EVALUACION DEL FRUTO DEL BANANO (Musa AAA Cavendish) DE RECHAZO DE EXPORTACION COMO SUSTRATO PARA LA PRODUCCIN DE L (+)-ACIDO

LACTICO UTILIZANDO Lactobacillus casei rhamnosus R. LOPEZ, C. VELZOUEZ, I. MORALES Centro Nacional de Ciencia y Tecnologa de Alimentos, CITA, Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Universidad de Costa Rica, San Jos, Costa Rica. Correspondencia a: carmela.velazquez@ucr.ac.cr
RESUMEN: En el estudio se valora la utilizacin del fruto de banano diluido en 3 partes de agua con sales y extracto de levadura como sustrato para la fermentacin de L(+)- cido lctico puro a partir de una cepa pura de Lactobacillus casei rhamnosus (ATCC 11443) y se comprara contra un control a partir de un sustrato de glucosa al 5%. Se utiliz un diseo experimental irrestricto aleatorio con 2 tratamientos (glucosa y banano sin hidrolizar), efectuando 10 y 4 repeticiones, respectivamente. Se hizo un anlisis de variancia usando un valor de a = 0.05 para comparar el rendimiento y la productividad de la produccin de cido lctico promedio entre tratamientos. La fermentacin con banano muestra un consumo de azcares secuencial: glucosa, fructuosa y sacarosa en ese orden y obtiene valores de rendimiento de produccin de cido lctico del 88.02%, siendo el del control de 87.75% (p<0.05). La productividad mxima del banano y del control fueron de 1.14 y 1.51 g/L h respectivamente (p<0.05). Estos resultados son indicadores del buen desempeo del banano como sustrato para las fermentaciones lcticas en relacin con los que se usan a nivel comercial en ste momento, glucosa de maz.

El aprovechamiento del rechazo bananero y de los subproductos de la explotacin comercial de fruta fresca es una preocupacin nacional. En el ao 2004 la produccin bananera fue cercana a los 98 millones de cajas de 18.14 Kg., de ste valor el 20% correspondi a banano no apto para exportacin (rechazo) [4]. La fruta de rechazo es absorbida por la industria que procesa jugos, pulpas y purs en cerca de un 50%, lo que deja un total cercano a los 177 millones de kilos de fruta que tiene potencial para ser procesado. En las ltimas dcadas, la produccin de cido lctico ha recibido mucha atencin, debido a los numerosos usos que se le dan en la industria de alimentos y en la bioqumica. El consumo de cido lctico en Estados Unidos en 1994 fue estimado entre 19.1 x 103 y 20.4 x103 toneladas [6]. La mitad de esta cantidad se import y el crecimiento se estim en 3-5% por ao. El cido lctico presenta las formas enantiomricas D(-) y L(+) pticamente activas, as como mezclas racmicas. La configuracin L(+) es la nica asimilable por humanos y animales. Para la produccin de este enantimero, se prefiere la sntesis directa del ismero puro, ya que la ruta qumica de hidrlisis del lactonitrilo produce una mezcla racmica [1]. El L(+)- cido lctico es un producto de mucha aplicacin en la industria especialmente por su capacidad de polimerizar y formar cido polilctico (PLA), un plstico biodegradable con un gran potencial comercial, que ya se est produciendo a nivel industrial a partir de glucosa de maz. El objetivo del presente estudio fue evaluar tcnicamente la fermentacin lctica para producir cido lctico utilizando el banano de rechazo de la exportacin como sustrato de la misma. El estudio utiliz banano Musa AAA, variedad Cavendish cultivar Gran naine, suministrado por la Corporacin Bananera Nacional (CORBANA). El banano grado de madurez 1 [2], se recibi en las instalaciones del CITA, se someti a un proceso de maduracin utilizando una solucin con un regulador de crecimiento fosfnico-etefn de la casa comercial Rhone Poulenc (Ethrel 48 SL). Los bananos permanecieron inmersos por 6 min y luego fueron colocados en recipientes forrados con papel peridico por un periodo de 7 das hasta alcanzar el grado de madurez 7, donde se obtiene la mayor concentracin de azcares simples corroborados por anlisis de pH y slidos solubles de la pulpa. Se confirm un pH en la pulpa entre 4.8 y 5.2 y Brix entre 22.5 y 23.5. El banano fue sometido a tratamientos de pelado manualmente, escaldado por 10 minutos con vapor a 120C directo, molienda hasta tamao trozo de 0.125 pulg, empaque en bolsas de polietileno de alta densidad y congelacin a -16 1 C hasta su utilizacin. Se descongel la pulpa en un bao con agua a temperatura ambiente y se prepar y esteriliz a 121 C por 60 min el sustrato bajo una relacin de pulpa 200g, agua destilada 789 mL, extracto de levadura 5.0 g,

MgSO4 7 H20 0.6g y MnSO4 1 H20 0.03g. Por cada litro de sustrato, se agregaron 5,0 ml de la solucin de sales esterilizado aparte con Acetato de sodio 20g, KH2PO4 10 g, K2HPO4 10 g, agua destilada 60 mL [5]. Se utiliz una solucin de glucosa como control al 5% con la adicin de todas las sales adicionadas al banano. El sustrato se ferment en un birreactor New Brunswick BIOFLO de 2 litros previamente esterilizado y se inocul con la cepa de Lactobacillus casei rhamnosus (ATCC 11443) activada a 37C en 18 h en un caldo similar al utilizado en la fermentacin. Las fermentaciones lcticas se trabajaron a 37 C, 250 rpm y pH 5,00 utilizando hidrxido de sodio 5N para el control. Se muestre la fermentacin y se determin la concentraciones de glucosa, sacarosa, cido lctico y el consumo de hidrxido de sodio en el tiempo de fermentacin. Se calcul para cada cintica el rendimiento de produccin (R = g cido lctico obtenido/ g de azcares consumidos x 100) y la productividad mxima obtenida (PM = pendiente mxima de la curva de cintica de produccin de cido lctico, expresada como g cido lctico/L h). Para el anlisis estadstico de PM y R, se utiliz un diseo experimental irrestricto aleatorio con 2 tratamientos (glucosa y banano sin hidrolizar), efectuando 10 y 4 repeticiones, respectivamente. Se hizo un anlisis de variancia usando un valor de a = 0.05 para comparar el rendimiento y la productividad de la produccin de cido lctico promedio entre tratamientos. Fermentacin del control con glucosa: Durante el proceso de fermentacin control con glucosa se pueden identificar claramente las tres fases de crecimiento bacteriano, tpico en un proceso batch (por lote). Se pudo observar un consumo de glucosa en 80 horas de fermentacin (Figura 1). El monitoreo de la concentracin de glucosa permiti determinar el momento en que la fermentacin se deba detener al obtenerse un consumo completo del ingrediente limitante de la fermentacin, la fuente de carbohidratos. A nivel industrial, el tiempo de fermentacin se debe determinar valorando la inversin en energa, el tiempo de reaccin y la productividad del cido lctico en las distintas fases de crecimiento del microorganismo. En la Figura 2 se puede observar el periodo de mxima productividad de cido lctico en la cintica control y esta ocurre entre las 10 y las 25 horas de fermentacin, obtenindose 1.51 g cido lctico/L de sustrato por h de proceso. Este valor es similar al reportado en la literatura de 1.480 y 1.92 g/l-h en [3] y [6] respectivamente, concluyendo un comportamiento similar y comparable bajo las condiciones de operacin de esta evaluacin. Con respecto al rendimiento total del proceso control, el promedio obtenido entre las rplicas fue de 87.75 % y en la literatura se reporta para un proceso similar 88 y 92% en [3] y [6] respectivamente. Sin embargo, la forma en la que s calcul este valor de rendimiento vara entre las publicaciones consultadas, [3] no considera los valores de los muestreo y [6] s los considera al igual que en este estudio.

Fermentacin del banano: El comportamiento de las cinticas correspondientes a la fermentacin de la solucin de banano enriquecida con sales muestra caractersticas diferentes a la fermentacin control en donde se observan las tres fases de crecimiento microbiano. La cantidad de azcares (sacarosa, glucosa y fructuosa) presentes en la pulpa de banano (diluido en 3 partes de agua) son equivalentes a una proporcin de 50g/L de glucosa en el proceso control. Se presentan dos fases lag y dos fases de crecimiento exponencial. Este comportamiento se debe a que el microorganismo se enfrenta a un sustrato complejo conformado por varias fuentes de carbohidratos, los azcares sencillos (fructuosa y glucosa) que el microorganismo va a utilizar de primero por ser procesos metablicos ms eficientes energticamente para l y luego los azcares complejos (sacarosa) que va a utilizar una vez agotados los anteriores (Figura 1). Se aprecia un consumo de la glucosa en las primeras 10 horas del proceso y luego el consumo de la sacarosa en el tiempo posterior.

Figura 1. Cinticas de fermentacin con sustrato control y banano, corresponden a 10 y 4 repeticiones respectivamente.

En la investigacin realizada por [3], utilizando una solucin de banano enriquecida con las mismas sales que se emplearon en este estudio y agregadas en las mismas concentraciones, las cinticas se desarrollaron por periodos de 70 horas y en estas no fue posible apreciar el inicio del consumo de sacarosa antes de las 60 horas por lo que no se pudo detectar el momento en el que esta se consuma en su totalidad. En este mismo estudio, se registr la concentracin de glucosa y la concentracin de fructosa, ambos azcares se consumieron antes que la sacarosa, pero se consumi la fructuosa primero que la glucosa. Este estudio consider la posibilidad de que el L. casei utilizado generara una batera de enzimas que le permiti degradar simultneamente ambos monosacridos pero esto no se comprob experimentalmente. La alta variabilidad del contenido de sacarosa inicial en el sustrato fue evidente ya que se obtuvo un rango de concentracin entre 10 y 20 g/L aproximadamente, esto afecta los tiempos de duracin de la fermentacin y los contenidos finales de cido lctico. Estas variaciones se pudieron deber a variaciones en la materia prima, a diferencias en el tratamiento trmico aplicado durante la produccin de la pulpa de banano o bien a diferencias en el tiempo de almacenamiento que pudieron afectar la hidrlisis de la sacarosa a glucosa y fructuosa. Industrialmente ser difcil trabajar con un sustrato tan variable y se recomienda el pretratamiento enzimtico con invertasas. En la Figura 2, es posible determinar las dos fases exponenciales del microorganismo, correspondientes al uso de azcares sencillos y complejos, glucosa-fructuosa y sacarosa, respectivamente. Estas fases coinciden con las observadas en las cinticas de consumo de azcares (Figura 1). Los valores finales de cido lctico son cercanos a los 30 g/L-h, sin considerar la rplica nmero 1 donde la concentracin de sacarosa fue inferior al resto de las rplicas (10 contra 20 g/l-h de las rplicas 2, 3 y 4). Este valor final de cido lctico es inferior al obtenido con sustratos de glucosa que iniciaron con concentraciones cercanas a 45 g/L. Los valores de rendimiento son similares a los obtenidos en las cinticas utilizado glucosa como sustrato, 87.75 y 88.02 % para las de glucosa y banano, respectivamente. Los valores en la productividad mxima promedio entre las cinticas con banano y las de glucosa, 1.14 y 1.51 g /1- h respectivamente, sin encontrar diferencia significativa entre los resultados (p<0.05). Estos resultados son indicadores del buen desempeo del banano como sustrato para las fermentaciones lcticas en relacin con los que se usan a nivel comercial en este momento, glucosa de maz.

Figura 2. Produccin de cido lctico para los tratamientos con banano y control con glucosa en el tiempo de la fermentacin. Valores de modelo con 6 rplicas.

REFERENCIAS: 1. Anuradha, R., Suresh, A.K. & Venkatesh, K.V. 1999. Simultaneous saccharification and fermentation of starch to lactic acid. Process Biochemistry 35 (1999): 367-3 75. 2. Chacn, S., Vquez, F. y Chacn, G. 1987. Escala fsico-qumica de maduracin de banano. Fruits, y. 42, n. 2. p. 95-102. 3. Chan, Y. Bonilla, A.R. Velzquez, C. 2003. Using banana to generate lactic acid through batch process fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology. Vol 63. No. 2 4. CORBANA, 2004. Costa Rica. Estadsticas de exportacin bananera 2004. Corbanacin Bananera Nacional. San Jos, 58 pp. 5. Ho, G., Pometto, A. & Hinz, P. 1997. Optimization of l-(+)-lactic acid production by ring and disc plastic composite support througt repeated-batch biofilm fermentation. Applied and Environmental Microbiology. 6. Velzquez, A., Pometto, A. Ho, K. & Demirci, A. 2001. Evaluation of plastic-composite supports in repeated fed-batch biofilm lactic acid fermentatopm by Lactobacillus casei. Applied Microbiology and Bioteclmology 55:434-441.

AGRADECIMIENTOS: Desarrollado en el Centro Nacional de Ciencia y Tecnologa de Alimentos, CITA con el apoyo financiero de la Universidad de Costa Rica, el Ministerio de Ciencia y Tecnologa, CORBANA, la Fundacin CRUSA y a la Agencia AIRE-Development.