DIVERSIDAD Y DISTRIBUCIN DE LA VARIACIN GENTICA DENTRO Y ENTRE POBLACIONES DE ZAMIA LODDIGESII MIQ.

EN LA VERTIENTE DEL GOLFO DE MXICO

TESIS QUE PRESENTA FRANCISCO LIMN SALVADOR PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS

Xalapa, Veracruz, Mxico (2012)

Aprobacin final del documento de tesis de grado:

Diversidad y distribucin de la variacin gentica dentro y entre poblaciones de Zamia loddigesii Miq. en la vertiente del Golfo de Mxico

Nombre Dr. Jorge Gonzlez Astorga

Firma

Director

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Comit Tutorial

Dr. Alejandro Espinosa de los Monteros Sols Dr. Francisco Vergara Silva

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Jurado

Dra. Carla Gutierrez Rodrguez Dr. Fernando Nicolalde Morejn

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AGRADECIMIENTOS A Dios El presente estudio fue posible gracias a la beca nmero 58618, otorgada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa para realizar mis estudios de maestra (2010-2012). A los miembros de mi comit tutorial, Dr. Alejandro Espinosa de los Monteros Sols y Dr. Francisco Vergara Silva, por su gran ayuda durante todo el proceso de la maestra, en sus correcciones y aporte de ideas a mi investigacin. A los Doctores que formaron parte de mi jurado, Dra. Carla Gutierrez Rodrguez y Dr. Fernando Nicolalde Morejn por la revisin de mi texto y sus sugerencias para enriquecer el manuscrito. A la M. en C. Janet Nolasco Soto y al Dr. Fernando Nicolalde-Morejn, por toda su ayuda en la colecta en el campo y durante el trabajo de laboratorio. A Martha Osorio por el empeo en la revisin de mi documento y las correcciones al mismo. En especial al Dr. Jorge Gonzlez-Astorga, quien desde el principio ha dirigido este proyecto de investigacin, aportando las formas y los medios para lograr la realizacin de esta tesis.

DEDICATORIA A mi esposa Faby, porque a lo largo de estos aos ha estado a mi lado en todas las fases de este proceso, aportando ideas, aguantando mis quejas, desveladas y salidas. Por preocuparse por m, de muchas formas y demostrarme as su amor en cada momento. A Zamia Sina, que an no te conocemos, pero disfrutamos tu desarrollo todos los das. A mis padres Francisco Limn y Juanita Salvador porque siempre estn al pendiente de mi. A Tatnai y a Topito. A mis amigos Ivan, Claus, Gabo, Moi, Nanche y Karina que aunque cada da los veo menos, siempre estn ah cuando ms se necesitan.

La mente inteligente adquiere sabidura, y los odos sabios van en pos de la ciencia. Proverbios 18:15

DECLARACIN
Excepto cuando es explcitamente indicado en el texto, el trabajo de investigacin contenido en esta tesis fue efectuado por Francisco Limn Salvador como estudiante de la carrera de Maestro en Ciencias entre Septiembre del 2010 y Agosto del 2012, bajo la supervisin del Dr. Jorge Gonzlez Astorga. Las investigaciones reportadas en esta tesis no han sido utilizadas anteriormente para obtener otros grados acadmicos, ni sern utilizadas para tales fines en el futuro. Candidato: Director de tesis: Bil. Francisco Limn Salvador Dr. Jorge Gonzlez Astorga _____________________ _____________________

NDICE RESUMEN.. 09 INTRODUCCIN.... 10 CAPTULO 1: MARCO TERICO.... 1.1 Zamia loddigesii Miq. .... 1.1.2 Distribucin y Hbitat..... 1.1.3 Descripcin botnica.... 1.2 Marcadores moleculares....... 1.2.1 ISSR (Inter Simple Sequence Repeats)..... 1.3 PREGUNTAS DE INVESTIGACIN........ 1.4 HIPTESIS ....... 1.5 OBJETIVOS....... 1.5.1 Objetivo general...... 1.5.2 Objetivos especficos....... CAPTULO 2: MATERIALES Y MTODOS......... 2.1 Fase de Campo...... 2.1.1 Colecta de material vegetal.......... 2.2 Fase de Laboratorio.... 2.2.1 Extraccin y Purificacin de DNA.... 2.2.2 Amplificacin de fragmentos de DNA mediante primers ISSR... 2.2.3 Visualizacin de productos amplificados...... 2.2.4 Registro de datos.... 2.3 Anlisis de datos... 2.3.1 Especificaciones metodolgicas... 2.3.2 Caracterizacin y lectura de los primers ISSR.. 2.3.3 Composicin gentica de las poblaciones.. 2.3.4 Estructura gentica.... 2.3.5 Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA)........ 2.3.6 Distancias genticas........ 2.3.7 Anlisis de agrupamiento... 2.3.7.1 UPGMA.......... 2.3.7.2 Neighbor-Joining (NJ)....... 2.3.7.3 Anlisis de Coordenadas Principales (PCoA)... 2.3.8 Anlisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA)...... 2.3.9 Prueba de Mantel........ CAPTULO 3: RESULTADOS........ 3.1 Amplificacin de fragmentos de DNA mediante primers ISSR... 3.2 Registro de datos...... 3.3 Caractersticas y atributos de los primers ISSR..... 3.4 Composicin gentica de las poblaciones.... 13 13 14 15 15 16 19 20 21 21 21 22 22 23 23 23 23 24 24 25 25 26 26 27 30 30 31 31 31 32 32 33 34 34 35 35 37 5

3.5 Estructura gentica...... 3.6 Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA)... 3.7 Distancias genticas..... 3.8 Anlisis de agrupamiento..... 3.8.1 UPGMA....... 3.8.2 Neighbor-Joining (NJ).... 3.8.3 Anlisis de Coordenadas Principales (PCoA)........ 3.9 Anlisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA). 3.10 Prueba de Mantel...... CAPTULO 4: DISCUSIN....... 4.1 Caractersticas y atributos de los primers ISSR..... 4.2 Composicin gentica de las poblaciones.... 4.3 Estructura gentica..... 4.4 Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA). 4.5 Distancias genticas....... 4.6 Anlisis de agrupamiento...... 4.6.1 UPGMA.... 4.6.2 Neighbor-Joining (NJ).... 4.6.3 Anlisis de Coordenadas Principales (PCoA).... 4.7 Anlisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA)...... 4.8 Prueba de Mantel........ 4.9 Implicaciones para la conservacin. 4.10 Conclusiones......

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LITERATURA CITADA........ 69

LISTA DE CUADROS Cuadro 2.1 Diferentes configuraciones usadas en la optimizacin del modelo. 29 Cuadro 3.1 Lista de primers utilizados en el anlisis ISSR, temperatura de alineamiento, nmero de bandas y sus respectivas secuencias... 34 Cuadro 3.2 Concentraciones finales de los reactivos... 34 Cuadro 3.3 Condiciones de tiempo y temperatura de cada fase del PCR.. 34 Cuadro 3.4 Caractersticas de las bandas dentro de las cinco poblaciones de Zamia loddigesii estudiadas en esta tesis 36 Cuadro 3.5 Resumen de la variacin gentica en Zamia loddigesii... 37 Cuadro 3.6 Estimador de la diferenciacin gentica promedio (FST) entre las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en Mxico....... 38 Cuadro 3.7 ndices para los cuatro modelos de Hickory (Holsinger y Lewis, 2003)... 39 Cuadro 3.8 Resumen de la diversidad gentica de Zamia loddigesii, de acuerdo a los anlisis bayesianos.............. 40 Cuadro 3.9 Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) para las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en Mxico.. 40 Cuadro 3.10 Estimadores de Distancia e Identidad gentica de Nei entre pares de poblaciones en Zamia loddigesii...... 41 Cuadro 3.11 PCoA basado en distancias genticas, porcentaje de variacin explicado en los primeros tres ejes.... 43 Cuadro 3.12 Resumen del Anlisis Espacial de Varianza Molecular.. 44 Cuadro 3.13 Combinaciones usadas en la prueba de Mantel. 45 Cuadro 4.1 Nmero de bandas entre especies de ccadas 49 Cuadro 4.2 Comparacin entre dos marcadores moleculares en las mimas poblaciones de Zamia loddigesii.. 53 Cuadro 4.3 Comparacin de ndices bajo dos enfoques. 55 Cuadro 4.4 Resumen de diferentes estudios usando marcadores moleculares.. 58

LISTA DE FIGURAS Figura 1.1 Zamia loddigesii. Tomado de Vovides et al. (1983). Figura 2.1 Ubicacin de las poblaciones colectadas de Zamia loddigesii..... Figura 2.2 Realce digital sobre las bandas amplificadas en varios primers de ISSR, en varios individuos de Zamia loddigesii... Figura 3.1 Electroforesis del Primer 835 de la poblacin de Zamia loddigesii en Oaxaca, Mxico, indicando su codificacin.... Figura 3.2 Distribucin de los atributos de las bandas entre las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en Mxico... Figura 3.3 Distribucin de los ndices de diversidad en las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en Mxico... Figura 3.4 Dendrograma usando la distancia sin sesgo de Nei (1978).. Figura 3.5 Dendrograma de Zamia loddigesii, obtenido con el mtodo de Neighbor-Joining.. Figura 3.6 Distribucin en dos dimensiones de los 91 individuos de Zamia loddigesii mediante el anlisis de coordenadas principales. Figura 3.7 Agrupacin de las poblaciones de acuerdo al SAMOVA. Figura 4.1 Tendencia en las publicaciones con ISSR vs Aloenzimas... Figura 4.2 Reconstruccin de escenarios..

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Diversidad y distribucin de la variacin gentica dentro y entre poblaciones de Zamia loddigesii Miq. en la vertiente del Golfo de Mxico
RESUMEN En Mxico se han realizado estudios sobre gentica de poblaciones en ccadas, stos han aportado informacin acerca de la diversidad y la estructura gentica en los tres gneros que se distribuyen en nuetsro pas (i. e., Zamia, Ceratozamia y Dioon), los cuales han revelado que las ccadas mexicanas poseen valores relativamente altos de diversidad gentica comparadas con ccadas de otras regiones y especies vegetales con caractersticas de vida similares. Estos estudios se han realizado bsicamente con marcadores aloenzimticos, los cuales a pesar de aportar informacin muy valiosa, han venido a ser reemplazados por marcadores moleculares de DNA. En el presente trabajo se usaron once marcadores ISSR para estudiar la composicin gentica dentro y entre cinco poblaciones de Zamia loddigesii abarcando su distribucin natural, en la vertiente del Golfo de Mxico. Se obtuvieron 472 bandas, en algunos casos disminuy su nmero gradualemente desde el norte al sur de la distribucin de la especie. A nivel de especie, el porcentaje de polimorfismo fue del 97.28%, el nmero de alelos fue 1.97 y el ndice de Shannon fue 0.38. Siguiendo aproximaciones convencionales y mtodos bayesianos, se detect una estructura poblacional de entre 40 y 56% (FST, GST, y ST), el flujo gnico estimado fue de 0.36. Los anlisis de agrupamiento diferenciaron escasamente a las poblaciones y la prueba de Mantel no fue significativa. Comparaciones con un estudio previo con aloenzimas, muestra valores superiores y un grado mayor de diferenciacin entre poblaciones a lo reportado. Finalmente se propone un escenario histrico basado en la informacin obtenida y se proponen planes de conservacin para preservar la diversidad gentica de esta especie amenazada. Palabras clave: Ccadas, Diversidad y Estructura Gentica, ISSR, Mxico, Zamia loddigesii

INTRODUCCIN El orden Cycadales es un grupo de plantas con semilla que est dentro de las gimnospermas, es un linaje monofiltico que surgi hace ca. 300 millones de aos, entre el Carbonfero y el Prmico temprano (Jones, 1993; Norstog y Nicholls, 1997). Aunque es importante sealar que las ccadas contemporneas (ca. 331 especies, Stevenson et al., 2012) se originaron de procesos de especiacin ocurridos a finales del Mioceno Plioceno (i.e., ca. 12 millones de aos) (Nagalingum et al., 2011), en este sentido su caracterizacin como fsiles vivientes queda en entredicho (Vergara-Silva et al., 2012). Con respecto a su conservacin, son junto con las cactceas y las orqudeas, entre otras, uno de los grupos de plantas ms amenazados del planeta, ya que el 62% de sus especies vlidas, se encuentran amenazadas de extincin (Hoffman et al., 2010; Da Silva et al., 2012). En Mxico se encuentra la mitad de todas las especies de ccadas del continente y ocupa el segundo lugar en diversidad a nivel mundial, con alrededor de 53 especies, seguido de Australia (ca. 80 especies) (Nicolalde-Morejn et al., 2011; Stevenson et al., 2012). Nuestro pas, adems de ser muy diverso en este grupo, posee un gran porcentaje de endemismos (ca. 90%), por lo que es considerado un importante centro de diversidad del Neotrpico (Vergara-Silva et al., 2012). El gnero Zamia tiene ca. 71 especies (Stevenson et al., 2012), habita nicamente en el continente americano, desde Georgia y Florida en Estados Unidos hasta Bolivia y el suroeste de Brasil (Norstog y Nicholls, 1997; Stevenson, 2001; Nicolalde-Morejn et al., 2009). Mxico cuenta con 15 especies de este gnero (Nicolalde-Morejn et al., 2009).

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Zamia loddigesii Miq. es una especie endmica a Mxico, con una amplia distribucin, presente en los estados de Tamaulipas, Hidalgo, Veracruz, Puebla, Oaxaca, Chiapas y Tabasco. La especie se ha adaptado a diversos tipos de hbitat desde ambientes conservados (Bosque Mesfilo de Montaa) hasta pastizales y lugares ampliamente perturbados, por lo que sus poblaciones se han visto afectadas y reducidas en tamao (Nicolalde-Morejn et al., 2009). De acuerdo con la Lista Roja de Especies Amenazadas (Chemnick y Gregory, 2010a), Zamia loddigesii est en la categora NT (casi amenazada), por lo que a nivel nacional se ha establecido legalmente su proteccin, as como a nivel internacional. Sin embargo, a pesar de ello, es muy colectada por su uso como planta de ornato, destinada principalmente a mercados nacionales e internacionales de coleccionistas. Con el surgimiento de tcnicas moleculares de DNA, una serie de marcadores han surgido y se han aplicado en la caracterizacin de la variabilidad gentica en especies de plantas. En particular, los marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeats por sus siglas en ingls) han destacado por ser tiles en la identificacin de variacin gentica entre y dentro de poblaciones, por lo que han sido aplicados en estudios de gentica de poblaciones (Hartl y Clark, 1997), lo cual permite conocer la diversidad y la estructura gentica de las especies, as como estimar las tasas de entrecruzamiento, la endogamia, el flujo gnico, la seleccin natural y la deriva gnica (Lewontin, 1974) y a partir de esta informacin, inferir cmo los procesos evolutivos han modulado la dinmica de los genes al seno de las poblaciones. Debido a que Zamia loddigesii es una especie endmica con tamaos poblacionales relativamente bajos y a los factores de riesgo a los que est sometida son extremos, es importante disponer de informacin detallada de su diversidad, variacin gentica y estructura

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gentica, ya que de esta manera se puede obtener informacin valiosa para proponer programas de conservacin y manejo sustentable (Yu et al., 2011). Por lo que los objetivos del presente estudio son: a) evaluar la diversidad gentica en las poblaciones de Zamia loddigesii a lo largo de su distribucin natural, utilizando como herramienta marcadores ISSR; b) conocer la distribucin de la variacin gentica dentro y entre las poblaciones; c) estimar la correlacin entre la diferenciacin gentica y la distancia geogrfica entre poblaciones; d) calcular el flujo gnico entre poblaciones; e) con base en los resultados obtenidos, diagnosticar los factores que estn determinando la forma en cmo se distribuye la variacin dentro y entre las poblaciones de la especie; finalmente f) proponer medidas de proteccin apropiadas a la especie, en base en los resultados obtenidos en esta tesis.

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CAPTULO 1: MARCO TERICO Dentro del orden Cycadales, la Familia Zamiaceae est compuesta por ocho gneros (Chigua D.W. Stev., Dioon Lindl., Encephalartos Lehm., Lepidozamia Regel, Macrozamia Miq., Ceratozamia Brongn, Microcycas A. DC. y Zamia L.) cuya distribucin se da en las regiones tropicales y subtropicales del planeta, i. e., frica, Australia, Amrica y Las Antillas (Stevenson, 1992). Zamia es uno de los gneros ms diversos desde diferentes contextos, es el segundo gnero ms numeroso con 71 especies, despus de Cycas (107) (Stevenson et al., 2012), se distribuye a lo largo de toda la regin tropical y subtropical del continente americano (NicolaldeMorejn et al., 2011). De igual manera, Zamia es uno de los gneros ms complejos debido a su diversidad en patrones de variacin morfolgica, ecolgica, citolgica y gentica (Vovides et al., 1983; Vovides y Olivares 1996; Marchant, 1968; Moretti y Sabato, 1984; Moretti, 1990a b; Moretti et al., 1991; Norstog y Nicholls, 1997; Nicolalde-Morejn, 2009; Nicolalde-Morejn et al., 2009; GonzlezAstorga et al., 2006; Limn-Salvador, 2009). 1.1 Zamia loddigesii Miq. Recibe su nombre en honor a Joachim Conrad Loddiges (1738-1826), proveedor de plantas exticas con sede en Londres, destacado monografista y sistematizador de las ccadas del siglo XVIII, que mantena una estrecha comunicacin con Friedrich Anton Wilhelm Miquel (Haynes, 2009) quien la describi en 1843 (Aiton, 1789) (ver Figura 1.1). Coloquialmente se le conoce con los nombres de Teocinte, Teocintle, Teosinte, Camotillo, Cocalito, Palmiche, Palmilla, Cihua, Chacuhua (Bonta y Osborne, 2007) y Tzompollo (Contreras-Medina et al., 2003).

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Zamia loddigesii es una de las especies ms colectadas dentro del gnero, junto con Zamia furfuracea (Chemnick y Gregory, 2010b) es apreciada por coleccionistas por su facilidad de manejo, crecimiento lento, as como a su resistencia a variaciones de temperatura y plagas. 1.1.2 Distribucin y Hbitat Es endmica a Mxico, se distribuye en los estados de Tamaulipas, Hidalgo, Veracruz, Tabasco, parte de Oaxaca y con slo una localidad conocida en Chiapas (NicolaldeMorejn et al., 2009). Al ser de amplia distribucin, los tipos de vegetacin donde crece son variados, incluyen bosque tropical lluvioso, bosque tropical deciduo y sub-decduo (sensu Rzedowski, 1978), asimismo en hbitats de sucesin secundaria como pastizales y cultivares (Nicolalde-Morejn et al., 2009) y conservados como el bosque
Figura 1.1 Zamia loddigesii. Tomado de Vovides et al., (1983)

mesfilo de montaa (Contreras-Medina et al., 2003). Comparte su distribucin con otras seis especies (i. e., Zamia cremnophila, Z. katzeriana, Z. lacandona, Z. purpurea, Z. polymorpha y Z. spartea) y se encuentra en altitudes que van desde el nivel del mar hasta los 1000 m s.n.m. (Nicolalde-Morejn, 2009).

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1.1.3 Descripcin botnica Es una planta con un tallo hipgeo, de ramificacin dicotmica con la edad, de 10-45cm longitud, 8-15cm de dimetro, catfilas cartceas, persistentes, de base triangular, de 8.4-3.7cm a la base, amarillento tomentoso. Hojas 2-3 (4) ascendiendo a separarse, de 45-96 x 30-41cm, verde claro cuando emergen, verde a verde oscuro cuando maduras, peciolo de 15-25cm longitud, verde en hojas jvenes, subterete, armado con espinas de hasta 4mm de longitud, raquis subterete de hasta 57cm de longitud, foliolos 12-23 pares, ssiles, coriceos, linearlanceolados, de opuestos a subopuestos, base atenuada, mrgenes serrulados (NicolaldeMorejn et al., 2009). Su nmero cromosmico diploide es 18 (Norstog, 1980; Moretti, 1990b). Aunque todas las ccadas se encuentran protegidas por convenios internacionales y nacionales (INE-SEMARNAP, 2000; Donaldson, 2003; IUNC, 2012; UNEP-WCMC, 2012), en la prctica existe poco o nulo cuidado en el manejo y proteccin de Zamia loddigesii, por lo que sus poblaciones son muy vulnerables a cambios de uso de suelo, extracciones ilegales y reduccin de su hbitat (Vzquez-Torres et al., 1999; Gonzlez-Astorga et al., 2006; Osborne y Vovides, 2007; Chemnick y Gregory, 2010a). Por lo anterior es de suma importancia conocer la distribucin de la variacin gentica dentro y entre las poblaciones de Zamia loddigesii para poder entender y explicar patrones evolutivos as como para plantear con ello acciones de conservacin (Vovides et al., 2002). 1.2 Marcadores moleculares El advenimiento de tcnicas moleculares mostr claramente sus ventajas sobre los marcadores morfobioqumicos en el anlisis de la diversidad gentica de las poblaciones. Debido a que los marcadores moleculares son estables e independientes del entorno (temporal y espacialmente),

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han venido a reemplazar a los caracteres fenotpicos para detectar variacin gentica, no solo entre poblaciones, sino tambin entre individuos dentro de poblaciones (Azofeifa-Delgado, 2006). Adems, permiten seleccionar regiones concretas del DNA, para ello el nmero de polimorfismos detectables es tericamente ilimitado y permiten analizar tanto la informacin que se expresa fenotpicamente como la que no es expresada (Jimnez y Collada, 2000). Bajo este principio, se han desarrollado muchas tcnicas moleculares, el primer marcador que se aplic a plantas fueron los Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) (Beckman y Soller, 1983) y desde entonces el desarrollo de marcadores basados en PCR aplicados a plantas ha crecido, entre ellos estn los Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) (Williams et al., 1990); los Microsatlites (SSR) (Ali et al., 1986), los Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) (Vos et al., 1995) y los Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) (Zietkiewicz et al., 1994), principalmente. Cada uno de estos marcadores moleculares tiene ventajas y desventajas para un estudio determinado, as la seleccin de la mejor tcnica a utilizarse depende de los objetivos planteados, del material que se analizar y del tipo de datos y resultados esperados. 1.2.1 ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) Los ISSR (Inter Secuencias Simples Repetidas) son un tipo de marcadores genticos, que permiten obtener la variacin en regiones de DNA entre los microsatlites que se encuentran dispersas en todo el genoma, particularmente en el ncleo (Zietkiewicz et al., 1994). Los microsatlites son secuencias de DNA pequeas (generalmente de 16 a 25 pares de bases) e hipervariables, se expresan como disimilitudes en las poblaciones y se caracterizan por ser repeticiones de mono, di, o trinucletidos (Wolfe et al., 1998). Los ISSR son marcadores

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dominantes que se encuentran entre regiones de microsatelites, los primers diseados para obtener estos marcadores son los propios microsatlites (secuencias simples repetidas de di o trinucletidos) anclados a la terminacin 3 o 5 del microsatlite con uno a tres nucletidos (Zietkiewicz et al., 1994; Grupta et al., 1994; Wolfe y Liston, 1998). El principio de los ISSR es que los sitios complementarios del primer estn dispersos en todo el genoma, as, hay altas probabilidades de que el primer se una a dos sitios localizados en hebras opuestas de DNA dentro de una distancia amplificable (Zietkiewicz et al., 1994; Culley y Wolfe, 2001). El primer es complementario a una regin microsatlite blanco y el nucletido extra permite que ocurra la amplificacin, siempre y cuando el primer se pegue a la terminacin del microsatlite con un primer del nucletido disponible en la secuencia flanqueadora. Los nucletidos extras juegan el papel de anclas y aseguran que la amplificacin inicie siempre del extremo 3 o 5 del microsatlite. As, el primer localiza dos regiones microsatlite separadas por una secuencia genmica amplificable del DNA blanco, por lo que la reaccin de PCR generar una banda de tamao particular (i.e., su peso molecular en pares de bases) para ese locus, representando la secuencia de DNA que se encuentra entre los microsatlites, i.e. el ISSR (Bornet y Branchard, 2001). Con frecuencia estas amplificaciones de un solo primer propicia altos niveles de bandas polimrficas (Wolfe y Liston, 1998; Culley y Wolfe, 2001), para ello las bandas obtenidas son analizadas como marcadores dominantes, lo cual significa que cada banda corresponde a un locus (Wolfe, 2005). As, la presencia de la banda representa el genotipo dominante (tanto homcigo, como hetercigo), mientras que su ausencia representa el genotipo homcigo recesivo. Esto es vlido si se asume que solamente existen dos alelos por locus.

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Los ISSR son usados en estudios de variabilidad gentica en poblaciones naturales debido a que no se requiere informacin previa del genoma, su implementacin tiene bajo costo y los procedimientos de laboratorio son fcilmente transferibles a cualquier especie, as como su alta reproducibilidad, debido principalmente a las altas temperaturas de alineacin de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Zietkiewicz et al., 1994; Wolfe et al., 1998; Wang, 2010). Adems, para disear los primers no es necesario tener la informacin a priori de secuencias del genoma de las poblaciones bajo estudio (Godwin et al., 1997), por lo que se ha utilizado ampliamente en investigaciones de variacin gentica entre grupos de individuos filogenticamente cercanos (Bornet y Branchard, 2001), as como en la identificacin de variedades dentro de especies (Nagaoka y Ogihara, 1997; Wolfe et al., 1998). Las investigaciones que abordan el estudio de la diversidad y la estructura gentica en ccadas utilizando marcadores enzimticos han mostrado que aunque son, en general especies con distribucin restringida, su diversidad gentica en promedio es mayor a lo esperado en otras especies con las mismas caractersticas biolgicas (Hamrick y Godt, 1996; Dioon edule: Gonzlez-Astorga et al., 2003; Dioon angustifolium: Gonzlez-Astorga et al., 2005; Zamia loddigesii: Gonzlez-Astorga et al., 2006; Dioon sonorense, D. tomasellii y D. holmgrenii: Gonzlez-Astorga et al., 2008; Dioon caputoi y D. merolae: Cabrera-Toledo et al., 2010). Respecto a marcadores moleculares de DNA, existen pocos estudios realizados en ccadas, los que se han realizado han sido en ccadas del continente asitico y recientemente en frica; sin embargo, hasta el momento no existen trabajos publicados que aborden el estudio de la diversidad y estructura gentica que utilicen marcadores moleculares de DNA en especies de ccadas en Mxico, por lo que el presente trabajo tambin proveer informacin novedosa a

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nivel de DNA para el gnero de Zamia y los resultados, discusin y conclusiones surgidas de esta investigacin incrementarn nuestro conocimiento sobre la biologa evolutiva de la ccadas. 1.3 PREGUNTAS DE INVESTIGACIN Zamia loddigesii, es una de las especies de ms amplia distribucin en Mxico, pero tambin es una especie que se han reducido sus poblaciones naturales, lo cual ha influido en una disminucin de su diversidad gentica y un incremento en la diferenciacin gentica entre las poblaciones remanentes, generndose un fuerte aislamiento gentico entre sus poblaciones (Gonzlez-Astorga et al., 2006); con base en lo anterior, en este trabajo de tesis, nos preguntamos: cul ser la manera en qu los marcadores de DNA ISSR detectarn este efecto?, esto con relacin a lo detectado con otro tipo de marcador molecular como lo son las isoenzimas, esto a nivel de la diversidad y la estructura gentica de las poblaciones remanentes de Zamia loddigesii en estado natural. De igual forma se ha probado que usando isoenzimas Zamia loddigesii posee valores relativamente altos de diversidad gentica, otros estudios utilizando marcadores de DNA, han revelado mayores niveles de polimorfismo que los registrados con marcadores de isoenzimas, entonces la pregunta es si, obtendremos ndices de diversidad superiores a los ya reportados para la misma especie?

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1.4 HIPTESIS Se espera que los niveles de diversidad gentica en Zamia loddigesii detectados con ISSR sean superiores a los reportados con isoenzimas (Gonzlez-Astorga et al., 2006), debido a que los marcadores de DNA tienden a ser ms neutros que las enzimas, ya que estas ltimas estn ms expuestas a la accin de la seleccin natural. Se espera que la estructura gentica en las poblaciones de Zamia loddigesii evaluada con ISSR sea mayor que lo reportado con isoenzimas, como se ha detectado en Cycas guizhouensis (Xiao et al., 2004), debido a que con los marcadores moleculares de DNA se est evaluando variacin gentica que ha estado expuesta durante mayor tiempo al efecto de la mutacin, a la reordenacin del genoma, a la fluctuacin aleatoria de las frecuencias allicas (i.e., deriva gnica), principalmente, en tanto que los marcadores isoenzimticos son ms conservados, ya que debido a su alto efecto funcional, puede purgar las mutaciones que cambien el efecto funcional de la enzima respecto al sustrato. Por lo anterior, cabra esperar que la diferenciacin gentica (F ST o GST) sea mayor evaluada con ISSR que con isoenzimas.

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1.5 OBJETIVOS 1.5.1 Objetivo general Evaluar la diversidad y distribucin de la variacin gentica dentro y entre poblaciones de Zamia loddigesii a lo largo de su rango de distribucin natural utilizando para ello marcadores ISSR. 1.5.2 Objetivos especficos Obtener el porcentaje de loci polimrficos (P), el nmero promedio de alelos por locus (A), la diversidad gentica de Nei (HE) y el ndice de diversidad de Shannon (I). Evaluar la distribucin de la variacin gentica entre y dentro de las poblaciones, utilizando los estimadores: FST o GST y anlisis molecular de varianza (AMOVA). Calcular las distancias genticas entre las poblaciones. Determinar el flujo gnico entre las poblaciones. Estimar la correlacin entre la diferenciacin gentica y la distancia geogrfica entre las poblaciones. Realizar anlisis de agrupamiento para determinar las relaciones entre las poblaciones estudiadas. Analizar la correlacin entre la distribucin gentica y la espacial, mediante un SAMOVA Diagnosticar los factores que influyen en la estructura gentica de la especie. Proveer medidas de proteccin apropiadas a la especie, en base a su informacin gentica.

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CAPTULO 2: MATERIALES Y MTODOS 2.1 Fase de Campo Para el desarrollo de esta tesis, se muestrearon cinco poblaciones de Zamia loddigesii: una en el estado de Tamaulipas, dos en Veracruz, otra ms en Oaxaca y la ltima en Tabasco, en todo este rango incluye toda la distribucin geogrfica de la especie, las ubicaciones se sealan en la Figura 2.1, las colectas se hicieron entre las altitudes de los 85 y los 250 m s.n.m.

Figura 2.1 Localizacin de las poblaciones colectadas de Zamia loddigesii.

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2.1.1 Colecta de material vegetal Se tomaron entre tres y cinco foliolos de cada individuo, estas muestras fueron etiquetadas individualmente y guardadas en nitrgeno lquido para evitar la degradacin del DNA. Finalmente las almacenamos, para su posterior anlisis, en un ultracongelador a -70C. 2.2 Fase de Laboratorio La parte experimental se realiz en el Laboratorio de Gentica de Poblaciones, del Instituto de Ecologa (INECOL) A. C. campus Xalapa, Veracruz, durante los meses de Febrero a Julio del 2011. 2.2.1 Extraccin y Purificacin de DNA Con la ayuda de un mortero maceramos individualmente con nitrgeno lquido todas las muestras hasta pulverizarlas. Se sigui el protocolo de extraccin DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, 2006) que, a diferencia del mtodo CTAB ofrece la ventaja de no requerir de una extraccin con Fenoles o Cloroformo, adems de ser ms rpido (Haymes et al., 2004). Al terminar, se tomaron 3ul de DNA y 2.5ul de Ficol de cada individuo y fueron colocados en geles de Agarosa al 1%, stos se corrieron por 40 minutos a 150V x 50mA, para comprobar la calidad de las purificaciones. Finalmente todas las muestras las almacenamos en tubos etiquetados a una temperatura de -20C en un congelador Fagor. 2.2.2 Amplificacin de fragmentos de DNA mediante primers ISSR Para la amplificacin de fragmentos de DNA fueron probados 100 primers ISSR procedentes de la serie No. 9 de la Unidad de Servicios de Protenas y cidos Nucleicos de la Universidad de Columbia Britnica, Vancouver, Canad. Los resultados dudosos o poco visibles fueron repetidos y realizamos todos los ensayos con un control negativo que contena todos los reactivos de la PCR excepto la solucin de DNA, para comprobar la ausencia de contaminacin en los reactivos.

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Todas las reacciones de PCR las hicimos en un termociclador Biometra T-personal (Whatman Biometra, Goettingen, Alemania). Tambin realizamos ensayos para determinar las concentraciones ptimas de Cloruro de Magnesio, Buffer, DNTPs, Taq Polimerasa, Templado de DNA y de los Primers. El nmero de ciclos y las temperaturas de alineamiento para cada primer fueron optimizados en una termocicladora de gradientes MasterCycler Gradient (Eppendorf International). 2.2.3 Visualizacin de productos amplificados Separamos los productos obtenidos del PCR por medio de electroforesis en geles de agarosa al 1%, utilizando TBE 0.5X como buffer de corrida con un pH de 8.4. En cada poblacin se coloc tambin 3l de una escalera o ladder (Quiagentm) de peso molecular conocido para calcular el tamao en pares de bases de los diferentes loci amplificados. Las muestras fueron corridas a 150V y 50mA por una hora y se les agreg bromuro de etidio para ser visualizados con luz UV. Al terminar la corrida electrofortica cada gel fue visualizado y registrado con una cmara digital Canon Power Shot A650 IS con filtro UV. 2.2.4 Registro de datos De la coleccin de fotografas agrupamos todas las poblaciones por primer de ISSR, usando los pesos moleculares como referencias; fueron registradas las bandas amplificadas para cada individuo y cada primer; adicionalmente se realiz un tratamiento digital a las fotografas con el fin de discriminar mejor las bandas (Figura 2.2), el cual consisti en un contraste (emboss) en el que cada pixel de la imagen, se sustituye, ya sea por un resalte o una sombra, dependiendo de la luz u obscuridad de los lmites de la imagen original, generando un relieve entre las bandas, del fondo obscuro o de los barridos del corrimiento del gel.

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Figura 2.2 Realce digital sobre las bandas amplificadas en varios primers de ISSR, en varios individuos de Zamia loddigesii.

A la presencia de una banda se asign el valor 1, mientras que las ausencias se registraron con 0 (Wolfe, 2005). Las bandas poco definidas o de difcil interpretacin no fueron consideradas en el registro de datos. Se construy una matriz binaria con todos los datos y sta fue utilizada para todos los diferentes paquetes de anlisis, realizando algunos ajustes de formato cuando fuera necesario. 2.3 Anlisis de datos Los ISSR son marcadores moleculares dominantes, esto es, que no se pueden distinguir directamente individuos heterocigotos, de homocigotos dominantes (Gonzlez y Aguirre, 2007), lo que genera una dificultad para calcular las frecuencias allicas a partir de estos resultados. Asimismo, la ausencia de una banda puede interpretarse como prdida del locus a travs de insercin o delecin del sitio, una mutacin o de rearreglos cromosmicos (Wolfe y Liston, 1998; Gonzlez y Aguirre, 2007). 2.3.1 Especificaciones metodolgicas Los anlisis estadsticos se realizaron asumiendo que las poblaciones se encuentran en

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Equilibrio Hardy-Weinberg (EHW), esto se debe a la naturaleza de los marcadores y la imposibilidad de distinguir homocigotos recesivos, esta asuncin debe ser hecha para la mayora de programas en gentica de poblaciones que analizan datos de marcadores dominantes y generalmente utilizan la correccin de Lynch y Milligan (1994) para reducir el sesgo. 2.3.2 Caracterizacin y lectura de los primers ISSR A partir de la matriz binaria se obtuvo el nmero de bandas por individuo, el nmero de bandas polimrficas, el nmero de bandas fijas (dentro de la poblacin y a nivel especie) y el nmero de bandas privadas, esto es el nmero de bandas que son nicas a una sola poblacin, utilizando el programa FAMD v1.25 (Schlter y Harris, 2006). Adems se obtuvo el nmero de bandas para toda la poblacin y el nmero de bandas comunes (con una frecuencia mayor o igual a 5%) con el programa GenAlEx v6.41 (Peakall y Smouse, 2006). 2.3.3 Composicin gentica de las poblaciones Dentro de una especie se encuentran tanto diferencias genticas entre poblaciones, como entre los individuos dentro de poblaciones. Estas diferencias pueden surgir como resultado de la accin de procesos aleatorios, que aunado al flujo gnico puede generar una nueva poblacin, proceso que Wright (1978) nombr efecto del fundador, en estas poblaciones que en general tienen tamaos efectivos relativamente inferiores a la poblacin o poblaciones originales es probable que se fijen o se pierdan alelos debido al efecto del azar, proceso que se le conoce como deriva (Templeton, 1991). Tambin, las diferencias entre poblaciones pueden surgir de manera sistemtica, especialmente si el entorno en varios lugares expone a los individuos a diferentes ptimos para su supervivencia y reproduccin, estas divergencias son especialmente

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fuertes y rpidas, cuando existe poco flujo gnico entre las poblaciones, por ejemplo en plantas debido a la dispersin limitada de semillas o polen o por barreras fisiogrficas; as con el transcurrir de las generaciones, esas diferencias entre, eventualmente se acumularn y resultarn en el desarrollo de una nueva especie (Templeton, 2006). La diversidad gentica evaluada en esta tesis se bas en estimadores que incorporan la variacin de alelos dentro de las poblaciones as como la divergencia de las poblaciones. Para ello se calcul: el nmero observado de alelos (Na) y el nmero efectivo de Alelos (Ne), donde este ltimo se refiere a los alelos con capacidad de pasar a la siguiente generacin (Kimura y Crow, 1964). El ndice de diversidad gentica de Nei (HE) (Nei, 1973), esto es la heterocigosidad esperada para la diversidad dentro de las poblaciones (HS) y a nivel de especie (HT); el nmero de loci polimrficos (NLP) y el ndice de informacin de Shannon (I), ste ndice no asume que haya equilibrio en Hardy-Weinberg (Lewontin, 1972), los anlisis fueron realizados con el programa Popgene versin 1.31 (Yeh et al., 1999). Se estim tambin, el Porcentaje de Loci Polimrficos (PLP), con respecto al nmero promedio de loci examinados, ste anlisis se calcul usando el programa TFPGA versin 1.3 (Miller, 1997). 2.3.4 Estructura gentica El perfil gentico del total de las poblaciones tpicamente vara de un lugar a otro a travs del rango de la especie, esto podemos verlo reflejado en el grado de diferenciacin entre las poblaciones, el cual puede ser calculado siguiendo uno o varios estadsticos. Los dos mtodos ms usados para marcadores moleculares de tipo dominante son el ndice de fijacin de Wright (FST) (Wright 1969, 1978) y el coeficiente de variacin gentica de Nei (Gst) (Nei, 1973) estos ndices son funciones de como la heterocigosidad es particionada dentro y entre poblaciones.

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El ndice de fijacin (FST), mide el efecto de las divisiones de una poblacin en la heterocigocidad de las subpoblaciones debido a la deriva gnica. Este coeficiente es el ms til y el ms utilizado para determinar las divergencias genticas entre las subpoblaciones. El ndice FST es siempre positivo. Tiene un valor cercano a 0 cuando no hay subdivisin (i. e., con apareamientos al azar) por lo que no existen divergencias genticas entre las poblaciones; y tiene un valor cercano a 1 cuando existe subdivisin extrema (aislamiento completo), de manera que valores de FST menores a 0.05 indican una diferenciacin gentica insignificante, mientras que valores mayores a 0.25 muestran una diferenciacin gentica significativa entre las poblaciones. Para estimar el grado de diferenciacin gentica entre las poblaciones (F ST de Wright), se utiliz el mtodo de Weir y Cockerham (1984) donde el ndice (theta) corresponde al coeficiente FST. Con los datos de las cinco poblaciones estudiadas, se utiliz el programa TFPGA versin 1.3 (Miller, 1997) para estimar el valor de ; para esto se realiz un anlisis Jackknife (i.e., rplicas de eliminacin secuencial de loci) a todos los datos para obtener estimados de varianza, as como un Bootstrap sobre todos los loci para obtener uno intervalos de confianza al 95% y 99%. La medida de diferenciacin gentica a travs de los loci (GST), es un ndice que ha sido usado ampliamente para describir la estructura gentica de las poblaciones, con especial enfoque en los efectos de la deriva gnica y migracin, que son fuerzas evolutivas que reflejan las caractersticas demogrficas que se encuentran bajo seleccin neutral y se espera que afecten a todos los loci de la misma forma (Ryman y Leimar, 2009). Tiene adems la propiedad de ser utilizado para uno o varios loci, no necesita de un nmero especifico de poblaciones y el

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estadstico es relativamente responsable de cambios en las frecuencias allicas en el tiempo (Falk et al., 2001), ste anlisis fue realizado con el programa Popgene, de Yeh et al., (1999) versin 1.31. A partir del resultado, se calcul tambin el flujo gnico (Nm) como: Nm = (1/GST - 1). Debido a la naturaleza dominante de los ISSR se utiliz el mtodo de anlisis propuesto por Holsinger et al., (2002) implementado en el programa Hickory version 1.1, el cual no asume que las poblaciones estn en equilibrio Hardy-Weinberg (Holsinger y Wallace, 2004), y estima anlogos bayesianos de FST y FIS, designados como -II (Theta II) y f, respectivamente (Holsinger y Wallace, 2004). Este programa permite la estimacin de cuatro diferentes modelos; el primero es un modelo completo en el que -II y f son estimados simultneamente. Despus utiliza dos modelos alternativos que asumen que no hay endogamia dentro de las poblaciones (f = 0) y que no hay estructura entre las poblaciones (-II = 0). Finalmente, el cuarto modelo permite que la estimacin de f vare conforme avanza el modelo. Al mismo tiempo se calcula la heterocigosidad local y total (HS y HT, respectivamente) con lo que se obtiene la GST sobre la misma matriz de datos. El programa corre los cuatro modelos probando diferente nmero de iteraciones (ver Cuadro 2.1), y del modelo seleccionado se realizaron al menos diez repeticiones para comparar los resultados, los valores fueron muy similares Cuadro 2.1 Diferentes configuraciones usadas en la optimizacin del modelo. nBurnin nSample thin Test1 20000 10000 10 Test2 50000 50000 50 Test3 50000 100000 50 Test4 50000 250000 50 Test5 100000 1000000 50

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Posteriormente, los modelos probados fueron comparados usando el criterio de informacin de la Desviacin (DIC) que combina una medicin de ajuste del modelo (Dbar) con uno de complejidad del modelo (pD, nmero efectivo de parmetros). Lo modelos con menor valor de DIC son los elegidos, pero es requerida una diferencia de ms de seis unidades para que el modelo est estadsticamente soportado (Holsinger et al., 2002). 2.3.5 Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) El grado de diferenciacin dentro entre poblaciones puede ser evaluado mediante el AMOVA, este es utilizado para determinar la varianza total existente entre individuos dentro de poblaciones y entre las poblaciones, y puede ser realizado a partir de una matriz de distancias genticas (Excoffier et al., 1992). Para ello, el estimador ST del AMOVA es anlogo del estadstico FST. El AMOVA, se hizo en el programa Arlequin version 3.1 (Excoffier y Schneider, 2005) usando 10,000 permutaciones y los intervalos de confianza fueron obtenidos con un bootstrap de 10 mil iteraciones. 2.3.6 Distancias genticas El clculo de distancias o identidades genticas es muy til para tener una idea general de que tan similares (o diferentes) son las poblaciones; las matrices de identidades y distancias genticas entre poblaciones fueron construidas con el mtodo original de Nei (1972) para medidas de distancia e identidades que considera a los cambios en las frecuencias allicas derivados tanto de mutaciones como de efectos de deriva gentica. Asimismo se utiliz el estimador no sesgado de Nei (1978), ambas frecuencias fueron estimadas con el mtodo de expansin de Taylor de Lynch y Milligan (1994), recomendado para marcadores dominantes y que considera que las poblaciones estn en equilibrio de Hardy-Weinberg, esto, utilizando el

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software TFPGA versin 1.3. Tambin se construy una matriz utilizando el coeficiente de Dice (1945), debido a que ste excluye de su anlisis la ausencia de bandas y adems no se asume el equilibrio Hardy-Weinberg (Meyer et al., 2004; Dalirsefat et al., 2009). 2.3.7 Anlisis de agrupamiento A partir de las distancias genticas, se construyeron dos rboles para conocer la estructura de agrupamiento de los datos, los cuales dieron lugar a representaciones visuales de las relaciones genticas existentes entre los individuos analizados (Hollingsworth y Ennos, 2004). Para ello seguimos dos aproximaciones, estas fueron: el mtodo no ponderado de apareamiento de grupos a travs de la media aritmtica (UPGMA) y el anlisis del vecino ms cercano o NeighborJoining. 2.3.7.1 UPGMA El UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean por sus siglas en ings), agrupa a los individuos en forma aglomerada y jerrquica con base los promedios de similitud, como resultado de ello se obtiene un dendrograma, mediante el cual se puede observar la formacin de grupos a distintos valores de similitud. El UPGMA se elabor basado en las distancias genticas de Nei (1978), utilizando el software TFPGA versin 1.3, este programa permite realizar un bootstrap a los datos y arroja ndices de consistencia que permiten inferir la fuerza relativa de los nodos producidos, calculados para cada nodo generado por el set de datos originales (Miller, 2007). 2.3.7.2 Neighbor-Joining El anlisis de Neighbor-Joining o del vecino ms cercano permite determinar a los individuos

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que se encuentran ms y menos relacionados entre s dependiendo de sus similitudes. La cercana de dos individuos y el hecho de que se formen de una misma rama indican el grado de similitud entre ellos. Para este anlisis, utilizamos el mtodo Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987) implementado en el software MEGA v5.0.1. El cual produce un rbol sin raz, porque no requiere asumir una tasa de evolucin constante, que a diferencia del UPGMA produce rboles enraizados y requiere presuponer una tasa constante de evolucin, es decir, se asume un rbol en el que las distancias desde la raz a cada extremo de las ramas son iguales. 2.3.7.3 Anlisis de Coordenadas Principales (PCoA) Adems se realiz un Anlisis de Coordenadas Principales (PCoA), que permite conocer el patrn de agrupamiento de todos los individuos en el espacio. El PCoA utiliza directamente la informacin de los datos reunidos en la matriz de similitud gentica, para extraer informacin relevante y as generar nuevas variables denominadas como componentes principales. Este anlisis se llev a cabo en FAMD (Fingerprint Analysis with Missing Data por sus siglas en ingls) versin 1.23 beta, utilizando como medida de distancia el coeficiente de Dice. Tambin se construy en GenAlex (Genetic Analysis in Excel) versin 6.2, ya que dicho software, permite observar en los primeros tres ejes, el porcentaje de variacin que es explicada por cada uno. 2.3.8 Anlisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA) Se realiz un Anlisis Espacial de la Varianza Molecular (SAMOVA) (Dupanloup et al., 2002), usando el programa SAMOVA versin 1.0. Este anlisis, maximiza la proporcin de varianza gentica total debida a diferencias entre grupos de poblaciones y minimiza la varianza dentro de estos, llegando a definir grupos e identificando la presencia de barreras genticas entre estos grupos, permitiendo inferir posibles barreras genticas que expliquen el aislamiento entre

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grupos de poblaciones. El SAMOVA utiliza al AMOVA y datos de informacin geogrfica, e involucra la definicin de grupos de poblaciones sin la necesidad de una delimitacin a priori, maximizando la diferenciacin entre poblaciones (Excoffier et al., 1992). La significancia de la varianza de componentes de CT (entre grupos), SC (entre poblaciones dentro de grupos) y ST (dentro de poblaciones) fue probada usando 10,000 permutaciones para cada nivel jerrquico. Las pruebas se realizaron con dos (k = 2), tres (k = 3) y cuatro (k = 4) grupos. 2.3.9 Prueba de Mantel Para conocer si hay una relacin significativa entre la distancia geogrfica y las distancias genticas de las poblaciones, se llev a cabo la prueba de Mantel (1967). La prueba de Mantel es una regresin en donde las variables son matrices de distancia que resumen la disimilaridad entre grupos. Se busca, por tanto, evaluar si la asociacin (positiva o negativa) es ms robusta de lo que se esperara por azar (Reynolds y Houle, 2002). Este anlisis fue llevado a cabo en el programa TFPGA versin 1.3. Las distancias geogrficas se compararon con las siguientes variables: Distancias genticas de Nei 1972, 1978; ST del AMOVA e ndices de Shannon.

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CAPTULO 3: RESULTADOS 3.1 Amplificacin de fragmentos de DNA mediante primers ISSR De los 100 primers de la serie 9 de la UBC, 51 amplificaron con ms de cuatro bandas y de ellos se utilizaron los once que mostraron el mayor nmero de bandas, lo cual se consider un mnimo de diez bandas (Cuadro 3.1). Las concentraciones ptimas para cada uno de los reactivos utilizados en los ensayos se muestran en el cuadro 3.2; el nmero de ciclos y temperaturas de alineamiento con mejores resultados se muestran en el cuadro 3.3. Cuadro 3.1 Lista de primers utilizados en el anlisis ISSR, temperatura de alineamiento, nmero de bandas y sus respectivas secuencias Primer T Alineamiento Intervalo de Secuencia 5`a 3` # Bandas ISSR (C ) Peso Molecular UBC 846 CACACACACACACACART 52 23 350-1600 UBC 881 GGGTG GGGTG GGGTG 52 22 300-1550 UBC 841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 52 21 220-1400 UBC 840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 52 18 250-1000 UBC 848 CACACACACACACACARG 52 18 300-1700 UBC 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 52 17 300-1200 UBC 886 VDVCTCTCTCTCTCTCT 48 16 350-1200 UBC 844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 52 15 500-1600 UBC 873 GACAGACAGACAGAC A 52 15 500-1200 UBC 835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 52 14 380-1400 UBC 836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA 52 10 300-970 R = A, G; Y = C, T; V = A, C o G; D = A, G o T Cuadro 3.2 Concentraciones finales de los reactivos Reactivo Cantidad Buffer 4l MgCl 2.5l Formamida (2%) 0.4l DNTP 0.4l Primer 2l Taq Polimerasa 0.2l Templado DNA 1l H 20 9.5l Volumen Total 20l Cuadro 3.3 Condiciones de tiempo y temperatura de cada fase del PCR Fase Temperatura Tiempo Denaturacin inicial 94 5 Min 44 Denaturacin 94 30 Seg Ciclos Alineamiento 52 45 Seg Extensin 72 2 Min Extensin Final 72 7 Min *48C para primer 886

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3.2 Registro de datos Cada uno de los geles se almacen en una serie de fotografas, registrando el nombre de la poblacin, el nmero de individuo ms un control negativo, la escalera, el primer utilizado, la temperatura de alineamiento, voltaje y miliamperaje, duracin y fecha de la corrida electrofortica, as como el nmero de PCR registrado en la bitcora (Figura 3.1)

Figura 3.1 Electroforesis del Primer 835 de la poblacin de Zamia loddigesii en Oaxaca, Mxico, indicando su codificacin.

3.3 Caractersticas y atributos de los primers de ISSR De los once primers, en las cinco poblaciones estudiadas (91 individuos), registramos un total de 472 bandas diferentes, la poblacin de Monte Oscuro en Veracruz presenta el mayor nmero de bandas totales. El mayor nmero de bandas por individuo, nmero de bandas fijas, bandas localmente comunes y el menor nmero de bandas nicas, se encontraron en la poblacin de Aldama en Tamaulipas. En general, los valores ms bajos se encuentran en la poblacin de Tabasco, ya que es la que tiene menor nmero de bandas totales, bandas por Individuo, bandas

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fijas y bandas localmente comunes (Cuadro 3.4), incluso sus valores estn debajo del promedio de las cinco poblaciones que fueron analizadas. Cuadro 3.4 Caractersticas de las bandas dentro de las cinco poblaciones de Zamia loddigesii estudiadas en esta tesis
Poblacin Aldama Misantla Monte Oscuro Oaxaca Tabasco Total N 20 20 20 15 16 91 #Bandas 95 96 101 94 86 472 Bandas por Individuo 60.65 60.55 57.35 57.2 55.25 58.38 # Band. # Bandas localmente #Bandas fijas nicas comunes 18 6 25 14 18 21 14 13 19 10 14 19 10 13 17 66 64 5*

N = Nmero de individuos muestreados # Bandas = Nmero de bandas Diferentes en la poblacin BPI = Bandas por individuo # Bandas Localmente Comunes = Encontradas en 50% o menos en la poblacin # Bandas nicas = Nmero de bandas nicas a la poblacin # Bandas fijas en el grupo de datos (Poblacin) [*Para todo el conjunto de datos]

Existe adems un patrn latitudinal cualitativo, donde tres grupos de datos (i.e., bandas por Individuo, bandas locales y bandas fijas) decrecen de norte a sur a lo largo de la distribucin de la especie (Figura 3.2).

Figura 3.2 Distribucin de los atributos de las bandas entre las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en Mxico

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3.4 Composicin gentica de las poblaciones Un resumen de la variacin gentica en las cinco poblaciones estudiadas se presenta en el cuadro 3.5, donde se observa que la poblacin ms al norte (Aldama, Tamaulipas) presenta los valores ms bajos para el nmero efectivo de alelos, el ndice de Shannon y la diversidad gentica de Nei. De forma opuesta, los valores ms altos los presenta la poblacin de Oaxaca. A nivel especie, Zamia loddigessi, presenta altos valores de polimorfismo (97.28%), as como la mayora de los indicadores de diversidad gentica. Cuadro 3.5 Resumen de la variacin gentica en Z. loddigesii
Poblacin Aldama Misantla Monte Oscuro Oaxaca Tabasco Promedio Especie (DE) Na 1.3804 1.4076 1.4457 1.4076 1.3750 1.40326 1.9728 (0.163) Ne 1.2190 1.2538 1.2392 1.2593 1.2463 1.24346 1.3843 (0.3246) HE 0.1286 0.1490 0.1435 I 0.1934 0.2215 0.2181 NLP 70 75 82 75 69 74.2 179 PP 38.04 40.76 44.57 40.76 37.50 40.326

0.1499 0.2224 0.1402 0.2063 0.1423 0.2121 0.2408* 0.3813 (0.0256) (0.2104)

97.28

Na = Nmero observado de alelos; Ne = Nmero efectivo de alelos; HE = Diversidad gentica de Nei *HT; I = ndice de Shannon; NLP = Numero de loci polimrficos; PP = Porcentaje de loci polimrficos

En la figura 3.3 se esquematiza la distribucin de los diferentes estimadores de la diversidad gentica en las poblaciones de Zamia loddigesii. Las lneas ms cercanas al centro indican bajos valores, mientras que los ms alejados del centro, muestran los valores ms altos y a la poblacin a la que pertenecen. La poblacin de Aldama en Tamaulipas, muestra valores relativamente bajos de diversidad gentica, mientras que los estimadores ms altos ocurren en las poblaciones de Misantla en Veracruz, la de Oaxaca y la de Monte Oscuro en el centro de Veracruz, principalmente.

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Figura 3.3 Distribucin de los ndices de diversidad en las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en Mxico.

3.5 Estructura gentica Con base en los dos mtodos ms utilizados para evaluar la estructura gentica de las poblaciones, tenemos que el coeficiente de endogamia de Wright (FST), fue de 0.444 0.023, lo cual indica que el 44.47% de la diversidad gentica de la especie, est distribuida entre las poblaciones. Los resultados obtenidos con las poblaciones, se muestran en el cuadro 3.6, junto con sus intervalos de confianza. Cuadro 3.6 Estimador de la diferenciacin gentica promedio (FST) entre las cinco poblaciones de Zamia loddigesii en Mxico. Se muestra la desviacin estndar (DE) del estimador, as como los intervalos de confianza al 95 y al 99% FST 95% IC. 99% IC 0.4447 Superior: 0.489 Superior: 0.5027 (DE) 0.023 Inferior: 0.3978 Inferior: 0.384

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El estimador de la diferenciacin gentica a travs de todos los loci fue GST = 0.409, a partir del mismo estimador, se calcul el flujo gnico como Nm = 0.361, lo cual indica un flujo gnico muy limitado entre las poblaciones. Para el clculo de FST, a partir de mtodos bayesianos, de las diferentes combinaciones la configuracin del test2 fue seleccionado, ya que se observ despus de las pruebas, que aunque se aumentaran el nmero de iteraciones, los valores ya no variaban. En el Cuadro 3.7 se muestran los resultados para los cuatro modelos, el modelo completo (full) es el que muestra el valor ms bajo de (DIC) que es el ndice de criterio de desviacin, el cual combina una medida del ajuste del modelo (Dbar), con una medida de la complejidad del modelo (pD), donde pD = Dbar - Dhat. Los valores ms bajos, son los recomendados de acuerdo a Holsinger y Wallace (2004). Cuadro 3.7 ndices para los cuatro modelos de Hickory (Holsinger y Lewis, 2003) Modelo Dbar Dhat pD DIC Full 1676.14 1321.57 354.57 2030.71 f=0 1677.01 1286.7 390.313 2067.33 =0 8721.46 8556.18 165.28 8886.74 Free model 1766.34 1329.68 436.656 2202.99 DIC es el ndice de criterio de desviacin Los valores de -II (anlogos al FST (Weir y Cockerham, 1984)), y GST-B (Anlogo Bayesiano al GST de Nei (1973)), se encuentran entre 0.56 y 0.45, respectivamente (Cuadro 3.8). Esto indica que la mayor proporcin de variacin gentica se atribuye a la diferencia entre las poblaciones. Para estas pruebas bayesianas, los estimadores: HS y HT en el cuadro 3.8 son similares a los estadsticos de Nei (1973), mientras que la f es el equivalente a la endogamia local (FIS) result ser de 0.778, lo cual refleja muy altos niveles de endogamia local en las poblaciones de

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Zamia loddigesii. Cuadro 3.8 Resumen de la diversidad gentica de Zamia loddigesii, de acuerdo a los anlisis bayesianos
f 0.778 (0.25) -II 0.560 (.51) HS[1] 0.139 (0.13) hS[2] 0.164 (0.15) hS[3] 0.157 (0.14) hS[4] 0.168 (0.15) hS[5] 0.148 (0.13) HS 0.155 (0.15) HT 0.284 (0.26) GST-B 0.452 (0.39)

3.6 Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) A fin de detectar la estructura gentica de las poblaciones, se realiz un AMOVA usando los 184 loci detectados para las cinco poblaciones de Zamia loddigesii. Los resultados del AMOVA se resumen en el cuadro 3.9, donde se indica que el mayor porcentaje de variacin gentica (i.e., 52.23%) es debido a las diferencias entre las poblaciones, en tanto que el 47.77% de la varianza gentica total restante se debe a la variacin promedio dentro de las poblaciones entre individuos. Cuadro 3.9 AMOVA para las poblaciones de Zamia loddigesii en Mxico
Fuente de variacin Suma de Cuadrados Entre poblaciones 1162.336 Dentro de Poblaciones 1200.192 Total 2362.527 ST = 0.52226 valor de P < 0.00001 Cuadrados Medios 290.584 13.956 Varianza de los componentes 15.25647 13.95572 29.21218 Porcentaje de variacin 52.23 47.77 100.00

3.7 Distancias genticas En el cuadro 3.10 se muestran los datos para distancias e identidad gentica entre las diferentes poblaciones comparadas (1. Aldama, 2. Misantla, 3. Monte Oscuro, 4. Oaxaca y 5. Tabasco) con el estimador gentico de Nei (1972) y el estimador sin sesgo de Nei (1978).

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Cuadro 3.10 Estimadores de Distancia e Identidad gentica de Nei entre pares de poblaciones en Zamia loddigesii
Poblaciones Distanciaa Identidada Distanciab Identidadb Comparadas 1 vs. 2 0.1626 0.8499 0.1584 0.8535 1 vs. 3 0.1526 0.8585 0.1485 0.8620 1 vs. 4 0.1939 0.8238 0.1888 0.8280 1 vs. 5 0.1357 0.8731 0.1311 0.8772 2 vs. 3 0.1504 0.8603 0.1460 0.8641 2 vs. 4 0.1542 0.8571 0.1487 0.8618 2 vs. 5 0.1773 0.8375 0.1723 0.8418 3 vs. 4 0.1307 0.8775 0.1253 0.8822 3 vs. 5 0.1289 0.8790 0.1240 0.8834 4 vs. 5 0.1300 0.8781 0.1240 0.8833 1.Aldama 2.Misantla 3.Monte Oscuro 4.Oaxaca 5.Tabasco a b Nei 1972 Nei 1978

3.8 Anlisis de agrupamiento 3.8.1 UPGMA Siguiendo el mtodo de UPGMA, utilizamos las distancias genticas de Nei (1978), usando 10,000 permutaciones, con este mtodo las poblaciones de Monte Oscuro (Veracruz) y Tabasco resultaron ser ms prximas, seguidas de Oaxaca (Figura 3.4).

Figura 3.4 Dendrograma usando la distancia sin sesgo de Nei (1978).

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3.8.2 Neighbor-Joining La Figura 3.5 muestra el dendrograma obtenido del anlisis de Neighbor-Joining, usando para ello 10,000 rplicas con el programa MEGA versin 5.0, las distancias fueron calculadas siguiendo el mtodo de distancia-p. Adems de la agrupacin de las poblaciones, as como la distribucin de los individuos dentro de las mismas, este dendrograma nos permite visualizar si hay individuos mezclados en poblaciones a las que no pertenecen. En este sentido, se observa que ningn individuo est fuera de la poblacin a la que corresponde y, de acuerdo con este anlisis, las poblaciones ms prximas entre s fueron Monte Oscuro y Oaxaca, seguidas por la de Tabasco.

Figura 3.5 Dendrograma de Zamia loddigesii, obtenido con el mtodo de Neighbor-Joining.

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3.8.3 Anlisis de Coordenadas Principales (PCoA) En la figura 3.6 se muestran los resultados obtenidos con GenAlEx. Espacialmente las cinco poblaciones de Zamia loddigesii aqu estudiadas se separan claramente, sin embargo para evitar confusiones (sobre todo en las poblaciones de Oaxaca, Tabasco y Monte Oscuro en Veracruz), se unieron con una lnea del mismo color todos los integrantes de cada poblacin.

Figura 3.6 Distribucin en dos dimensiones de los 91 individuos de Zamia loddigesii mediante el anlisis de coordenadas principales

En el cuadro 3.11 se muestra el porcentaje de variacin que explica cada coordenada, el primer componente explica el 31.67% de la variacin total, en tanto que el segundo explica el 24.94% y el tercero el 17.92%. Dentro de cada una de las cinco agrupaciones (poblaciones) se observa que la distancia a la que se encuentran separados los individuos de las poblaciones de Oaxaca y Tabasco es relativamente ms estrecha que las poblaciones de Misantla y Monte Oscuro, ambas en Veracruz. Cuadro 3.11 PCoA basado en distancias genticas, porcentaje de variacin explicado en los primeros tres ejes 1 2 3 Eje 31.67 24.94 17.92 % % Acumulado 31.67 56.61 74.53 43

3.9 Anlisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA) Se analizaron tres escenarios, los cuales se compararon para conocer la agrupacin de las poblaciones incluyendo los datos genticos y el espacio geogrfico. Similar al UPGMA y otros rboles (no publicados), cuando se consideran dos grupos (K = 2), la poblacin de Misantla en Veracruz resulta separarse de las dems (Cuadro 3.12); de igual manera cuando se contemplan tres y cuatro grupos (K = 3 y K = 4, respectivamente) presentan un comportamiento similar al observado en los dendrogramas, sin embargo ninguna de las tres formas de agrupacin de ste anlisis fue significativo.

Cuadro 3.12 Resumen del Anlisis Espacial de Varianza Molecular. Entre parntesis se muestran las poblaciones que se agrupan de acuerdo al nmero de conjuntos seleccionados
Varianza de Porcentaje ndice de componentes de Variacin Fijacin K= 2 Grupos: (Aldama, Monte Oscuro, Oaxaca, Tabasco) (Misantla) CT Entre grupos 1 2.87893 9.33 0.09331 SC Entre poblaciones 3 14.01765 45.43 0.50111 dentro de grupos ST Dentro de poblaciones 86 13.95572 45.23 0.54766 K = 3 Grupos: (Monte Oscuro, Oaxaca, Tabasco) (Aldama) (Misantla) CT Entre grupos 2 3.14775 10.48 0.10481 SC Entre poblaciones 2 12.92904 43.05 0.48091 dentro de grupos ST Dentro de poblaciones 86 13.95572 46.47 0.53531 K = 4 Grupos: (Misantla) (Monte Oscuro, Tabasco) (Aldama) (Oaxaca) CT Entre grupos 3 3.12082 10.57 0.10574 SC Entre poblaciones 1 12.43827 42.14 0.47125 dentro de grupos ST Dentro de poblaciones 86 13.95572 47.28 0.52716 Fuente de Variacin G.L. Valor de P 0.194 0.013 0.00 0.0 0.00 0.0 0.112 0.000 0.00 0.0 0.00 0.0 0.100 0.008 0.00 0.0 0.00 0.0

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Figura 3.7 Agrupacin de las poblaciones de acuerdo al SAMOVA.

3.10 Prueba de Mantel Con la finalidad de conocer la relacin existente entre la composicin gentica y la localizacin geogrfica correspondiente a cada poblacin se aplic una prueba de Mantel, la cual compara matrices pareadas. De todas las comparaciones realizadas (Cuadro 3.13), los resultados de la prueba de Mantel indican que la variabilidad o distancia gentica observada es independiente de la distancia geogrfica de las poblaciones de Zamia loddigesii, es decir no existe una relacin significativa entre ambas matrices. Cuadro 3.13 Combinaciones usadas en la prueba de Mantel
Combinacin Distancia geogrfica vs Fst-1 Distancia geogrfica vs Distancia Gentica Nei Distancia geogrfica vs Fst-1 quitando Aldama-Tabasco Distancia geogrfica vs PhiPt (AMOVA) Distancia geogrfica vs Shannon Correlacin (r) 0.4201 -.0540 0.7410 0.3306 -.1113 Probabilidad superior (p) 0.1640 0.4960 0.0070 0.2210 0.6080 Probabilidad inferior (p) 0.8480 0.5110 1.0000 0.7850 0.4000

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CAPITULO 4: DISCUSIN En esta tesis se estudi la diversidad y la estructura gentica en cinco poblaciones de Zamia loddigesii en todo su mbito de distribucin, pare ello se utilizaron once primers de ISSR, que fueron seleccionados de 100 primers, el criterio que se utiliz para escoger los primers fue que como mnimo presentaran diez bandas, este criterio se utiliz a partir de la revisin de ms de un centenar de publicaciones cientficas que abordan el estudio de la gentica de poblaciones en plantas desde 1996 a la fecha, para ello las primeras tres publicaciones que se registraron en una bsqueda en el ISI Web de Thomson Reurtes fueron: Tsumura et al., (1996), Esselman et al., (1999) y Ge y Sun (1999); en tanto que durante el 2011 se publicaron mas de una veintena de artculos, en los que en su mayora utilizan al menos diez primers de ISSR y con diez bandas como mnimo. Lo anterior es evidencia de que los datos y resultados de esta tesis son

consistentes con lo reportado en otros estudios con plantas. En el caso del orden Cycadales el primer estudio donde se utilizan los ISSR como marcadores de diversidad y estructura gentica es en 12 poblaciones de Cycas guizhouensis K. M. Land y R. F. Zou en el sur de China, donde utilizaron 11 primers de ISSR (Xiao et al., 2004), lo cual coincide con el mismo nmero de marcadores que us en esta tesis. Los estudios con marcadores moleculares a nivel del DNA suelen, en general, detectar mayor diversidad gentica que con protenas enzimaticas, esto puede ser explicado primero, por la naturaleza conservativa de las secuencias codificantes en los genes muestreados por isoenzimas, en contraste con las secuencias no codificantes por RAPD e ISSR (Fahima et al., 1999; Aboel-Atta, 2009), por lo que las isoenzimas podran subestimar la diversidad gentica (Culley y Wolfe, 2001). Segundo, en el caso de los microsatlites que son secuencias repetitivas

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cortas en tndem, con una longitud de apenas unos pares de bases, son muy abundantes a lo largo del genoma; en este contexto Condit y Hubell (1991) estiman que hay 5 x 103 a 3 x 105 microsatlites en cada organismo. As los microsatlites estn dispersos a travs de todo el genoma y son altamente polimrficos debido al deslizamiento del DNA (Hamada y Kakunaga, 1982). Por lo tanto, usar un marcador ISSR compuesto de una secuencia microsatlite, anclada por dos a cuatro nucletidos y con frecuencia degenerando en las terminaciones 3 or 5 (Zietkiewicz et al., 1994), podra detectar muchas ms bandas polimrficas por primer que los marcadores RAPD (Quian y Hong, 2001), adicionalmente este tipo de marcadores (dominantes), son neutrales, de manera que no se ven afectados por la accin de la seleccin natural (Nagaoka y Ogihara, 1997). En esta tesis, trabajando con cinco poblaciones de Zamia loddigesii usando marcadores ISSR fue posible detectar suficiente variacin gentica entre poblaciones y entre individuos dentro de las poblaciones. En este contexto, se ha reportado que los ISSR pueden ser ms informativos y tener un mejor desempeo que los RAPD (Ge y Sun, 1999; Korbin et al., 2002; Galvn et al., 2003; Wu et al., 2004; Souframanien y Gopalakrishna, 2004; Vijayan et al., 2004). Los ISSR son superiores a los RAPD, principalmente en trminos de bandas polimrficas detectadas por primer y por ser mas reproducibles (Culley y Wolfe, 2001; Quian y Hong, 2001). Finalmente, cuando comparamos la informacin gentica obtenida a partir de marcadores de isoenzimas, una desventaja que caracteriza a los ISSR es su naturaleza dominante, que resulta en un menor contenido de informacin, esto al no poder detectar los heterocigotos. Sin embargo, como afirma Ge y Sun (1999), esta desventaja es compensada por el alto nmero de loci polimrficos que se obtienen y por la capacidad de muestrear un mayor

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nmero de regiones del genoma. Es importante mencionar que existe un renovado inters en la evaluacin de la diversidad, tanto en ecologa como en gentica de poblaciones (Jost, 2007; Ricotta y Burrascano, 2008; Ryman y Leimar, 2009; Gregorius, 2010; Meirmans y Hedrick, 2011; Whitlock, 2011), as como el aumento en el nmero de publicaciones en revistas indizadas (Figura 4.1) utilizando ISSR como marcadores para conocer la diversidad de las especies, a la vez que van en desuso los mtodos enzimticos (a pesar la informacin que ellos aportan), desde 1995 a la fecha.

Figura 4.1 Tendencia en las publicaciones con ISSR vs Aloenzimas

4.1 Caractersticas y atributos de los primers de ISSR Los resultados obtenidos, concuerdan con otros estudios en ccadas donde se emplean marcadores moleculares ISSR. Para ello, de los once primers utilizados en la presente tesis, cinco han sido reportados en otros estudios con ccadas: los primers 835, 836 y 840 tambin son reportados por Xiao et al., (2004), Xiao y Gong (2006), Jianguang et al., (2005) y Xiao et al., (2005), el primer 841 por Xiao y Gong (2006), Jianguang et al., (2005) y Xiao et al., (2005), as como el primer 842 (Xiao et al., 2004; Xiao y Gong, 2006; Xiao et al., 2005). En las dos ccadas asiticas, Cycas guizhouensis y Cycas debaoensis Y. C. Zhong y C. J. Chen, que reportan el nmero de bandas obtenido por cada primer, se puede observar que en

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todos los casos las especies asiticas presentan un menor nmero de bandas por primer, comparadas con Zamia loddigesii (Cuadro 4.1). Cuadro 4.1 Nmero de bandas entre especies de ccadas Primer Zamia Cycas Cycas ISSR loddigesii guizhouensis debaoensis UBC 835 14 11 8 UBC 836 10 7 8 UBC 840 18 8 7 UBC 842 17 7 Cycas guizhouensis: (Xiao et al., 2004); Cycas debaoensis: (Xie et al., 2005) Aunque no se incluyeron en el anlisis, durante las pruebas preeliminares con los 100 primers, los primers 808 y 810 mostraron variacin de bandas como lo reportan Xiao et al., 2004; Xiao et al., 2005; Jianguang et al., 2005; Xiao y Gong, 2006 (datos no publicados), pero en el presente estudio, no se incluyeron por mostrar pocas bandas (cinco y seis, respectivamente). La temperatura de alineamiento para la mayora de los primers fue de 52C, excepto para el primer 886 que fue de 48C, estos son resultados similares a los reportados por Xiao y Gong (2006). Con la presente informacin podemos indicar que los primers utilizados podran aplicarse a posteriores estudios con ccadas de otros gneros, as como en especies tanto de Amrica como del resto del mundo. El promedio de individuos muestreados en las poblaciones de Zamia loddigesii fue de 18.2. Respecto a esto Nybom (2004) reporta en un meta anlisis, con marcadores moleculares en 307 especies estudiadas, principalmente dominantes (RAPD, AFLP, ISSR), que el nmero medio de plantas por poblacin vara entre 14.5 y 18.5, resultado que indica que en esta tesis se tiene un muestreo consistente. En Zamia loddigesii, se detectaron un total de 472 bandas diferentes y un promedio de 94.4 bandas en cada poblacin, aunque existe poca informacin sobre el numero de bandas 49

necesarias para los anlisis, Staub et al., (2000) en su estudio indica que casi no existen cambios con respecto a los coeficientes de variacin gentica ms all de 80 bandas, en Zamia loddigesii este nmero fue mayor que 80 en todas las poblaciones. Como se muestra en las figuras 3.2 y 3.3, la distribucin de las bandas entre las poblaciones no es homognea, por el contario, los diferentes valores tienden hacia una u otra poblacin de acuerdo a diversos factores; sin embargo, es importante sealar que el nmero de bandas nicas es muy similar entre las poblaciones del sureste, lo mismo sucede con el nmero de bandas locales, lo que hace que la especie, dentro de estas poblaciones sea genticamente muy similar, debido a que comparten un nmero alto de alelos. Con respecto al nmero de alelos (bandas) por individuo y al nmero de bandas locales, se observa una disminucin de norte a sur, a lo largo de la distribucin de la especie. Esta disminucin en el nmero de bandas podra implicar que el origen de la distribucin de la especie sea probablemente la poblacin de Aldama (i. e., ms nortea) ya que posee ms bandas siendo esta caracterstica un atributo ancestral. En este contexto, Gonzalez-Astorga et al., (2006) encontraron un resultado similar para las mismas poblaciones de Zamia loddigesii usando aloenzimas, detectndose una disminucin de la frecuencia de un alelo (i.e., Malato deshidrogenesa, MDH), desde el norte al sur de la distribucin de la especie. Slatkin (1985) seala que el nmero de alelos privados es un estimador indirecto del flujo gnico, y cuanto ms bajo sea ste, ms alelos de este tipo surgen, y son fijados por eventos de mutacin en una poblacin. Las frecuencias encontradas en los alelos privados de Z. loddigesii (entre 6.3 y 18.7% de la poblacin total), indican que probablemente las poblaciones estudiadas presentan ciertas limitaciones de flujo gnico entre ellas (i.e. aislamiento). Lo que se

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explica por la gran distancia geogrfica entre la poblacin de Aldama y las otras cuatro. Todas las poblaciones presentaron en mayor o menor grado un nmero de alelos fijos, lo que sugiere la existencia de grandes diferencias genticas entre estas. Adems, la presencia de estos alelos, parece distintivo de especies antiguas y relictas (Retegui-Zirena et al., 2009), algo que es caraterstico en las ccadas. 4.2 Composicin gentica de las poblaciones Una de las aproximaciones para la estimacin de la diversidad gentica, usando marcadores dominantes, es integrar los anlisis incluyendo informacin obtenida con datos de marcadores codominantes y as evitar asumir equilibrio Hardy-Weinberg (Narzary et al., 2010). En el presente estudio, se hicieron pruebas con los datos de isoenzimas publicados por GonzlezAstorga et al., (2006), integrando el coeficiente de endogamia (endogamia local: FIS) para los datos de ISSR, sin embargo las diferencias obtenidas fueron mnimas (datos no publicados) y se opt por no considerar este enfoque para permitir la comparacin con otros estudios. Ge y Sun (1999) reportan haber encontrado tambin muy poca diferencia cuando integraron datos de aloenzimas a ISSR. La variacin gentica dentro de las poblaciones es el reflejo de diversos procesos evolutivos, los cuales pueden ser interpretados a partir de la informacin obtenida de los diferentes estimadores de diversidad gentica. A nivel de poblaciones presentan altos nmeros de alelos; adems, existe una gran similitud en el nmero de alelos, las heterocigosis, el ndice de Shannon y el porcentaje de loci polimrficos, entre las poblaciones de Misantla en Veracruz y Oaxaca.

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El polimorfismo en las poblaciones de Aldama y Tabasco, es el ms bajo en la especie (38% y 37.5%, respectivamente), son valores incluso ms bajos que el promedio de las dems y coincide que ambas poblaciones son las que se encuentran en los extremos de la distribucin de la especie, lo cual puede indicar el aislamiento que han tenido, mientras que la poblacin con los valores ms altos se encuentra en el centro de su distribucin (Monte Oscuro, 44%). Wright (1946) demostr que especies con niveles de endogamia significativa pueden resultar de la prdida o fijacin de ciertos alelos dentro de una poblacin, dando como resultando una baja diversidad gentica, esto es particularmente visible en la poblacin de Aldama, que presenta el mayor nmero de bandas fijas y el menor nmero de bandas nicas dentro del anlisis. A nivel de especie, el porcentaje de loci polimrficos es relativamente alto (97.28%), estos loci son los de mayor importancia en aspectos de la biologa de la restauracin, debido a que estos loci polimrficos pueden o no estar adecuadamente representados dependiendo del diseo y ejecucin de un programa de restauracin y conservacin de las especies (Falk et al., 2001). La diversidad gentica resulta tambin ser mucho ms alta a nivel de especie (HT 0.240) que a nivel de poblaciones (HS = 0.142), resultados similares se obtuvieron con ISSR en Magnolia officinalis (Yu et al., 2011) y Emmenopterys henryi (Li y Jin, 2008), rboles que al igual que las ccadas, son especies primitivas, de larga vida y amenazadas en la actualidad por reduccin de su hbitat natural. Esta abundante variacin en las poblaciones y a nivel de la especie, es atribuida como una caracterstica heredada de sus ancestros, lo cual explica la alta diversidad gentica a nivel de especie (Ge y Sun, 1999; Li y Jin, 2008; Yu et al., 2011).

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De acuerdo a nuestra hiptesis que contrasta los niveles de diversidad con aloenzimas e ISSR, cuando comparamos nuestros resultados, se observa que a nivel de especie, con similar nmero de individuos por poblacin analizados, el porcentaje de polimorfismo y el nmero de alelos por locus son ms altos con ISSR que con aloenzimas, resultados que se muestran similares a los reportados en otros estudios (i.e., Buso et al., 1998; Ge y Sun, 1999; Ayers et al., 1999; Xiao et al., 2004; Aboel-Atta, 2009; Jonaviien et al., 2009). Sin embargo, entre las poblaciones sucede lo contrario, esto puede deberse a que el haber muestreado 15 loci aloenzimticos, la representacin del genoma haya sido muy limitada y por lo tanto los resultados exhiban una informacin restringida. Aunque tambin es importante considerar que los marcadores aloenzimticos pueden ser afectados por la seleccin natural, para ello los loci elegidos podran estar adaptados en cuanto a su dinmica enzimtica. Mientras que los marcadores ISSR al ser neutrales y no verse afectados por la accin de la seleccin natural, incluyen informacin de genes no codificantes y la diversidad de la especie podra ser menor que lo detectado por las aloenzimas. Cuadro 4.2 Comparacin entre dos marcadores moleculares en las mimas poblaciones de Zamia loddigesii.
Aloenzimas* Poblacin N PP Aldama 20.8 66.6 Misantla Monte 19.5 73.3 Oscuro Oaxaca 21.5 60.0 Tabasco 19.2 66.6 Especie 20.25 66.6 *Gonzlez-Astorga et al. (2006). Na 1.93 1.73 1.80 1.73 1.80 HE 0.291 0.233 0.273 0.268 0.266 N 20 20 20 15 16 PP 38.04 40.76 44.57 40.76 37.50 97.28 ISSR Na 1.38 1.40 1.44 1.40 1.37 1.97 HE 0.128 0.149 0.143 0.149 0.140 0.240

4.3 Estructura gentica La estructura gentica de la poblacin puede ser resultado de muchos factores, incluyendo el efecto de la deriva gnica, el sistema de cruzamiento, el flujo gnico, la seleccin natural y la

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historia ecolgica de la especie, lo cual implica cambios en la distribucin de los poblaciones y de los individuos al seno de las mismas, por efecto de la fragmentacin del hbitat, lo cual da como resultado el aislamiento geogrfico entre poblaciones (Ellstrand y Ellam, 1993). De acuerdo al anlisis con el estimador theta (FST) de TFPGA, nuestros resultados indican, un grado de diferenciacin del 44.4% entre las poblaciones. Este resultado sugiere que existe una mayor estructuracin gentica en las poblaciones de Zamia loddigesii usando ISSR, que respecto a lo que se haba reportado para esas mismas poblaciones con aloenzimas (cf. FST = 0.179; Gonzlez-Astorga, et al., 2006). El estadstico GST es tpicamente usado para describir la cantidad promedio de diferenciacin observada sobre mltiples loci (Ryman y Leimar, 2009), en nuestro estudio este valor es de 0.4092. Aunque GST suele ser usado como un anlogo al FST, los resultados obtenidos no fueron exactamente los mismos, esto puede deberse a que el valor de GST es afectado por las diferencias en las tasas de mutacin en los distintos loci evaluados (Ryman y Leimar, 2009). Tambin, la discordancia entre FST y GST se puede deber a que los estimadores de diversidad por poblacin sean muy variables (Nei, 1973), cosa que no es el caso de los resultados de esta tesis (ver Cuadro 3.5) ya que las diferencia entre FST y la GST es de solo el 3%. Los resultados que se obtienen con los mtodos convencionales a partir de los estadsticos de Wright, son similares a los obtenidos siguiendo la aproximacin de modelos bayesianos (Holsinger et al., 2002); siendo estos ltimos ligeramente ms consistentes ya que no se requiere asumir el equilibrio Hardy-Weinberg en las poblaciones. Los resultados obtenidos a partir de diferentes enfoques, nos permiten tener una mayor verosimilitud, ya que ante la imposibilidad de calcular el ndice de endogamia (F IS) con

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marcadores dominantes y asumir a las poblaciones en equilibrio Hardy-Weinberg como en los enfoques tradicionales, permite comparar los resultados y observar las diferencias y similitudes (Cuadro 4.3). Adems, considerando que el abordaje que se plantea con los modelos

bayesianos involucra el no tener que definir si las poblaciones estn o no en equilibrio, sino que conforme las iteraciones avanzan, ste valor es estimado. Cuadro 4.3 Comparacin de ndices bajo dos enfoques
ndice [HS] Aldama [HS]Misantla [HS]Monte Oscuro [HS]Oaxaca [HS]Tabasco HT GST-B PopGene 0.525 0.1286 0.1490 0.1435 0.1499 0.1402 0.2408 0.4092 Hickory 0.560 0.139 0.164 0.157 0.168 0.148 0.284 0.452

Hubo sin embargo un detalle en la estimacin de FIS que se observ al comparar los resultados obtenidos de aloenzimas (cf. Gonzlez-Astorga et al., 2006) y los estimados con el programa Hickory, esto es, que el valor estimado de este ltimo es de f = 0.778, mientras que con datos de marcadores codominantes el estimado de la endogamia local es de FIS = 0.041, esto aparentemente surge no como un problema de sentido biolgico, sino como un aspecto de la forma como se analizan los datos y se estiman los estadsticos (Holsinger y Lewis, 2003), donde se advierte que los marcadores dominantes pueden no ser muy apropiados para estimar (FIS), al menos bajo un marco bayesiano, lo cual se explica a partir de que los tamaos de muestra de las poblaciones son bajos; sin embargo otros estudios con poblaciones naturales y con simulaciones (Levsen et al., 2008) indican que es un problema que va ms all del tamao de las poblaciones y se recomienda no confiar demasiado en estos valores si los resultados son muy contrastantes.

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4.4 Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) En Zamia loddigesii, la mayor riqueza en diversidad gentica est distribuida entre sus poblaciones (52.2%), ms que dentro de ellas (47.7%). Se ha planteado que el nivel de heterogeneidad gentica entre poblaciones es mayor en especies con poblaciones geogrficamente disjuntas, que especies con distribuciones continuas (Hamrick y Godt, 1996). El rango de distribucin de Z. loddigesii ha sido gradualmente limitado a pequeas reas aisladas y eventualmente se ha dividido en pequeas poblaciones tipo islas. As, la diferenciacin gentica probablemente haya ocurrido despus de que estas barreras hayan surgido. En general, muchos estudios suelen considerar en el anlisis de diferenciacin, a los estadsticos FST, GST y ST como equivalentes, aunque nuestros resultados muestran que los ndices no son idnticos, s podemos afirmar que en todos los casos, el grado de estructuracin entre las poblaciones de Z. loddigesii es relativamente alto, de un 40.9% al 56%. A partir del valor de GST se estim el flujo gnico (Nm), que se refiere al movimiento de individuos entre las poblaciones, donde Nm = 0.361, lo cual nos indica que menos de un individuo est migrando por generacin. Ellstrand y Ellam (1993) sostienen que una tasa de migracin de 0.5 es considerado suficiente para superar los efectos de la deriva gnica, por lo que podemos deducir que la deriva gnica est moldeando la estructura al interior de las poblaciones. Esto se corrobora con los estimados de tamao efectivo detectados con marcadores dominantes en las mismas poblaciones, donde se encontr que este tamao efectivo vara de 9 a 57 individuos por poblacin con una media de Ne = 20 15 (cf. GonzlezAstorga et al., 2006), lo cual es sintomtico de que las poblaciones remanentes son relativamente pequeas, y siguiendo a Octavio-Aguilar et al., (2009) esto representa

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aproximadamente la cuarta parte de la poblacin de tamao demogrfico N T el cual variara de entre ca. 40 a 200 plantas por poblacin. De acuerdo a Hamrick y Godt (1996) y Hamrick et al., (1991), la distribucin de la variacin gentica est fuertemente relacionada con caracteres de historia de vida, particularmente con los sistemas reproductivos y la dispersin, para ello el flujo gnico tambin puede ser obstruido por barreras fsicas, que impidan a un migrante atravesarlas, as como tambin pueden impedir el paso de un polinizador o dispersor (Levin, 1981; Slatkin, 1987). Al respecto, el nivel de flujo gnico va polen depende de la capacidad migratoria del polinizador. La evidencia nos indica que muchas ccadas tienen asociaciones simbiticas con insectos especficos, la mayora escarabajos y gorgojos. Tales insectos son atrados a los conos de las ccadas, algunas veces por fragancias, algunas veces por comida, albergue, lugar de cra y probablemente por combinaciones de todas ellas (Norstog y Fawcett, 1989; Norstog et al., 1992; Stevenson et al., 1998; Vovides, 1991; Vovides et al., 1997), dando oportunidad a la polinizacin; sin embargo, con los cambios en la reduccin de las poblaciones, el saqueo de plantas, los incendios a los que se ven sometidas, causa que los polinizadores tambin se vean afectados (cf. Negrn-Ortz y Breckon, 1989; Negrn-Ortz et al., 1996). Por lo que con el transcurso del tiempo las poblaciones se vuelven cada vez ms aisladas, y el trnsito de los polinizadores es muy probable que sea cada vez ms difcil. En este contexto, y acentuando el aislamiento de las poblaciones de ccadas por la biologa de los polinizadores, Hall et al., (2004) encontraron que el movimiento del polen por parte de los machos de curculionidos es muy bajo, menos de cinco metros en Lepidozamia peroffskyana.

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En el cuadro 4.4, se resume la informacin de un estudio previo de Zamia loddigesii con aloenzimas (Gonzlez-Astorga et al., 2006), junto con los estudios que se han realizado en ccadas que utilizan marcadores dominantes de DNA; se incluye el nico artculo donde se analizan ISSR en diferentes especies de plantas y se discute con su forma de vida, rea de distribucin y forma de reproduccin (Nybom, 2004), finalmente realizamos una revisin de artculos donde se incluyen 74 plantas de larga vida y con algn grado de amenaza en sus poblaciones, usando nicamente marcadores ISSR. Cuadro 4.4 Resumen de diferentes estudios usando marcadores moleculares
Zamia loddigesii Cycas fairylakea Encephalartos latifrons Encephalartos barteri Cycas guizhouensis Cycas parvula Cycas balansae Cycas debaoensis Cycas balansae Promedio sin los datos propios 14 estudios 74 rboles Primers 11 6 16 11 12 12 9 12 11.14 11.9 PP 97.28 60.22 84.17 93.75 35.90 25.00 40.00 57.40 60.19 57.03 64.62 Na 1.38 I 0.38 0.232 0.347 0.169 0.083 0.192 0.315 0.316 0.236 0.250 HE GST/FST 0.240 0.409 0.356 0.315 0.138 0.026 0.297 0.231 0.108 0.432 0.054 0.098 0.13 0.400 0.215 0.342 0.211 0.602 0.188 0.220 0.232 0.305 0.340 0.379 ST 0.525 0.257 0.590 0.323 0.125 0.370 Nm 0.361 0.544 9.365 0.832 0.328 2.305 0.374 0.481 0.330 0.727 0.735 ISSR ISSR Nybom 2004 Marcador Referencia ISSR Presente tesis AFLP Jian et al., 2006 AFLP Da Silva et al., 2012 RAPD Eku et al., 2008 ISSR Xiao et al., 2004 ISSR Xiao et al., 2005 ISSR Xiao et al., 2005 ISSR Xie et al., 2005 ISSR Xiao y Gong 2006

1.93 1.09 1.23 1.36 1.40 1.30

0.226 0.350 0.368

En un anlisis con los principales marcadores moleculares dominantes Nybom (2004) indica que las especies de larga vida son las que presentan los valores ms bajos de diferenciacin gentica entre poblaciones (ST = 0.25), as como los ms altos en diversidad gentica dentro de las poblaciones (HS = 0.25), mientras que los valores ms altos corresponden a las formas de vida anuales (ST = 0.62 y HS = 0.13, respectivamente), los resultados obtenidos en Zamia loddigesii, son ms parecidos a los encontrados en especies anuales, que a especies de larga vida. De igual forma, tomado en cuenta el sistema reproductivo en Z. loddigesii que es por fecundacin cruzada, respecto los valores que reporta Nybom (2004), en nuestro estudio es ms

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parecido a las especies vegetales con autofecundacin (ST = 0.65), que a las especies con fecundacin cruzada (ST = 0.27). Comparando los resultados presentados por Nybom (2004), con los obtenidos en nuestro anlisis de 74 especies, se nota que la informacin es muy similar a lo ya reportado. Se observa que en las poblaciones de Zamia loddigesii hay valores de diversidad mayores a varias especies de plantas de larga vida, as como en el nmero de alelos y el ndice de diversidad de Shannon, mientras es evidente que el grado de diferenciacin entre las poblaciones es ms alto en Z. loddigesii que en especies de vida larga, este ltimo resultado se puede deber a que las poblaciones estudiadas estn expuestas al efecto de la fragmentacin del hbitat, aunque an no ha habido efecto de prdida de diversidad gentica, la cual se mantiene en plantas las adultas. Quiz una forma de detectar este efecto es evaluar otros estadios como semillas y plntulas (cf. Gonzlez-Astorga y Nez-Farfn, 2001; Gonzlez-Astorga y Castillo-Campos, 2004), aunque en un estudio por categoras de historia de vida en Dioon edule, Octavio-Aguilar et al., (2009) encontraron que la cohorte de las semillas son un reservorio de variacin gentica, cosa que tambin podra estar ocurriendo en las poblaciones de Z. loddigesii. Al comparar nicamente entre especies de ccadas, vemos que Encephalartos barteri Carruth ex Miq., posee tambin altos ndices de diversidad, pero a pesar de ser una especie vulnerable de acuerdo a la IUCN, se encuentran menos estructuradas sus poblaciones y mantiene un flujo mayor de individuos que Z. loddigesii. En promedio para los datos acumulados de ccadas, el porcentaje de polimorfismo que se obtiene es muy inferior (57.03%), comparado a los valores de Z. loddigesii.

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Con el nmero de primers usados, se obtuvieron buenos resultados para la deteccin de diversidad gentica en Zamia loddigesii, es hasta ahora la especie con ms altos ndices de polimorfismo; as, en otras cuatro especies (Xiao et al., 2005; Xiao y Gong, 2006; Eku et al., 2008) se han empleado un mayor nmero de primers en sus estudios (de 12 a 16) y la diversidad muestreada no ha sido tan alta, tampoco en el nmero de bandas reportadas por individuo. Es de resaltar los bajos ndices reportados en Cycas parvula (25% de polimorfismo), donde se emplearon 12 primers, nuestros resultados indican que con el nmero de primers usados, se tiene una buena representacin del genoma, que aporta informacin sobre la diversidad gentica de Z. loddigesii. Ha sido reportada una alta diversidad gentica en otras ccadas que tienen distribucin restringida y bajas densidades poblacionales (cf. Macrozamia riedlei: Byrne y James, 1991; Dioon edule: Gonzlez-Astorga et al., 2003; D. angustifolium: Gonzlez-Astorga et al., 2005; D. sonorense, D. tomasellii y D. holmgrenii: Gonzlez-Astorga et al., 2008). Otra informacin que se obtiene de estas comparaciones es ver que en la mayora de estudios sobre diversidad gentica con especies del orden cicadales, ha mostrado que las ccadas se caracterizan por baja variacin dentro de las poblaciones y alta diferenciacin entre poblaciones (Ellstrand et al., 1990; Walters y Decker Walters, 1991; Yang y Meerow, 1996; Sharma et al., 1999; Gonzlez-Astorga et al., 2003, 2005, 2006, 2008; Xiao et al., 2004, 2005; Xiao y Gong, 2006; Cibrin-Jaramillo et al., 2010; Xiao et al., 2004; Xiao et al., 2005; Da Silva et al., 2012), resultados que concuerdan con la hiptesis planteada para Z. loddigesii, donde se esperaba que de acuerdo con estos antecedentes la diferenciacin fuera mayor entre poblaciones, que dentro de ellas.

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4.5 Distancias genticas Las distancias genticas en algunas poblaciones fueron muy similares. La menor distancia est entre las poblaciones de Monte Oscuro y Tabasco (0.1289), se esperara que estos valores bajos fueran entre las poblaciones de Misantla y Monte Oscuro (ambas en Veracruz) por ser las ms prximas geogrficamente. Por otro lado, las distancias genticas entre las poblaciones de Monte Oscuro, Oaxaca y Tabasco fueron muy parecidas, algo que en los dendrogramas complica la construccin de los nodos. Esta falta de concordancia se puede deber al origen diferencial de las poblaciones. 4.6 Anlisis de agrupamiento Debido a los resultados obtenidos y comentados en las distancias genticas entre las poblaciones y entre los individuos, los dos mtodos de agrupacin usados difieren en cuanto a las agrupaciones obtenidas. 4.6.1 UPGMA El dendrograma usando el mtodo de Nei (1978) se construy siguiendo varios algoritmos y entre todas las repeticiones tenemos que en ocasiones las poblaciones de Oaxaca y Tabasco, son las ms emparentadas, mientras que en otras, se agrupan Monte Oscuro y Tabasco (como el dendrograma mostrado en la figura 3.4). Esta dificultad obedece a que el mtodo, ejecuta una reduccin progresiva de la matriz de similaridad por lo que en ocasiones el programa asocia de una manera, y de forma diferente en otras, seleccionando a una poblacin distinta con la misma probabilidad. Esto es evidente entre el nodo que agrupa a Monte Oscuro con Tabasco cuya distancia es de 0.128, mientras que en el siguiente nivel que incluye a la poblacin de Oaxaca la distancia

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es de 0.130, por lo que la diferencia entre estas tres poblaciones es muy escasa. 4.6.2 Neighbor-Joining Los resultados para Zamia loddigesii muestran que todos los individuos pertenecen a sus correspondientes poblaciones, sin embargo debido a que los modelos utilizan distancias genticas y como se coment previamente, los resultados variaron entre las diferentes repeticiones. Manteniendo de forma general una agrupacin entre las poblaciones de Monte Oscuro en Veracruz, Oaxaca y Tabasco. 4.6.3 Anlisis de Coordenadas Principales (PCoA) Los dendrogramas construidos para Zamia loddigesii, aportan poca informacin sobre la distribucin de las poblaciones, sin embargo con un PCoA se puede apreciar cmo se organizan los individuos en un espacio tridimensional. Las poblaciones que resultaban en complicaciones para los dendrogramas, cuando las poblaciones que resultaban en complicacin para los dendrogramas se visualizan en el espacio tridimensional, se puede notar que se encuentran muy prximas y que cualquier individuo podra estar fcilmente relacionado con la poblacin vecina. Por otra parte, la poblacin de Misantla en Veracruz, que se ubica en el centro de la distribucin de la especie, result ser la ms distanciada de las dems poblaciones, lo que nos proporciona indicios de una falta de relacin entre la distancia gentica y geogrfica de la especie. 4.7 Anlisis Espacial de Varianza Molecular (SAMOVA) El SAMOVA, mostr que ninguno de los tres escenarios probados fuera significativo. Sin embargo, la forma de agrupamiento entre poblaciones en consistente con los UPGMA construidos. Cuando se formaron tres grupos (K = 3), el anlisis incluy en el mismo grupo a las

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poblaciones de Monte Oscuro en Veracruz, Oaxaca y Tabasco (sureste) y separ a Aldama en Tamaulipas y Misantla en Veracruz, esto como resultado de las diferencias tanto en la mayora de ndices, donde la poblacin de Aldama es una de las menos diversas, mientras que Monte Oscuro en Veracruz, Oaxaca y Tabasco son muy similares entre ellas, incluso geogrficamente y Misantla es separada del anlisis por poseer valores ms altos que los dems, a pesar de encontrarse geogrficamente relacionada con el grupo del sureste, algo que podra deberse a un origen relativamente reciente de la poblacin de Misantla. 4.8 Prueba de Mantel Respecto a la relacin de la distancia geogrfica con la distancia gentica, nuestra hiptesis planteada suscribe que las poblaciones ms cercanas, sern ms semejantes genticamente. Sin embargo la prueba de Mantel confirma que no existe una relacin significativa entre ambas distancias, lo cual sugiere que Zamia loddigesii no sigue un modelo de aislamiento por distancia sensu Wright (1943). stos resultados contrastan con otros estudios en ccadas como el caso de Dioon edule donde s se encontr una relacin entre la distancia geogrfica y la gentica (Gonzalez-Astorga et al., 2003) A pesar de que los resultados muestran que no existe correlacin entre la distancia geogrfica y la distancia gentica entre todas las poblaciones analizadas, se puede decir que hay una tendencia a considerar que la distancia influye en la diferenciacin gentica de algunas agrupaciones, en particular en la disminucin de la diversidad. Por ejemplo, las poblaciones de Aldama y Tabasco son las poblaciones que se encuentran ms distanciadas, esto es, en ambos extremos de la distribucin de la especie y son tambin estas poblaciones las que poseen los valores ms bajos de diversidad en polimorfismos.

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Generalmente, el grado de diferenciacin de una especie surge con el incremento de la distancia geogrfica (Wright, 1946; Moyle, 2006; Pusadee et al., 2009), sin embargo esto no aplica para Z. loddigesii (prueba de Mantel). Los resultados mostraron que la diferenciacin gentica es afectada no solo por deriva gentica y aislamiento geogrfico, sino por otros factores. Primero, al comparar los resultados obtenidos con las distancias geogrficas, la poblacin de Monte Oscuro en todos los anlisis, se agrupa con las poblaciones del sur: Oaxaca y Tabasco, donde la distancia que los separa es de 141.1 y 398.6 km respectivamente, mientras que existe muy poca relacin gentica con la poblacin de Misantla, donde la distancia que los separa es de apenas 70km, estos resultados podran sugerir que la deriva gnica es una fuerza que ejerce presin sobre estas poblaciones (Xiao et al., 2004). Segundo, la destruccin/reduccin del rea de distribucin, afecta el flujo gnico de la especie. Aldama puede representar una poblacin genticamente aislada con un tamao de poblacin, relativamente pequeo, debido a su tamao y endogamia en marcha, aumentada por deriva gentica, podra explicar la fijacin de bandas y un nmero muy bajo en el nmero de alelos efectivos (Templeton, 2006). Por lo tanto, una existencia discontinua y pequeos tamaos de poblacin relacionadas con esta distribucin, son factores importantes que resultan en un alto grado de diferenciacin entre poblaciones. Tercero, las distancias genticas sugieren que existen ciertas restricciones geogrficas influenciando las agrupaciones entre las poblaciones. Un factor importante podra ser la franja que representa el Eje Neovolcnico Transversal, ya que es una barrera geogrfica que podra limitar la distribucin no solo de los individuos, sino constituir una barrera insuperable para los

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polinizadores de Zamia loddigesii, principalmente insectos de la superfamilia Curculionoidea (Norstog y Fawcett, 1989; Norstog et al., 1992, Vovides et al., 1997). Finalmente, sustentados en la acumulacin de esta informacin, as como el alto nmero de bandas nicas que la caracteriza y estar alejada genticamente del resto de las poblaciones (PCoA, figura 3.6), nos lleva a proponer que Misantla es una poblacin de origen reciente y podra haberse originado a partir de la poblacin de Monte Oscuro, considerando su alta diversidad y sobre todo la proximidad geogrfica y gentica que las une. 4.9 Implicaciones para la conservacin El conocimiento de la variacin gentica entre y dentro de las poblaciones de especies raras y amenazadas juega un papel muy importante en la formulacin de estrategias apropiadas para su manejo y conservacin. Nuestros resultados indican que Zamia loddigesii posee relativamente altos niveles de diversidad gentica y una alta diferenciacin espacial en su rango de distribucin. Considerando el alto nivel de diferenciacin gentica entre las poblaciones, todas las poblaciones deben ser protegidas in situ para conservar la variacin existente en la especie. La preocupacin principal est en las poblaciones de Monte Oscuro, Misantla y Oaxaca, que son las ms diversas y poseen alelos particulares, en contraste, son poblaciones que no estn protegidas localmente, por lo que es importante tomar acciones para resguardarlas. El establecimiento de reas protegidas alrededor de estas poblaciones podra ser la mejor opcin para conservar los recursos genticos de la especie. La poblacin de Monte Oscuro es la nica donde ya se han tomado ciertas medidas para proteger a la poblacin y seguir un uso sustentable de la poblacin (Vovides et al., 2002). Dicho lo anterior, de considerarse la

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conservacin ex situ, las semillas deben ser colectadas, pero evitando ser mezcladas entre las poblaciones para mantener su estructura gentica. El plan de accin de ccadas de la IUCN/SSC (Donaldson, 2003) identific un nmero de posibles intervenciones para el manejo de poblaciones pequeas de ccadas, incluyendo la introduccin de plntulas a jardines botnicos, polinizacin artificial de plantas silvestres y la translocacin de plantas para crear subpoblaciones viables con proporciones de sexos balanceadas. De este modo se favorecera la conservacin in situ al disminuir la extraccin de ejemplares de las poblaciones naturales y la conservacin ex situ al promover la supervivencia de ejemplares fuera de su medio natural (Primack, 1993). 4.10 Conclusiones Zamia loddigesii, es una especie de amplia distribucin en Mxico, puede vivir en diferentes tipos de hbitats y adaptarse a condiciones adversas, lo que le ha permitido permanecer como especie. Los marcadores moleculares ISSR son una herramienta til en el estudio de la diversidad gentica en especies que han sido poco estudiadas, estos marcadores, proveen de un alto nmero de bandas, e informacin para caracterizar a nivel de individuos y poblaciones. De acuerdo a nuestras hiptesis, los niveles de diversidad gentica fueron superiores a los reportados con aloenzimas y se encontr una mayor diversidad entre las poblaciones, que dentro de ellas. Sin embargo a diferencia de lo que se esperaba en nuestra hiptesis, la distribucin de la especie no sigue un modelo de aislamiento por distancia, sino que la distribucin actual de las poblaciones obedece a procesos ms all de la distancia.

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Zamia loddigesii, posee altos niveles de diversidad a nivel de especie, pero a nivel de poblaciones su diversidad es baja. Los resultados indican que las poblaciones ubicadas en los extremos de la distribucin de la especie, presentan problemas en la fijacin de bandas y prdida de diversidad. Numerosos estudios tericos y empricos predicen que la reduccin en el tamao efectivo de la poblacin y un incremento en el aislamiento de las poblaciones puede llevar a una erosin gentica a travs de una mayor deriva gentica (Ellstran y Elam, 1993), mayor endogamia (Keller y Waller, 2002) flujo gnico restringido y reducidas tasas de inmigracin (Couvet, 2002; Li y Jin, 2008). La dificultad para separar en los fenogramas a las poblaciones de Monte Oscuro, Oaxaca y Tabasco, obedece a la similitud que comparten en el nmero de alelos, diversidad de Shannon y de Nei. Esta informacin nos lleva a proponer una reconstruccin de los eventos que pudieron dar origen a la estructuracin actual de las poblaciones (Figura 4.2). Planteamos que Zamia loddigesii, tuvo una distribucin continua desde Tamaulipas, hasta Tabasco o Chiapas, posiblemente originado del Norte, debido a su mayor nmero de bandas por individuo. En un segundo momento, hubo una reduccin y aislamiento en la poblacin de Aldama, esto por su alto nmero de bandas fijas y sus bajos valores de diversidad en general. Con el tiempo, surge la poblacin de Misantla a partir de una poblacin con alta diversidad: Monte Oscuro (y tal vez Oaxaca), de igual forma, las distancias genticas y geogrficas las avecinan. Finalmente, la poblacin de Tabasco presenta bajos valores de diversidad, pudiendo ser esto como consecuencia de un aislamiento que empieza a notarse en la fijacin de sus bandas, que para este caso, representa pocas bandas por individuo y por lo

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tanto menor polimorfismo. Esto potenciado por los bajos valores de flujo gnico que existe entre todas las poblaciones.

Figura 4.2 Reconstruccin de escenarios

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LITERATURA CITADA Aboel-Atta, A.I.I. 2009. Isozymes, RAPD and ISSR Variation in Melilotus indica (L.) All. and M. siculus (Turra) B.G. Jacks. (Leguminosae). Academic Journal of Plant Sciences 2 (2):113118. Aiton, W. 1789. Zamia. Hortus Kewensis 3:477-479. Ali, S., Muller, C.R., Epplen, J.T. 1986. DNA finger printing by oligonucleotide probes specific for simple repeats. Human Genetics. 74:239-243. Ayers, D.R. & Ryan, F.J. 1999. Genetic diversity and structure of the narrow endemic Wyethia reticulata and its congener W. bolanderi (Asteraceae) using RAPD and allozyme techniques. American Journal of Botany 86:344353. Azofeifa-Delgado, A. 2006. Uso de marcadores moleculares en plantas: aplicaciones en frutales del trpico. Agronoma Mesoamericana 17(2):221-242. Balduzzi, A., De Luca, P., & Sabato S. 1982. A phytogeographical approach to the New World cycads. Delphinoa, n.s., 24: 185-202. Beckman, J.S. & Soller, M. 1983. Restriction fragment length polymorphism in genetic improvement: methodologies, mapping and cost. Theoretical and Applied Genetics 67, 33-43. Byrne, M. & James, S.H. 1991. Genetic diversity in the cycad Macrozamia riedlei. Heredity 67: 3539. Bonta, M. & Osborne, R. 2007. Cycads in the vernacular a compendium of local names. In A.P. Vovides, D.W. Stevenson & R. Osborne (eds), Proceedings of the Seventh International

69

Conference on Cycad Biology (Xalapa, Mxico, 2005). Memoirs of the New York Botanical Garden 97: 143175. Bornet, B. & Branchard, M. 2001. Nonanchored Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Molecular Biology Reporter 19: 209-215. Buso, G.S.C., Rangel, P.H. & Ferreira, M.E. 1998. Analysis of genetic variability of South American wild rice populations (Oryza glumaepatula) with isozymes and RAPD markers. Molecular Ecology, 7: 107117. Cabrera-Toledo, D., Gonzlez-Astorga, J., Nicolalde-Morejn, F., Vergara-Silva, F. & Vovides, A.P. 2010. Allozyme diversity levels on two congeneric Dioon spp. (Zamiaceae, Cycadales) with contrasting rarities. Plant Systematics And Evolution 290: 115-125. Chemnick, J. & Gregory, T. 2010a. Zamia loddigesii. In: IUCN 2011. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2011.2. <www.iucnredlist.org>. Downloaded on 26 June 2012. Chemnick, J. & Gregory, T. 2010b. Zamia furfuracea. In: IUCN 2012. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2012.1. <www.iucnredlist.org>. Downloaded on 26 June 2012. Cibrin-Jaramillo, A., Daly, A., Brenner, E., Desalle, R., & Marler, T. 2010. When North and South dont mix: genetic connectivity of a recently endangered oceanic cycad, Cycas micronesica, in Guam using ESTmicrosatellites. Molecular Ecology 19: 2364-2379. Condit, R., & Hubbell, S.P. 1991. Abundance and DNA sequence of two-base repeats in plant genomes. Genome, 34: 66-71.

70

Contreras-Medina, R., Luna, I. & Alcntara, O. 2003. Zamiaceae en Hidalgo, Mxico. Anales del Instituto de Biologa, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Serie Botnica 74 (2): 289-301. Couvet, D. 2002. Deleterious effects of restricted gene ow infragmented populations. Conservation Biology 16: 369376. Culley, M.T. & Wolfe, A.D. 2001. Population genetic structure of the cleistogamous plant species Viola pubescens Aiton (Violaceae), as indicated by allozyme and ISSR molecular markers. Heredity 86: 545-556. Da Silva, J., Donaldson, J.S., Gail-Reeves., & Hedderson T.A. 2012. Population genetics and conservation of critically small cycad populations: a case study of the Albany Cycad, Encephalartos latifrons (Lehmann). Biological Journal of the Linnean Society 105(2): 293-308. Dalirsefat, S.B., Meyer, A., & Mirhoseini, S.Z. 2009. Comparison of similarity coefficients used for cluster analysis with amplified fragment length polymorphism markers in the silkworm, Bombyx mori. Journal of Insect Science , 9:71: 681-689. Dice, L.R. 1945. Measures of the Amount of Ecologic Association Between Species. Ecology 26 (3): 297302. Donaldson, J.S. 2003. Introduction. En: Donaldson JD, ed. Cycads. Status survey and conservation action plan. Switzerland and Cambridge, UK: IUCN-The World Conservation Union. Pp. 1-2. Dupanloup, I., Schneider, S. & Excoffier, L. 2002. A simulated annealing approach to define the genetic structure of populations. Molecular Ecology 11(12): 2571-81.

71

Eku M.R.M., Gailing, O., Hlscher, D., Sinsin, B. & Finkeldey, R. 2008. Population genetics of the cycad Encephalartos barteri ssp. Barteri (Zamiaceae) in Benin with notes on leaflet morphology and implications for conservation. Belgian Journal of Botany 141: 7894. Ellstrand N.C. & Ellam, D.R. 1993. Population genetic consequences of small population size: implications for plant conservation. Annual Review of Ecology and Systematics 24: 217242. Esselman, E.J., Jianqiang, L., Crawford, D.J., Windus, & Wolfe, A.D. 1999. Clonal diversity in the rare Calamagrostis porteri ssp. insperata (Poaceae): comparative results for allozymes and random amplified polymorphic DNA (RAPD) and intersimple sequence repeat (ISSR) markers. Molecular Ecology 8: 443-451. Excoffier, L., Smouse, P.E., & Quattro, J.M. 1992. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131: 479-491. Excoffier, L.L.G. & Schneider, S. 2005. Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for population genetics data analysis. Evolution, Bioinformatics and Evolutionary Bioinformatics Online 1: 47-50. Fahima, T., Sun, G.L., Beharav, A., Krugman, T., Beiles A. & Nevo, E. 1999. RAPD polymorphism of wild emmer wheat populations, Triticum dicoccoides, in Israel. Theoretical and Applied Genetics, 98: 434-447. Falk, D.A., Knapp, E.E. & Guerrant, E.O. 2001. An Introduction to Restoration Genetics. Plant Conservation Alliance, Bureau of Land Management, US Department of Interior,US Environmental Protection Agency. USA

72

Galvan M.Z., Bornet, B., Balatti, P.A. & Branchard, M. 2003. Inter simple sequence repeat (ISSR) markers as a tool for the assessment of both genetic diversity and gene pool origin in common bean (Phaseolus vulgaris L.). Euphytica 132: 297-301. Ge, X.J. & Sun, M. 1999. Reproductive biology and genetic diversity of a cryptoviviparous mangrove Aegiceras corniculatum (Myrsinaceae) using allozyme and intersimple sequence repeat (ISSR) analysis. Molecular Ecology, 8: 20612069. Godwin, I.D., Aitken E.A.B. & Smith, L.W. 1997. Application of inter simple sequence repeat (ISSR) markers to plant genetics. Electrophoresis, 18: 1524-1528. Gonzlez, A. & Aguirre, X. 2007. Captulo 19: Inter simple sequence repeats (ISSR's). En Eguiarte, Souza y Aguirre (comps). Ecologa Molecular. Instituto Nacional de Ecologa, Semarnat. Mxico. Gonzlez-Astorga, J., & Nez-Farfn, J. 2001. Effect of habitat fragmentation on the genetic structure of the narrow endemic Brongniartia vazquezii. Evolutionary Ecology Research, 3: 861-872. Gonzlez-Astorga, J., & Castillo-Campos, G. 2004. Genetic variability of the narrow endemic tree Antirhea aromatica (Rubiaceae, Guettardeae) in a tropical forest of Mexico. Annals Of Botany, 93: 521-528. Gonzlez-Astorga, J., Vovides, A.P., Ferrer, M., & Iglesias, C. 2003. Population genetics of Dioon edule Lindl. (Zamiaceae, Cycadales): biogeographical and evolutionary implications. Biological Journal Of The Linnean Society, 80: 457-467. Gonzlez-Astorga, J., Vovides, A.P., Cruz-Angn, A., Octavio-Aguilar, P., & Iglesias, C. 2005. Allozyme variation Miq. (Zamiaceae) from north eastern Mexico. in the three extant

73

populations of the narrowly endemic cycad Dioon angustifolium. Annals of Botany, 95: 999-1007. Gonzlez-Astorga, J., Vovides, A. P., Octavio-Aguilar, P., Aguirre-Fey, D., Nicolalde-Morejn, F. & Iglesias, C. 2006. Genetic diversity and structure of the cycad Zamia loddigesii Miq. (Zamiaceae): implications for evolution and conservation. Botanical Journal of the Linnean Society, 152: 533-544. Gonzlez-Astorga J. A., Vergara-Silva, F., Vovides, A.P., Nicolalde-Morejn, F., Cabrera-Toledo, D. & Prez-Farrera, M. A. 2008. Diversity and genetic structure of three species of Dioon Lindl. (Zamiaceae, Cycadales) from the Pacific seaboard of Mxico. Biological Journal of the Linnean Society, 94: 765-776. Gregorius, H.R. 2010. Linking diversity and differentiation. Diversity 2: 370-394. Gupta, M., Chyi, Y.S., Romero-Severson, J. & Owen, J.L. 1994. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats. Theoretical and Applied Genetics, 89: 998-1006. Hall, J.A., Walter, G.H., Bergstrom, D.M. & Machin, P.J. 2004. Pollination ecology of the Australian cycad Lepidozamia peroffskyana (Zamiaceae). Australian Journal of Botany, 52: 333343. Hamada, H., & Kakunaga, T. 1982. Potential Z-DNA sequences are highly dispersed in the human genome. Nature, 298: 396-398. Hamrick, J.L. & Godt, M.J.W. 1996. Effects of life history traits on genetic diversity in plant species. Philosophical Transactions of the Royal Society of London - Series B: Biological Sciences, 351: 1291-1298.

74

Hamrick, J.L., Godt, M.J.W., Murawski, D.A. & Loveless, M.D. 1991. Correlations between species traits and allozyme diversity: Implications for conservation biology. pp. 75-86. In Falk, D. and K. Holsinger (eds.) Genetics and Conservation of Rare Plants, Oxford Press. London. Hartl, D.L. & Clark, A.G., 1997. Principles of Population Genetics. 3 ed. Sinauer Associates, Sunderland, MA. Haymes, K.M., Ibrahim, I.A., Mischke, S., Scott, D.L., & Saunders, J.A. 2004. Rapid isolation of DNA from chocolate and date palm tree crops. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(17): 5456-62. Haynes, J.L. 2009. Etymological Compendium of Cycad Names. The Cycad Society. 19 pp Hoffmann, M., Hilton-Taylor, C., Angulo, A., Bhm, M., Brooks, T.M., Butchart, S.H.M., Carpenter, K.E., Chanson, J., Collen, B., Cox, N. A., Darwall W.R.T., Dulvy, N.K., Harrison, L.R., Katariya, V., Pollock C. M., Quader, S., Richman N.I., Rodrigues, A.S.L., Tognelli, M.F. Vi J-C., Aguiar, J.M., Allen, D.J., Allen, G.R., Amori G., Ananjeva, N.B., Andreone, F., Andrew, P., Aquino Ortiz A.L., Baillie, J.E.M., Baldi, R., Bell, Ben D., Biju, S.D., Bird, J. P., Black-Decima, P., Blanc, J. J., Bolaos, F., Bolivar, W., Burfield, I. J., Burton, J.A., Capper, D.R., Castro, F., Catullo, G., Cavanagh, R.D., Channing, A., Chao, N.L., Chenery, A. M., Chiozza, F., Clausnitzer, V., Collar, N. J., Collett, L. C., Collette, B. B., Cortez Fernandez, C. F., Craig, M.T., Crosby, M.J., Cumberlidge, N., Cuttelod, A., Derocher, A.E., Diesmos, A.C., Donaldson, J.S., Duckworth, J.W., Dutson, G., Dutta, S.K., Emslie, R.H., Farjon, A., Fowler, S., Freyhof, J., Garshelis, D. L., Gerlach, J., Gower, D.J., Grant, T.D., Hammerson, G.A., Harris, R.B., Heaney, L.R., Hedges, S.B., Hero, J-M., Baz Hughes,

75

Hussain, S.A., Icochea M.J., Inger, R.F., Ishii, N., Iskandar, D. , Jenkins, R.K. B., Kaneko, Y., Kottelat, M., Kovacs, K.M., Kuzmin, S.L., La Marca, E., Lamoreux, J.F., Lau, M.W.N., Lavilla, E.O., Leus, K., Lewison, R.L., Lichtenstein, G., Livingstone, S.R., Lukoschek, V., Mallon, D.P., McGowan, P.J.K., McIvor, A., Moehlman, P.D., Molur, S., Muoz Alonso, A., Musick, J.A., Nowell, K., Nussbaum, R.A., Olech, W., Orlov, N., Papenfuss, T.J., ParraOlea, G., Perrin, W.F., Polidoro, B. A., Pourkazemi, M., Racey, P.A., Ragle, J.S., Ram, M., Rathbun, G., Reynolds, R.P., Rhodin, A.G.J., Richards, S.J., Rodrguez, L.O., Ron, S.R., Rondinini, C., Rylands, A B., Sadovy de Mitcheson, Y., Sanciangco, J.C., Sanders, K.L., Santos-Barrera, G., Schipper, J., Self-Sullivan, C., Shi, Y., Shoemaker, A., Short, F.T., Sillero-Zubiri, C., Silvano, D.L., Smith, K.G., Smith, A.T., Snoeks, J., Stattersfield, A.J., Symes, A.J., Taber, A.B., Talukdar, B.K., Temple, H.J., Timmins, R., Tobias, J.A, Tsytsulina, K., Tweddle, D., Ubeda, C., Valenti, S.V., van Dijk, P.P., Veiga, L.M., Veloso, A., Wege, D.C., Wilkinson, M., Williamson, E.A., Xie, F., Young, B.E., Akakaya, H.R., Bennun, L., Blackburn, T.M., Boitani, L., Dublin, H. ., da Fonseca, G.A.B., Gascon, C., Lacher, Jr, T.E., Mace, G.M., Mainka, S.A., McNeely, J.A., Mittermeier, R.A., Reid, G.M., Rodriguez, J.P., Rosenberg, A.A., Samways, M.J., Smart, J., Stein, B.A., & Stuart, S.N. 2010. The Impact of Conservation on the Status of the Worlds Vertebrates. Science, 330: 1503-1509. Hollingsworth, P.M., & Ennos, R.A. 2004. Neighbour joining trees, dominant markers and population genetic structure. Heredity, 92: 490-498. Holsinger, K.E., Lewis, P.O. & Dey, D. K. 2002. A Bayesian approach to inferring population structure from dominant markers. Molecular Ecology 11: 1157-1164.

76

Holsinger, K.E., & Lewis, P.O. 2003. Hickory: A package for analysis of population genetic data v1.1. Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Connecticut, Storrs, Connecticut, USA. Holsinger, K.E., & Wallace, L.E. 2004. Bayesian approaches for the analysis of population structure: an example from Platanthera leucophaea (Orchidaceae). Molecular Ecology 13: 887-894. INE-SEMARNAP. 2000. Prep 6: Proteccin, conservacin y recuperacin de la familia Zamiaceae (Cycadales) de Mxico. Mxico D.F., INE-SEMARNAP. IUCN 2012. IUCN Red List of Threatened Species. Version 2012.1. www.iucnredlist.org Jian, S., Zhong, Y., Liu, N., Gao, Z., Wei, Q., Xie, Z., & Ren, H. 2006. Genetic Variation in the Endangered Endemic Species Cycas fairylakea (Cycadaceae) in China and Implications for Conservation. Biodiversity and Conservation 15(5): 1681-1694. Jianguang, X., Shuguang, J., & Nian, L. 2005. Genetic variation in the endemic plant Cycas debaoensis on the basis of ISSR analysis. Australian Journal of Botany 53: 141145. Jimnez, P. & Collada, C. (2000). Tcnicas para la evaluacin de la diversidad gentica y su uso en los programas de conservacin. Investigacin agraria. Sistemas y recursos forestales, 2: 237-248. Jonaviien, K., Paplauskien, V., & Brazauskas, G. 2009. Isozymes and ISSR markers as a tool for the assessment of genetic diversity in Phleum spp. emdirbyst-Agriculture, 96: 4757. Jones, D.L. 1993. Cycads of the World. Smithsonian Institution Press, Washington, D.C. Jost, L. 2007. Partitioning diversity into independent alpha and beta components Ecology, 88: 24272439.

77

Keller, L.F, & Waller, D.M. 2002. Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology & Evolution, 17: 230-241. Kimura, M., & Crow, J.F. 1964. The number of alleles that can be maintained in a finite population. Genetics 49: 725-738. Korbin, M., Kuras, A., & Zurawicz, E. 2002. Fruit Plant Germplasm characterization using molecular markers generated in RAPD and ISSR-PCR. Cellular and Molecular Biology Letters, 7(2B): 785794. Levin, D.A. 1981. Dispersal versus gene flow in plants. Annals of the Missouri Botanical Garden, 68: 233-253. Levsen, N.D., Crawford, D.J., Archibald, J.K., Santos-Guerra, A., & Mort, M.E., 2008. Neys to Bayes: comparing computational methods and genetic markers to estimate patterns of genetic variation in Tolpis (Asteraceae). American Journal of Botany, 95: 14661474. Lewontin, R.C. 1972. The Apportionment of Human Diversity Evolutionary Biology 6: 391398. Lewontin, R.C. 1974. The Genetic Basis of Evolutionary Change. New York: Columbia University Press. Li, J.M. & Jin, Z.X. 2008. Genetic structure of endangered Emmenopterys henry Oliv. based on ISSR polymorphism and implications for its conservation. Genetica, 133: 227-234. Limn-Salvador, F., 2009. Gentica de Poblaciones de Zamia furfuracea L. f. (Zamiaceae); una ccada endmica al estado de Veracruz, Mxico. Tesis de licenciatura, Universidad Veracruzana, Mxico. Lynch, M., & Milligan, B. 1994. Analysis of population-genetic structure using RAPD markers. Molecular Ecology 3: 91-99.

78

Mantel, N. 1967. The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Research 27 (2): 209220. Marchant, C. J., 1968. Chromosome patterns and nuclear phenomena in the cycad families Stangeriaceae and Zamiaceae. Chromosoma 24: 100-134. Meirmans, P.G., & Hedrick, P.W. 2011. Assessing population structure: FST and related measures. Molecular Ecology Resources 11: 5-18. Meyer A, Garcia AAF, Souza AP, & Souza CL. 2004. Comparison of similarity coefficients used for cluster analysis with dominant markers in maize (Zea mays L). Genetics and Molecular Biology 27:83-91. Miller M.P., 1997. Tools for population genetic analyses (TFPGA) 1.3: A Windows program for the genetic data. Computer software distributed by author. Moretti, A. 1990a. Cytotaxonomy of cycads. Memoirs of the New York Botanical Garden, 57: 114-22. Moretti A., 1990b. Karyotypic data on north and central American Zamiaceae (Cycadales) and their phylogenetic implications. American Journal of Botany, 77: 10161029. Moretti A., Caputo P., Gaudio L., & Stevenson D.W. 1991. Intraspecific chromosome variation in Zamia (Zamiaceae, Cycadales). Caryologia 44: 1-10. Moretti A. & Sabato S., 1984. Karyotype evolution by centromeric fission in Zamia (Cycadales). Plant Systematics and Evolution 146: 215-223. Moyle LC. 2006. Correlates of genetic differentiation and isolation by distance in 17 congeneric Silene species. Molecular Ecolology. 15(4): 1067-1081.

79

Nagalingum, N. S., Marshall, C. R., Quental, T. B., Rai, H. S., Little D. P. & Mathews S., 2011. Recent synchronous radiation of a living fossil. Science 334: 796-799. Nagaoka, T. & Y. Ogihara, 1997. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers. Theoretical and Applied Genetics, 94: 597-602. Narzary, D., Rana, T.S. & Ranade, S.A. 2010. Genetic diversity in ISSR profiles across natural populations of Indian pomegranates (Punica granatum L.). Plant Biology (12): 806- 813. Negrn-Ortiz, V. & Breckon, G. J. 1989. Population structure in Zamia debilis (Zamiaceae) I. Size classes, leaf phenology, and leaf turnover. American Journal of Botany 76: 891-900. Negrn-Ortiz, V., Gorchov, D. L. & Breckon, A. J. 1996. Population structure in Zamia (Zamiaceae) in northern Puerto Rico. II. Seed germination and stage-structured population projection. International Journal of Plant Sciences, 157: 605-614. Nei M. 1972. Genetic distances between populations. American Naturalist 106: 283-292. Nei M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 70: 33213323. Nei M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics 89: 583-590. Nicolalde-Morejn F, Vergara-Silva F, Gonzlez-Astorga J, & Vovides AP 2011. Perspectivas Sistemticas de Zamia (Zamiaceae) en Megamxico: de la taxonoma alfa a los cdigos de barras genticos. Revista Mexicana de Biodiversidad. 82: 341-355. Nicolalde-Morejn, F., 2009. Revisin taxonmica y Cdigos de Barras de DNA para Zamia L. en MegaMxico. Tesis de doctorado. Instituto de Ecologa A.C., Mxico.

80

Nicolalde-Morejn, F., Vovides, A.P., & Stevenson, D.W., 2009. Taxonomic revision of Zamia in Mega-Mexico. Brittonia, 61: 301-335. Norstog, K. J. & P. K. Fawcett, 1989. Insect-Cycad symbiosis and its relation to the pollination of Zamia furfuracea (Zamiaceae) by Rhopalotria mollis (curculionidae), American Journal of Botany, 76(9): 1380-1394 Norstog K.J. & Nicholls T.J. 1997. The biology of cycads. Cornell University Press. Ithaca, NY, USA. Norstog, K. J., Fawcett P. K & A. P. Vovides, 1992. Beetle pollination of two species of Zamia: evolutionary and ecological considerations Palaeobotanist, 41:149-158. Nybom H. 2004. Comparison of different nuclear DNA markers for estimating intraspecific genetic diversity in plants Molecular Ecology, 13: 11431155. Octavio-Aguilar P, Gonzlez-Astorga J, & Vovides AP. 2009. Genetic diversity through life history of Dioon edule Lindley (Zamiaceae, Cycadales). Plant Biology 11: 525-536. Osborne R & Vovides A.P., 2007. The cardboard plant, the cardboard palm, or Zamia furfuracea. Palms y Cycads 97: 23-30. Peakall, R., & Smouse, P.E., 2006. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes 6: 288-295. Primack, R.B. 1993. Essentials of Conservation Biology. Sinauer Associates, Inc., Sunderland U.K. Pusadee T, Jamjod S, Chiang Y, Rerkasem B, & Schaal BA 2009. Genetic structure and isolation by distance in a landrace of Thai rice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 106: 1388013885. Octavio-Aguilar, P., Gonzlez-Astorga, J., & Vovides, A.P. 2009. Genetic diversity through life history of Dioon edule Lindley (Zamiaceae, Cycadales). Plant Biology, 11: 525-536.

81

Qiagen., 2006. Protocol: purification of total DNA from plant tissue (mini protocol), In: DNeasy plant mini kit for miniprep purification of total cellular DNA from plant cells and tissues, or fungi. p. 19-21. Qian, W., Ge, S., & Hong, D.Y. 2001: Genetic variation within and among populations of a wild rice Oryza granulata from China detected by RAPD and ISSR markers. Theoretical and Applied Genetics, 102: 440-449. Retegui-Zirena, E., Jean-Franois, R., Carvajal Vallejos, F., Corvera, R., Del-Castillo, D. & GarcaDvila, C. 2009. Evaluacin de la variabilidad gentica de la castaa Bertholletia excelsa en la regin de Madre de Dios (Per), mediante marcadores microsatlites. Folia Amaznica 18: 41-50. Reynolds, C.E. & Houle, G. 2002. Mantel and partial Mantel tests suggest some factors that may control the local distribution of Aster laurentianus at les de la Madeleine, Qubec. Plant Ecology, 164: 19-27. Ricotta, C. & Burrascano, S. 2008. Beta diversity for functional ecology Preslia, 80: 6171. Ryman, N., & Leimar, O. 2009. GST is still a useful measure of genetic differentiation - a comment on Josts D. Molecular Ecology 18: 20842087. Rzedowski, J., 1978. Vegetacin de Mxico. Limusa, S. A. Mxico, D.F. Sabato, S. 1990. West Indian and South American Cycads. Memoirs of the New York Botanical Garden, 57: 173-185. Saitou, N. & Nei, M. 1987. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, 4: 406-425.

82

Schlter, P.M. & Harris, S.A. 2006. Analysis of multilocus fingerprinting data sets containing missing data. Molecular Ecology Notes, 6: 569-572. Sharma IK, Jones DL, Foster PI, Young AG. 1999. Low isozymic differentiation among ve species of the Macrozamia heteromera group (Zamiaceae). Biochemical Systematics and

Ecology, 27: 6777. Slatkin, M. 1985. Gene flow in natural populations. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics, 16: 393430. Slatkin, M. 1987. Gene flow and the geographic structure of natural population. Science 236: 787-792. Staub, J. E., Danin-Poleg, Y., Fazio, G., Horejsi, T., Reis, N., & Katzir, N. 2000. Comparative analysis of cultivated melon groups (C. melo L.) using random amplied polymorphic DNA and simple sequence repeat markers. Euphytica 115: 225-241. Stevenson, D.W. 2001. Orden Cycadales. Flora de Colombia. Monografa No. 21. Editorial Unibiblos. Bogot D.C. Stevenson, D.W., Norstog, K. & Fawcett, P. 1998. Pollination biology of cycads. In: Reproductive Biology: In systematics, conservation, and economic botany. Eds. S. Owens & P. Rudall. pp. 277294. Royal Botanic Gardens, Kew. Stevenson, D.W. Stanberg, L. & Calonje, M. 2012. The world list of cycads. Memoirs of the New York Botanical Garden. En Prensa. Souframanien, J., & Gopalakrishna, T. 2004. A comparative analysis of genetic diversity in blackgram using RAPD and ISSR markers. Theoretical and Applied Genetics, 109: 16871693.

83

Templeton, A.R. 1991. Genetics and conservation biology. In: Seitz, A. and Loeschche V. (Ed.), Species Conservation a Populationbiological Approach. Basel, Birkhauser Verlag., 1529. Templeton, A. R. 2006. Population Genetics and Microevolutionary Theory. John Wiley & Sons. Tsumura, Y., K. Ohba & S.H. Strauss, 1996. Diversity and inheritance of inter-simple sequence repeat polymorphisms in Douglasr (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria japonica). Theoretical and Applied Genetics, 92: 40-45. UNEP-WCMC. 4 June, 2012. UNEP-WCMC Species Database: CITES-Listed Species Vzquez Torres, M., Torres Hernndez, L. & Bojrquez-Galvn, L.H. 1999. Aprovechamiento sustentable y conservacin de la palma bola (Zamia furfuracea), especie endmica protegida, en la zona de Los Tuxtlas, Veracruz. Universidad Veracruzana. Instituto de Investigaciones Biolgicas. Informe final SNIB-CONABIO proyecto No. Q039. Mxico D.F. Vergara-Silva, F., Nicolalde-Morejn, F., Gonzlez-Astorga, J. & Stevenson, D.W. 2012. Biodiversidad de Zamiaceae en Mxico. Revista Mexicana de Biodiversidad. En prensa. Vijayan, K., Awasthi, A.K., Srivastava, P.P. & Saratchandra, B. 2004. Genetic analysis of Indian mulberry varieties through molecular markers. Hereditas, 141: 814. Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans M., Van De Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., & Zabeau M., 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23: 4407-4414. Vovides, A.P., Iglesias, C., Prez-Farrera, M., Vzquez-Torres, M. & Schippmann, U. 2002. Peasant Nurseries: a concept for an integrated conservation strategy for Cycads in

84

Mexico. En: Maunder M, Clubbe C, Hankamer C, Groves M, eds. Plant Conservation in the Tropics. Perspectives and practice. Kew, UK: The Royal Botanic Garden. Pp. 423444. Vovides, A.P., Rees, J.D. & Vzquez-Torres, M. 1983. Flora de Veracruz. Zamiaceae. Fascculo 26. INIREB, Xalapa, Veracruz, Mxico. Vovides, A.P. 1991. Insect Symbionts of some Mexican Cycads in their natural habitat. Biotropica 23: 102-104. Vovides, A.P., Ogata, N., Sosa, V. & Pea-Garcia, E. 1997. Pollination of endangered Cuban cycad Mimocycas calocoma (Miq.) A.DC. Botanical Journal of the Linnean Society 125: 201210. Vovides, A.P. & Olivares M. 1996. Karyotype polymorphism in the cycad Zamia loddigesii (Zamiaceae) of the Yucatan peninsula, Mexico. Botanical Journal of the Linnean Society 120: 77-83. Walters, T.W. & Decker-Walters, D.S. 1991. Patterns of Allozyme Diversity in the West Indies Cycad Zamia pumila (Zamiaceae). American Journal of Botany 78: 436-445. Wang, X.M. 2010. Optimization of DNA isolation, ISSR-PCR system and primers screening of genuine species of rhubarb, an important herbal medicine in China. Journal of Medicinal Plants Research, 4(10): 904-908. Weir, B.S. & Cockerham, C.C. 1984. Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution 38: 1358-1370.

85

Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. & Tingey, S.V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research, 18: 6531-6535. Whitlock, M. 2011. GST and D do not replace FST. Molecular Ecology 20: 1083-1091. Wolfe A.D. 2005. ISSR techniques for evolutionary biology, Methods in Enzymology, 395: 134 144. Wolfe, A.D. & Liston, A. 1998. Contributions of PCR-Based methods to Plant Systematics and Evolutionary Biology. En: Soltis, Soltis y Doyle (eds.) Molecular Systematics of Plants II, 45-82, Kluwer academic Publishers, USA. Wolfe, A.D., Xiang, Q.Y. & Kephart, S. R. 1998. Diploid hybrid speciation in Penstemon (Scrophulariaceae). Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 95: 51125115. Wright, S. 1946. Isolation by Distance Under Diverse Systems of Mating. Genetics 31: 3959. Wright, S. 1969. The Theory of Gene Frequencies. Chicago. Wright, S. 1978. Evolution and the Genetics of Populations vol. 4, Variability Within and Among Natural Populations. University of Chicago Press, Chicago, IL. Wu, S., Collins, G. & Sedgley, M.A. 2004. Molecular linkage map of olive (Olea europea L.) based on RAPD, microsatellites and SCAR markers. Genome. 47: 26-35. Xiao, L.Q., Ge, X.J., Gong, X., Hao, G. & Zheng, S.X. 2004. ISSR variation in the endemic and endangered plant Cycas guizhouensis (Cycadaceae). Annals of Botany 94: 133138.

86

Xiao, L.Q, & Gong, X. 2006. Genetic differentiation and relationships of populations in the Cycas balansae complex (Cycadaceae) and its conservation implications. Annals of Botany, 97: 807812. Xiao, L., Gong, X., Hao, G., Ge, X., Tian, B. & Zheng, S. 2005. Comparison of the genetic diversity in two species of cycads. Australian Journal of Botany 53(3): 219-223. Xie, J., Jian S., & Nian, L. 2005. Genetic variation in the endemic plant Cycas debaoensis on the basis of ISSR analysis. Australian Journal of Botany 53: 141-145. Yang, S.L. & Meerow, A.W. 1996. The Cycas pectinata (Cycadaceae) complex: genetic structure and gene flow. International Journal of Plant Sciences, 157: 468-483. Yeh, F.C., Yang, R.C. & Boyle, T. 1999. POPGENE 32-version 1.31. Population Genetics Software Yu, H.H., Yang, Z.L., Sun, B. & Liu, R.N. 2011. Genetic diversity and relationship of endangered plant magnolia officials assessed with ISSR polymorphisms. Biochemical Systematics and Ecology, 39(2): 71-78. Zietkiewicz, E., Rafalski, A. & Labuda, D. 1994. Genome fingerprinting by Simple Sequence Repeat (SSR)-Anchored polimerase chain reactions amplification. Genomics 20: 176183.

87