la cantidad de especies en el mundo y por su valor de diversidad representan un reto para el barcode. Sin embargo comparando con otros taxones como aves o mamferos los reptiles representan muchas dificultades en la secuenciacin de sus genomas y en la creacin del cdigo de barras para cada especie (Nagy et al, 2011). Factores como la extincin de la mayora de esta taxa como su antigedad y su gran divergencia evolutiva dificultan la generacin de un cdigo de barra para esta taxa. (Nagy et al, 2011) Sin embargo ya se han tenido el resultado para 1243 especies. Segn el barcode el marcador molecular con mejor resultado utilizado para los reptiles es el COI-5P marcador presente en el genoma mitocondrial en el reino animal (exceptuando el philo Cnidaria presente en este reino) (Hebert et al. 2012). Debido a los beneficios que este marcador presenta en la comparacin de especies de difcil clasificacin (por igual que se le ha denominado el marcador estndar por su amplia gama de identificacin aproximadamente de 727750 especies que este marcador puede ayudar a diferenciar. Este marcador tiene diferentes grados de afinidad segn el gnero; para Elmer et al. En el 2011 uso el COI como marcador para el gnero Chelonia spp. Obtuvo un grado de afinidad del 99.84% mientras que en el 2002 Carranza obtuvo datos de afinidad del COI a nivel de especies de reptiles grado de exactitud de variabilidad gentica del 14.2% solo arriba del marcador Ctib (con 14%). En ese mismo estudio Carranza demostr que la manera de obtener mejores resultados para resolver la filogenia de algunas especies de reptiles es la combinacin de los marcadores usados para esta taxa. Citb + COI (98.7%), Citb + 12S rRNA (97%) y Citb+ COI + 12S rRNA (99.4%) (Combinaciones usadas por Carranza en el 2002 para la identificacin de Gallotia) El secuencio un total de 2.381 pb procedentes de dos genes mitocondriales codificantes (786 pb del citocromo b (Citb) y 501 pb de la citocromo oxidasa I (COI)), dos genes mitocondriales no codificantes (392 pb del 12S rRNA y 349 pb del 16S rRNA) y un gen nuclear (353 pb del c-mos). Por lo cual no se puede decir que el COI sea un marcador universal para todas las especies de reptiles lo cual ha sido otro de los factores de limitacin en la generacin de cdigos de barras de los reptilianos. Sin embargo para Stoeckle et al en el 2005 el COI es uno de los marcadores estndar para los animales debido a que el conjunto entre identificar esa regin especifica de la mitocondria ms las diferencias encontradas en los genes

ribosmicos ayuda a distinguir de una manera ms efectiva las diferencias entre especies estrechamente relacionadas y representa una mejor comparacin ya que generalmente en los genes ribosomales se encuentra un gran nmero de inserciones o delecciones. Para Wang y Pollock en el 2007 este marcador presenta una gran ventaja al ser una secuencia que presenta una coevolucion con los integrantes del reino animal lo que permite la diferenciacin entre estos, lo que ha ayudado a la formacin de rboles evolutivos ms exactos. Con todo esto se podra decir que aunque (no con exactitud pero acercndose en gran manera) que el COI es un marcador bastante til en la identificacin de los reptilianos segn el gnero. Como ejemplo de la identificacin de especies por medio del COI en reptiles podemos basarnos en el cdigo de barra de la especie Iguana iguana especie que se encuentra en peligro de extincin. La secuencia que es amplificada por el PCR para la identificacin por COI es la siguiente:
ACCCGTTGATTCTTCTCAACCAACCACAAAGATATCGGCACCCTTTACTTAGTCTTCGGTGCCT GAGCCGGCATGGTCGGAACTGCCCTCAGCCTGCTAATTCGAGCAGAACTTAGCCAACCAGGG GCCCTTCTCGGCGAC---GACCAAATTTACAACGTTATTGTAACCGCCCATGCTTTTGTTATAATTTTCTTCATAGTAATGCC CGTCATAATCGGAGGATTCGGAAACTGATTAGTCCCTCTAATGATCGGCGCACCAGACATGGC CTTCCCCCGAATAAACAACATAAGCTTCTGACTCCTACCCCCGTCCTTTCTGCTCCTCTTAGCC TCCTCTGGCATTGAGGCCGGAGCCGGTACAGGCTGAACTGTTTACCCCCCACTAGCGGGCAA CCTAGCACATGCAGGCGCCTCAGTAGACCTTACAATTTTCTCCCTCCACCTGGCCGGAATCTC ATCCATCCTAGGAGCAATCAACTTTATCACAACATCTATCAACATAAAACCCCCCACAATAACC CAGTATCAAACACCCTTGTTTGTCTGATCCGTACTAATTACGGCCGTACTACTTCTGCTATCTCT ACCCGTCCTAGCAGCAGGTATTACAATACTACTCACCGACCGCAACTTAAACACCTCATTCTTT GACCCCGCAGGAGGGGGGGACCCAATTCTTTACCAACACTTATTTTGATTTTTTGGCCACCCT GAAGTCTACATTCTCATCCTCCCCGGATTCGGAATAATCTCCCACATCGTTACCTACTACGCCG GTAAAAAAGAGCCCTTCGGGTACATGGGCATGGTCTGAGCTATAATATCAATCGGCTTCCTAG GATTCATCGTATGGGCCCACCATATGTTCACAGTCGGAATAGACGTAGACACACGAG.

Secuencia de aminocido identificada por el marcador.

TRWFFSTNHKDIGTLYLVFGAWAGMVGTALSLLIRAELSQPGALLGDDQIYNVIVTAHAFVMIFFMVMPVMIGG FGNWLVPLMIGAPDMAFPRMNNMSFWLLPPSFLLLLASSGIEAGAGTGWTVYPPLAGNLAHAGAS VDLTIFSLHL AGISSILGAINFITTSINMKPPTMTQYQTPLFVWSVLITAVLLLLSLPVLAAGITMLLTDRNLNTSFFDP AGGGD PILYQHLFWFFGHPEVYILILPGFGMISHIVTYYAGKKEPFGYMGMVWAMMSIGFLGFIVWAHHMFT VGMDVDTR X

Figura 1. Cdigo de barras generado por el marcador COI-5P para la especie Iguana iguana.

Pero porque utilizar el COI como marcador universal en los reptiles aun sabiendo que no es 100% exacto? Para Tolley et al en el 2006 indica que en la mayora de los vertebrados el gen que codifica para el COI sufre de mutaciones silenciosas lo cual no cambia la expresin del Gen y se ve conservado en las diferentes especies de vertebrados por igual los reptiles. Al igual como el barcoding seala este es un primer universal en la ampliacin y secuenciacin del cdigo de barras para los reptilianos. Al igual que para la mayora de las especies este genoma esta tan conservado en casi toda la clase en el reino animal puesto que es parte esencial de la respiracin celular realizado por la mitocondria. Otro de los factores importantes de usar el COI-5P es su corta longitud en pares de bases lo cual se puede procesar rpidamente con la tecnologa actual y a un bajo costo (Stoeckle 2005). Por esta razn este marcador se le ha nombrado como el marcador estndar (con un registro de identificacin de especies de 727750 seguido por el ITS con tan solo 3655)1 sin embargo con la secuenciacin de diferentes organismos se ha hecho evidente que an no existe un marcador universal para todas las especies de todos los reinos (Stoeckle, et al. 2004 y 2005). En comparacin con otros marcadores usados en reptiles por si solo el COI representa un grado de afinidad en su deriva gentica muy amplia en la identificacin de especies. Pero como seala Carranza en el 2002 se podra recomendar la combinacin de dos o ms marcadores para lograr una identificacin y ubicacin en la poblacin ms precisa. Por qu no se usan los ITS en los reptiles? Los espaciadores internos transcritos (ITS por sus siglas en ingls) representan un tndem en los genes ribosomales funcionales y los no funcionales 18s, 5.8s y 28s, presentes miles de copias en el gen eucariota y en la mayora de las especies representan un marcador molecular efectivo en la identificacin de especies (Laca, 2010). Sin embargo para Rodrguez en el 2010 la identificacin de especie por ITS presenta cierta dificultad, debido a que las secuencias que detectan los ITS se tratan de segmentos no codificantes que se encuentran relacionado con segmentos con funciones especficas, y est sujeto a variaciones especificas (por especie), los cambios de este segmento entre especies no podra ser tan relevante como se cree debido a que se tiene la tendencia de conservar las secuencias de estos, esto ocasiona que no exista una variacin entre escalas de tiempo cortas y en identificacin de una taxa menor a la poblacional. Rodrguez concluye en que no es un marcador sensible en la identificacin de especies tan cercanas. Por igual lvarez en el 2005 seala que investigaciones recientes han demostrado que se pueden encontrar diferentes variaciones de los ITS, y puede resultar en filogenias errneas.

Por lo cual los ITS a pesar de tener una buena crtica podran no ser tan efectivos como se cree y menos an en la identificacin de reptiles debido a que los reptiles comparten lneas evolutivas que son muy cercanas entre s. Es por eso que el barcode ha optado por el uso del COI como marcador universal al menos en la mayora de las especies del reino animal. El uso de marcadores moleculares ha facilitado la identificacin de especies muy parecidas entre s, aclarado dudas en la filogenia, y la fcil identificacin de especies. Aun se seguir en la bsqueda de un marcador molecular universal para todas las especies, pero mientras tanto se est obteniendo conocimiento que hace unos aos como bilogos no imaginamos tener. La identificacin de una especie con solo sacar una parte de la secuencia genmica de nuestro espcimen ha facilitado mucho las investigaciones de las poblaciones as como del estudio de la evolucin de las mismas, encontrar el porqu de tanta variacin es una meta que poco a poco estamos alcanzando. Y las nuevas tecnologas en el uso de marcadores son pioneras de esto. Sin duda el COI-5P es un marcador muy til en la identificacin de especies de animales. Aunque se seguir en la investigacin de marcadores ms efectivos que brinden cada vez un mayor grado de exactitud en la identificacin de los organismos entre especies y de diferentes reinos, con el fin de facilitar las futuras investigaciones y el uso de los cdigos de barras en la proteccin de animales en riesgo, y en su mayora en las clasificacin de la filogenia an ms exactos, que ayude a diferenciar entre especies muy parecidas o muy cercanas entre s.