Ingeniera y Tecnologa arbitrado

Artculo

Mtodo para la extraccin de ADN cloroplastdico de Bouteloua gracilis como herramienta para aplicaciones moleculares
Method of chloroplast DNA extraction from Bouteloua gracilis as a tool for molecular applications
DAVID I. HERNNDEZ-QUEZADA1, SIGIFREDO ARVALO-GALLEGOS1, DAVID A. BETANCOURTGUERRA1, ARMANDO AGUADO-SANTACRUZ2, TANIA SIQUEIROS-CENDN1, BLANCA RIVERA-CHAVIRA1, GUADALUPE VIRGINIA NEVREZ-MOORILLON1 Y QUINTN RASCN-CRUZ1,3
Recibido: Mayo 10, 2011 Aceptado: Octubre 24, 2011

Resumen

Abstract

La manipulacin gentica del genoma de cloroplasto esta a la vanguardia en investigacinGenetic manipulation of the chloroplast biotecnolgica. El pasto B. gracilis es un modelo para el estudio de estrs hdrico y oxidativo,genome is at the forefront of biotechnology capacidades relacionadas al cloroplasto. Es necesario tener un mtodo que facilite laresearch. B. gracilis is a model for the study of obtencin de ADN de buena calidad, particularmente cuando se refiere al ADN de cloroplastowater stress and oxidative capacities related de B. gracilis. La implementacin de un mtodo para la extraccin de cpADN se logrto the chloroplast. It is requires a method to probando diferentes estrategias de extraccin de cpADN reportados en la literatura yfacilitate the obtaining of good quality DNA, combinando las etapas ms apropiadas para B. gracilis. La incorporacin de un paso adicionalparticularly when it comes to chloroplast DNA del lavado con CTAB permiti la recuperacin de cpDNA enriquecido, el cual se puede utilizarof B. gracilis. The implementation of a method en el desarrollo de hermanitas moleculares. Debido la implementacin de un protocolo defor extracting cpDNA was achieved by extraccin tambin fue posible obtener una cantidad considerable de cpADN de B. gracilis. Elassaying different strategies cpDNA extraction cpADN fue digerido con varias enzimas de restriccin y los fragmentos resultantes fueronreported in the literature and combining the analizados por Southern blot con las sondas de los genes de rADN 16S y 23S. Con base en most appropriate stage for B. gracilis for los perfiles de restriccin, en este trabajo se reporta un mapa parcial de restriccin del genomacpDNA extraction. The incorporation of an del cloroplasto de B. gracilis y se plantea que la metodologa aqu establecida en un futuroadditional step of washing with CTAB after lysis of chloroplasts, allowed the recovery of permitir abordar la manipulacin gentica del genoma de cloroplasto. enriched cpDNA which can be used in the Palabras clave: Anlisis molecular, clonacin de genes, mapa gentico, transferencia development of molecular tools. Due to the implementation of an extraction protocol was horizontal de genes. also possible to obtain a considerable amount of B. gracilis cpDNA. The cpDNA was digested with several restriction enzymes and the resulting fragments were analyzed by Southern blot with probes of genes 16S and 23S rDNA. The method developed allowed us to obtain a considerable amount of cpDNA of B. gracilis which can be cut with restriction enzymes and used for genetic mapping.

These results allow us in future work for the genetic manipulation of the chloroplast genome. Keywords: Molecular analysis, gene cloning, gene mapping, horizontal gene transfer .

Introduccin

cloroplastos; estos organelos pueden convertir la luz en energa qumica utilizable por el organismo (Blaustein et al., 1998). Los cloroplastos son organelos intracelulares que contienen la maquinaria necesaria para los procesos involucrados en la fotosntesis. Estos participan en la biosntesis de aminocidos, nucletidos, lpidos y carbohidratos (Sugiura, 1992).
_________________________________ 1 Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad Autnoma de Chihuahua. Campus Universitario II. Apdo. Postal 1542-C. Chihuahua, Chih., Mxico. 31125. Tel. (614) 236-6000. 2 Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias. Carretera Celaya-San Miguel de Allende S/N CP.30110. Celaya, Gto. Mxico. 3 Direccin electrnica del autor de correspondencia: qrascon@uach.mx.

as clulas de las plantas verdes y algunos protistas contienen organelos llamados

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Al igual que las mitocondrias, el estroma de un cloroplasto La lnea de investigacin alberga pequeas molculas de ADN circular de doble cadena yest enfocada al estudio del ribosomas similares a las procariotas. El estudio de esta molculacpADN de B. gracilis (navajita promete ser una alternativa para el desarrollo biotecnolgico deazul), el cual es un pasto gramneas de importancia en campos como la ganadera y laforrajero presente en amplias agricultura, adems de ser una herramienta til en el estudio deregiones del continente las caractersticas fisiolgicas relacionadas con el cloroplasto. En(Garca-Snchez y Monroy1963 se comprob que los cloroplastos contenan su propio ADNAta, 2005) y posee (Sager e Ishida, 1963); el ADN del cloroplasto (cpADN) es unimportantes caractersticas remanente de genomas de un simbionte bacteriano ancestral.relacionadas a la resistencia al Dependiendo del organismo, el cloroplasto contiene de 60 a 200estrs hdrico. El inters del genes que participan en la expresin gnica (Leister, 2003). Elgrupo de investigacin es tamao de la molcula de ADN cloroplastdico puede variar,desarrollar metodologas dependiendo de la especie, entre 120 y 170 Kb (Palmer, 1987).moleculares para el anlisis En los aos 80 surgi la idea de realizar ingeniera gentica de la organizacin de los dentro del cloroplasto (Daniell et al., 2002), desde entonces, el genes cloroplastdicos debido estudio del cpADN de diferentes especies se ha perfilado como a dos caractersticas uno de los objetivos de la manipulacin gentica (Bogorad, 2000). importantes de este organelo Ya se ha logrado insertar genes heterlogos en el genoma de y su ADN: uno, participa cloroplasto; se han expresado antgenos para la elaboracin de bioqumica y molecularmente vacunas dentro de este organelo (Chebolu y Daniell, 2007; en el desarrollo y adaptacin Tregoning et al., 2003), as como protenas de inters farmacutico como el IGF-1 (Ruiz, 2002). La modificacinde la planta al medio ambiente dos, los caracteres gentica dentro del cloroplasto tiene ventajas cuando se comparay codificados en el genoma con la modificacin de ADN nuclear, debido a que las condiciones slo se internas del cloroplasto presentan menos mecanismos decloroplastdico segregan va materna. regulacin debido a su carcter procaritico (Koya y Daniell, El primer paso para realizar 2005). Adems, la caracterstica de mayor inters del cloroplasto es la manera como se transfiere a su descendenciainvestigacin relacionada con preferentemente va materna, lo que hace a este organelo unADN de cloroplasto fue elaborar contenedor de genes con capacidad para evitar la liberacin deuna estrategia que permitiera polen transgnico (Scotty Wilkinson, 1999), es decir, evitar laobtener fracciones enriquecidas de cpADN de buena calidad y en transferencia horizontal de genes. cantidad suficiente para llevar a cabo los experimentos necesarios dentro del laboratorio. Se han desarrollado varios mtodos para la extraccin de cpADN, la mayora de los mtodos contienen tres etapas principales: 1) La separacin de los cloroplastos de otros organelos, 2) La lisis de los cloroplastos y 3) La purificacin del cpADN (Jansen et al., 2005). Algunos mtodos utilizan gradientes de sacarosa (Palmer, 1987), soluciones con altas concentracin de NaCl (Bookjans et al., 1984) y tratamiento con DNAsa 1 (Kolodner y Tewari,

1979). Nuestro grupo de investigacin, utilizando un mtodo salinocontenido de lignina y sin DNAsa, logr extraer suficiente ADN para hacer anlisispolisacridos (Diekmann et al., molecular; sin embargo, es un mtodo que no result eficiente y2008), y en algunos casos ha sido simple para la recuperacin de ADN de cloroplasto enriquecidonecesaria la adicin de etapas de (Aguado et al., 2011). Se ha reportado que la extraccin de cpADNpurificacin del ADN durante la en plantas pertenecientes a la familia Poaceae es difcil de realizarextraccin del cpADN (Virupakshi debido a las caractersticas fisiolgicas de las plantas por su altoy Naik, 2007).

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En el presente trabajo se desarroll un mtodo de extraccinNaCl (10% CTAB, 0.7 M NaCl); donde, el primer objetivo fue mejorar el rendimiento para lase incub durante 15 min a obtencin de cpADN; el segundo objetivo fue recuperar cpADN65C, posteriormente se agreg volumen de con una pureza tal que fuera posible realizar un patrn deun digestin y mapa gentico parcial de un segmento del cpADN defenol:cloroformo:alcohol isoamlico (25:24:1) y se agit Bouteloua gracilis, como herramienta molecular. durante 5 min, los tubos se Materiales y mtodos centrifugaron por 10 min a Extraccin ADN cloroplastdico de Bouteloua gracilis. Se12,000 rpm a temperatura colocaron 40 gramos de clulas cloroflicas (c.c.) con 180 ml deambiente, se descart la fase buffer de extraccin (1.25 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM fenlica y la fase acuosa se EDTA, 0.1% BSA, 0.1% -mercaptoetanol). La mezcla se licu por 2transfiri a un tubo limpio. A la min (en un vaso previamente enfriado), en lapsos de 30 s cada vez. fase acuosa se le agreg 1 El homogenizado fue filtrado a travs de ocho capas de gasa yvolumen de cloroformo:alcohol recuperado en un recipiente estril y frio. El filtrado fue centrifugado aisoamlico (24:1) y se agit 1,000 rpm por 20 min a 4C, trasladando el sobrenadante a undurante 5 min, el tubo se recipiente limpio y descartando la pastilla, la cual contena restoscentrifug a 12,000 rpm por 10 celulares y clulas no lisadas. El sobrenadante fue centrifugado amin a temperatura ambiente. Se 4,500 rpm por 20 min a 4C con el fin de empaquetar los cloroplastos recuper la fase acuosa, se (pastilla enriquecida con cloroplastos), dejando en la suspensin lastransfiri a un tubo limpio y se mitocondrias. Con cuidado, la pastilla se resuspendi con 5 ml deagreg 1/10 de volumen de buffer de lavado fro (0.35 M Sorbitol, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 25 mMacetato de amonio 5 M y 1 EDTA) para no lisar los cloroplastos. Despus, se agregaron 50 mlvolumen de isopropanol, La de buffer de lavado y se centrifug a 4,500 rpm por 20 min a 4 C. La mezcla se incub toda la noche pastilla se resuspendi con una pipeta de boca ancha en 1 ml dea -20 C. Al siguiente da, las amortiguador de resuspensin fro (100 mM Tris-HCl, pH 7.2, 50 mMmuestras se centrifugaron a EDTA, 100 mM NaCl, 0.2% b-mercaptoetanol) y se transfiri a tubos12,000 rpm durante 15 min a 4 de 1.5 ml, repartiendo en volmenes iguales (650 ml). A los tubos seC; se descart el sobrenadante les agreg 60 ml de SDS al 10%, y se mezcl; los tubos sey al precipitado se le agreg un calentaron a 60 C en bao Mara por 5 min. Despus de la lisis, avolumen de etanol al 7%; se los tubos se les agreg 3 ml de RNAsa (10 mg/ml), 5 ml decentrifug en las condiciones proteinasa K (10 mg/ml) y 30 ml de SDS al 10%, esta solucin seanteriores. Se decant el etanol incub durante 25 min a 37C; se agregaron 100 ml de 5 M NaCl y 80 y a la pastilla resultante se le agreg un volumen de etanol ml de solucin CTAB/ absoluto y se centrifug a 14,000 rpm durante 5 min a 4C. Se descart el etanol, la pastilla se sec a temperatura ambiente y posteriormente se resuspendi en 10 ml de agua destilada estril. Para la cuantificacin del ADN, se realiz una dilucin 1:100 con agua destilada estril. La dilucin se analiz a 260 y 280 nm en un espectrofotmetro (SmartSpec 3000, BioRad). Marcaje de sondas de las sondas 16S y 23S ribosomales con digoxigenina. Las sondas se

marcaron mediante la Reaccin en Cadena de la Polimerasamin desnaturalizacin inicial, 95 incorporando dUTP-digoxigenina en los fragmentos de los genesC/30 s desnaturalizacin, 60 de inters (Hoisington et al., 1994) e iniciadores especficos paraC/40 s alineamiento, 72 C /40 cada sonda. La reaccin (volumen final 50 ml) contuvo 1X Taqs extensin, durante 35 ciclos y Buffer, 50 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 2.4 nM dTTP-Dig, 2 Muna xtensin final de 10 min a Forward y Reverse Oligonucletido, 2 U de Taq polimerasa y 1072 C. ng de ADN) . Las condiciones de amplificacin fueron: 95 C/ 3

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Deteccin de genes por hibridacin tipo Southern blot. Las (Virupakshi y Naik, 2007). muestras de cpADN sometidas a digestin con enzimas de Este tratamiento permiti restriccin, fueron separadas electrofortica-mente en geles de obtener una pastilla de agarosa y antes de la transferencia el gel fue depurinado con 100 cpADN con la calidad mM HC por 30 min y luego desnaturalizado con 1.5 M NaCl y 200 suficiente para ser tratada con mM NaOH durante 30 min. La transferencia del ADN a membranas diferentes enzimas de de nylon se realiz de acuerdo con lo reportado por Southern (1975). restriccin. Se realiz una pre-hibridacin e hibridacin en tubos de vidrio dentro Como material inicial se de un horno a 65 C con solucin HYB (5 X SSC, 0.1% utilizaron 40 g de clulas Laurilsarcosina, 0.2% SDS, 1% Reactivo de bloqueo) suplementado cloroflicas de B. gracilis y 25 g con 1 ng/ml de sonda marcada con digoxigenina especfica para de acelga (Beta vulgaris) esta cada gen, siguiendo las instrucciones descritas por Hoisinton et al. ltima como control de (1994). La deteccin inmunolgica y el revelado quimioluminiscente extraccin. Se obtuvo un mayor (CSPD-Star) se llev a cabo de acuerdo a lo reportado por Kessler rendimiento en la cantidad de et al. (1990).

cpADN obtenida en B. vulgaris debido a su alto contenido de cloroplastos; el rendimiento para Resultados y discusin las clulas cloroflicas (c.c.) de Implementacin de la extraccin de cpDNA. B. gracilis aument (Cuadro 1), El mtodo desarrollado consiste en varias etapas de fcil realizacin, en comparacin al rendimiento como la molienda, eliminacin de contaminantes de elevado peso promedio obtenido en la misma molecular y la separacin de los cloroplastos mediante especie al utilizar el mtodo centrifugacin; tambin contiene soluciones diseadas para la salino (Bookjans et al., 1984). disolucin de ADN nuclear contaminante (Bookjans et al., 1984; Cuatro mg de cpADN de B. Triobush et al., 1998; Virupakshi y Naik, 2007). Contiene una etapa vulgaris y de c.c. de B. gracilis de purificacin de cidos nucleicos haciendo uso de la estructura se digirieron con EcoRI, el molecular y de las caractersticas fisicoqumicas del detergente producto obtenido fue separado Bromuro Cetiltrimetilamonio (CTAB). En este mtodo, el punto clave mediante electroforesis en un para la obtencin de cpADN puro e ntegro es la extraccin con el gel de agarosa (Figura 1); con la detergente CTAB, esto se debe a que este detergente se adhiere a finalidad de observar la estructuras con caractersticas fisicoqumicas similares a los integridad del cpADN. sacridos, polisacridos y polifenoles; en bajas concentraciones inicas, el detergente se une a la estructura de los sacridos de los Cuadro 1. Concentraciones de cpDNA cidos nucleicos; al elevar la polaridad del medio en el que se obtenidas a partir de clulas cloroflicas de B. gracilis y B. vulgaris con el encuentra el CTAB debilita su adhesin
mtodo salino modificado con CTAB.
Rendimien to (ng/l) C.c. de B. gracilis B. vulgaris 2. 6 2. 8

260/280 nm 1. 89 1. 85

(g) 104 140

(g/g) 2.6 5.6

Figura 1. Separacin electrofortica de la digestin de cpDNA de c.c. de B. gracilis y B. vulgaris. Carril 1, marcador l-HindIII; carril 2 cpDNA de B. vulgaris con EcoRI; carril 3, cpDNA B. vulgaris sin cortar; carril 4cpDNA de c.c. de B. gracilis con

EcoRI; carril 5, cpDNA de c.c. de B. gracilis sin cortar.

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En la Figura 1 se observ un patrn de digestin para ambas Figura 2. Separacin electrofortica de la digestin cpDNA de c.c. de B. gracilis. especies en los carriles 2 y 4 (B. gracilis y B. vulgaris). Es posible Carril 1, MPMl-HindIII; carril 2, cpDNA c.c. observar en los carriles 3 y 5 una banda de ADN de alto peso de B. gracilis sin digerir; carril 3, cpDNA molecular que corresponde al cpADN no cortado. En la parte c.c. de B. gracilis con EcoRI; carril 4, cpDNA c.c. de B. gracilis con HindIII; carril inferior de los carriles se observ una cantidad considerable de 5, cpDNA c.c. de B. gracilis con BamHI. ARN. Los resultados de la pureza y digestin del ADN son similares a lo reportado por Bookjans et al. (1984) y por Triobush (1998). La adicin de RNAsa antes de la lisis cloroplastdica elimina la presencia de ARN, por lo que la cuantificacin se atribuye a la presencia de cpADN. En el anlisis espectrofotomtrico se observ una relacin en la absorbancia 260/280 cercana al 2.0, esto indica que la pureza del cpADN es buena (Cuadro 2) y que la absorbancia es debida preferentemente a la presencia de cpADN y no a ARN (Figura 2). Si bien el rendimiento en mg/g fue inferior, se mantuvo la cantidad de cpADN recuperado (Cuadro 2).
Cuadro 2. Concentraciones de cpDNA obtenidas a partir de c.c. de B. gracilis con el mtodo salino modificado con CTAB mas RNAsa.
Material inicial

Concentraci n (ng/l)

Abs 260/280 nm 1. 98 1. 99

Total (g) 133 144

Rendimient o (g/g) 3.325 3.6

C.c. de B. gracilis 1 C.c. de B. gracilis 2

3. 345 3 . 59 0

El cpADN obtenido a partir de B. gracilis fue cortado con diferentes enzimas de restriccin. En la Figura 2 es posible Se puede observar que el observar que se present un patrn de digestin claro para las tratamiento con CTAB despus de la lisis tres enzimas utilizadas (EcoRI, BamHI, HindIII). cloroplastdica permite separar En la Figura 2 se observ tambin menor cantidad de RNA comparado con la Figura 1 debido al uso de RNAsa. Se al cpADN de contaminantes observ que con este mtodo la banda de cpADN de B. que en ocasiones inhiben la vulgaris y de c.c. de B. gracilis (Figura 1) fue semejante en accin de las enzimas de intensidad e integridad, por lo que se puede inferir que el restriccin. El CTAB permite tratamiento con el detergente CTAB no afect la integridad separar a las ribosas de los nucleicos de ADN y permiti obtener cantidades similares de ADN, en cidos detrimento del rendimiento. contaminantes, ya que estos tienen una estructura similar, que se adhieren a estos azcares, como lo son los polisacridos y polifenoles (Virupakshi y Nail, 2007). Existen por tanto compuestos contaminantes de caractersticas fisicoqumicas similares a las del ADN que son extradas de manera

simultnea. parcial de segmentos Para mostrar el potencial uso de este mtodo como ribosomales del cpADN. herramienta para el anlisis molecular, se realiz un mapa

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Figura 3. Hibridacin tipo Southern blot del cpDNA de B. gracillis cortado con diferentes enzimas. A. Hibridacin con sonda 16S. Carril 1, MPM HindIII-Dig; carril 2, cpDNA B. gracilis con EcoRI; carril 3, cpDNA B. gracilis con EcoRI y BamHI; carril 4, cpDNA B. gracilis con BamHI; carril 5, cpDNA Z. mays con HpaI. B. Hibridacin con sonda 23S. Carril 1, MPM HindIIIDig; carril 2, B. gracilis con EcoRI; carril 3, B. gracilis con BamHI; carril 4, B. gracilis con HindIII; carril 5, Z. mays con HpaI.

Mapa de los genes de rADN 16S y 23S en el genoma cloroplastdico de B. gracilis. Para la identificacin del gen de rADN16S y 23S en el cpADN de B. gracilis, el cpADN se someti a restriccin con diferentes enzimas; los productos digeridos fueron separados electroforticamente y transferidos a membranas de nylon; posteriormente mediante Southern blot con las ondas ribosomales 16S y 23S los genes arriba referidos fueron identificados en la membrana conteniendo el DNA digerido. En la Figura 3 A, se observa la hibridacin de la sonda 16S ribosomal con fragmentos de 16000, 3300, 3300 y 12300 resultantes de la restriccin con las enzimas EcoRI, EcoRI/BamHI, BamHI y HpaI, respectivamente. El gen ribosomal 23S mostr un perfil de hibridacin distintivo, con fragmentos tanto de alto peso molecular como de bajo peso molecular (Figura 3B).

La hibridacin con el 23S ribosomal (Figura 3B) muestra fragmentos de 15058, 3452, (8841, 890) y 11547 pb con las enzimas EcoRI, BamHI, HindIII y HpaI, respectivamente. En los Debido a la conservacin de carriles 5 de la Figura 3 A y B se corri ADN de cpDNA de maz como referencia debido a que el maz y el zacate B. gracilislos genomas de los cloroplastos en pertenecen a la misma familia. La combinacin de estos datos deplantas, se consider que el hibridacin permiti elaborar un mapa parcial de restriccingenoma de maz puede servir como referencia. Esto se confirm (Figura 4).

utilizando la base de datos de GeneBank y los genomas reputados de cpDNA de maz (accesin AY928077) y B. gracilis (accesin EU282003) analizados utilizado la herramienta de Clustal X 2.0 (resultados no mostrados). La similitud entre los resultados esperados permiti asumir que los sitios de corte en B. gracilis se encuentran posicionados justo donde se espera que estn localizados los sitios en maz, con excepcin del sitio de corte para la enzima BamHI que est ubicado en diferente posicin, quiz sea la nica diferencia entre estos dos segmentos (Figura 4).

Figura 4. Mapa parcial de restriccin de un repetido invertido del cpDNA de Bouteloua gracilis y Zea mays. El mapa comprende la secuencia presente entre los nucletidos 90741 y 105618 del cpDNA de maz, la diferencia encontrada en el sitio de restriccin para la enzima BamHI se muestra en un recuadro negro.

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Conclusiones

En el mtodo separacin de los reportados por Triobush en 1998 y por Bookjans en 1984 utilizando Ciencias Qumico-Biolgicas. 8: 61-70. and D. NaCl con la finalidad de eliminar ADN nuclear que pudiera estarHOISINGTON, D., M. Khairallah,Laboratory Gonzlez-De Len. 1994. adherido a las membranas cloroplastdicas. El paso incorporado es protocols: CIMMYT Applied Molecular una etapa de purificacin del cpADN con el detergente CTAB Genetics Laboratory. CIMMYT. pp 70. despus de la lisis cloroplastdica, con el fin de eliminarJANSEN, R.K., L.A. Raubeson, J.L. Boore, C.W. contaminantes que se encuentran adheridos a los esqueletos dede Pamphilis, T.W. Chumley, R.C. Haberle, S. K. Wyman, A. J. fosfato del cpDNA. El uso de RNAsa tiene un efecto positivo en la Alverson, R. Peery, cantidad y calidad de cpDNA extrado en este mtodo. La S. J. Herman, H. M. Fourcade, J. V. elaboracin de un mapa parcial de restriccin permite asumir que el Kuehl, J. R. McNeal, J. Leebens-Mack, and L. Cui. 2005. Methods for obtaining mtodo de extraccin se puede utilizar para el desarrollo de and analyzing whole chloroplast genome herramientas moleculares y para el anlisis el genoma sequences. Meth.Enzymol. 395: 348-384. cloroplastdico. KESSLER, C., H. Hltke, R. Seibl, J. Bur, and
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Vol. V, No. 3 Septiembre-Diciembre 2011

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