CULTIVO IN VITRO CASERO

OBJETIVOS Utilizar mtodos bsicos de cultivo in vitro y sus caractersticas. FUNDAMENTO TERICO El cultivo in vitro el desarrollo y crecimiento de plantas o partes de plantas en condiciones especiales, dentro de recipiente de vidrio. En estas condiciones se le debe sumisnistra a la planta todo lo que necesita para su desarrollo: agua, nutriente, luz y agua. El agua y los nutrientes se aportan con el medio y la luz la reciben a travs de las paredes de vidrio. Es vital importancia que el medio, los frascos, los aparatos y las semillas se mantengan desinfectadas desde el principio del proceso de germinacin. Cualquier bacteria u hongo que se introduzca en los frascos crecer ms rpido que las semillas y pronto ocupar su espacio hasta matarlas. MATERIAL
Reactivos FRASCOS DE CRISTAL (4 por grupo). Olla a presin. Guantes. Mascarilla de papel. Esptula. Bistur. Mechero de alcohol. Soporte y rejilla. Varilla de vidrio. Pinzas metlicas. Trapo. Papel de aluminio (o papel film). Gasa estril. Cinta adhesiva(o film de parafina) y etiquetas. Leja. cido clorhdrico. Hidrxido sdico. Lavajillas. MEDIO DE CULTIVO: FRMULA DEL PLTANO (para 1 litro) 100g de pltano maduro hecho pur o licuado 10 g de agar-agar. 15 g de azcar. 900 ml de agua destilada. 1,2 g Tiamina * Cpsula semillas orqudea u otra semilla.

Material de Laboratorio

Material biolgico

*4 comprimidos de algn remedio compuesto de Tiamina (vitamina B1) de 300 mg. Puede ser substituido por complejos polivitamnicos (Teragram M o Supradyn). MTODO

a) Preparacin de los frascos. Se lavan bien los frascos y tapas con jabn y leja. Se le quitan todos los restos de etiquetas. b) Preparacin y esterilizacin del medio de cultivo.
1.

Poner en una olla los 180 ml de agua destilada, 20g de pltano maduro hecho pur o licuado, 1 g de azcar y 0.24 g Tiamina. Una vez disuelto se aaden 2 g de agar agar y se hierve el medio. (lo ideal es hacerlo en el microondas o en un hornillo con agitacin continua para que el agar no se estropee). Si se hace en una olla, usar una cuchara de madera o de plstico hasta disolver todos los componentes.

2.

Mide el pH y ajstalo (usa HCL para disminuirlo y NaOH para incrementarlo). Debe de quedar entre 5.5 y 6. Distribuye el medio de cultivo en los tubos de ensayo y frascos, para ello utiliza un embudo de vidrio. Ten especial cuidado en que el medio de cultivo no entre en contacto con la apertura de los frascos, ya que esto puede ayudar a la contaminacin por hongos y bacterias.

3.

4.

Vierte en cada frasco en el fondo una cantidad de preparado de ms o menos 1 centmetro (45 a 50 ml). Por cada litro de preparado podemos llenar ms o menos 20 frascos.

c)

Esterilizacin del medio de cultivo

Los frascos se esterilizan en una olla a presin, la cual se puede considerar como un pequeo autoclave. Nos sirve para esterilizar medios o material sometindolos a temperatura y presin elevadas. Los pasos para la esterilizacin son los siguientes: Se pone un pedazo de tela en el fondo de la olla (un trapo cualquiera) para impedir as que los frascos toquen el fondo de la olla y se revienten con el calor. Se aaden dos o tres centmetros de agua. Colocamos los frascos (con el medio) tapados, pero sin cerrar del todo, la tapadera debe quedar suelta o de lo contrario los botes acumularn presin y estallarn. Cerrar y calentar en un fogn a fuego fuerte hasta que la pesa comience a moverse y liberar vapor o el medidor marque 15 PSI. Dejar a 15 PSI unos 20 o 30 minutos a fuego suave. Apagar una vez trascurrido el tiempo y esperar a que la olla baje y est totalmente enfriada. No se debe abrir la olla antes porque la diferencia de presin o temperatura har que entre aire no estril a los frascos, creando un peligro de contaminacin.

Se dejan enfriar hasta que el medio gelifique (se solidifique) por accin del agar. Con guantes desinfectados con alcohol, se terminan de cerrar los botes para evitar la entrada de aire no estril. Los frascos se pueden guardar por varios das y meses en la nevera o congelados.

d) Preparacin de las semillas. Si las cpsulas de orqudeas estn abiertas quiere decir que lleg a su totalidad de madurez. Las semillas se esterilizan de la siguiente forma: -Prepara dos recipientes con agua (a la mitad de su capacidad) y uno vaco y se cubren con tapas dobles de aluminio. Los botes se esterilizan en el autoclave o una olla a presin. Dejar enfriar todo el material. La esterilizacin se puede hacer en el microondas (5-10 min) pero en este caso los frascos se tapan con papel film. Dejar enfriar antes de usarlo para la esterilizacin de las semillas. -Las semillas se envuelven en una gasa y se sumergen en una solucin 50% leja con unas gotas de lavavajillas. El tiempo que deben estar en leja es variable, puede ser de 10 a 30 min segn el tipo de semilla. Como termino medio se tienen 15 min y despus comprobar (si nos pasamos no germinan y si las tenemos poco tiempo se contaminan). - Pasa las semillas por los dos botes de agua estril, 5 minutos mnimo en cada bote, para eliminar la leja de su superficie. Este paso debe hacerse en condiciones de esterilidad ambiental, trabajando cerca de la llama del mechero para evitar la cada de esporas en las semillas o en el medio y lo contamine. Las pinzas metlicas deben ser flameadas antes de su uso. Si las cpsulas estn cerradas, se esterilizan la cpsula entera en leja, se esterilizan el bistur y la esptula en el mechero de alcohol y se corta la cpsula con el bistur cerca de la llama, antes de introducirlas en los frascos. e) Cultivo del material vegetal en condiciones aspticas. - Limpia la superficie de trabajo con leja. S tienes el pelo largo recgelo y, si es posible, ponte una mascarilla para que este todo prefecto. Hay que trabajar con mucho cuidado y muchsima limpieza. Los frascos muy fcilmente se contaminan con hongos. - En todo momento trabajaremos cerca del mechero. Las semillas se pasan del recipiente con agua a los botes con el medio con una pinza que previamente hemos flameado con etanol para esterilizarla.

Abre cuidadosamente un poco el bote, sin destapar el bote del todo, y coloca las semillas sobre el medio de cultivo. Este paso debe hacerse cerca de la llama del mechero. Cierra rpidamente la tapa para que no entre ningn microrganismo. -Una vez se han puesto de 4 o 5 semillas por bote. Se cierran los frascos hermticamente cerca del mechero y se sellan con cinta adhesiva o film de parafina. Etiqueta los botes con la fecha y tipo de semilla cultivado, tambin puedes anotar los nombres de los componentes del grupo. -Estos botes se mantienen en oscuridad hasta que se observe la germinacin de la semilla, que puede tardar de uno a diez das. - En ese momento, se colocan los frascos en un sitio con bastante luz, pero sin sol directo a temperatura constante (de unos 22-24 C) evitando una exposicin directa al sol, sin embargo son necesarias de 16 a 18 horas de luz al da, as pues, ser preciso prever una iluminacin de apoyo como un fosforescente. Se debe esperar aproximadamente entre 5 y 6 semanas (dependiendo de la especie) hasta que se vea la primera alfombra verde sobre el medio de cultivo. Si germinan demasiadas plantas en una botella o frasco hay que trasplantar las plantitas a otros frascos. Tambin hay que decir que muchas no sobreviven. El trasplante debe hacerse con las mismas medidas de higiene que el procedimiento anterior y dividindolas en varios frascos con las mismas condiciones. Hay que tener mucha paciencia y calma y no tocar mucho los botes de cultivo. Despus de un ao o ao y medio se pueden retirar las plantitas de los frascos y sembrarlas en macetas. Como sustrato se recomienda usar musgo serrano, con arena de ro y fina. Es conveniente esterilizar este nuevo medio con agua hirviendo y dejar enfriar. El momento de sacar las plantitas de los frascos es el ms peligroso ya que fcilmente pueden contaminarse con hongos del ambiente. Conviene baar las plantitas con un funguicida antes de sembrarlas. La espera y la paciencia te dar una gran satisfaccin de conseguir germinar la semilla de la orqudea, despus para ver su flor tardars varios aos en verla. Una catleya tarda entre 6 y 8 aos en dar flor desde que se sembraron sus semillas. Una Phalaenopsis 4 aos pero es un sueo llegar a tener tantas orqudeas y saber que el tiempo que le has dedicado ha valido la pena.