UNIVERSIDAD EARTH OBTENCIN DE UN EDULCORANTE NATURAL PROVENIENTE DE LA STEVIA (STEVIA REBAUDIANA BERTONI)

Por JUAN ENRIQUE RODRGUEZ MALO MIGUEL NGEL SENZ DE VITERI CAMACHO

Trabajo de graduacin presentado como requisito parcial para optar al ttulo de

INGENIERO AGRNOMO

Con el grado de

LICENCIATURA

Gucimo, Costa Rica Diciembre, 2005

Trabajo de Graduacin presentado como requisito parcial para optar al ttulo de Ingeniero(a) Agrnomo(a) con el grado de Licenciatura

Profesor Asesor

B.K. Singh, Ph.D.

Profesor Coasesor

Lus Emilio Pineda, Lic. Qumico

Decano

Marlon Brev, Ph.D

Candidato

Juan Enrique Rodrguez Malo

Candidato

Miguel Senz de Viteri Camacho

Diciembre, 2005

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DEDICATORIA

Dedico este trabajo en especial a mis padres Juan Enrique y Maria de Lourdes y mi hermana por ser lo ms importante en mi vida. A todos mis amigos que estuvieron siempre junto a m. Tambin a todas las personas que formaron parte de mi permanencia en EARTH. Juan Enrique Rodrguez Malo

Me gustara dedicar esta investigacin a todas las personas que estuvieron conmigo durante estos cuatro aos aqu en EARTH. Muy especialmente dedico el fruto de mi trabajo a mis padres: Miguel y Maria del Carmen; a mi hermano Xavier Andrs. Ustedes han sido un soporte y apoyo muy grande para m. Tambin quiero dedicarle este trabajo a dos personas que siempre han estado a mi lado, mis grandes amigos: Salome y Juan Enrique. Gracias por su amistad. Miguel Senz de Viteri Camacho

AGRADECIMIENTO

A Dios por ser mi gua. A mis padres y hermana por su apoyo incondicional, su inagotable paciencia y por todos los consejos. Gracias por haber sido mi mayor apoyo para la realizacin de este proyecto y los logros alcanzados no slo en estos cuatro aos sino tambin en toda mi vida. A todos mis amigos que estuvieron siempre conmigo en los buenos y malos momentos durante todo este tiempo. En especial a Miguel, Salom y Diana por su incondicional amistad y apoyo en estos cuatro aos. Gracias!! A B.K. Singh y Luis Emilio Pineda por ser parte fundamental en la elaboracin de esta investigacin. Adems a Marlon Brev, Jonathan Crane, Roger Ruiz y a todos mis profesores por ser parte de mi formacin integral. Juan Enrique Rodrguez Malo

Agradezco a todos los que han estado junto a m estos cuatro aos. A mis amigos, que siempre me brindaron su apoyo incondicional: Karen, Alejandra, Diana, Ada, Melissa, Mnica, Omari, Ronald, Lus Eduardo, David, Juan B., Gabriel, Santiago, Lus Arturo, Jacobo y Yhenner. compartir estos 5 meses junto a ti. A mis profesores, los cuales participaron en mi formacin profesional, pero sobre todo, quiero agradecer a Egbert Spaans, Irmino Perera, Roger Ruiz y a Pedro Bidegaray por sus consejos los cuales me hicieron crecer como persona. A todos ustedes, muchas gracias!. A B.K. Singh y a Luis E. Pineda por ser pilar fundamental en el desarrollo de esta investigacin. Tambin quisiera agradecer a Vctor Quiroga por su ayuda incondicional. Miguel Senz de Viteri Camacho Tambien a Helen, por tener la oportunidad de

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RESUMEN La stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) es una planta arbustiva originaria de Paraguay y Brasil, la cual posee poderes edulcorantes que pueden llegar hacer hasta 15 veces ms dulce que el azcar de mesa y su extracto puede llegar a ser entre 100 a 300 veces ms dulce que el jugo de la caa de azcar. Esta planta se ha considerado como un producto saludable debido a que dentro de sus compuestos se encuentran carbohidratos, protenas, vitaminas, minerales y no posee caloras. A pesar de todos los beneficios que trae su consumo, existen problemas en su comercializacin debido a la presencia de un ligero sabor amargo al principio de su degustacin, provocando problemas en su comercializacin. Por esta razn, esta investigacin busca obtener un edulcorante natural proveniente de la Stevia, para su utilizacin en productos alimenticios. Como primer paso para la realizacin de este proyecto se utiliz la cromatografa de capa fina y el Protocolo Chagas-Space, los cuales determinaron la naturaleza de los compuestos existentes (polares, no polares y medianamente polares) y la identificacin de cuatro compuestos no polares en la solucin extractora acuosa y de 15 compuestos nos polares en la alcohlica . Se procedi a eliminar el sabor amargo del extracto de stevia mediante la utilizacin de filtros de carbn activado, una aceptacin alta en las pruebas sensoriales. Finalmente, se utiliz la bebida Natural ONE Classic como medio de comparacin entre el extracto de stevia obtenido y el azcar de mesa, adems de la produccin de dos formulas de Natural ONE Light. Mediante el uso de pruebas de degustacin se obtuvo una marcada aceptacin de la bebida con azcar de mesa, debido a que el sabor dulce del Natural ONE Light es muy parecido al de las bebidas lights que utilizan aspartame. La que tuvo ms aceptacin dentro de la poblacin encuestada fue el Natural ONE Light 2.

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Palabras claves: Stevia rebaudiana Bertoni, Edulcorante, Extracto, Light, Saludable, Sabor amargo, Cromatografa de capa fina, Protocolo Chagas Space, Compuestos polares, Compuestos no polares, Compuestos medianamente polares, Carbn activado, Pruebas sensoriales, Natural ONE, Aspartame. Rodrguez Malo, J.; Senz de Viteri Camacho, M. 2005. Obtencin de un edulcorante natural proveniente de la stevia (Stevia Rebaudiana Bertoni). Proyecto de Graduacin Lic. Ing. Agr. Gucimo, CR, Universidad EARTH. 64 p.

ABSTRACT Stevia (Rebaudiana bertoni) is a shrub of Paraguayan and Brazilian origins, which has powerful sweeteners that can be up to 15 times sweeter than table sugar (sucrose) and has extracts that can be up to 100 to 300 times sweeter than sugarcane juice. This plant is considered as a light or healthy product because of its carbohydrates, vitamins and minerals and it has no calories. Also its consumption brings beneficial effects in fat absorption and artery pressure reduction. In spite of all the benefits of this product, there are some problems marketing stevia because of a slight bitter after taste caused during the degradation process which takes place in the mouth. With this in mind, our investigation sought to develop a natural sweetener from the stevia plant to use it in food products. The first step of this project consisted in using fine plate chromatography and Chagas-Space Protocol, to determine the nature of the existing constituents (polarized, non-polarized and medium polarized), the identification of four non-polarized components in the aqueous extractor solution, and 15 non-polarized components in the alcoholic solution. After obtaining this information, we proceeded to eliminate the bitter flavor of the stevia extract using activated carbon filters, achieving a high acceptance in 4 gram doses in the taste tests conducted. Finally, Natural ONE Classic which contains sugar was compared with Natural ONE plus stevia extract (called Natural ONE Light). Most people preferred the Natural ONE Classic over Natural ONE Light because the sweet taste of Natural ONE Light is very similar to light drinks that used aspartame. Then two formulations of Natural ONE Light were compared. Natural ONE Light 2 was preferred to Natural ONE Light 1.

Key words: Stevia rebaudiana Bertoni, Sweetener, Extract, Light, Healthy, Bitter taste, Fine plate chromatography, Chagas-Space Protocol, Constituents, Components polarized, Components no polarized, Components medium polarized, Activated carbon, Taste tests, Natural ONE, Aspartame.

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Rodrguez Malo, J.; Senz de Viteri Camacho, M. 2005. Obtencin de un edulcorante natural proveniente de la stevia (Stevia Rebaudiana Bertoni). Proyecto de Graduacin Lic. Ing. Agr. Gucimo, CR, Universidad EARTH. 64 p.

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TABLA DE CONTENIDO Pgina DEDICATORIA........................................................................................................ V AGRADECIMIENTO.............................................................................................. VII RESUMEN.............................................................................................................. IX ABSTRACT............................................................................................................ XI LISTA DE CUADROS ...........................................................................................XV LISTA DE FIGURAS ............................................................................................XVI LISTA DE ANEXOS ............................................................................................XVII 1. 2. INTRODUCCIN ...............................................................................................1 OBJETIVOS ......................................................................................................3 2.1. OBJETIVO GENERAL ...............................................................................3 2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS......................................................................3 3. REVISIN DE LITERATURA ............................................................................4 3.1. ASPECTOS GENERALES. .......................................................................4 3.2. INVESTIGACIONES REALIZADAS...........................................................6 3.3. EL SABOR AMARGO. ...............................................................................8 4. MATERIALES Y MTODOS ...........................................................................10 4.1. METODOLOGA ......................................................................................10 4.1.1. Obtencin del extracto de stevia crudo, destanificado y purificado ...................................................................................................11 4.1.1.1. Extracciones con agua y etanol de 96% ......................11 4.1.1.2. Destanificacin del extracto .........................................11 4.1.1.3. Desengrase y eliminacin de gases ............................12 4.1.2. Comparacin de extraccin por medio acuoso y alcohlico ......13 4.1.3. Eliminacin del sabor amargo del producto final (extracto) utilizando filtros de carbn activado. ..........................................................13 4.1.4. Comparar poder edulcorante entre el extracto de la stevia y productos convencionales en la bebida Natural ONE................16 5. RESULTADOS Y DISCUSIN ........................................................................18 5.1. OBTENCIN DEL EXTRACTO DE STEVIA CRUDO, DESTANIFICADO Y PURIFICADO...........................................................................................18

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5.2. COMPARACIN DE EXTRACCIN POR MEDIO DE DOS TIPOS DE SOLUCIONES, ACUOSA Y ALCOHLICA. ........................................... 20 5.3. ELIMINACIN DEL SABOR AMARGO DEL PRODUCTO FINAL (EXTRACTO) UTILIZANDO FILTROS DE CARBN ACTIVADO. ......... 23 5.4. COMPARACIN DEL PODER EDULCORANTE ENTRE EL EXTRACTO DE LA STEVIA Y PRODUCTOS CONVENCIONALES EN LA BEBIDA NATURAL ONE. ....................................................................................................... 25 6. 7. 8. 9. CONCLUSIONES ........................................................................................... 29 RECOMENDACIONES................................................................................... 31 BIBLIOGRAFIA CITADA................................................................................ 32 ANEXOS......................................................................................................... 33

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LISTA DE CUADROS

Cuadro

Pgina

Cuadro 1. Compuestos posibles identificados con el GC-MS en el extracto de stevia con agua................................................................... 18 Cuadro 2. Compuestos posibles identificados con el GC-MS en el extracto de stevia con alcohol. .............................................................. 19 Cuadro 3. Resultados de pruebas sensoriales realizadas.................................... 24 Cuadro 4. Resultados de las pruebas sensoriales realizadas comparando el Natural ONE Light 1 y 2 con el Natural ONE Classic en una poblacin de 93 personas.. ................................................................... 25 Cuadro 5. Resultados de la comparacin de las dos formulas de Natural ONE Light en una poblacin de 93 personas............................ 26 Cuadro 9. Cantidad de Potasio y Sodio presente en las diferentes formulaciones de Natural ONE. ............................................................ 28

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LISTA DE FIGURAS

Figura

Pgina

Figura 1. Flujo de la extraccin con agua a dos tipos de temperatura................. 14 Figura 2. Diagrama del flujo de filtrado al vaci con carbn activado. .................. 15 Figura 3. Cromatografa de capa fina. Compuestos no polares........................... 20 Figura 4. Cromatografa de capa fina. Extracto de Stevia crudo, purificado y destanificado. ........................................................................................ 21 Figura 5. Concentracin de compuestos polares y no polares. ............................ 22 Figura 6. Concentracin de compuestos medianamente polar............................. 23

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LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Extraccin con Etanol de 95%............................................................... 35 Anexo 2. Extraccin con agua destilada............................................................... 35 Anexo 3. Destanificacin. ..................................................................................... 37 Anexo 4. Desengrase y eliminacin de sales. ...................................................... 38 Anexo 5 .Filtrado de carbn activado ................................................................... 40 Anexo 6. Compuestos no polares encontrados en extracto de steviapor medio del Protocolo Chagas - Space .................................................... 41 Anexo 7.Tipo de encuesta realizada en la prueba sensorial. ............................... 50 Anexo 8. Resultados de las pruebas sensoriales realizadas el 16 y 19 de septiembre del 2005. Cafetera de la Universidad EARTH................... 50 Anexo 9. Tipo de encuesta realizada en la prueba sensorial. Azcar- Stevia ...... 55 Anexo 10. Resultados de las pruebas sensoriales realizadas el 19 de Octubre del 2005. Cafetera EARTH. ................................................... 56 Anexo 11. Tipo de encuesta realizada en la prueba sensorial. Frmula 1 y 2...... 60 Anexo 12. Resultados de las pruebas sensoriales realizadas el 19 de Octubre del 2005. Cafetera EARTH. ................................................... 60

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1. INTRODUCCIN La stevia (Stevia rebaudiana Bertoni), que es originaria de Paraguay y Brasil es una planta que poco a poco est ingresando al mercado debido a sus poderes edulcorantes. Esta caracterstica de la planta es hasta 15 veces ms dulce que el azcar de mesa (sucrosa) y su extracto puede llegar a ser entre 100 a 300 veces ms dulce que el jugo de la caa de azcar. En cuanto al extracto en polvo presenta un 4095% de glucsidos dulces concentrados, los cuales se obtienen a partir de las hojas mediante la eliminacin de los compuestos no deseados, teniendo como resultado un polvo de color blanco (UVA, 2003). Segn la Unin Vegetariana Argentina (2003), laboratorios paraguayos, argentinos y japoneses han comprobado mediante anlisis toxicolgicos que el extracto de stevia no posee efectos secundarios de ninguna clase. Alrededor de 1000 toneladas anuales son consumidos en Japn, sin que hasta el momento se hayan denunciado efectos txicos. Adems, es importante mencionar que estudios resaltan la actividad antibitica de la stevia especialmente contra las bacterias E.coli, Stafilococos aureus, y Corynebacterium difteriae. Esta hierba es recomendada para personas que desean perder peso, ya que les ayudar a disminuir la ingesta de caloras que poseen los edulcurantes convencionales. Adems, la stevia posee propiedades para el control de la presin arterial por su efecto vasodilatador, diurtico y cardiotnico 2005). Dado a todos los atributos mencionados anteriormente, podemos asegurar que la stevia pertenece al grupo de productos llamados saludables. Estos productos tienen un mercado asegurado debido a las tendencias o modas del consumo de alimentos a nivel mundial. Sin embargo, a pesar de todos los beneficios que trae el consumo de los derivados de esta planta, no se ha podido encontrar en el mercado un producto que no posea un ligero sabor amargo al principio de su degustacin, lo cual (Alimentacin Sana,

ha generado un sabor no tan llamativo, provocando posteriormente problemas en su comercializacin. Identificado dicho problema, este proyecto mediante el Protocolo Chagas-Space (desarrollado en la Universidad EARTH) busca obtener el extracto de stevia crudo, destanificado y purificado para la evaluacin de su calidad y posteriormente su uso en preparacin de alimentos.

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL Obtener un edulcorante natural proveniente de la Stevia Rebaudiana Bertoni, para su utilizacin en productos alimenticios.

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS Obtener extracto de stevia crudo, destanificado y purificado. Comparar diferentes compuestos extrados por un medio acuoso y un medio alcohlico, mediante cromatografas de capas finas. Eliminar el sabor amargo del edulcorante obtenido, utilizando filtros de carbn activado. Comparar la aceptabilidad del poder edulcorante entre el extracto de la stevia y azcar de mesa en la bebida Natural ONE.

3. REVISIN DE LITERATURA

3.1. ASPECTOS GENERALES.

La stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) es una planta con poder edulcorante, la cual es utilizada como un producto alternativo al azcar y a los endulzantes artificiales. La Stevia es un pequeo arbusto originario de la flora sudamericana que se criaba espontneamente en el hbitat semirido de las laderas montaosas de Paraguay y en las zonas adyacentes de Brasil. Se trata de una hierba subleosa perenne, perteneciente a la familia de las Compuestas, caracterizada por presentar una altura de 30-80 cm con tallo de color pardo; hojas ssiles ovoidales con bordes aserrados, las terminales agrupadas en nmero de 3 o 4; y flores pequeas terminales, blanquecinas, hermafroditas, de corola tubular. La raz es pivotante y adems su tamao equivale a un cuarto de la planta. Existen en la actualidad alrededor de doscientas especies, diseminadas a travs de toda Amrica (UVA, 2003). Las hojas de la planta han sido utilizadas por la tribu de Indios Guaran desde los tiempos pre-colombinos, para endulzar los alimentos. Sin embargo, no fue sino hasta 1887 que el cientfico americano Anthony Bertoni la descubri. Esta planta no tiene caloras y tiene efectos beneficiosos en la absorcin de la grasa y la presin arterial. Contiene carbohidratos, protenas, vitaminas y minerales, por lo que hoy en da, en pases como Japn abarca el 41% de los edulcorantes consumidos. El sabor dulce de la planta se debe a un glucsido llamado esteviosida, adems de otros compuestos como glucosa y rebaudiosida (SteviaCanada, 2004). Segn la FDA (2005) la Stevia en su forma natural es 15 veces ms dulce que el azcar de mesa (sucrosa) y el extracto es de 100 a 300 veces ms dulce que el azcar. Algo importante de recalcar es que se ha descubierto que no afecta los

niveles de azcar sanguneo, por el contrario, se ha podido encontrar que posee propiedades hipoglucmicas, las cuales mejoran la tolerancia a la glucosa. Por este motivo se recomienda su uso a pacientes diabticos. Actualmente esta planta ha empezado a cultivarse en extensas reas de todo el mundo y de modo extensivo en Brasil, China, Japn, Corea, Tailandia, Israel y Colombia; donde se utiliza como edulcorante en todo tipo de alimentos y bebidas naturales. El Centro de Investigacin de Stevia de Brasil, que en el ao 1970, en el Congreso Internacional de Diabetes, coincide con la tesis del Dr. Carlos A. Oviedo, Efectos del Kaa He (Stevia rebaudiana Bertoni) sobre la glucemia. Estudios sobre 25 razones clnicas hidrocarbonado normal. En 1970, el Dr. Carlos A. Oviedo de la Facultad de Medicina de la UNA., expone los efectos del Kaa He sobre la glucemia. Informacin suministrada al 209 Congreso de Diabetes realizado en Buenos Aires por el Dr. Ovidio Miguel. En el Japn se experimenta el uso domstico y su aplicacin en las fbricas de alimentos y en la industria farmacutica. En 1976, en la 28 Reunin Anual para el Progreso de la Ciencia, realizada en Brasilia, la Dra. Gila de Amaral de Von Schmelling present el trabajo titulado Stevia rebaudiana Bertoni y sus efectos hipoglicemiantes en conejos aloxannizados, con el que deja comprobado el efecto antidiabtico de la planta. (Primal Nature, 2005) En el 6 Congreso de Farmacologa, celebrado en Buenos Aires en el ao 1976, tambin se presentaron 2 trabajos por el Centro de Investigacin de la Stevia de la ciudad de San Paulo, el Primer trabajo fue: El efecto inductor de la prdida de peso corporal (demostracin de la accin de Kaa He contra la obesidad); el segundo: Los efectos antiarrtmicos (demostracin sobre el valor beneficio para el funcionamiento regular del corazn).

En el 7 Congreso Internacional de diabetes se dio a conocer su posible accin hipoglucemiante.

3.2. INVESTIGACIONES REALIZADAS

Las hojas de la planta de stevia poseen una mezcla de ocho glucsidos los cuales tienen una potencia edulcorante superior a la de la sacarosa. Entre los

glucsidos podemos destacar el steviol, el stevisido y el rebaudisido-A, adems de rebaudisido-C (Dulcsido B), rebaudisido-D, rebaudisido-E y dulcsido A. Gracias a las diferentes pruebas y anlisis realizados se ha comprobado que el rebaudisido-A es el que mejor sabor tiene mientras que los otros dulcsidos, que estn presentes en menor cantidad, tienen un sabor amargo residual por incluir en su composicin una sustancia con este sabor. La hoja, en su estado natural, posee una gran cantidad de nutrientes como carbohidratos de fcil asimilacin (ms del 50%), ms del 10% en fibras, ms del 10% de polipptidos (protenas vegetales), adems del 1% de lpidos y potasio (Kinghorn, 2002). Segn Martnez (2003) en 1908 y 1909 mediante el uso del alcohol se logr extraer la sustancia dulce de las hojas, purificarla y posteriormente obtenerla en forma de cristales blancos e inodoros. En 1921 el principio activo fue denominado estevisido por la Unin Internacional de Qumica (Unin Internationale de Chimie). La mayor parte de estevisido se encuentra en las hojas, un poco menos en las flores y en los tallos tiernos mientras que en las races no hay presencia de estevisido. Los estevisidos y los rebaudisidos tienen la estructura qumica diferente al de las molculas del azcar. Por esta razn, se puede ver que el producto industrial extrado de la stevia es en realidad una combinacin de varios glucsidos, cuyas cantidades varan en funcin a las variedades, de los climas y de los terrenos.

Numerosas investigaciones del departamento de endocrinologa y metabolismo de la Universidad Aarhus de Dinamarca han determinado que la stevia acta directamente sobre el pncreas, restaurando sus clulas para que estas produzcan su propia insulina. Esto se debe al potencial antihiperglucmico que posee esta planta sobre los pacientes que padecen diabetes tipo 2 (Sociedad Latinoamericana de Nefrologa e Hipertensin, 2005). Otras investigaciones realizadas en la Universidad de Medicina de Taipei-

Taiwan han demostrado que luego de haber trabajado en experimentos con 106 hipertensos chinos de ambos sexos y edades (entre 28 y 75 aos), se logr demostrar que esta planta acta como agente hipotensor y cardiotnico (regula presin y latidos del corazn), lo que daba como resultado la disminucin de la presin sistlica y diastlica (Sociedad Latinoamericana de Nefrologa e Hipertensin, 2005). Segn Pontoriero (UVA, 2003), otros estudios realizados sobre el uso de la stevia han demostrado cualidades de su consumo en personas obesas con problemas de diabetes. Este estudio se bas en el anlisis de las curvas de tolerancia a la sobrecarga de glucosa postprandial fue mejor en aquellos que haban sido tratados previamente con 130-140 mg de extracto de hierba dulce (stevia), que en aquellos que haban recibido 280-300 mg del hipoglucemiante de sntesis glibenclamida. El

porcentaje de descenso fue en promedio del 35% respecto a los niveles basales al cabo de 6-8 horas. El efecto hipoglucemiante como el incremento en la tolerancia a la glucosa tambin se evidenci en las personas euglucmicas, durante y despus de la toma de un extracto acuoso elaborado con 5 g de hojas de stevia. A pesar de todas estas investigaciones realizadas sobre el uso de esta hierba dulce, la FDA en su boletn IA #45-06 elaborado en el ao 1996 y actualizado en el 2003, obliga a sus agentes a la detencin de todos los productos que contengan stevia (hojas, tallos y races). El motivo de esta detencin es la poca informacin

toxicolgica que se ha logrado obtener de sus compuestos, principalmente el steviosido. Estos productos estn prohibidos para su consumo como alimentos

(GRASS- hierbas seguras para el consumo humano), sin embargo, es permitido como suplemento diettico. Por esta razn, existen grandes preocupaciones a nivel legal y comercial de las compaas que los producen, ya que lo que se est logrando con esto es un control en la importacin de este producto. La FDA dice no tener resultados de los experimentos realizados y mientras estos no demuestren que la stevia es completamente inofensiva para el cuerpo humano, esta detencin del producto continuar. En respuesta a este boletn, el Japanese Food and Drug Safety Center ha reportado que en Japn se consumen anualmente ms de 1000 toneladas anuales de extracto de stevia, sin que hasta el momento se hayan denunciado efectos txicos por ella. Este hecho ha cobrado vital relevancia a la luz de los comentarios surgidos por el uso de otros edulcorantes de sntesis tal como el aspartame, que en principio no tendra el mismo margen de seguridad, pero tiene una gran importancia econmica (FDA, 2005).

3.3. EL SABOR AMARGO.

Segn la Sociedad Latinoamericana de Nefrologa e Hipertensin el amargor se asemeja al dulzor debido a su dependencia de la estereoqumica de las molculas que desencadenan el estmulo; las dos sensaciones son puestas en marcha por caractersticas similares de las molculas, haciendo que algunas molculas produzcan ambas sensaciones amarga y dulce, incluso simultneamente. Si bien las molculas dulces tienen que poseer dos grupos polares que pueden ser complementados con un grupo no polar y un grupo hidrfobo. Sin embargo, la mayora de las sustancias amargas poseen una unidad spida AH/B idntica a la de las molculas dulces, as como el grupo hidrfobo. La orientacin de las unidades AH/B en la cavidad del receptor proporcionan la discriminacin entre dulce y amargo. Si la geometra de la molcula permite orientarse en ambas direcciones la molcula dara respuesta 8

amargo-dulce. Este modelo describe adecuadamente la respuesta dulce-amarga de los aminocidos en los cuales los ismeros D son dulces y los ismeros L son amargos. Las sales amargas poseen un mecanismo de recepcin diferente relacionado con la suma de los dimetros inicos de los componentes aninicos y catinicos de la sal. Las sales con dimetros inicos inferiores a 6,5 tienen un gusto puramente salino (LiCl = 4,98 , NaCl = 5,56 y KCL = 6,28 ). Cuando aumentan los diametros inicos (CsCl = 6,96 y CsI = 7,74 ), las sales resultan cada vez ms amargas. El cloruro de magnesio (8,50 ) es por tanto muy amargo.

4. MATERIALES Y MTODOS

4.1. METODOLOGA

Mediante esta metodologa se pretende conocer los compuestos presentes en las hojas de la Stevia y de esta manera elaborar un protocolo de produccin eficiente de un edulcorante natural proveniente de esta planta. Por este motivo el primer paso que se realiz fue la purificacin del extracto por medio del protocolo Chagas Space de la Universidad EARTH. Con este protocolo se pudo separar diferentes compuestos como los taninos y las grasas determinando la influencia de estos sobre el potencial edulcorante de esta planta. Luego de realizado estos anlisis, se procedi a encontrar la solucin extractora adecuada para la produccin de este edulcorante. Se prob con agua y etanol de 96% como soluciones extractoras, las cuales al poseer diferentes polaridades, extraen

diferentes compuestos como cidos carboxlicos, aminas, steres, aldehdos, cetonas y aromticos. De esta manera se obtuvo dos soluciones con capacidades

edulcorantes y concentraciones desiguales. Otro aspecto importante a tratar en nuestra investigacin, es eliminar el sabor amargo que posee esta solucin al principio de su degustacin, problema que ha ocasionado baja aceptacin de este producto en el mercado. Para lograr este objetivo se realizaron pruebas en las cuales se pas el extracto de Stevia por filtros de carbn activado. Adems de este filtrado, se adicion pequeas cantidades de acido ctrico, el cual es utilizado en bebidas y productos alimenticios como controlador de sabores mediante la regulacin del pH. Para verificar el resultado de estas pruebas se

realizaron anlisis sensoriales del producto. Por ltimo, se realizaron pruebas comparativas entre el extracto de Stevia y los edulcorantes comerciales en la bebida Natural ONE, elaborada por la Universidad

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EARTH. Para esto se elabor encuestas y pruebas de degustacin en una poblacin establecida para su posterior anlisis estadstico.

4.1.1. Obtencin del extracto de stevia crudo, destanificado y purificado Se utiliz el Protocolo Chagas Space, elaborado en la Universidad Earth, por medio del cual se logro obtener un extracto crudo, destanificado y depurado (desalinizacin y desengrase del extracto) procurando la mayor purificacin del producto. 4.1.1.1. Extracciones con agua y etanol de 96% En las dos extracciones se agreg 15 gr. de material botnico en 90 ml de la solucin extractora (agua y etanol de 96%) y de forma dinmica utilizando el mortero se obtuvo la muestra 1 (agua) y la muestra 2 (etanol). Estas muestras se filtraron para dejarlas libres de fibras y poder ser liofilizadas. 4.1.1.2. Destanificacin del extracto Para la obtencin del extracto destanificado se disolvieron 5 gr del extracto liofilizado en 200 ml de metanol, posteriormente se agreg Polivinilpirrolidona (PVP) en una proporcin PVP: extracto de 5:1, para la eliminacin de fenoles. Una vez realizado este paso se dej en reposo la muestra por 30 minutos, agitndola ocasionalmente. Despus de haber dejado la muestra en reposo se filtr lentamente por gravedad mediante papel filtro. El filtrado se lo recolect en un baln para evaporar en el rotovapor pero no a sequedad, luego se trasvas a un vial que fue previamente tarado para de esta manera secar en el rotovapor. Por ltimo se pes la muestra y se la dej con su respectiva rotulacin. Para poder obtener los taninos una vez realizado el filtrado por gravedad se agreg en un beaker 100 ml de metanol y se llev a cabo un bao ultrasnico por 10 minutos. Finalmente, se volvi a filtrar consiguiendo as los taninos.

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4.1.1.3. Desengrase y eliminacin de gases El primer paso para lograr el desengrase y la respectiva eliminacin de sales fue redisolver el extracto previamente destanificado en la menor proporcin de una mezcla de diclorometano: metanol 1:1. Luego, se aadi el contenido en un frasco en el cual se agreg 40 ml (2 gr. de muestra, 40 ml de resina) de Diaion HP-20, que es una resina poli aromtica adsorbente para compuestos hidrofbicos. Posteriormente se dej secar la resina colocando el frasco en el rotovapor el cual se lo mezcl ocasionalmente para lograr un secado uniforme. Una vez obtenida la resina seca se la transfiri a una columna de vidrio apropiada del sistema MPLC donde se agreg una cantidad igual de resina nueva. Despus se pas 250 ml de agua para un lavado inicial el cual se descart. Seguidamente se pas 600 ml de metanol y se recogi el extracto lquido de la descarga en un beaker. Lo que se realiz para poder llevar a cabo este paso fue un lavado de la resina y lo que se recolect fue lo que finalmente se separ en la fase reversa. Luego, se trasvas en un vial previamente tarado, se evapor y determin su peso (Muestra depurada, desalinizada y desengrasada). Este es el lavado el cual se le efecto el respectivo anlisis. Por ltimo, se diluy el material retenido en la resina Hp20 con 500 ml de una mezcla de diclorometano/metanol 1:1. Este lavado se descart. Adems, se realizaron cromatografa de capas para poder determinar la cantidad de compuestos existentes en cada disolucin (acuosa y alcohlica). De esta forma se conoci la solucin extractora con la cual la stevia alcanz mayor rendimiento. Para la cromatografa de capa fina se diluy la muestra con metanol, el cual es un diluyente altamente voltil y de secado rpido. Se coloc (sembr) 5 microlitros de esta dilucin en proporciones de 1:100 en una superficie metlica alumnica. Esta superficie fue impregnada con una fase estacionaria, en nuestro caso se utiliz slice en gel.

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A continuacin se coloc el cromatofolio en un envase cerrado el cual en su interior contiene la fase mvil (65% acetato de etilo, 34% de metanol y 1% de agua). Esta se dej reposar por el tiempo necesario que la muestra corra 7 cm. aproximadamente. Para el secado se lo dej reposando por 15 minutos, luego se lo roci con una solucin de cido sulfrico al 25% e inmediatamente se lo introdujo a un horno a 100C. De esta forma se revel los patrones y seales cromatogrficas. Para la interpretacin de la cromatografa se leen las bandas desde el punto de inyeccin (el cual es el lado polar del cromatofolio) hacia el borde contrario (lado no polar). Se evala la concentracin de la solucin a lo largo de sus bandas, viendo la diferente naturaleza de los compuestos presentes en dicha solucin. 4.1.2. Comparacin de extraccin por medio acuoso y alcohlico Se procedi a la elaboracin de un nuevo extracto de stevia por cada solucin extractora, para esto se utiliz el mismo procedimiento del punto 4.1.1.1 descrito anteriormente. Se utilizaron estas dos soluciones extractoras (agua y etanol) debido a su diferencia en polaridad lo que brind una capacidad arrastre de diferentes tipos de compuestos. Para estas comparaciones se realizaran cromatografas de capas finas, las cuales nos brindarn un resultado de forma visual de los diferentes compuestos arrastrados o extrados por cada solucin extractora. 4.1.3. Eliminacin del sabor amargo del producto final (extracto) utilizando filtros de carbn activado. La stevia es una planta arbustiva con grandes poderes edulcorantes, sin embargo presenta un pequeo sabor amargo al principio de su degustacin. Este ha sido un problema importante en la aceptacin del producto, ya que sensorialmente no es agradable. Para la eliminacin de este sabor amargo se utilizaron filtros de carbn activado y pequeas dosis de acido ctrico para control de pH.

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Para la realizacin de estas pruebas y anlisis se elaboraron nuevos extractos, utilizando 20 gr. de stevia por cada 400 ml de agua. La primera muestra se realiz con 200 ml de agua caliente (99 C) y 10 gr. de hojas de la stevia, el cual se dejo sumergido durante 30 min. Luego del tiempo requerido las hojas fueron retiradas por medio de un cedazo. Luego se procedi a realizar la segunda muestra utilizando el mismo procedimiento que la anterior, con la nica diferencia de que la temperatura del agua era de 24 C, pudiendo obtener dos extractos con diferentes tipos de sus compuestos y proporciones.

20 gr. de stevia liofilizada + 400 mL de agua

Extracto en agua caliente (99C) 200 mL

Extracto en agua (24C) 200 mL

fra

Figura 1. Flujo de la extraccin con agua a dos tipos de temperatura. Estas soluciones fueron muestreadas sensorialmente para determinar cual extraccin (fro y caliente) posea menos sabor amargo. Luego de obtener los

resultados se continu con el filtrado, realizando cinco soluciones de 200 ml cada una, utilizando la metodologa de extraccin mencionada anteriormente. Estas soluciones fueron filtradas con diferentes cantidades de carbn activado, 1 gr., 2 gr., 3 gr., 4gr y 5 gr. respectivamente.

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Solucin menos amarga

Error! Muestra A(200 ml): 5 gr. Carbn activado

Muestra C(200 ml): 3 gr. Carbn activado

Muestra E(200 ml): 1 gr. Carbn activado

Muestra B(200 ml): 4 gr. Carbn activado

Muestra D(200 ml): 2 gr. Carbn activado

Figura 2. Diagrama del flujo de filtrado al vaci con carbn activado. Este filtrado fue envasado y refrigerado para ser utilizado en las pruebas sensoriales, para las cuales se elaboraron encuestas para la participacin de una poblacin de 150 personas. Esta metodologa (Prueba sensorial de umbral de sabor) se utiliza para pulir la calidad deseada por el consumidor de productos alimenticios antes de ser lanzados al mercado. En la encuesta realizada, se coloc cinco vasos de 1 oz., con un ml de cada muestra, A, B, C, D y E. Se pidi a la persona encuestada que comience con la solucin de mayor cantidad de carbn activado (A = 5gr.) y continuar con las otras soluciones hasta a la muestra la cual se perciba el umbral del sabor (sensacin gustativa del cambio de sabor dulce a amargo). La muestra de

mayor porcentaje de aceptacin ser utilizada en la siguiente prueba, la cual consiste en dosificar la cantidad de extracto de stevia para la bebida Natural ONE.

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4.1.4. Comparar poder edulcorante entre el extracto de la stevia y productos convencionales en la bebida Natural ONE.

Despus de haber obtenido el producto purificado y libre del sabor amargo, se realiz una comparacin del poder edulcorante de este producto y el azcar de mesa en la bebida Natural ONE. Para esto se realizaron 2 tipos de formulaciones de Natural ONE Light, utilizando los mismos ingredientes del Classic, a excepcin del azcar. Entre los

ingredientes se encuentran: Rosa de Jamaica, cardamomo, canela, sorbato de potasio y benzoato de sodio como preservantes, azcar (Natural ONE Classic), stevia (Natural ONE Light formula 1 y formula 2) y adems se utiliz menta para una de las

formulaciones lights (formula 1). Para poder comparar la efectividad entre la stevia y el azcar de mesa, se realizaron pruebas sensoriales, las cuales nos permiti detectar la diferencia de dos o ms condiciones en una poblacin de 93 personas. Las comparaciones se realizaron entre dos formulaciones de Natural ONE Light y el azcar de mesa refinada, la cual es utilizada para la produccin del Natural ONE Classic. Despus de realizar la comparacin entre el Natural ONE Clasicc y las dos formulas lights, a la misma poblacin encuestada se realiz otra prueba sensorial. Estas degustaciones reflejaron las preferencias de dicha poblacin con respecto a las dos formulas de Natural ONE Light. Adems de las pruebas sensoriales se realiz la medicin del pH, conductividad elctrica y de grados Brix en la bebida Natural ONE sin ningn tipo de azcar y del Natural ONE con stevia. De esta forma se analiz si existe algn cambio en las propiedades qumicas de la bebida. Para estas pruebas se utilizaran 5 probetas con 25 mL de la bebida sin azcar y 5 probetas de la bebida con stevia. Luego se pasaron cada probeta por el medidor de brix, conductividad elctrica y pH. De esta forma se mediaran los azucares disueltos, 16

las sales solubles y el pH. Otra comparacin realizada entre las bebidas analizadas fue la cuantificacin en gramos de la presencia de sales, como sodio y potasio.

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5. RESULTADOS Y DISCUSIN

5.1. OBTENCIN DEL EXTRACTO DE STEVIA CRUDO, DESTANIFICADO Y PURIFICADO

Los compuestos extrados e identificados con el GC-SM (Protocolo Chagas Space de la Universidad EARTH) en dos soluciones extractoras utilizadas, agua y alcohol. son estrictamente de naturaleza no polar. A continuacin se enumeran los posibles compuestos identificados bajo la nomenclatura IUPAC:

Cuadro 1. Compuestos posibles identificados con el GC-MS en el extracto de stevia con agua.

Nmero de compuesto 1 2 3 4

Compuesto

Di - (2 - ethylhexyl) phtalate
1 , 2 - Benzenedicarboxylic aacid Eicosane Olan - 12 - en 3 - ol, acetate Urs - 12 -en -24 -oic -acid, 3 - oxo -, met Lupeul acetate Lup - 20 (29) - en - 3 Toraxasterol acetate Dammaradienyl acetate Dammara - 2

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Cuadro 2. Compuestos posibles identificados con el GC-MS en el extracto de stevia con alcohol.
Nmero de compuesto Compuesto 1 Methane, dicholoro 2 Octadecane n - octadecane Heneicosane n - heneicosane 3 2 - Pentadecanone, 6 , 10, 14 - trimetyl Acetyl - choline 4 1H - Naphtho [2 , 1 - b] pyran, 3 - ethenyld Manoyl oxide 4 - Nitro - (meta - terphenyl) 5 Hexadecanoic acid, ethyl ester Ethyl hexadecanoate 6 Phytol 2 - Hexadecen - 1 - ol, 3, 7, 11, 15 - tetram 7 Ethyl linoleate linoleic acid 8 9, 12, 15, - Octadecatrienoic acid Ethyl Linoleolate 9 Octadecanoic acid, ethyl ester Ethyl stearate ethyl octadecano 10 Nonadecane n- nonadecane Tritetracontane 11 Dodecane 12 1, 2 - Benzenedicarboxylic acid Di - (2 - ethylhexyl) phthalate 13 Eicosane n - eicosane Heptacosane n - heptacosane 14 Urs - 12 - en - 24 - oic acid, 3 - oxo -methyl 5 (1H) - Azulenone, 2, 4, 6, 8, 8a - hexa Aristolone 2H - Cyclopropa [a] naph 15 Viminalol Urs - 12 - en - 3 - ol .beta. - Amyrin olean - 12- en - 3 - ol Aristolone 2H - Cyclopropa [a] naph

En los cuadros 1 y 2 podemos visualizar los diferentes compuestos identificados (Ver anexo 6). Estos compuestos se pueden agregar a la lista de compuestos identificados por diferentes investigadores como Djaja Djendoel Soejarto, Edwaerd J. Kennelly, Carlos M. Cerda Garca - Rojas, Darrick Kim, Kazuhiro Ohtani, Kazuo Yamasaki (Kinghorn,

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D. 2002). Ellos han basado su anlisis en los compuestos polares de la stevia, como el steviosido, el steviol, entre otros.

Compuestos analizados por medio de Protocolo Chagas - Space

Figura 3. Cromatografa de capa fina. Compuestos no polares.

5.2. COMPARACIN DE EXTRACCIN POR MEDIO DE DOS TIPOS DE SOLUCIONES, ACUOSA Y ALCOHLICA.

Para la comparacin entre las dos soluciones extractoras se realizaron cromatografa de capa fina adems de realizar degustaciones de estos extractos, para poder determinar la eficiencia de extraccin de la dulzura caracterstica de esta planta. Esta cromatografa se realiz bajo un sistema polar, el cual es el ms utilizado en los laboratorios que se especializan a realizar estas muestras.

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Compuestos no polares

Compuestos medianamente polar

Compuestos polares

Figura 4. Cromatografa de capa fina. Extracto de Stevia crudo, purificado y destanificado.

En la figura anterior podemos visualizar la cromatografa de capa fina que se realiz. En esta vemos claramente la variacin (polar y no polar) de los compuestos presentes en la extraccin acuosa (color negro) y la alcohlica (color azul). Para cada extracto se realizo la respectiva cromatografa, los cuales son: Crudo (color rojo), destanificado (color verde) y purificado (color amarillo).

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A (extracto crudo + H2O) Figura 5. Concentracin de compuestos polares y no polares.

En la figura 5 podemos ver con mayor claridad la disposicin de los compuestos a lo largo de las bandas, partiendo de una concentracin polar alta hasta la no polar. De acuerdo a las investigaciones realizadas (Kinghorn, D. 2002), dentro de estos compuestos polares estn el steviol, el stevisido y el rebaudisido-A, adems de rebaudisido-C (Dulcsido B), rebaudisido-D, rebaudisido-E y dulcsido A, los cuales le otorgan el poder edulcorante a esta planta. Sensorialmente el agua arrastro un sabor ms amargo que la extraccin con alcohol (etanol 96%).

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Compuestos medianamente polar

Figura 6. Concentracin de compuestos medianamente polar.

En la figura 6 podemos visualizar el perfil cromatogrfico que presentan los extractos acuoso y etanlico de la stevia revelado con una disolucin acuosa de H2SO4 (25%) y luego calentado a 100C. Se observan bandas de distinta polaridad.

5.3. ELIMINACIN DEL SABOR AMARGO DEL PRODUCTO FINAL (EXTRACTO) UTILIZANDO FILTROS DE CARBN ACTIVADO.

Para poder realizar los tratamientos se efectuaron pasos previos en los se descart la extraccin mediante agua a una temperatura de 24C. Esta decisin se tomo debido a que esta extraccin present un sabor amargo muy pronunciado. Por este motivo los tratamientos se llevaron a cabo mediante agua apunto de ebullicin (99C). Una vez obtenida la extraccin se filtr la solucin por medio de carbn activado en diferentes dosis (1, 2, 3, 4 y 5 gramos). Al obtener los cinco tratamientos

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se procedi a realizar las pruebas sensoriales de umbral de sabor amargo. De esta manera se pudo conocer cual de estos tratamientos fue el que present el menor grado de amargura. Las pruebas se ejecutaron en una poblacin de 122 personas obteniendo as resultados contundentes. La degustacin de los encuestados empez con el tratamiento en el cual se filtr la extraccin con 5 gr. de carbn activado y 19 personas que representan un 16% percibieron el amargo. Luego en el cuarto tratamiento 28 personas (23%) detectaron el amargo de la solucin pero en el tratamiento 3 un total de 56 personas (45%) encontraron un sabor amargo pronunciado (ver anexo 8). Con estos resultados queda claro que la tendencia en cuanto a la concentracin de amargura queda en los tratamientos 3 y 4 ya que de un 16% de las personas que encontraron el sabor amargo del primer tratamiento pas a un 86% de personas en el tratamiento 3 como se muestra en el cuadro 5. Por esta razn, el tratamiento que acepta el sabor de la solucin filtrada es el de 4gr.

Cuadro 3. Resultados de pruebas sensoriales realizadas

gr de C Activado Resultados
1 2 3 4 5 Total 6 13 56 28 19 122

Porcentaje O. descendente
5% 11% 46% 23% 16% 100% 100% 95% 84% 39% 16%

O. ascendente
5% 16% 61% 84% 100%

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5.4. COMPARACIN DEL PODER EDULCORANTE ENTRE EL EXTRACTO DE LA STEVIA Y PRODUCTOS CONVENCIONALES EN LA BEBIDA NATURAL ONE.

Los resultados de estas pruebas sensoriales realizadas demuestran una clara diferencia entre la aceptacin entre los productos comparados (azcar de mesa y stevia en la bebida Natural ONE). El 86% de la poblacin encuestada rechaz el sabor de las bebidas lights, eligiendo el Natural ONE Classic como el de mejor sabor. Lo cual demuestra una clara ventaja del sabor del azcar antes el sabor de la stevia, esto se puede deber a la costumbre al sabor dulce del azcar. Cuadro 4. Resultados de las pruebas sensoriales realizadas comparando el Natural ONE Light 1 y 2 con el Natural ONE Classic en una poblacin de 93 personas..

Producto Natural ONE classic Natural ONE light 1 Natural ONE light 2

Nmero de aceptacin 80 0 13 93

Porcentaje 86.0 0 14.0 100.0

En la segunda encuesta realizada, la cual se bas en la comparacin de las dos diferentes formulas de produccin de las bebidas lights, se not una clara aceptacin de la segunda frmula, con un 94%. Esta frmula lleva los mismos ingredientes

menos la menta, la cual esta entre los ingredientes de la frmula 1, sin embargo, el proceso de la extraccin de la stevia es diferente. En esta frmula se filtr el extracto de stevia con 4 gr. de carbn activado, dato obtenido de la prueba sensorial realizada para detectar concentracin de sabor amargo. De esta forma se logr mitigar

considerablemente este sabor, logrando una aceptacin muy alta comparada con la segunda frmula (Ver anexo 10 y 12).

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Cuadro 5. Resultados de la comparacin de las dos formulas de Natural ONE Light en una poblacin de 93 personas.

Producto Natural ONE light 1 Natural ONE light 2

Nmero de aceptacin 6 87 93

Porcentaje 6.5 93.5 100.0

Como se puede ver en los cuadro 6,7 y 8 se realiz las mediciones del pH, conductividad elctrica y grados Brix de la bebida Natural ONE Classic y de las dos diferentes formulaciones del Natural ONE Light. En cuanto al pH se logr apreciar que no hay gran variacin entre las diferentes bebidas, sin embargo el Natural ONE Classic present una acidez mayor (2.84) a diferencia de la formulacin 1 (3.26) y de la formulacin 2 (2.97). A pesar de existir esta diferencia, sensorialmente no sufre variaciones importantes, lo que no causa un efecto negativo en la aceptacin del producto. Cuadro 6. Comparaciones en cuanto a pH de las diferentes frmulas del Natural ONE.

Bebida Natural ONE Classic Natural ONE Light 1 Natural ONE Light 2

pH 2,84 3,26 2,97

Al medir la conductividad elctrica en las tres diferentes formulaciones de bebidas no hubo una diferencia considerable ya que la conductividad elctrica del Natural ONE Classic es de 1.86 ms/cm mientras Este parmetro tiene relacin con la existencia de iones disueltos en el agua, que son partculas con cargas elctricas. Cuanto mayor sea la concentracin de iones disueltos, mayor ser la conductividad elctrica del agua. 26

Cuadro 7. Comparaciones en cuanto a la conductividad elctrica de las diferentes frmulas del Natural ONE.

Bebida Natural ONE Classic Natural ONE Light 1 Natural ONE Light 2

Cond. Elctrica (ms/cm) 1,86 2,52 2,5

Al conocer los grados Brix de las distintas bebidas elaboradas se pudo notar una diferencia marcada entre el Natural ONE Classic (9.2) y el Natural ONE Light 1 (3) y 2 (2). Esta diferencia es lgica ya que los grados Brix miden la cantidad de slidos solubles presentes en un jugo o pulpa expresados en porcentaje de sacarosa. Los slidos solubles estn compuestos por los azcares, cidos, sales y dems compuestos solubles en agua presentes en los jugos de las clulas de una fruta. Por esta razn, las bebidas Light obtuvieron un menor grado Brix que el Natural ONE Classic porque los Natural ONE Light 1 y 2 tienen en su formulacin Stevia como edulcorante natural sustituto del azcar. Cuadro 8. Comparaciones en cuanto a los Brix de las diferentes frmulas del Natural ONE.

Bebida Natural ONE Classic Natural ONE Light 1 Natural ONE Light 2

Brix 9,2 3 2

Con respecto a la utilizacin de menta como saborizante en la formula 1 de la bebida Light, esta no fue aceptada. El sabor el cual fue de preferencia general fue el que contena los ingredientes del Natural ONE Classic.

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Cuadro 9. Cantidad de Potasio y Sodio presente en las diferentes formulaciones de Natural ONE.

Frmulas Classic Natural ONE Light 1 NaturalONE Light 2

K (ppm) 541 970 800

Na (ppm) 23 26 24

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6. CONCLUSIONES Se obtuvo el extracto crudo, destanificado y depurado provocando as la purificacin del producto. Adems se realiz la separacin de diferentes compuestos como las grasas y los taninos de esta manera se pudo conocer la influencia que tienen estos compuestos sobre el potencial edulcorante que esta planta posee. Adems se logr identificar 19 compuestos no polares presentes en la stevia. Para poder encontrar la solucin extractora adecuada para la produccin del edulcorante natural se prob como soluciones extractoras al agua y etanol (96%) por su diferencia en polaridad lo que ayud a brindar una capacidad de arrastre de diferentes tipos de compuestos. En el extracto puro en agua se encontr una

concentracin de compuestos polares lo cuales son taninos o compuestos polifenlicos. Adems, dentro de los compuestos polares segn Kinghorn,D. estn steviol, el stevisido y el rebaudisido-A, as como rebaudisido-C (Dulcsido B), rebaudisido-D, rebaudisido-E y dulcsido A, que son los que generan el poder edulcorante en la planta de stevia. Por otro parte, la solucin alcohlica arrastr un mayor porcentaje de compuestos no polares con lo que se puede concluir que la solucin extractora que mejor funcion es el agua caliente, ya que su sabor amargo era menor que la extraccin con alcohol. En cuanto a la eliminacin del sabor amargo se obtuvo que el mejor tratamiento fue el que se filtr con 4 gr. de carbn activado, por lo que esta es la cantidad ideal para la eliminacin del sabor amargo de la stevia.

Al comparar el poder edulcorante, mediante pruebas sensoriales realizadas, entre el extracto de stevia y azcar de mesa en la bebida Natural ONE se not una marcada diferencia en cuanto a preferencia de la bebida Natural ONE Classic. Esto se debe a que el sabor dulce del Natural ONE Light (Stevia) es diferente al que se est

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acostumbrado que es el dulce del azcar de mesa, muchos comentarios recogidos en las pruebas sensoriales dicen que el sabor es muy parecido al de las bebidas lights que utilizan aspartame. Sin embargo estn concientes que este sabor es un sabor caracterstico de las bebidas bajas en caloras, con la ventaja que este es natural, por lo tanto ms saludable. En cuanto a preferencia de las dos formulaciones del Natural ONE Light la que fue de ms agrado para la poblacin encuestada fue la segunda formulacin, la cual posee los mismos ingredientes que la formula 1 a excepcin de la menta.

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7. RECOMENDACIONES Finalizada esta investigacin, es necesario incluir algunas observaciones importantes. Estas permitirn tener datos y resultados ms claros sobre el estudio de la stevia. Por esto se recomienda: Establecer un cultivo de Stevia Rebaudiana Bertoni en la Universidad EARTh. De esta forma se podr estudiar su comportamiento, produccin y capacidad edulcorante bajo condiciones del trpico hmedo. Incluir en la investigacin la diferencia entre un producto comercial a base de stevia y azcar de mesa (sacarosa). Contratar catadores profesionales para las pruebas sensoriales, ya que as se asegura un mayor anlisis del producto en estudio. Realizar un estudio de mercado de la bebida Natural ONE Light siguiendo las recomendaciones brindadas por catadores profesionales, utilizando la formula 2 establecida en este proyecto para su produccin. De esta manera se podr medir aun ms el grado de aceptacin comercial de este producto. Para este estudio se debe realizar una produccin constante de este producto por un mes, el cual puede ser vendido en la soda de la Universidad EARTH. Estudiar el tiempo de caducidad del producto, ofreciendo calidad y seguridad al consumidor.

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8. BIBLIOGRAFIA CITADA Alimentacin Sana. 2005. La stevia (en lnea). Buenos Aires, AR, s.e. Consultado 15 jun. 2005. Disponible en http://www.alimentacionsana.com.ar/informaciones/novedades/estevia%202.htm Clnica de nutricin Von Saalfeld. 2004. Alimentos modificados y su relacin con la salud (en lnea). San Jos, CR. Consultado 13 feb. 2005. Disponible en http://www.saborysalud.com/saborysalud1.htm FDA (Food and Drug Administration, US). 2005. Dietary supplements (en lnea). US. Consultado 3 mar. 2005. Disponible en http://www.fda.gov/ora/about/enf_story/archive/2002/ch4/cfsan2.htm FDA (Food and Drug Administration, US). 2005. Automatic detention of Stevia leaves, extract of Stevia leaves, and food containing Stevia (en lnea). US. Consultado 3 mar. 2005. Disponible en http://www.fda.gov/ora/fiars/ora_import_ia4506.html Fundacin Grupo Eroski. 2005. Edulcorantes, dulces y bajos en caloras (en lnea). Barcelona, ES. Consultado 23 feb. 2005. Disponible en http://www.consumaseguridad.com/web/es/investigacion/2002/09/18/3378.php Kinghorn, D. 2002. Stevia: The genus Stevia. Londres, GB, Taylor and Francis. 211 p. Martnez, T. 2003. Composicin qumica de la stevia (en lnea). New Jersey, US. Vorras. Consultado 16 jun. 2005. Disponible en http://es.agriscape.com/foro/azucar/?read=11797 Primal Nature Products. 2005. Nuevo edulcorante 100% natural (en lnea). Pymble, AU. Consultado 13 feb. 2005. Disponible en http://www.primalnature.com/spanish/stevia.html Proyecto Chagas Space, 2003. Protocolo Proyecto Chagas Space. Gucimo, CR, Universidad EARTH. 24 p. Stevia Canada. 2004. Learning From Ancient Wisdom (en lnea). Canada, s.e. Consultado 3 mar. 2005. Disponible en http://www.steviacanada.com/ Sociedad Latinoamericana de Nefrologa e Hipertensin. 2005. Stevia peruana, lo nuevo para la diabetes, hipertensin y obesidad. (en lnea). Sao Paulo, BR. s.e. Consultado 10 jul. 2005. Disponible en http://www.slanh.org/noticias/noticias_detalhes.asp?noticia_id=49 UVA (Unin Vegetariana Argentina). 2003. Stevia (en lnea). Buenos Aires, AR. Consultado 11 jul. 2005. Disponible en http://www.uva.org.ar/stevia.html

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9. ANEXOS

Anexo 1. Extraccin con Etanol de 95% Tomar 15 gr. De material botnico seco. Agregar 90 mL de etanol de 95% y de forma dinmica obtener extracto. Filtrar usando un percolador recibiendo el filtrado en envases de vidrio. Hacer un lavado adicional con 10 ml de etanol al 95% al material botnico y de nuevo se filtra. El filtrado se evapora en rotovapor y se liofiliz hasta sequedad y se almacen a 0 C en frascos de 8 onzas. Se rotul el vial como extracto crudo. Material botnico Moler Tomar 5 g

Agregar 90 ml de etanol 95%

Filtrar Lavar con 10 ml de etanol 95% Filtrado Evaporar en rotovapor Desechar s Trasvasar a frasco de 8 oz., tarado y rotulado

EXTACTO CRUDO Anexo 1. Diagrama de extraccin: Etanol 95% Anexo 2. Extraccin con agua destilada.

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Tomar 5 gr. De material botnico seco. Agregar 90 ml de agua destilada y de forma dinmica obtener extracto. Filtrar usando un percolador recibiendo el filtrado en envases de vidrio. Hacer un lavado adicional con 10 ml de agua destilada al material botnico y de nuevo se filtra. Liofilizar el extracto hasta sequedad. El producto se rotula como extracto crudo.

Material 5 gr. botnico Moler Tomar 5 g

Agregar 90 ml de agua destilada

Filtrar

Lavar con 10 ml de agua destilada

Filtrado Liofilizar Desechar s EXTRACTO PURO EN POLVO

Anexo 2. Diagrama de extraccin: Agua destilada

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Anexo 3. Destanificacin. Disolver 5 g de extracto en 200 ml de metanol en un Elenmeyer. Agregar PVP en una proporcin PVP: extracto de 5:1. Dejar reposar por 30 min. agitando ocasionalmente el Elenmeyer. Filtrar por gravedad lentamente usando papel filtro Whatman # 40. Recoger el filtrado en un baln, evaporar en el rotovapor pero no a sequedad. Trasvasar a un vial previamente tarado, secar en la capilla o rotovapor. Determinar el peso y rotular como destanificado.

Destanificacin Disolver 5 g e extracto crudo en 200 ml de metanol en un erlenmeyer

Agregar PVP en proporcin PVP: extracto e 5:1

Reposar 30 min. Agitar Filtrar por gravedad papel Whatman # 40

Evaporar Trasvasar a vial tarado y pesado, secar DESTANIFICADO

Beaker + 100 ml metanol Bao ultrasnico 10 min. Filtrado TANINOS

Anexo 3. Diagrama de destanificacin

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Anexo 4. Desengrase y eliminacin de sales. Redisolver el extracto destanificado en la menor proporcin de una mezcla de diclorometano:metanol 1:1, realizar el ultrasonido de ser necesario. Verter el contenido en un frasco de 8 onzas que contenga 40 ml (2 g de muestra, 40 ml de resina) de resina Diaion HP-20. Emplear una pipeta y pipeteador. Dejar secar la resina en el frasco colocndolo en el rotovapor mezclndolo ocasionalmente para lograr un secado uniforme. La resina seca y se transfiere a una columna de vidrio apropiada del sistema MPLC. Aadir una cantidad igual de resina nueva y tapar la columna. Pasar 250 ml H2O para un lavado inicial. Este lavado se descarta. Posteriormente pasar 600 ml de metanol y recoger el extracto liquido de la descarga en una botella de plstico o en un beaker de vidrio. Este paso consiste en realizar un lavado de la resina y lo que se recolecte ser lo que finalmente se separar en la fase reversa. Trasvasar en un vial previamente tarado, evaporar y determinar su peso (MUESTRA depurada, desalinizada y desengrasada). Este lavado se analizar Finalmente diluir el material retenido en la resina Hp-20 con 500 ml de una mezcla de diclorometano/metanol 1:1. Este lavado se descarta

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Desengrase y eliminacin de sales Redisolver extracto destanificado en DM 1:1 usar bao ultrasnico

Agregar 40 ml de resina Diaion HP- 5 (2g/40 ml)

Secar resina en capilla mezclando ocasionalmente

Dividir resina en dos Guardar en reserva Transferir a columna MPLC

Pasar 250 agua destilada MUESTRA 1 Pasar 600 ml metanol MUESTRA 2 Concentrar Pasar 500 ml de DM 1:1

MUESTRA 3

Anexo 4. Diagrama de depurado

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Anexo 5 .Filtrado de carbn activado Realizar extracto de stevia en 400 mL de agua, 200 mL en agua caliente 99C (MUESTRA 1) y 200 mL en agua a temperatura ambiente 24C (MUESTRA 2). Dividir cada muestra en dos partes de 100 mL de extracto. (SUBMUESTRA 1 Y 2) Filtrar la submuestra 1-1 en carbn activado. EXTRACTO A. Filtrar la submuestra 2-1 en carbn activado. EXTRACTO B. Realizar pruebas sensoriales de la muestra y definir extracto menos amargo. Anexo 4. Filtrado por carbn activado.
Extracto de stevia 400 mL

Extracto en agua caliente (99C) 200 mL

Extracto en agua fra (24C) 200 mL

SUBMUESTRA 1-1

SUBMUESTRA 1-2

SUBMUESTRA 2-1

SUBMUESTR A 2-2

Filtro de carbn activa do

Filtro de carbn activa do

EXTRACTO A

EXTRACTO B

40

Anexo 6. Compuestos no polares encontrados en extracto de steviapor medio del Protocolo Chagas - Space

41

42

43

44

45

46

47

48

49

Anexo 7.Tipo de encuesta realizada en la prueba sensorial. Colocar una X en el nmero que corresponde a la muestra la cual percibe el sabor amargo. Despus de cada degustacin, favor enjuagarse la boca con agua.

Nombre

Solucin 1

Anexo 8. Resultados de las pruebas sensoriales realizadas el 16 y 19 de septiembre del 2005. Cafetera de la Universidad EARTH. # de encuestaA (5 gr) B (4 gr) C (3 gr) D (2 gr) E (1 gr) cantidad (gr) carbn activado 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 X X X X X X X X X X X X X X 4 4 5 3 5 4 1 5 3 3 3 2 4 3

50

15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 X X X X X X X X X X

X X

3 3 4 4

X X X X X X

3 3 3 2 3 3 4 4 4 4 X 2 3 3 4 X 2 5 5 5

X X

51

38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 X X X X X X X X

3 5 4

X X X X X X

3 3 1 3 2 3 4

X X X X X

3 3 3 2 2 5 5 5 4 5

X X X

3 2 3

52

61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

1 3 4 4 5 3 3 3

1 2 3 3 4 3 4 3 3

1 3 2 3 5 4

53

84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 X X X X X X X X X

X X X

3 3 3 4

3 4 X 2 3 3 3 3 4 X 2 5

X X X X

3 5 5 5 4 4

X X X

3 2 3

54

107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 X X X X X X

X X X X X

3 3 3 3 3 4 5 5 4 X 1 3 4

X X X

3 3 3 4

Anexo 9. Tipo de encuesta realizada en la prueba sensorial. Azcar- Stevia Coloque una X en el cuadro que representa la bebida que mas le agrado.

55

Anexo 10. Resultados de las pruebas sensoriales realizadas el 19 de Octubre del 2005. Cafetera EARTH.

Comparacin entre producto Natural ONE con stevia y Natural ONE Classic

nmero de encuesta 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

N.O light 1

N.O. light 2

N.O. classic X X X X X X X X X X X X

X X X X X X

56

19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

57

43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 X X X X

X X X X X X X X X

X X X X X X X X

X X X

58

67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 X

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

59

91 92 93 total 0 13

X X X 80

Anexo 11. Tipo de encuesta realizada en la prueba sensorial. Frmula 1 y 2. Coloque una X en el cuadro que representa la bebida que mas le agrado.

Anexo 12. Resultados de las pruebas sensoriales realizadas el 19 de Octubre del 2005. Cafetera EARTH.

nmero de encuesta 1 2 3 4 5 6 7 8 9

frmula 1

frmula 2 X X X X X X X X X

60

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

61

34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 X

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

X X X X

62

58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 X X X X X

X X X X X X X X X

X X X X X X X X X

63

82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 total 6

X X X X X X X X X X X X 87

64