NDICE

Pgina Presentacin Normas generales para el trabajo en el laboratorio. Procedimientos de laboratorio Materiales indispensables para cada prctica. Prctica 1. La bioseguridad en el laboratorio de microbiologa... Prctica 2. Manejo y uso del microscopio ptico compuesto Prctica 3. Tincin Gram Prctica 4. Tincin de Ziehl Neelsen.
Prctica 5.

3 5 6 7 8 10 18 25 31 36 45 53 58

Tincin de cpsula y espora.. y esterilizacin de material y medios de cultivo

Prctica 6. Preparacin

Prctica 7. Obtencin de un cultivo puro de bacterias y mohos Prctica 8. Preparacin de medios de cultivo enriquecidos... Prctica 9. Preparacin y utilizacin de medios de cultivo selectivos.. Prctica 10. Preparacin de medios de cultivo diferenciales para enterobacterias (bacilos Gram negativos).
Prctica 11. Pruebas

64 68 75 83 88 93

de diferenciacin bioqumica. en Placa de Unidades Formadoras de Colonias.

Prctica 12. Recuento Prctica 13. Efecto

de los metales pesados y detergentes... de microorganismos utilizando luz ultravioleta.

Prctica 14 .Control

Bibliografa..

PRESENTACIN

La microbiologa es la ciencia que estudia a los organismos microscpicos. Esta definicin implica que el objeto material de la microbiologa viene delimitado por el tamao de los seres que investiga, lo que supone que abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonmicos: desde partculas no celulares como los virus, viroides y priones, hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias, los protozoos y parte de las algas y de los hongos. Los microorganismos estn presentes por todas partes a nuestro alrededor y, a pesar de sus aspectos ms negativos, son absolutamente necesarios para el desarrollo de la vida en nuestro planeta. El estudio de los microorganismos comprende el conocimiento de su forma, estructura, reproduccin, fisiologa, metabolismo e identificacin. Trata de su distribucin en la naturaleza, de sus relaciones recprocas, as como los efectos benficos o perjudiciales para el hombre y los dems seres vivos, y por ltimo, de las transformaciones fsicas y qumicas que ejercen en su medio circundante. El presente manual de prcticas de Microbiologa General pretende de manera general, introducir al estudiante en el estudio de los microorganismos, en sus caractersticas morfolgicas, de cultivo y crecimiento, medidas de control
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as como del conocimiento de la metodologa y

herramientas bsicas del

trabajo de un laboratorio de microbiologa, garantizando con ello la manipulacin adecuada de los microorganismos para evitar la contaminacin del medio ambiente y personal, complementando as los temas comprendidos en las sesiones tericas. Este manual comprende 14 prcticas, que de manera gradual introducen al estudiante con los procedimientos de bioseguridad, tcnicos de tincin, observacin al microscopio de la morfologa de los diferentes tipos de microorganismos, tcnicas de aislamiento y cultivo de acuerdo a las necesidades nutricionales, deteccin de su metabolismo, cuantificacin y medidas de control. Este manual puede ser utilizado en el programa de la materia de Microbiologa General de las licenciaturas de Qumico Bilogo Clnico y Qumico en Alimentos, ofrecidas en la Universidad de Sonora.

NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

Para el Desarrollo de las Prcticas es Conveniente Tener Siempre en Cuenta las Siguientes Normas Bsicas 1. Indispensable el uso de bata (abrochada) quitarse antes de salir del laboratorio. 2. Lavarse las manos con agua y jabn al inicio y al final de cada prctica y cada vez que se sospeche el contacto con material contaminado, usar guantes, cubrebocas y adems lentes de seguridad y para el uso de luz UV. 3. Prohibido, comer, beber, fumar, almacenar alimentos, aplicarse cosmticos, cambiarse lentes de contacto. 4. Usar lentes de contacto solamente cuando no sea posible otro tipo de lentes. Trabajar con el cabello recogido cuando ste sea largo. 5. No pipetear con la boca, usar bombilla o pipeteador automtico. 6. No deben dejarse mecheros encendidos si no se est trabajando con ellos. Asimismo, debe evitarse la proximidad del mechero a sustancias inflamables, tales como alcohol, ter, entre otras. 7. Minimice la generacin de aerosoles. 8. En caso de accidente (ruptura de material contaminado, derramamiento de microorganismos) se comunicar inmediatamente al instructor o al responsable del laboratorio.
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9. Observe las medidas de seguridad establecidas en el laboratorio. 10. No se admitirn visitas personales que distraigan y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza.

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO

1. Mantener la disciplina dentro del laboratorio, hablando lo necesario sin levantar la voz, manteniendo siempre el orden y evitando cualquier escndalo. 2. Desinfectar el rea de trabajo antes y despus de trabajar, mantener ordenado y limpio su espacio. 3. Siempre deber dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, autoclave, balanza analtica, etc.) 4. Al concluir cada prctica el estudiante deber asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contaminados sean colocados en recipientes especficos para ello, colocarlos en lugares apropiados, que les indicar el profesor. 5. Por ningn motivo se podr sustraer el material y/o equipo sin la autorizacin del maestro responsable del laboratorio. 6. Abstenerse de intentar reparar equipo por iniciativa propia y/o manipular equipo del cual se desconoce su operacin.

7. Libros, mochilas, carpetas y cualquier otro material que no se utilice en la realizacin de la prctica deben ser apartados del lugar de trabajo. 8. Las siembras y resiembras debern realizarse siempre en el rea de esterilidad del mechero Bunsen (aproximadamente 15 cm). Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que crean corrientes de aire que originan contaminaciones o pueden ser causa de accidentes.

MATERIALES INDISPENSABLES PARA CADA PRCTICA

1. Bata de laboratorio limpia, manga larga y con sistema de apertura rpido. 2. Protocolo de la prctica y bitcora de laboratorio 3. Marcador indeleble, tijeras, cerillos u encendedor, masking tape, cinta adhesiva transparente. 4. Portaobjetos, cubreobjetos, asas de punta recta y punta redonda., 5. Mechero bunsen o Fisher. 6. Placas Petri desechables.

Prctica N 1

SESIN TERICA

LA BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Objetivo

Cubrir los diferentes aspectos bsicos de la Bioseguridad desde las prcticas estndar, tcnicas de desinfeccin, niveles de bioseguridad, buenas prcticas de laboratorio, el uso de equipo de proteccin personal y el manejo de residuos de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNATSSA1-2002).(http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/087ecolssa.html) (ltimo acceso 19 de junio de 2012.)

Introduccin

La bioseguridad es un concepto amplio que implica una serie de medidas orientadas a proteger al personal que trabaja en el laboratorio, a los pacientes y al medio ambiente que pueden verse afectados como resultado de las actividades en el laboratorio. Al trabajar en un laboratorio existe un riesgo, el cual implica la probabilidad de que ocurra un dao, lesin o enfermedad. En el
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contexto de los laboratorios clnicos, la evaluacin del riesgo se concentra principalmente en la prevencin de infecciones de laboratorio, cuando se trate de actividades de laboratorio que involucren material infeccioso o

potencialmente infeccioso, la determinacin del riesgo representa un ejercicio crtico y productivo. Ayuda a asignar los niveles de bioseguridad (instalaciones, equipo y prcticas) que reducen al mnimo el riesgo de exposicin del trabajador o del ambiente a un agente (OMS, 2005). Los factores de inters en la evaluacin del riesgo incluyen: La patogenicidad del agente infeccioso, la ruta de transmisin (por ejemplo, parenteral, por aire o por ingestin), la estabilidad del agente, la dosis infecciosa del agente, la concentracin (nmero de organismos infecciosos por unidad de volumen), el origen del material potencialmente infeccioso. Otro de los factores esenciales a ser considerados es la disponibilidad de una profilaxis eficaz o la intervencin teraputica (Chosewood y Wilson, 2009).

Actividad: Realizar un resumen de la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002

Prctica N 2

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO

Objetivo El alumno identificar cada una de las partes del microscopio compuesto y lo manejar correctamente, observando la presencia de microorganismos en muestras biolgicas a travs de preparaciones hmedas.

Material

Porta y cubreobjetos, 2 tubos de 13x100, guantes y cubrebocas. Reactivos: Lugol. Material biolgico: Orina o materia fecal humana, agua de estanques o yogurt

Introduccin

El microscopio es el instrumento ms frecuentemente utilizado y el ms til en un laboratorio de microbiologa, proporciona la amplificacin o agrandamiento que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista. Los microscopios permiten una amplia gama de amplificaciones, desde cien veces a cientos de miles de veces. Con el microscopio podemos observar
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forma, tamao, caractersticas tintoriales y ciertas estructuras presentes en los microrganismos (Becker, y col., 2007). Las dos categoras de microscopios disponibles son los microscopios pticos y los microscopios electrnicos. Los microscopios pticos utilizan un sistema de lentes pticos y comprenden los microscopios de campo claro,

campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases. Los microscopios electrnicos emplean flujos de electrones en lugar de ondas de luz por lo que, mientras que con el microscopio ptico ordinario o el de contraste de fases las estructuras ms pequeas que pueden observarse tienen unos 0.2 m, con el microscopio electrnico pueden verse fcilmente objetos de 0.001 m (ArenasAlatorre, 2005). El examen directo de microorganismos vivos puede tener gran utilidad para determinar relaciones de tamao, forma y movilidad. Puede ser preparacin en fresco y gota suspendida. La ventaja de esta ltima tcnica, es que la preparacin permanece hmeda y puede ser observada durante un tiempo ms largo. Ambos mtodos preservan la forma natural de los microorganismos y reducen los efectos de distorsin que suelen ocurrir cuando los especmenes se secan y fijan. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos principalmente parsitos en heces (Versalovic, 2011).

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Manejo y Uso del Microscopio ptico

1. Colocar el microscopio sobre una superficie plana, limpia y libre de objetos o material que pudiera entorpecer la labor. 2. Si es necesario mover el microscopio hscerlo con una mano en el brazo y otra debajo de la base. Acomodar el microscopio con los oculares y platina frente al observador en una posicin cmoda frente a Usted. 3. Colocar el portaobjetos con la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 4. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de uso y hacer descender la platina con el tornillo macromtrico 5. Iniciar la observacin con el objetivo de 4 aumentos (4X) o colocar el de 10 aumentos (10 X) si la preparacin es de bacterias. 6. Para realizar el enfoque: a) Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, haciendo subir la platina con el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. b) Una vez logrado el mayor acercamiento entre la preparacin y el objetivo, observar a travs de los oculares y hacer descender lentamente la

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platina con los tornillos macromtrico y micromtrico hasta lograr un enfoque del material presente en la preparacin. 7. Luego mover el revlver y colocar el siguiente objetivo de mayor aumento la imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el tornillo micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: 1) incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y 2) mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. 8. Girar el objetivo seco fuerte, fuera de la trayectoria de observacin. Adicionar una gota de aceite de inmersin sobre el rea del portaobjetos, ajuste el objetivo de inmersin (100X) en posicin y enfoque la preparacin con el tornillo micromtrico. Registrar sus observaciones. 9. Cuando haya finalizado su observacin, girar el revlver para colocarlo en el objetivo de menor aumento (posicin inicial). Nunca hacer girar el

objetivo seco fuerte (40X) sobre el aceite de inmersin. 10. Limpiar cada uno de los objetivos con papel y solucin para lentes (el exceso de aceite del portaobjetos, primero elimnelo mediante el uso de un

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trozo de papel absorbente, sin tallar y el resto con un trozo de papel especial para lentes o de un pauelo desechable). 11. Cubrir el microscopio sin desconectarlo.

Preparacin Directa o en Fresco ("entre porta y cubre")

Muestra de Orina:

1. Centrifugar aproximadamente 5 mL de orina a 2,500 rpm durante 5 minutos. 2. Desechar el lquido sobrenadante en el lavabo y proceder a mezclar el sedimento urinario. 3. Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar una gota del mezclado en el centro de un portaobjetos limpio y seco. 4. Colocar encima un cubreobjetos y observar con el objetivo dbil, secofuerte y si es necesario aplicar observaron el objetivo de una gota de aceite de inmersin y aumento (100X). Registrar sus sedimento

mayor

observaciones.

Muestra de Materia Fecal con Solucin de Lugol:

1. En un portaobjetos limpio y seco, colocar una gota de solucin de lugol.

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2. Con un aplicador de madera tomar una pequea cantidad de materia fecal y depositarla en el portaobjetos mediante movimientos de rotacin y

extendiendo la muestra por toda la gota, observar y registrar igual que con las muestras anteriores.

Observaciones

Dibuje lo observado en los diferentes objetivos para cada muestra que prepar durante la prctica.

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Cuestionario 1.- Qu es poder de resolucin?_____________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 2.- Cules son los usos del microscopio compuesto? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 3.- Cul es la importancia que tiene el diafragma en el microscopio? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 4.- Qu importancia tiene el estudiar y observar los microorganismos en muestras biolgicas?______________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 5.- Cules son los principales cuidados que se deben de tener con el uso del microscopio?_____________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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6.- Escriba el nombre de cada una de las partes del microscopio compuesto. 1. _________________________________ 2. _________________________________ 3. _________________________________ 4. _________________________________ 5. _________________________________ 6. _________________________________ 7. _________________________________ 8. _________________________________ 9. _________________________________ 10. _________________________________ 11. _________________________________ 12. _________________________________

Conclusiones ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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Prctica No. 3

TINCIN GRAM

Objetivo

Que el alumno clasifique algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la tincin Gram y que comprenda la importancia que tiene para la caracterizacin e identificacin de las bacterias.

Material Portaobjetos, asa de punta redonda y en punta recta, guantes y

cubrebocas. Reactivos: Solucin salina 0.85%, cristal violeta, alcohol etlico con acetona, lugol y safranina. Material biolgico: Escherichia coli y Staphylococcus aureus

Introduccin

Para observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias, las preparaciones fijas y teidas son las que se usan con mayor frecuencia. Las ventajas de este procedimiento son que: a) Las clulas y otros materiales presentes en la preparacin son ms
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claramente visibles despus de ser teidas. b) Las tinciones facilitan la observacin de diferencias entre clulas. Para teir los microorganismos se dispone de un gran nmero de compuestos orgnicos coloridos llamados colorantes. En general estos colorantes pueden presentar grupos alcalinos que les permite unirse a compuestos cidos presentes en la preparacin o viceversa (Koneman y col., 2008). La tincin Gram fue desarrollada en 1884 por el bacterilogo Dans Hans Christian Gram. Es uno de los procedimientos de tinciones ms utilizado porque permite dividir a las bacterias en dos grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas de acuerdo a la retencin o no del cristal violeta (Cisternas, 2007). Los resultados de la tincin son ms consistentes cuando la tcnica es utilizada en bacterias jvenes o en desarrollo (cultivos nuevos). En muchos de los casos, el informe de la tincin Gram brinda informacin relevante para la aplicacin de un mejor tratamiento mdico frente a un proceso infeccioso. Por ejemplo: las infecciones causadas por bacterias Gram positivas pueden ser tratadas con antibiticos del tipo de las penicilinas, en cambio las infecciones causadas por bacterias Gram negativas pueden requerir la aplicacin de cefalosporinas o aminoglucsidos (Koneman y col., 2008).

Preparacin de Frotis

1. Flamear el portaobjeto lavado y seco para desengrasarlo.

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2. Si el frotis se va a preparar a partir de una colonia aislada, colocar una pequea gota de solucin salina al 0.85% en el centro del portaobjeto, y con el asa bacteriolgica, tomar una pequea cantidad del centro de la

superficie de la colonia o material, emulsionar el material en la gota de solucin salina y extenderla uniformemente en una superficie aproximada de 1 cm2. 3. Si el frotis se va a preparar a partir de un cultivo lquido, tomar directamente del caldo o material con el asa de inoculacin de punta redonda estril fra y extenderlo uniformemente sobre la superficie marcada. 4. Dejar secar la extensin al aire, para evitar la formacin de aerosoles y no provocar una contaminacin ambiental. 5. Una vez seca la extensin, fijarla al calor suave, pasando rpidamente el portaobjetos sobre la flama del mechero, sin que se caliente demasiado, unas 5 veces. 6. Las extensiones deben ser finas y uniformes para permitir el paso de la luz a travs de ellas y se facilite su observacin. 7. Preparar 4 extensiones a partir de cada cultivo o muestra. 8. Realice la tincin al Gram.

Tincin Gram

1. Cubrir los frotis con una solucin de cristal violeta y dejar actuar el colorante
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durante 1 minuto (figura 1-1). 2. Lavar los 4 frotis bajo el chorro de agua con poca presin (evitando el barrido de la muestra) y separar una de las preparaciones para observar al microscopio. Cubrir con lugol los tres frotis restantes y dejarlo actuar por 1 minuto. Escurrir el lugol y lavar bajo el chorro de agua con poca presin, separar un segundo frotis (figura 1-2). 3. Decolorar con alcohol-acetona hasta que las preparaciones dejen de perder color. Para llevar a cabo esto, tomar el portaobjetos con el dedo pulgar e ndice, inclinarlo y agregar el decolorante gota a gota hasta que no salga ms colorante (esto dura aproximadamente 10 segundos)(figura 1-3) 4. Lavar nuevamente bajo el chorro de agua con poca presin o como en el paso anterior y retirar otro frotis para observacin. 5. Cubrir el ltimo frotis con safranina por 1 minuto. Lavar con agua (figura 14). 6. Secar la preparacin al aire o suavemente en papel absorbente y examinar con el objetivo seco dbil hasta el de inmersin los cuatro frotis, realizar las comparaciones pertinentes. 7. Se observarn las bacterias Gram positivas teidas en violeta obscuro y las bacterias Gram negativas en rojo o rosa.

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Cristal violeta 2

Lugol 3

Alcohol- acetona 4 Safranina

Figura 1. Procedimiento de la Tincin Gram. http://uriel-93.over-blog.com/article-32225521.html

Observaciones Realice los dibujos correspondientes a las tinciones realizadas

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Cuestionario

1.

Por qu es conveniente realizar una capa fina al momento de hacer el del microorganismo a estudiar?_____________________________

frotis

________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 2. Cul es la ventaja que ofrece la observacin con aceite de inmersin, con

respecto a la observacin con los objetivos secos?Qu diferencia existe entre ellos?__________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 3. Explique el fundamento de la coloracin Gram. _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 4. Explique cul es la utilidad de la tincin Gram

_______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 5. Escriba correctamente el gnero y especie de 3 bacterias patgenas

Gram positivas. Mencione la enfermedad que causa cada una de ellas. _______________________________________________________________ _______________________________________________________________
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_______________________________________________________________ 6. Escriba correctamente el gnero y especie de 3 bacterias patgenas Gram negativas. Mencione la enfermedad que causa cada una de ellas.

_______________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

Conclusiones ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

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Prctica No. 4

TINCIN DE ZIEHL NEELSEN

Objetivo

El alumno llevar a cabo la tincin de Ziehl -Neelsen en una muestra de expectoracin para la observacin de bacilos cido-alcohol resistentes.

Material

Portaobjetos nuevos, aplicadores de madera, papel filtro, lmpara de alcohol, guantes y cubrebocas. Reactivos: Carbol-fucsina, alcohol etlico con cido y azul de metileno. Material biolgico: Expectoracin.

Introduccin

Esta tincin es para colorear bacilos cido alcohol resistentes (BAAR) en el diagnstico de la tuberculosis y otras enfermedades producidas por bacterias cido-resistentes. Las tinciones cido alcohol resistentes como la de ZiehlNeelsen, Kinyoun y fluorocrmica, son utilizadas principalmente para teir bacterias del gnero Mycobacterium cuya pared celular compuesta por lpidos
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tipo cera impiden su coloracin en la tincin Gram. Estas tinciones se fundamentan en la aplicacin de calor a colorantes mezclados con fenol. Una vez teidos las bacterias cido-alcohol resistentes no se decoloran al tratarlas con una solucin de alcohol etlico y cido clorhdrico (Versalovic, 2011). En casos de tuberculosis pulmonar es fcil demostrar la presencia de BAAR a partir de muestras de esputo, cuando se encuentren en

concentraciones de 107 o ms bacilos por mililitro. En otros tipos de muestras, como orina y lavados gstricos, la presencia normal de micobacterias no

patgenas, entorpece la interpretacin del hallazgo de BAAR. Los bacilos se buscan en esputo debido a que la localizacin pulmonar es la forma ms frecuente de tuberculosis. Dada la importancia que requiere la obtencin de un producto que sea representativo de las vas respiratorias bajas se le deber explicar al paciente detalladamente que para su recoleccin tendr que toser y recoger flemas (no saliva) en un recipiente de boca ancha, rotularlo adecuadamente y enviarlo al laboratorio (Manual para el diagnstico bacteriolgico de la tuberculosis).

Procedimiento

1.

Preparar un frotis a partir de la muestra de esputo, con un lpiz graso se traza una lnea divisoria en el portaobjetos dividiendo su superficie en un
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tercio para el etiquetado (con un lpiz con punta de diamante anotar el nmero de muestra, nombre del paciente y procedencia) y dos tercios para el frotis.
2.

Destapar el envase de la muestra a procesar colocndolo junto al portaobjetos. Se recomienda hacerlo sobre un papel negro para facilitar la eleccin de muestra til.

3.

Tomar un aplicador de madera y partirlo en dos porciones; una de las mitades entre el pulgar y el ndice de cada mano y con los extremos irregulares de la madera se selecciona la partcula til de muestra, constituida por la parte purulenta, sanguinolenta o ms densa de la misma. Se recomienda enrollar la muestra en una de las mitades del aplicador con ayuda de la otra, para cada muestra se utiliza aplicador diferente.

4.

Colocar la muestra sobre el portaobjetos cerca de la lnea divisoria y extenderla con el aplicador, mediante movimientos circulares hasta lograr un grosor homogneo. El resto de la muestra regresarla al envase con el mismo aplicador. Los aplicadores se desechan en un recipiente que contenga una solucin de cloruro de benzalkonio.

5.

Secar al aire a temperatura ambiente, fijar al calor y cubrir la zona donde se encuentra la muestra con un pedazo de papel filtro

6.

Colocar en las varillas para iniciar su tincin, se recomienda inclinarlas un poco para evitar el contacto del colorante con el etiquetado del frotis.
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7.

Cubrir el frotis con el colorante carbol-fucsina y calentar por debajo del mismo utilizando la flama pequea de un mechero de alcohol, hasta la emisin de vapores blanquecinos visibles. Retirar la flama y cuando los vapores desaparezcan volver a aplicar calor. Esto se repite durante 3 a 5 minutos, evitar que hierva y/o seque, aadiendo ms colorante conforme ste se evapora.

8. 9.

Lavar bajo el chorro de agua con poca presin (o con piceta). Cubrir el frotis con la solucin de alcohol-cido, hasta lograr la decoloracin completa del frotis, tomando el portaobjetos por el lado del etiquetado con movimientos de vaivn, alrededor de 2 minutos, lave con agua igual que antes. Si el portaobjetos est de color rosa aplicar nuevamente alcohol cido y mantngalo durante 1 3 minutos ms y vuelva a enjuagar con agua.

10.

Cubrir con el colorante de contraste azul de metileno durante 60 segundos.

11.

Lavar con agua, secar al aire y observar con el objetivo de inmersin. Los bacilos cido resistentes retienen el color de la fucsina (color rojo) y se observan en un fondo azul.

Observacin Microscpica: Se realiza la observacin microscpica en cada campo del microscopio siguiendo las manecillas del reloj, realizando el recorrido del portaobjetos como se observa en la figura 2.

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Figura 2. Procedimiento para la observacin microscpica de un frotis para la bsqueda de bacilos cido alcohol resistentes.

Cuestionario

1.

Qu caractersticas debe tener la muestra de expectoracin para

obtener un resultado confiable?______________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 2. Todas las bacterias cido resistentes son patgenas? _______________________________________________________________ 3. La presencia de una bacteria cido resistente en esputo puede

significar la presencia de tuberculosis en el paciente? Explique. ________________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ 4. Qu componentes celulares son responsables de las caractersticas

acidorresistentes?_________________________________________________ ________________________________________________________________

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5.

Mencione dos organismos los cuales posean

propiedades cido

resistentes_______________________________________________________ ________________________________________________________________

Conclusiones ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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Prctica No. 5

TINCIONES SELECTIVAS OBSERVACIN DE CPSULAS Y ESPORAS

Objetivo

Que el alumno observe estructuras bacterianas especiales, como las endosporas y cpsulas a travs de tinciones selectivas.

Material

Portaobjetos, asa de punta redonda, mechero Bunsen, lmpara de alcohol, guantes y cubrebocas. Reactivos: Nigrosina (tinta china), safranina, verde de malaquita al 5%, Cristal violeta, lugol y alcohol etlico con acetona. Material biolgico: Klebsiella pneumoniae y Bacillus subtilis . Introduccin

La cpsula es una sustancia viscosa que rodea a las bacterias que la poseen formando una cubierta alrededor de ellas. De acuerdo a su grosor, composicin y solubilidad se puede llamar microcpsula o material limoso. La
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microcpsula es delgada compuesta por polisacridos, lpidos y protenas. Se encuentra en bacterias Gram negativas, se le reconoce tambin como endotoxina. El material limoso es similar a las cpsulas, pero es ms soluble y tiene menor integridad estructural. La funcin de la cpsula es la de proteccin y almacn de alimento, aumenta la capacidad infecciosa de bacterias patgenas (Kenneth y col., 2011). El procedimiento de tincin negativa para cpsula no tie a la bacteria pero en su lugar el colorante acta sobre el fondo para impartir un contraste. Las endosporas son estructuras celulares que poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos (Madigan y col., 2009). Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin. Se aplica un colorante primario en solucin acuosa al espcimen y se le hace vaporizar para incrementar la penetracin de los recubrimientos relativamente impermeables de las esporas que sometidas correctamente al mtodo resistirn la substitucin por el colorante de contraste y se podran observar esporas verdes dentro de clulas rojas (tcnica de Schaeffer-Fulton) (Hussey y Zayaitz, 2007).

Tincin Negativa (para observacin de cpsula)

1. Colocar una gota de tinta china en uno de los extremos de un portaobjetos

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limpio, poner junto una gota del cultivo de Klebsiella sp. Mezclar cuidadosamente con la tinta china. 2. Colocar el portaobjeto sobre la mesa para afianzar el portaobjeto. Usar un segundo portaobjeto para deslizar y distribuir la tinta china y el cultivo (figura 3). 3. Dejar secar al aire. 4. Observar bajo el objetivo de aceite de inmersin y realizar una tincin Gram para comparar entre ambas tinciones y reportar sus observaciones.

Figura

3.

Preparacin

de

frotis

para

la

observacin

de

cpsula.

http://www.educa2.madrid.org/web/ejemploclase/practicas-de-laboratorio.

Tincin de Schaeffer-Fulton (tincin de esporas) 1. Preparar frotis de los cultivos proporcionados. 2. Cubrir el frotis con verde de malaquita 5%. 3. Calentar hasta producir vapores durante 5 min.
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4. Dejar que la preparacin se enfre durante otros 5 min. 5. Enjuagar con cuidado bajo una corriente suave de agua (usar una piceta). 6. Agregar safranina 0.5% durante 1 minuto, para contrastar. 7. Lavar nuevamente con cuidado, como se hizo en el paso 5; secar con

presin leve con la ayuda de una sanita o papel absorbente o al aire y observar mediante el objetivo de inmersin.

Observaciones:

Cuestionario 1. Explique el fundamento de la tincin de endosporas y diga por qu se debe calentar la preparacin? __________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ ____________________________________________________________ 2. Hacer una lista de 3 patgenos aerobios y anaerobios que forman esporas, as como de las enfermedades que causan.
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_______________________________________________________________ _______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 3. Explique el fundamento de la tincin negativa y qu tipo de informacin se obtiene?_____________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 4. Mencione 3 ejemplos de bacterias encapsuladas y si causan alguna enfermedad.__________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________

Conclusiones ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

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Prctica No. 6

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO

Objetivo

Que el alumno se involucre en la preparacin de algunos medios de cultivo y materiales para el cultivo de microorganismos, as como en la tcnica para su esterilizacin por vapor hmedo.

Material

Matraz Erlen Meyer de 500 mL, probeta de 100 mL, mechero Bunsen, dos tubos de 13X100/con tapn de rosca, pipeta serolgica de 10 mL,

guantes y cubrebocas. Medios de cultivo: Agar Sabouraud, agar nutritivo, medio SIM y caldo BHI.

Introduccin

Para estudiar y conocer a los microorganismos, sean stos bacterias u hongos; es necesario aislarlos y cultivarlos de manera in vitro. Para lo cual se
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debe disponer de medios de cultivo que favorezcan su desarrollo, para realizar esto, es necesario que todo material que se emplee est rigurosamente

esterilizado (eliminacin completa de cualquier forma de vida) para evitar contaminaciones y por consiguiente, resultados errneos. La eleccin del mtodo depende de la naturaleza fsica del material que se va a esterilizar y del uso que se le piensa dar (Madigan y col., 2009). El mtodo ms empleado para esterilizar medios de cultivo, soluciones, cantidades medias de agua en tubos o botellas, materiales de cristalera, etc., es a travs de la esterilizacin por vapor. El vapor a presin es un agente esterilizante debido a que se alcanzan temperaturas superiores a las alcanzadas por ebullicin, adems del poder de penetracin comparado con otros mtodos, el resultado de lo anterior es la desnaturalizacin de protenas. El equipo de laboratorio diseado para esterilizar por este mtodo, se llama autoclave, consiste en una doble cmara que puede saturarse de vapor y mantenerse a una determinada presin y temperatura durante un tiempo largo. Es importante que el aire de la cmara sea reemplazado por completo por vapor saturado. Si hay aire presente, se alcanzar una temperatura inferior. Generalmente se opera a una presin de 15 lb/pulg2 (121 C). El tiempo de operacin depende de la naturaleza del material por esterilizar, del tipo de recipiente y del volumen (Madigan y col., 2009).

37

Procedimiento

Preparar: 2 placas con agar Sabouraud, 2 placas con agar nutritivo, un tubo con medio SIM y un tubo con caldo BHI, por equipo. El material de vidrio, lavar con agua y jabn, enjuagar con agua de la llave y al final con agua destilada.
1.

Es importante antes de empezar a preparar cualquier medio de cultivo, leer cuidadosamente las instrucciones del frasco contenedor del medio.

2. 3.

Pesar el medio de acuerdo a las instrucciones y a la cantidad a preparar. En el matraz Erlen Meyer, agregar una pequea cantidad conocida de agua destilada y se le adiciona el medio de cultivo pesado, se le agrega el resto de agua de acuerdo a la cantidad de medio de cultivo a realizar. (Nota: se recomienda que el matraz sea del doble de la capacidad del volumen del medio a preparar).

4.

Calentar lentamente

con agitacin continua,

hasta que el medio se

observe homogneo ( transparente, no turbio y sin grumos en las paredes del matraz ), cuidando que no se queme ni se derrame. Tapar con algodn y gasa.
5.

Los medios que van en tubo agregar al mismo, dejando el tapn flojo sin riesgo de caer, para permitir que el vapor entre.

6.

Comprobar el nivel de agua de la autoclave y asegurar que el dren se encuentre bien cerrado. Colocar en su interior el material permitiendo la
38

correcta distribucin del vapor de agua. Para ello se deben tomar las siguientes precauciones: a) Distribuir el material en forma ordenada en toda la superficie interna disponible. b) Evitar acumular el material en un rea especfica. No colocar el material uno sobre otro. c) Evitar que el material toque las paredes de la autoclave.
7.

Colocar

la

ampolleta

del

indicador

biolgico

(Bacillus

stearothermophilus) el vapor.
8.

en el lugar que se considere ms difcil que llegue

Si no se cuenta con autoclave

autmatica puede utilizarse ollas de

presin o autoclave manual, en donde se tiene que calentar con la vlvula abierta hasta que se observe una columna constante de flujo de vapor, cerrar o colocar la vlvula, dejar subir la temperatura hasta 121C (15 lb de presin) e iniciar la contabilidad del tiempo manteniendo la temperatura constante de 121C.
9.

Esterilizar por 15 minutos o de acuerdo a las instrucciones del proveedor.

10.

Cuando termine el tiempo de esterilizacin, esperar que baje la presin hasta que se indique "cero" en el manmetro, antes de abrir la autoclave.

11.

Una vez que se abra, con mucha precaucin y con ayuda de un guante de asbesto, sacar el material.
39

12.

Retirar el indicador biolgico e incubarlo bajo las condiciones que seale el fabricante. Despus del periodo de incubacin observar las

caractersticas del mismo.

13.

Dejar enfriar los tubos (cerrar bien) y el matraz a temperatura a ~45oC (hasta tolerar en el dorso de la mano), distribuirlo (aproximadamente de 15 a 20 mL) en las previamente cajas Petri estriles colocadas en la mesa alrededor de un

desinfectada con lisol, estando stas

mechero (zona estril).

14.

Para hacer esta operacin retirar el tapn del matraz, sin dejarlo en la mesa, y pasar por la flama del mechero la boca de ste, luego levantar la tapa de la caja de Petri estril, solamente lo necesario para permitir la entrada del cuello del matraz para vaciar el agar. Es necesario mover ligeramente la caja para que el medio se distribuya uniformemente.

NOTA: Las cajas no pueden ser destapadas a menos que sea entre los mecheros o dentro de la campana de flujo laminar. Las tapas no se tocan por dentro con los dedos, ni se sacan del rea de esterilidad.

15.

Solidificado el agar, cerrar las placas, etiquetar y someterlas a prueba de esterilidad.

40

Se recomienda el uso de controles biolgicos por lo menos una vez a la semana para verificar el buen funcionamiento del autoclave. En caso de que se sospeche de alguna falla se debe colocar un indicador biolgico en cada carga de esterilizacin.

Prueba de Esterilidad

1. Colocar TODAS las placas Petri con agar nutritivo a incubar a 37C por 24 hrs y las de agar Sabouraud 5 das a temperatura ambiente. 2. Al finalizar la incubacin revisar y descartar las placas contaminadas, stas se guardan en el refrigerador para su posterior esterilizacin. 3. Las placas que no estn contaminadas se etiquetan con el tipo de medio, equipo, grupo y fecha de elaboracin. Guardar en forma invertida en el empaque original, y almacenarlas en el refrigerador para utilizar en la siguiente sesin prctica.

NOTA: Llevar 1 placa de agar Sabouraud a su casa por equipo y dejarla abierta por 30 min. Despus cerrarla, colocndole cinta masking-tape (para que no se destapen y provoquen una posible contaminacin personal o ambiental) e incubar a temperatura ambiente (observar diariamente el

crecimiento sin abrirla) y traerla para la prxima prctica.

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Resultados:

Hacer la descripcin morfolgica de las colonias obtenidas en las placas Petri contaminadas. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) regular y (+++) abundante.

Cuestionario

1.

Investigue la composicin de cada uno de los medios utilizados y su

fundamento______________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

42

________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 2. Qu tipo de material se puede esterilizar por calor hmedo?

________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 3. A qu condiciones de temperatura y presin se destruyen todas las

formas vegetativas? _______________________________________________ 4. Cules son las condiciones de temperatura y presin que permiten la

destruccin de endosporas?________________________________________ 5. Por qu es necesario trabajar en una zona o rea estril y con material

estril?__________________________________________________________ ________________________________________________________________

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Conclusiones ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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Prctica No. 7

OBTENCIN DE UN CULTIVO PURO DE BACTERIAS Y MOHOS

Objetivo

Al finalizar el trabajo prctico el alumno estar capacitado para llevar a cabo las tcnicas bsicas para el aislamiento de bacterias y mohos en un cultivo puro.

Material

Asa de punta redonda, recta y en L, portaobjetos, mechero bunsen, guantes y cubrebocas. Medios de cultivo: 2 placas de agar Sabouraud (una con crecimiento previo de hongos del ambiente), 2 placas de agar nutritivo, 1 tubo de medio SIM y 1 de caldo BHI. Reactivos: Cristal violeta, lugol, alcohol etlico con acetona, safranina y azul de lactofenol.

Introduccin

En los ambientes naturales los microorganismos se encuentran usualmente en poblaciones mixtas, pero si queremos estudiarlos, caracterizarlos e identificarlos
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por los mtodos tradicionales, se requiere su aislamiento y purificacin. Un cultivo puro, aqul en el que todos los microorganismos provienen, en teora, de una sola clula. La obtencin de un cultivo puro, a partir de una poblacin mixta, se lleva a cabo en dos etapas (Willey y col, 2011): 1. La muestra debe diluirse de manera tal, que los diferentes microorganismos queden lo suficientemente separados sobre la superficie de un medio de cultivo slido, con el objetivo de obtener colonias aisladas. Este proceso se conoce precisamente como aislamiento. En esta placa tendremos diferentes tipos de colonias correspondientes a los diferentes microorganismos presentes en la poblacin original. 2. Despus de obtener colonias aisladas, se elige una de ellas y se transfiere, en el caso de bacterias y levaduras con el asa en punta a un tubo con caldo nutritivo estril y se incuba. Para mohos se transfiere directamente a un agar slido con una asa en L Se considerar que se ha obtenido un cultivo puro, cuando al volver a cultivar en un medio slido, todas las colonias obtenidas presenten las mismas caractersticas, macro y microscpicas. Otro mtodo para obtener colonias aisladas y as iniciar la obtencin de un cultivo puro, es realizando diluciones en caldo y posteriormente depositar un inculo medido sobre un medio slido o aplicando la tcnica de placa vertida. Esta forma se utiliza para la cuantificacin de microorganismos pero puede cumplir con un segundo objetivo, como lo es el de obtencin de colonias aisladas.
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Procedimiento para Aislar Bacterias: Estra cruzada

1. Esterilice el asa y tome la muestra, levante la tapadera de su caja Petri con su mano izquierda (preparada con el agar correspondiente para su utilizacin y etiquetada) lo suficientemente alto para que le permita introducir el asa de inoculacin (estril y fra) y moverla libremente con la mano derecha. Coloque el asa con la muestra cerca del borde del agar y

enseguida distribyalo con movimientos de izquierda a derecha, hasta que haya cubierto aproximadamente una cuarta parte de la placa( figura 4-1). 2. Esterilizar el asa y enfriarla despus de la primera estra, hacer las siguientes estras en forma perpendicular a las estras anteriores (figura 42). 3. Repita este mismo procedimiento hasta que haya cubierto aproximadamente 90% del rea de la superficie de la placa, lo cual se logra generalmente en la cuarta vez (figura 4-3 y 4-4). Es importante no tocar la primera estra con la ltima, ya que esto afecta el proceso de aislamiento. 4. Identifique su placa, utilizando para ello el revs de la parte que contiene al agar. 5. Incubar de 18-24 horas/35-37o C la placa en forma invertida para evitar que el agua de condensacin caiga sobre la superficie del agar y evite la formacin de colonias separadas.

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6. Observar si hubo o no aislamiento de colonias, anote las caractersticas coloniales desarrolladas, teniendo especial cuidado en considerar la informacin que considere relevante para la posterior identificacin del microorganismo. 7. Prepare un frotis para tincin Gram. 8. Inocular a partir de una de las colonias aisladas un tubo de caldo nutritivo para la obtencin del cultivo puro. Incubar de 18-24 horas/35-37oC. 9. Despus de este perodo, a partir del cultivo puro inocule una placa de agar nutritivo en estras para observar si efectivamente hubo crecimiento de un solo tipo de morfologa colonial.

2 3 4

Figura 4. Procedimiento de Estra Cruzada para el aislamiento bacterias.

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Procedimiento para Aislar Mohos del Aire

1. Recordar llevar al laboratorio las placas con hongos en agar Sabouraud de la prctica anterior. 2. Observar la presencia de colonias filamentosas de diversos tipos y colores. Tambin pueden encontrarse colonias de levaduras presentes, las cuales son similares en apariencia a las colonias bacterianas. 3. Anotar las caractersticas de las colonias seleccionadas ya que esta informacin es un criterio importante para la identificacin del moho. 4. Seleccionar una de las colonias aisladas y con el asa bacteriolgica de punta en L, inocular el agar Sabouraud , tocando la colonia y depositando unas esporas sobre la parte central de la superficie del medio. Incubar a temperatura ambiente por 5 das.

Mtodo de Montaje Hmedo para Mohos.

1. Seleccionar una colonia aislada. 2. Calentar una aguja de diseccin en forma de L y extraer un pequeo fragmento de la colonia tratando de tomarlo desde la base del agar. 3. Depositar el fragmento extrado sobre un portaobjetos en el cual, previamente, se ha depositado una gota de azul de lactofenol.

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4. Colocar un cubreobjetos y presionar directamente sobre el fragmento de colonia usando el extremo de un lpiz con borrador. 5. Observar bajo el microscopio, con el objetivo seco dbil buscando

estructuras representativas. Cambiar al objetivo seco fuerte para observar mejor las estructuras seleccionadas, procurando que stas presenten la estructura completa del hongo para facilitar su identificacin

Disposicin de Residuos Peligrosos Biolgicos Infecciosos (RPBIs)

Las cajas Petri que contengan los cultivos de bacterias colocarlas en una bolsa de plstico, pesar y anotar en bitcora. Posteriormente esterilizar a 121C por 30 min. En autoclave (olla de presin). Despus de esterilizar desechar en basura ordinaria

Observaciones:

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Conclusiones ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

Cuestionario

1. Defina cultivo axnico o puro de microorganismos? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 2. Que es un inculo?____________________________________________ ________________________________________________________________ 3. Fsicamente en un medio de cultivo de microorganismos cundo se dice que no se obtiene un cultivo puro__________________________________ _______________________________________________________________

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4.

En qu consiste el aislamiento por estras?_______________________

________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 5. Indique otros mtodos para el aislamiento de bacterias diferente al de

siembra por estra. ________________________________________________ _______________________________________________________________

6.

Mencione las caractersticas macroscpicas de las colonias

________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 7. Cules son los componentes del agar Sabouraud? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 8. Cules son los componentes del agar Sabouraud? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________

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Prctica No. 8

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO ENRIQUECIDOS

Objetivo

El alumno aprender a preparar correctamente los medios de cultivo enriquecidos como el agar sangre y agar chocolate para el cultivo y aislamiento de bacterias

Material Portaobjetos, asa de punta redonda y en punta recta, mechero Bunsen, matraz Erlen Meyer 250 mL, probeta de 100 mL, guantes y cubrebocas.

Medios de cultivo: Agar sangre. Reactivos: Cristal violeta, alcohol etlico con acetona, lugol y safranina

Introduccin

Los requerimientos nutricionales de los microorganismos son amplios y variados, por lo que es necesario conocer cual es el medio de cultivo adecuado para su crecimiento. Existen algunos microorganismos exigentes para los cules se requiere adicionar algunas substancias o suplementos a los medios
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generales, con el propsito de satisfacer sus necesidades nutricionales y de este modo recuperarlos in vitro. A estos medios se les denomina, medios enriquecidos y entre los ms utilizados est al agar sangre que lleva en su composicin 5% de sangre de cordero. Este medio, adems de permitir el crecimiento de microorganismos exigentes, puede utilizarse para observar la actividad de hemolisinas que poseen algunas bacterias y as determinar su carcter hemoltico, que en algunos casos permite la clasificacin presuntiva como por ejemplo con el gnero Streptococcus, el cual est agrupado en Streptococcus alfa, beta o no hemolticos. Otro medio utilizado frecuentemente sobre todo para patgenos obligados es el agar chocolate en el cual tambin se le adiciona sangre pero sta es desnaturalizada mediante calor (DIFCO & BBL Manual).

Preparacin de Agar Sangre y Agar Chocolate

1. Pesar las cantidades correspondientes de agar base sangre para preparar el volumen que se requiera de agar sangre y agar chocolate (se usa el mismo medio base), de acuerdo a lo recomendado por el fabricante. 2. Disolver las cantidades pesadas en el volumen correspondiente de agua destilada, utilizando los matraces Erlen Meyer ser necesario calentar por algn tiempo, agitar constantemente para que la disolucin sea uniforme. El medio estar disuelto cuando se observe transparente.
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Tapar con algodn y gasa, y esterilizar los medios de cultivo en autoclave a 15 libras de presin (121 C) por 15 minutos. 3. Una vez esterilizados, dejar enfriar a temperatura ambiente 5 minutos o en agua bajar a 80C el medio base para agar chocolate y en condiciones aspticas agregar la sangre (3-5%), homogenizar y enfriar al chorro del agua a unos 50C (hasta tolerar en la dorso de la mano), distribuirlo en las cajas Petri estriles. 4. Para el agar sangre una vez esterilizados los medios, enfriar al chorro del agua a unos 50C (hasta tolerar en el dorso de la mano) y en condiciones aspticas agregar la sangre (5%), homogenizar y distribuir en las cajas Petri estriles.

NOTA: Para hacer esta operacin se retira el tapn del matraz, sin dejarlo en la mesa y se pasa por la flama del mechero la boca de ste, luego se levanta la tapa de la placa Petri estril, solamente lo necesario para permitir la entrada del cuello del matraz para vaciar el agar. Inmediatamente se vuelve a tapar la placa Petri. Es necesario mover ligeramente la caja para que el medio se distribuya uniformemente.

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Inoculacin de Agar Sangre y Agar Chocolate

1. A partir de muestras de odo, nariz, exudado farngeo o cepa de Streptococcus, inocular en agar sangre y agar chocolate, empleando la tcnica de siembra por estra cruzada. 2. Incubar las placas de agar sangre en posicin invertida en una jarra para cultivo de anaerobios (sistema Gaspak ) e incubar a 37C por 24h. 3. Las placas de agar chocolate incubarlas a 37C por 24h en anaerobiosis. 4. Preparar un frotis de las diferentes colonias obtenidas en los cultivos, teir con la tcnica de Gram y observar al microscopio con objetivo de inmersin

Disposicin de Residuos Peligrosos Biolgicos Infecciosos (RPBIs)

Las cajas Petri que contengan los cultivos de bacterias colocarlas en una bolsa de plstico, pesar y anotar en bitcora. Posteriormente esterilizar a

121C por 30 min. En autoclave (olla de presin). Despus de esterilizar desechar en basura ordinaria

Observaciones:

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Conclusiones ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ Cuestionario

1.

Qu significa la presencia de un halo de hemlisis?

________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 2. Cul es la diferencia entre el agar sangre y agar chocolate?

____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________ 57

Prctica No. 9

PREPARACIN Y UTILIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS

Objetivo

El alumno comprender las ventajas que supone la utilizacin de medios de cultivo selectivos en la identificacin de bacterias, y describir las caractersticas de cultivo, morfolgicas y bioqumicas ms relevantes de los gneros Staphylococcus sp y Salmonella sp.

Material

Porta objetos, asa en punta recta, mechero bunsen, matraz Erlen Meyer de 250 mL, esptula, probeta de 100 mL, guantes y cubrebocas. Medios de cultivo: Agar sal manitol y agar Salmonella Shigella. Reavctivos: Cristal violeta, alcohol etlico con acetona, lugol, safranina, perxido de hidrgeno al3%.

Introduccin

Los medios selectivos se utilizan para aislar grupos especficos de bacterias. Incorporan en su composicin sustancias qumicas que inhiben el
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crecimiento de un tipo de bacterias concreto mientras permite el crecimiento de otros facilitando as su aislamiento. Como ejemplos de medios selectivos tenemos al agar sal y manitol, el cual es utilizado para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos a partir de muestras clnicas y diversos materiales. Este medio fue formulado por

Chapman para obtener el aislamiento de estafilococos, inhibiendo el crecimiento de otras bacterias al utilizar una alta concentracin de sal. Otro medio selectivo utilizado con frecuencia es el Agar Salmonella Shigella

tambin conocido como Agar SS, el cual es utilizado para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras clnicas y de alimentos donde las sales biliares y el verde brillante actan como inhibidores de bacilos Gram positivos y de la mayora de bacilos coliformes, permitiendo el crecimiento de Salmonella sp. (DIFCO & BBL Manual).

Procedimiento

1. Preparar los medios de cultivo siguiendo el procedimiento de la prctica No. 6, en caso de que ya se hayan preparado, continuar con el siguiente paso: 2. Tomar una asada del tubo conteniendo la cepa proporcionada por el maestro y/o de la muestra seleccionada (faringe, nariz, odo, queso, para el medio de sal manitol y muestra de heces, vsceras de pollo, carne molida, etc).
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3. Sembrar por estra cruzada para aislarlo, incubar por 18-24 horas entre 3537C. 4. Seleccionar la colonia tpica, leer caractersticas macro y microscpicas. 5. Realizar tincin Gram, prueba de catalasa (para diferenciar entre los gneros Staphylococcus y Streptococcus), siguiendo la metodologa descrita a continuacin:

Prueba de la Catalasa:

Se comprueba la presencia de la enzima catalasa que descompone el perxido de hidrgeno en oxgeno y agua. Por lo general los microorganismos que no poseen el sistema citocromo tampoco poseen la enzima catalasa y por lo tanto no pueden descomponer el perxido de hidrgeno. Esta prueba la da positiva Staphylococcus y negativa Streptococcus.

Procedimiento por el Mtodo de Portaobjetos:

1. Se recoge del centro de la superficie de una colonia aislada de un cultivo de 18-24 horas de desarrollo, con un asa de inoculacin y se coloca sobre un portaobjeto de vidrio limpio. 2. Sobre el microorganismo puesto en el portaobjeto se agrega una gota del reactivo perxido de hidrgeno (H2O2). No se debe invertir el procedimiento
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o mezclar con el asa el microorganismo y el perxido porque pueden producirse resultados falsos positivos si el platino es el material del asa utilizada. Con asa de nicromo no existe este problema. 3. Se observa la inmediata formacin de burbujas de oxgeno (liberacin de gas) y registrar el resultado como positivo y negativo con la ausencia de burbujas.

Disposicin de Residuos Peligrosos Biolgicos Infecciosos (RPBIs)

Las cajas Petri que contengan los cultivos de bacterias colocarlas en una bolsa de plstico, pesar y anotar en bitcora. Posteriormente esterilizar a

121C por 30 min. En autoclave (olla de presin). Despus de esterilizar desechar en basura ordinaria

Observaciones:

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Conclusiones ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

Cuestionario

1. Describa el fundamento bioqumico de la prueba catalasa. ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 2.Cul es la composicin qumica de los medios Sal manitol y SS? _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________
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_______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ ______________________________________________________________ 3 Cules son los componentes responsables de su funcin como medio selectivos del Sal Manitol y del SS?___________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________

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Prctica No. 10 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES PARA ENTEROBACTERIAS (BACILOS GRAM NEGATIVOS)

Objetivo

El alumno aprender a preparar, conocer y comprender las ventajas de la utilizacin de medios de cultivo Diferenciales en la identificacin de enterobacterias de muestras de heces y/o cepa.

Material

Portaobjetos, asa redonda y en punta mechero bunsen, matraz Erlen Meyer, 250 mL, esptula, probeta de 100 mL, guantes y cubrebocas Medios de cultivo: Agar Endo, agar Eosina y Azul de Metileno (EMB), Agar Mac Conkey. Reactivos: Cristal violeta,alcohol etlico con acetona, lugol y safranina. Material biolgico: Escherichia coli, Proteus sp. Klebsiella sp. y Salmonella sp.

Introduccin

En los medios diferenciales se

pueden distinguir tipos diferentes de

microorganismos que se encuentran generalmente relacionados ya sea

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morfolgica o bioqumicamente. Incorporan compuestos qumicos que tras la inoculacin e incubacin producen un cambio caracterstico en el aspecto del crecimiento bacteriano y/o en el medio que los rodea lo cual permite su diferenciacin. Ejemplo Agar Eosina y Azul de Metileno (EMB, por sus siglas en ingls), ENDO y Mac Conkey (DIFCO & BBL Manual).

Procedimiento

1. Preparar los medios de cultivo siguiendo el procedimiento de la prctica No. 6, en caso de que ya se hayan preparado pasar al siguiente paso: 2. Tomar una asada del tubo conteniendo la cepa de enterobacterias correspondiente a trabajar. 3. Sembrar por estra cruzada para aislarlo, incubar por 18-24 horas entre 3537C. 4. Seleccionar la colonia tpica, leer caractersticas macro y microscpicas. 5. Realizar las pruebas bioqumicas de la siguiente prctica.

Observaciones:

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Conclusiones: ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________

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Cuestionario

Complete la siguiente tabla Medio de Cultivo Indicador de pH Agente Inhibidor Nutrientes y/o Componentes

Agar EMB

Agar ENDO

Agar MacConkey

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Prctica No. 11

PRUEBAS DE DIFERENCIACIN BIOQUMICA

Objetivo

Que el alumno realice algunas pruebas bioqumicas en medios de cultivo con sustratos especiales que permitan demostrar actividades metablicas de bacterias y correlacionar su importancia en la caracterizacin e identificacin.

Material

6 tubos c/tapn de rosca 13x100mm, gradilla, asa en punta recta, mechero Bunsen, matraz Erlen Meyer 125 mL. probeta de 100 mL, esptula, guantes y cubrebocas. Medios de cultivo: Caldo RM/VP, agar citrato, SIM, urea. (caldo). Material biolgico Escherichia coli, Salmonella sp. Proteus sp., Klebsiella sp.y

Introduccin

En el laboratorio es posible conocer las caractersticas metablicas de los microorganismos (M.O.), inoculndolos en diferentes medios de cultivo, con
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sustratos que pueden utilizar como fuente de energa, fuente de carbono y de otros nutrientes esenciales para su crecimiento. La mayora de los M.O utilizan glucosa como fuente de carbono y energa. Al entrar a la clula, la glucosa es oxidada en forma incompleta (fermentacin) o completa (respiracin)

dependiendo de la presencia de oxgeno y de las capacidades enzimticas de los M.O. (Madigan y col., 2009). Se han propuesto numerosas pruebas bioqumicas en medios de cultivo con indicadores de pH, para detectar la produccin de cido o lcali, con inhibidores selectivos como bilis, cianuros, colorantes, sulfuros etc., que facilitan la determinacin de diferentes actividades metablicas como son: la capacidad de fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa), catabolizar

aminocidos y urea, la produccin de enzimas como: oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas, etc. (Mac Faddin, 2003).

Preparacin de Pruebas Bioqumicas

1. Pesar las cantidades correspondientes de cada una de los medios y preparar el volumen que se requiera. 2. Disolver en el volumen correspondiente de agua destilada, utilizando los matraces Erlen Meyer. Ser necesario calentar por algn tiempo, agitar constantemente para que la disolucin sea uniforme. El medio estar

disuelto cuando se observe transparente, no turbio y sin grumos en las

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paredes. Pasar 3 mL. si son caldos y si son agares 4 mL a cada uno de los tubos (13x 100mm), tapar (tapn flojo). Esterilizar los medios de cultivo en autoclave a 15 libras de presin (121 C) por 15 minutos. 3. Una vez esterilizados los medios, los agares ponerlos en plano inclinado y dejar enfriar para que solidifiquen en forma de pico de flauta a temperatura ambiente, despus guardar en refrigeracin hasta su uso.

Tcnicas de Inoculacin en Tubo

Se utilizarn los cultivos de Escherichia coli, Klebsiella sp., Salmonella sp., y Proteus sp. de la prctica anterior.

1. A partir de uno de los cultivos de la prctica anterior, se inocularn los 6 tubos de pruebas bioqumicas de una sola asada, iniciando con los medios slidos, siguiendo con semislidos y al final los caldos. Si dentro de los slidos se tiene citrato, inocularlo primero. 2. Los tubos de Citrato se inocularn en estra simple en la superficie y los de TSI se inocularn por estra simple en la superficie y por picadura hasta 5 mm antes del fondo del tubo. 3. El tubo con medio SIM se inocular slo con picadura. 4. Los tubos con caldo RM-VP y Urea, se inocularn agitando el asa.

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5. Incubar todos los tubos a 37C durante 24 horas (rojo de metilo y VogesProskauer 48 horas).

Disposicin de RPBIs

Las cajas Petri que contengan los cultivos de bacterias colocarlas en una bolsa de plstico (el alumno deber de traerla) y poner los tubos en gradilla o en botecitos con tapn flojo para posteriormente esterilizar a 121C x 30 min, en autoclave (olla de presin). Desechar en basura ordinaria bolsa con placas y el residuo de los tubos ponerlo en bolsa de plstico y desechar en basura ordinaria, lavar los tubos.

Observaciones: Describa que ocurre despus del desarrollo bacteriano en las pruebas bioqumicas utilizadas en la prctica.

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________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________

Conclusiones ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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Cuestionario

1. Investigar el fundamento bioqumico de cada una de las pruebas realizadas. ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ______________________________________________________________ 2. Investigar cmo se realizan las pruebas del Rojo de metilo y del VogesProskauer. ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________

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Prctica No. 12

Recuento en Placa de Unidades Formadoras de Colonias

Objetivo

Que el alumno se familiarice con el mtodo de recuento en placa de microorganismos

Material

Gradilla, 2 pipetas serolgicas de 1 mL, y una de 10 mL,mechero Bunsen, matraz Erlen Meyer de 250 mL. probeta de 100 mL. esptula, guantes y cubrebocas. Medios de cultivo: Agar Plate Count. Reactivos: Solucin salina 0.85%. Material biolgico: Orina, leche, agua y/o queso

Introduccin

Este mtodo de recuento est basado en la suposicin terica de que un microorganismo viable da lugar al desarrollo de una colonia y en que el nmero total de colonias que se desarrollan sobre un medio de cultivo slido es igual al nmero original de microorganismo viables presentes en la muestra. A fin de
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disponer de un nmero adecuado de colonias para el recuento, es necesario diluir la muestra original, inocular de forma adecuada una cantidad conocida de muestra sobre el medio de cultivo e incubar. Luego de la incubacin, se cuenta las colonias formadas. El nmero total de microorganismos viables en la muestra original es determinado multiplicando el nmero de colonias formadoras por el factor de dilucin. Presenta las ventajas de ser muy sensible, y de que permite determinar unos pocos microorganismos/mL Sin embargo, tiene la desventaja de que se necesita gran cantidad de medios y tiempo para visualizar los resultados (Madigan y col., 2009).

Procedimiento

La preparacin del medio de cultivo se realizar de acuerdo a las instrucciones del fabricante, ajustando los volmenes a la cantidad requerida para la prctica (100 mL por equipo).

Preparacin de la Muestra

1. Preparar 5 tubos con 9 mL de solucin salina isotnica o agua peptonada al 0.1% (todo estril) 2. Hacer diluciones seriadas partiendo de 1 mL de muestra para la primera dilucin 1:10.
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3. Transferir 1 mL de la primera dilucin al siguiente tubo (dil 1:100) y as sucesivamente, hasta obtener una dilucin 1:100 000 (figura 5). . 4. Una vez preparadas las diluciones, se sembrar la muestra dentro de los 15 minutos siguientes.

Inoculacin

1. Depositar 1 mL en placas estriles vacas, empezando por la menor dilucin a la mayor. a. Elegir el medio segn el tipo de microorganismo, pudiendo incluso utilizarse medios selectivos o diferenciales. 2. Agregar a cada placa 15-20 mL del medio de cultivo previamente fundido y enfriado a 45C en bao Mara. 3. CUIDADOSAMENTE agitar la placa tapada sobre la superficie de la mesa para homogenizar la muestra, con movimientos circulares (4-5 veces en cada sentido), verticales y horizontales SIN levantar la placa de la mesa (figura 5). 4. Dejar solidificar a temperatura ambiente, enseguida invertir las placas e incubar a 37C de 24 a 48 horas 5. Se observan con buena luz con el fin de visualizar las colonias puntiformes y diferenciarlas de cualquier partcula extraa que pudiera haber. 6. Realizar el conteo con un contador de colonias.
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1.0mL

Figura 5. Dilucin e inoculacin de la muestra para el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias.

Reglas para Conteo en Placa Las reglas para seleccionar las cajas para los clculos son las siguientes: 1. Se consideran representativas las cajas que tienen un nmero de colonias dentro del rango de sensibilidad del mtodo, en este caso, entre 25 y 250 Unidades Formadoras de Colonia (UFC). 2. Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes, se aplica el factor de dilucin, que es el inverso de la dilucin y se redondea el nmero a 2 cifras significativas (o dgitos) y potencias de 10. Cuando el tercer dgito del promedio es 4 o menor, se omite, dejando el nmero de 2 cifras significativas.
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Por ejemplo, si en una caja se cuentan 312 UFC, se debe reportar como 31 X 101, porque el tercer dgito es 2 y se redondea al segundo dgito. Cuando el tercer dgito es 5 o superior, el segundo dgito se redondea al siguiente, por ejemplo: si en una caja se cuantifican 199 UFC se reportar como 20 x 101 UFC, porque el tercer dgito es superior a 5. Otro ejemplo: Si el promedio es de 237.5 en la dilucin 10-3, se reportar como 24 x 104 UFC. 3. Cuando las 2 placas de una dilucin contienen un nmero de colonias caractersticas dentro del rango de sensibilidad del mtodo, se promedian los nmeros y se multiplica por el inverso de la dilucin. 4. Cuando hay una placa con crecimiento extendido, no se consideran sta ni su duplicado. 5. Cuando una de las 2 placas de una dilucin es representativa y la otra no, se consideran ambas y se promedian. 6. Cuando hay placas representativas en 2 diluciones subsecuentes, se promedian cada una con su duplicado (aunque el duplicado no lo sea), se aplica el factor de dilucin a cada una y luego se promedia nuevamente. 7. Si en las placas no hay colonias (o no son caractersticas del grupo en estudio), reportar el resultado como: menos de un (grupo) en 10-x (la ms baja utilizada), por ejemplo < 100 / g si la dilucin ms baja fue 10 -2 < 1 / mL si la muestra se sembr directamente, sin diluciones. Se agrega la leyenda: valor estimado. 8. Si no hay placas representativas pero hay alguna con un nmero menor de
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UFC, se consideran las de la menor dilucin y se agrega valor estimado. 9. Cuando el nmero de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribucin de colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del rea de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de dimetro contiene 65 cuadros de la cuadrcula del contador. Agregar la leyenda "valor estimado". 10. Se cuentan como una sola colonia: Cadenas o pequeos grupos no separadas claramente entre s, que parecen ser causadas por la desintegracin de un cmulo de bacterias y que estn separadas de otras colonias o cadenas.

Disposicin de Residuos Peligrosos Biolgicos Infecciosos ( RPBIs)

Las cajas Petri que contengan los cultivos de bacterias colocarlas en una bolsa de plstico (recordar traerla) y los tubos ponerlos en gradilla o en botecitos con tapn flojo para posteriormente esterilizar a 121C x 30 min. En autoclave (olla de presin). Desechar en basura ordinaria bolsa con placas y el residuo de los tubos tirar al lavabo y los tubos se lavan.

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Observaciones:

Conclusiones ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________

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Cuestionario

1.

Indique la importancia de utilizar el mtodo de dilucin para el

aislamiento de microorganismos.____________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 1. Comparar el mtodo de dilucin con el de estra para el aislamiento de

microorganismos._________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 3. Por qu el nmero de microorganismos es el resultado de multiplicar el nmero de colonias por el inverso de la dilucin? ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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Prctica No. 13

EFECTO DE LOS METALES PESADOS Y DETERGENTES

Objetivo

Que el alumno aplique algunas tcnicas para determinar los diversos efectos, letal, inhibidor o promotor del crecimiento, que los metales pesados o los detergentes pueden tener sobre los microorganismos

Material

Tubos de 18x150mm con tapn de rosca, hisopos estriles pinzas de diseccin, discos de papel estriles, guantes y cubrebocas. Medios de Cultivo Caldo nutritivo con Tween 80 al 1,3,5,7 y 9 %, gar nutritivo. Reactivos: AgNO3 al 1% MgSO4 al 2% Dodecil sulfato de sodio 1% HgCl2 al 1%, etanol, cloruro de benzalconio al 2%.Cepas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae

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Introduccin

Debido a la gran variedad de microorganismos (M.O.) y ambientes que habitan, no hay un mtodo ideal para eliminar, remover o inhibir a todos los M.O. de todos los sitios. Los metales pesados y los detergentes han sido usados profusamente para lograr en parte el control de los M.O. Estos productos son qumicos que ayudan a eliminar M.O. de las superficies inertes o de los tejidos vivos (Madigan y col., 2009). Dentro de los compuestos con metales pesados se encuentran

derivados de la plata, mercurio, cobre y estao. Actan combinndose con los grupos sulfihidrilos libres de las enzimas; causando inactivacin mediante una coagulacin o precipitacin, lo cual puede provocar un efecto microbicida o microbiosttico. El efecto que tienen los metales pesados a bajas

concentraciones de inhibir el crecimiento se conoce como efecto oligodinmico (Willey y col., 2011). Los catinicos detergentes actan como agentes tensoactivos y adems los alteran el potencial electronegativo de las membranas.

Los detergentes aninicos son los jabones cuya funcin principal es la de arrastre microbiano. Algunos compuestos sin embargo se incorporan a dentrficos como agentes antiplaca ya que al disminuir la tensin superficial favorecen la penetracin en el interior de la placa (ej.: lauril sulfato sdico). Los detergentes catinicos, contienen un tomo de nitrgeno cargado (un grupo
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amonio) que es hidrfilo con cuatro grupos orgnicos hidrfobos unidos al nitrgeno, desorganizan membranas. Se utilizan para limpiar heridas y en odontologa como antispticos bucales (ejemplo cloruro de benzalkonio, cloruro de bencetonio) (WHO, 2009).

Procedimiento

Efecto de los Metales Pesados y Detergentes en Solucin sobre el Crecimiento Microbiano.

1. Impregnar discos de papel filtro con los diferentes qumicos a probar. 2. Sembrar con hisopo una placa de agar nutritivo con cada una de las cepas. 3. Marcar cada caja de Petri con el nombre de la cepa y con la clave del agente qumico distribuyndolos separados y presionarlos ligeramente con la punta de las pinzas de diseccin estriles. 4. Incubar las cajas a 37C por 24 horas. 5. Medir en mm el dimetro del halo de inhibicin del crecimiento (zona transparente alrededor del disco de papel)

Determinacin del Efecto del Tween 80

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1. Colocar en una gradilla los tubos de caldo nutritivo sin y con tween 80 a las diferentes concentraciones. Escriba el nombre de las cepas que va a sembrar. 2. Inocular los tubos con una asada de la cepa 3. Incubar a 37C durante 24 horas 4. Determinar el crecimiento en los tubos por el mtodo de las 4 cruces. Poner especial cuidado en las caractersticas que presenta el tipo de crecimiento en cada tubo

Observaciones:

Conclusiones ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________

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Cuestionario

1. Todos los agentes qumicos utilizados en la prctica se disolvieron en agua. Explique por qu? _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 2. Si los agentes qumicos se hubieran disuelto en etanol. Se habran obtenido resultados diferentes? Explique su respuesta. _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ 3. La concentracin del nitrato de plata utilizada en esta prctica es ms baja que la de los otros agentes. Explique la razn. _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________ _____________________________________________________________
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Prctica No. 14

CONTROL DE MICROORGANISMOS UTILIZANDO LUZ ULTRAVIOLETA

Objetivo

Que el alumno vea el efecto de la luz ultravioleta sobre las bacterias y su aplicacin como forma de control del crecimiento bacteriano.

Material

1 Matraz Erlen Meyer de 500 mL, estriles, asa de platino, agar nutritivo y

1 Probeta de 100 mL, hisopos Lmpara de luz UV. Material

biolgico: Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

Introduccin

Algunas radiaciones electromagnticas son capaces de producir un efecto letal sobre las clulas por lo que pueden ser utilizadas como medidas de control microbiolgico. Entre otras se incluyen aquellas con una longitud de onda por debajo de 300 nm como son: la luz ultravioleta, los rayos gamma y los

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rayos X. Las radiaciones con una longitud de onda mayor no tienen suficiente energa para destruir las clulas (Madigan y col., 2009). La luz ultravioleta es capaz de producir un efecto letal cuando se irradian las clulas con un rango comprendido entre 210-300 nm. Los componentes celulares capaces de absorber la luz UV son los cidos nuclicos con el DNA como diana ms importante. Dentro de sus componentes son las pirimidinas las que absorben especialmente la luz UV, resultando como efecto a esta accin, la formacin de dmeros de timina (unin covalente de dos molculas adyacentes de timina). La formacin de estos dmeros distorsiona la configuracin de la molcula de DNA y esto interfiere con la replicacin y transcripcin del DNA durante la sntesis de las protenas. El efecto bactericida puede verse influido por: la densidad de la suspensin bacteriana, por la naturaleza del medio donde se encuentra y por el tipo y estado fisiolgico de la clula.

La radiacin UV debido a su baja penetrabilidad no puede ser usada como un medio de esterilizacin por lo que su aplicacin se limita a su uso en superficies y para la desinfeccin del aire, fundamentalmente en centros sanitarios e industrias alimentaras (Madigan y col., 2009).

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Procedimiento

1. Tomar el tubo que contiene el cultivo de 24 horas del microorganismo. 2. Inocular completamente y de modo uniforme la superficie del agar de cada una de las placas Petri usando el hisopo estril humedecido con el cultivo lquido o el asa de platino. 3. Rotular una de las placas como control. No recibir ningn tratamiento. 4. Retirar la tapa de la placa Petri durante la exposicin a la luz UV. 5. Exponer las placas restantes a la luz UV, durante 10 seg, 30 seg, 1 minuto y 2 minutos. 6. Incubar todas las placas a 37C durante 24-48 horas. 7. Anotar las variaciones que se producen en el crecimiento de los cultivos, segn el tiempo de exposicin a la fuente de luz UV. Distribucin de trabajo: Cada cuatro personas. Sembrar una placa por persona y luego se renen para ver el efecto.

Observaciones:

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Conclusiones ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________

Cuestionario

Definir los siguientes trminos: 1. Esterilizacin__________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 2. Desinfectantes_________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 3. Antispticos___________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________ 4. Bactericida____________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________
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5. Bacteriosttico_________________________________________________ ________________________________________________________________ ________________________________________________________________

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