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artigo de atualizao update article

III Consenso Brasileiro para Pesquisa de Autoanticorpos em Clulas HEp-2: perspectiva histrica, controle de qualidade e associaes clnicas

Primeira submisso em 20/06/09 Publicado em 20/06/09

Third Brazilian Consensus for Autoantibodies Screening in HEp-2 Cells: historical perspective, quality control and clinical associations
Paulo Luiz Carvalho Francescantonio1, Luis Eduardo Coelho Andrade2, Wilson de Melo Cruvinel3, Flvia Ikeda e Arajo4, Alessandra Dellavance5, Alexandre Gabriel Jnior6#, Barbara Nuccitelli7, Ben Hur Taliberti8, Carlos Alberto von Mhlen9, Carlos David Arajo Bichara10, Cludio Henrique Ramos dos Santos11, Cleonice Bueno12, Cristiane Martinez Yano13, Cristvo Luis Pitangueira Mangueira14, Darlene Gonalves Carvalho15, Elizngela Cardoso16, Elosa Bonf17, Gustavo Gabriel Rassi18, Hugo Mendona Mundim19, Izidro Bendet20, Jozlia Rego21, Lisiane Maria Enriconi dos Anjos Vieira22, Maria Ordlia Ferro Barbosa23, Mitiko Sugiyama24, Mittermayer Barreto Santiago25, Natasha Slhessarenko26, Nilzio Antnio da Silva27, Renata Jarach28, Roberto Suda29, Roger Abramino Levy30, Silvia Oliveira Sampaio31, Suzane Pretti Figueiredo Neves32, Wilton Silva dos Santos33, Yanna K. de M. Nbrega34

unitermos
Autoanticorpos Clulas HEp-2 Anticorpos antincleo Imunofluorescncia indireta

resumo
Objetivo: O III Consenso Brasileiro para Pesquisa de Autoanticorpos em Clulas HEp-2 (FAN) objetivou discutir estratgias para controlar a qualidade do ensaio, promover a atualizao das associaes clnicas dos diversos padres e avaliar as dificuldades de implantao do II Consenso ocorrido no ano de 2002. Mtodos: Nos dias 13 e 14 de abril de 2007 participaram do encontro em Goinia pesquisadores e especialistas de diversos centros universitrios e laboratrios clnicos de diferentes regies do Brasil, com o propsito de discutir e aprovar as recomendaes que visam a melhores padronizao, interpretao e utilizao do ensaio pelos clnicos. Foram convidados como ouvintes representantes comerciais de diferentes empresas produtoras de insumos para realizao do teste de FAN. Resultados e concluso: Dada a heterogeneidade de microscpios e reagentes disponveis no mercado, o III Consenso enfatizou a necessidade do controle de qualidade em ensaios de imunofluorescncia indireta. Foram tambm feitas algumas adequaes na terminologia utilizada para classificar os diferentes padres. Finalmente, foi realizada uma atualizao das associaes clnicas com finalidade de facilitar cada vez mais o melhor uso do ensaio pelos clnicos.

abstract
Objective: The Third Brazilian Consensus for Autoantibodies Screening in HEp-2 Cells (ANA) had as purpose the evaluation of difficulties in the accomplishment of the 2nd Consensus recommendations that took place in the year of 2002, the discussion of strategies for quality control of the assay and the discussion of an update of the clinical associations of the several immunofluorescent patterns. Methods: Several ANA experts from university centers and private laboratories in different areas in Brazil joined the workshop in Goinia on 2007 April 13 and 14 with the purpose of discussing and approving the recommendations for standardization, interpretation and use of the test by physicians. Commercial representatives of different ANA slide brands were also invited as listeners to the workshop. Results and conclusion: The 3rd ANA Consensus emphasized the need for quality control in indirect immunofluorescent assays since there is a considerable heterogeneity of available microscopes and reagents. It also promoted adaptations in the previously approved terminology used to classify the different patterns and finally updated the clinical associations of the several patterns with the purpose of providing guidance for interpretation of the assay by clinical pathologists and assistant physicians.

key words
Autoantibodies HEp-2 cells Antinuclear antibodies Indirect immunofluorescence assays

# in memoriam 1. Mestre em Cincias Ambientais e Sade pela Universidade Catlica de Gois (UCG); professor assistente I de Imunologia dos cursos de Biomedicina e Medicina da UCG; coordenador do III Consenso Brasileiro para Pesquisa de Autoanticorpos. 2. Professor associado; livre docente da disciplina de Reumatologia na Universidade Federal de So Paulo (UNIFESP); coordenador do Programa de Ps-Graduao da disciplina de Reumatologia da UNIFESP; assessor-mdico do setor de Imunologia do Fleury Medicina e Sade. 3. Doutorando de Reumatologia pela UNIFESP; professor assistente de Imunologia nos cursos de Biomedicina e Medicina da UCG; secretrio do III Consenso Brasileiro para Pesquisa de Autoanticorpos. 4. Mestra em Cincias Ambientais e Sade pela UCG; professora assistente I de Imunologia do curso de Biomedicina da UCG; coordenadora do Laboratrio de Apoio Didtico do Departamento de Biomedicina da UCG. 5. Doutoranda de Reumatologia pela UNIFESP; assessora cientfica do setor de Imunologia do Fleury Medicina Diagnstica. 6. Ps-doutorado pela Scripps Medical Center La Jolla La USA; coordenador mdico da AFIP-Medicina Laboratorial e Centro Imuno-Reumatolgico de So Paulo. 7. Biomdica do Padro Laboratrio Clnico. 8. Ps-doutor pela Reumaklinik Aachen, Alemanha; professor titular de clnica mdica da Universidade Federal de Uberlndia (UFU); coordenador do servio de reumatologia do Hospital das Clnicas da UFU.
(continuao das titulaes na pgina 199)

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Introduo

A pesquisa de autoanticorpos em clulas HEp-2 no Brasil

A medicina laboratorial tem vivenciado uma constante evoluo cientfico-tecnolgica que repercute nos exames laboratoriais, afetando parmetros importantes para a interpretao clnica, como os valores preditivos positivo e negativo, a sensibilidade e a especificidade. Essa realidade pode ser ilustrada em procedimentos laboratoriais, como na pesquisa de anticorpos antincleo (ANA), pela tcnica de imunofluorescncia indireta (IFI) em clulas HEp-2, tambm conhecido como fator antincleo (FAN), hoje denominado pesquisa de anticorpos contra antgenos celulares (PAAC). Trata-se de um excelente exame de rastreamento de autoanticorpos em soro de pacientes com suspeita de doena autoimune que, ao longo das ltimas dcadas, foi tecnicamente modificado, de forma a conferir sensibilidade progressivamente maior. Como consequncia, a pesquisa de anticorpos contra antgenos celulares passou tambm a apresentar menor especificidade(17). No entanto, a maior sensibilidade do teste de PAAC-IFI em HEp-2 trouxe algum prejuzo na especificidade, pois resultados reagentes so observados em amostras de alguns indivduos sem evidncia clnica ou laboratorial aparente de doena autoimune. Este cenrio exige interpretao criteriosa dos achados sorolgicos(19). A alta frequncia de resultados positivos do teste em indivduos saudveis ou com manifestaes clnicas vagas tem trazido tona uma situao denominada por alguns de sndrome do anticorpo antincleo idioptico(17). A perda de especificidade do teste agravou-se tambm pelo fato de que uma vasta gama de especialistas mdicos passou a utiliz-lo. Inicialmente, os reumatologistas e nefrologistas eram os grandes usurios desse exame e, em decorrncia de sua familiaridade com o mesmo e das caractersticas de sua clientela, tinham maior chance de solicitar o exame a quem realmente tivesse quadro autoimune. Gradativamente o teste vem sendo solicitado por especialistas em outras reas, como gastroenterologia, ginecologia, ortopedia, otorrinolaringologia, neurologia, psiquiatria, entre outras. Isto refora a necessidade de fundamentarmos que o ensaio deve ser considerado como um teste de triagem e a interpretao e a valorizao do resultado devem estar fundamentadas no conhecimento da sensibilidade e especificidade do mesmo e no contexto clnico particular(15,13). Atualmente, o PAAC-IFI

em HEp-2 um exame solicitado com menos critrio por grande variedade de especialistas, que obviamente atendem pacientes distintos, nos quais o diagnstico de doena reumtica autoimune menos prevalente. Portanto, a chance de resultados reagentes em indivduos saudveis ou com apresentaes clnicas pouco expressivas tornou-se maior. Alguns elementos so importantes para a valorizao adequada do teste do PAAC-IFI em HEp-2. Em primeiro lugar, o exame deve ser solicitado apenas quando houver suspeita convincente de doena autoimune. Sua solicitao frente a um paciente com queixas vagas frequentemente trar mais confuso ao raciocnio clnico, visto que um resultado positivo no implica necessariamente em autoimunidade. Um segundo ponto a ser considerado o ttulo do PAACIFI em HEp-2: em geral, os pacientes autoimunes tendem a apresentar ttulos moderados (1/160 e 1/320) e elevados ( 1/640), enquanto os indivduos sadios com PAAC-IFI em HEp-2 positivo tendem a apresentar baixos ttulos (1/80)(37). Entretanto, em ambas as situaes pode haver excees(29). Outro ponto importante o padro de fluorescncia, que fornece uma indicao da identidade do(s) autoanticorpo(s) em questo (21) e deve ser analisado com bastante cautela. Para sua caracterizao ser levada em considerao a experincia e expertise do observador, a capacidade de se reproduzir o padro por parte do kit, que pode ser de diferentes fabricantes, e os parmetros tcnicos relacionados com o controle de qualidade da imunofluorescncia indireta(13). Autoanticorpos contra alguns antgenos tm associao bastante especfica com determinadas doenas autoimunes ou ao estado de autoimunidade em si, enquanto outros ocorrem indiscriminadamente em indivduos autoimunes e no-autoimunes. Dessa forma, determinados padres de fluorescncia so mais especficos de doena autoimune, enquanto outros ocorrem com frequncia em indivduos sadios ou em pacientes com outras enfermidades noautoimunes(17). Outro ponto a se considerar que o nvel de autoimunidade fisiolgica, ou basal, pode flutuar na dependncia de sobrecargas a que o sistema imunolgico seja exposto. Est bem demonstrada a presena de autoanticorpos desencadeada transitoriamente por infeces, por medicamentos e por neoplasias. Tem sido demonstrada claramente alta prevalncia de autoanticorpos em pacientes infectados pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) e por outros vrus linfotrpicos(31). Portanto, outra considerao a ser feita ante um paciente com um achado positivo de PAAC-IFI em HEp-2 refere-se a possibilidade de infeces virais recentes, uso de medicamentos e processos neoplsicos.

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Vrias evidncias demonstram que os autoanticorpos frequentemente precedem ecloso clnica das doenas autoimunes(6). Um teste de PAAC-IFI em HEp-2 positivo pode preceder o aparecimento clnico do LES em at nove anos. Cerca de 80% dos pacientes com LES apresentam PAAC-IFI em HEp-2 positivo antes do aparecimento dos primeiros sintomas. O mesmo vlido, embora em menor porcentagem, para os vrios autoanticorpos especficos dessa enfermidade, como anti-DNA nativo e anti-Sm. Portanto, outra possibilidade a se considerar em presena de um achado clinicamente inconsistente de PAAC-IFI em HEp-2 positivo a de que o paciente poder vir a desenvolver uma doena autoimune nos prximos anos. No entanto, alguns indivduos podem seguir dcadas com autoanticorpos circulantes sem desenvolver qualquer sinal de enfermidade autoimune(12). Perante um resultado positivo de PAAC-IFI em HEp-2 imprescindvel que se caracterize essa reatividade, buscando a presena de anticorpos peculiares de patologias autoimunes por meio de tcnicas especficas. Essa investigao deve ser subsidiada pela busca de evidncia clnica ou laboratorial de doena autoimune sistmica. Alm do exame clnico apurado, importante verificar possveis alteraes em hemograma, urina I, protena C-reativa (PCR) e velocidade de hemossedimentao (VHS), que podem ser consideradas extenses do exame clnico. Na dependncia da apresentao clnica, pode ser vlido investigar enzimas hepticas e musculares. A presena de sintomas vagos, como artralgia e astenia, com exames laboratoriais gerais normais, no suficiente para subsidiar um achado laboratorial de PAAC-IFI em HEp-2 em ttulo baixo e com padro de fluorescncia pouco especfico. Nesses casos, deve-se exercitar o bom senso e proceder ao acompanhamento clnico do paciente em consultas regulares. Levando-se em considerao essa problemtica, os dois primeiros consensos contriburam para o aperfeioamento das leituras e a interpretao dos padres de PAAC-IFI em HEp-2 a partir da criao de critrios morfolgicos a serem seguidos durante a leitura do teste. No I Consenso foram institudas as rvores de classificao para os diversos padres, a partir da combinao dos critrios, formando os grupos principais (ncleo, nuclolo, citoplasma e aparelho mittico). De fato, a grande diversidade e heterogeneidade de terminologia ento utilizada para caracterizar os diferentes padres foi o ensejo para a realizao do consenso(14). No II Consenso foram ratificados os algoritmos de deciso para leitura dos padres na imunofluorescncia indireta vistos na primeira edio do consenso brasileiro,

adicionando-se ainda o algoritmo para os padres mistos. Tendo em vista a habilidade do teste em detectar autoantgenos nos distintos compartimentos celulares, e no apenas no ncleo, foram propostas algumas denominaes para este exame laboratorial que expressasse a totalidade de sua dimenso diagnstica:
FAN pesquisa de anticorpos contra componentes do

ncleo, nuclolo, citoplasma e aparelho mittico;

FAN

Pesquisa de autoanticorpos; de autoanticorpos (FAN e citoplasmticos);

pesquisa

pesquisa de anticorpos contra componentes do ncleo

(FAN), nuclolo, citoplasma e aparelho mittico;

pesquisa de autoanticorpos ncleo (FAN), nuclolo,

citoplasma e aparelho mittico;

pesquisa de autoanticorpos contra antgenos intracelulares (FAN HEp-2).

O II Consenso recomendou ainda a elaborao de laudos descritivos com o propsito de aprimorar a leitura da lmina pelos profissionais de laboratrio. O laudo deve contemplar os padres de fluorescncia observados em ncleo, nuclolo, citoplasma, aparelho mittico e na placa metafsica cromossmica, bem como o ttulo dos respectivos padres. Na Figura 1 esto representados dois exemplos de laudos, conforme as recomendaes do consenso. Ainda por ocasio do II Consenso foram abordadas informaes sobre as principais associaes clnicas dos diferentes padres. Na Tabela esto resumidas as justificativas que fundamentaram a realizao dos consensos e

Figura 1 Exemplos de laudos descritivos conforme as recomendaes dos consensos

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as recomendaes deliberadas pelos participantes. Como pode ser observado, aps a implantao do I e II Consensos, surgiram dificuldades que motivaram a realizao de um novo encontro. Na ocasio da implantao do II Consenso, um dos problemas observados refere-se classificao do padro nuclear homogneo quanto reatividade dos nuclolos e com relao classificao dos padres mistos englobando mltiplas reatividades dentro do mesmo grupo, por exemplo, um padro com dois ou mais autoanticorpos contra antgenos nucleares. Outro aspecto relevante, detectado aps o II Consenso, foi a necessidade de alertar quanto heterogeneidade dos reagentes e substratos, como, por exemplo, o ttulo dos conjugados prontos para uso. Uma vez que alguns laboratrios no esto habituados a titular o conjugado contra um padro absoluto ou consensual, um mesmo teste realizado em kits de marcas diferentes pode apresentar ttulos divergentes. Isto se agrava com a heterogeneidade no poder de iluminao dos microscpios utilizados nos diversos laboratrios. Esses problemas, em seu conjunto, so responsveis pela heterogeneidade de resultados entre os vrios laboratrios e precisam ser mais bem discutidos. Finalmente, ao longo dos anos, sentiu-se necessidade de revisar as associaes clnicas dos diferentes padres estabelecidos no II Consenso. Desse modo, o III Consenso Brasileiro para Pesquisa de Autoanticorpos em Clulas HEp-2 teve como propsito avaliar as dificuldades de implantao do II Consenso, ocorrido no ano de 2002, discutir estratgias para controlar a qualidade do ensaio e promover a atualizao das associaes clnicas dos padres de fluorescncia.

apresentados para os componentes da assembleia e discutidos amplamente com vistas obteno de consenso entre os diversos participantes. As discusses foram embasadas por prvia reviso da literatura referente aos diversos temas, bem como apresentao de dados prprios pelos participantes.

Recomendaes gerais
A classificao da reatividade dos nuclolos quando em concomitncia com padro nuclear homogneo passa a ser no-reagente. O III Consenso reitera a classificao atual dos padres de fluorescncia nos quatro compartimentos celulares (citoplasma, ncleo, nuclolo e aparelho mittico). Ademais, foram feitas algumas definies para situaes de possvel ambiguidade ou indefinio. Nos casos em que o ncleo uniformemente corado e no se destaca a regio do nuclolo, os membros do III Consenso entendem que no h reatividade precpua contra o nuclolo, portanto, o mesmo deve ser descrito como no-reagente. Obviamente, o nuclolo ser tambm descrito como no-reagente nos casos em que o mesmo se mostrar no-corado. Quando da existncia de um padro nuclear, o nuclolo somente ser descrito como reagente quando sua colorao sobressair sobre a colorao do ncleo. O exemplo do laudo do padro nuclear homogneo pode ser observado no painel inferior da Figura 1.

Padres mistos
Foi retificada a definio de padres mistos. Foram categorizados como padres mistos todos os casos em que a colorao de compartimentos celulares distintos (ncleo, nuclolo, citoplasma ou aparelho mittico) ou de diferentes padres de fluorescncia em um mesmo compartimento celular foi observada. Assim, por exemplo, o padro NuMA-1 considerado um padro misto, pois cora o ncleo e o aparelho mittico. Outro exemplo representado por um soro com uma mistura de autoanticorpos que corem simultaneamente o ncleo com padro pontilhado fino e padro nuclear pontilhado centromrico.

Mtodo de trabalho
O III Consenso ocorreu em Goinia nos dias 13 e 14 de abril de 2007, com a participao de pesquisadores e especialistas de diversos centros universitrios e laboratrios clnicos de diferentes regies do Brasil, com o propsito de discutir e aprovar as recomendaes que visam a melhores padronizao, interpretao e utilizao do ensaio pelos clnicos. Representantes comerciais de diferentes empresas produtoras de insumos para realizao do teste de PAAC-IFI em HEp-2 foram convidados como ouvintes. Essa verso do consenso abordou os seguintes problemas: 1) a necessidade de controlar a qualidade do ensaio; 2) a definio de alguns aspectos controversos na classificao proposta no II Consenso; 3) o relato de novos padres de fluorescncia; e 4) a reviso das associaes clnicas. Os problemas foram

Padro nuclear pontilhado com pontos isolados

O III Consenso alterou a deliberao do II Consenso quanto necessidade de subclassificao do nmero de pontos no padro nuclear pontilhado do tipo pontos isolados. No mais se recomenda a denominao maior que 10 pontos por ncleo e menor que 10 pontos por ncleo. A deno-

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Tabela Padres

Padres de PAAC-IFI em HEp-2, descrio, principais autoanticorpos associados e associaes clnicas mais frequentes Descrio
O padro caracterizado por uma fluorescncia em toda a membrana nuclear (podendo ser emitida com informao adicional em aspecto contnuo ou pontilhado). No observamos fluorescncia em nuclolos e citoplasma; a clula em diviso em todos os estgios apresenta-se no fluorescente. No confundir com o antigo padro perifrico observado em fgado de rato onde o DNA de dupla hlice se encontrava ancorado s protenas da membrana nuclear, dando seu aspecto caracterstico. Nucleoplasma fluorescente de forma homognea e regular. No possvel distinguir a rea de nuclolo e este considerado no reagente. Placa metafsica cromossmica intensamente corada, de aspecto hialino, com decorao homognea dos cromossomos, tambm positiva na anfase e telfase. Citoplasma normalmente no fluorescente. Nucleoplasma com grnulos de aspecto grosseiro, heterogneos em tamanho e brilho, sendo que sobressaem alguns poucos grnulos maiores e mais brilhantes (1 a 6/ ncleo) que correspondem ao corpo de Cajal, rico em ribonucleoprotenas do spliceossomo. Nuclolo, clula em diviso e citoplasma no fluorescentes.

Relevncias clnicas por autoanticorpos

anticorpo contra protenas do envelope nuclear. Cirrose biliar primria, hepatites autoimunes, raramente associado a doenas reumticas. Algumas formas de lpus eritematoso sistmico e esclerodermia linear, sndrome do anticorpo antifosfolpide. Esse padro pode ser observado em indivduos sem evidncia aparente de autoimunidade, principalmente quando em baixos ttulos. Anticorpo anti-gp210 especfico para cirrose biliar primria. Outros autoanticorpos associados a esse padro: anti-p62 (nucleoporina), anti-lamin A, anti-lamin B, anti-lamin C, anti-LBP.(9) anticorpo anti-dNa nativo. Marcador de lpus eritematoso sistmico. anticorpo anti-histona. Marcador de lpus eritematoso sistmico induzido por drogas, lpus eritematoso sistmico idioptico, artrite reumatoide, artrite idioptica juvenil, importante associao com uvete na forma oligoarticular, sndrome de felty e hepatite autoimune.(35, 26) anticorpo anticromatina (DNA/histona, nucleossomo). Lpus eritematoso sistmico.(3) anticorpo anti-sm. Marcador para lpus eritematoso sistmico.(32, 10) anticorpo anti-rnp. Critrio obrigatrio no diagnstico da doena mista do tecido conjuntivo, tambm presente no lpus eritematoso sistmico e esclerose sistmica.(32) anticorpo anti-ss-a/ro. Sndrome de Sjgren primria, lpus eritematoso sistmico, lpus neonatal e lpus cutneo subagudo, esclerose sistmica, polimiosite e cirrose biliar primria.(7) anticorpo anti-ss-B/la. Sndrome de Sjgren primria, lpus eritematoso sistmico, lpus neonatal. (7)
(continuao da Tabela na prxima pgina)

Nuclear tipo membrana nuclear

Nuclear homogneo

Nuclear pontilhado grosso

Nuclear pontilhado fino

Nucleoplasma com granulao fina. Nuclolo, clula em diviso e citoplasma no fluorescentes.

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Tabela Padres

Padres de PAAC-IFI em HEp-2, descrio, principais autoanticorpos associados e associaes clnicas mais frequentes (continuao) Descrio Relevncias clnicas por autoanticorpos
anticorpo antiprotena p75 (cofator de trascrio) denominado ledgF/p75. um dos padres mais frequentes encontrados na rotina, cuja correlao clnica ainda no est bem estabelecida, sendo frequentemente encontrado em indivduos sem evidncia objetiva de doena sistmica. Encontrado raramente em doenas reumticas autoimunes, processos inflamatrios especficos e inespecficos. Existem relatos na literatura do encontro desse padro em pacientes com cistite intersticial, dermatite atpica, psorase e asma.(33)

Nuclear pontilhado fino denso

Nucleoplasma da clula em intrfase apresenta-se como um pontilhado peculiar, de distribuio heterognea, nuclolo no fluorescente. A clula em diviso apresenta decorao em pontilhado intenso e grosseiro dos cromossomos na placa metafsica, com citoplasma no fluorescente.

Nuclear pontilhado pontos isolados

Nucleoplasma apresenta-se com pontos fluorescentes isolados (podendo ser fornecida como informao adicional o numero de pontos maior ou igual a 10 ou menos do que 10 pontos por ncleo). Nuclolo, clula em diviso e citoplasma no fluorescentes. Nucleoplasma da clula em intrfase, apresentando-se pontilhado com um nmero constante de 46 pontos. Nuclolo normalmente no fluorescente, clula em diviso apresenta concentrao dos pontos na placa metafsica. Citoplasma no fluorescente.

anticorpo anti-p80 coilina. No possui associao clnica definida.(4) anticorpo anti-sp100 anti-p95. Descrito principalmente na cirrose biliar primria.(30) anticorpo anticentrmero (protenas ceNp-a, ceNp-B e ceNp-c). Esclerose sistmica forma CREST (calcinose, fenmeno de Raynaud, disfuno motora do esfago, esclerodactilia e telangiectasia), cirrose biliar primria e sndrome de Sjgren. Raramente observado em outras doenas autoimunes. Pode preceder a forma CREST por anos.(22, 23)

Nuclear pontilhado centromrico

Nuclear pontilhado pleomrfico

Nucleolar homogneo

O nucleoplasma apresenta-se totalmente no fluorescente na clula em fase G1 da intrfase, passando a pontilhado com anticorpo contra ncleo de clulas em proliferao grnulos variando de grosso, fino a fino denso (anti- pcNa). Encontrado especificamente em na medida em que a clula evolui para as pacientes com lpus eritematoso sistmico. (36) fases S e G2. Nuclolo e citoplasma no fluorescentes. Esse padro sugestivo de anticorpos anti-PCNA. anticorpo anti-to/th. Ocorre na esclerose sistmica. (38) anticorpo antinucleolina. Muito raro, descrito no lpus eritematoso sistmico, doena enxerto versus hospedeiro e na mononucleose infecciosa. anticorpo anti-B23 (nucleofosmina). Descrito Nuclolo homogneo, clula em diviso e na esclerose sistmica, alguns tipos de cncer citoplasma no fluorescentes. sndrome do anticorpo antifosfolpide e doena enxerto versus hospedeiro.

(continuao da Tabela na prxima pgina)

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Tabela Padres

Padres de PAAC-IFI em HEp-2, descrio, principais autoanticorpos associados e associaes clnicas mais frequentes (continuao) Descrio
O nuclolo se apresenta com grumos de intensa fluorescncia (como cachos de uva). Citoplasma e ncleo no fluorescentes. A clula em diviso apresenta-se amorfa, com colorao delicada em volta dos cromossomos da placa metafsica.

Relevncias clnicas por autoanticorpos

anticorpo antifibrilarina (u3-nrNp). Associado esclerose sistmica, especialmente com comprometimento visceral grave, entre elas a hipertenso pulmonar. (34)

Nucleolar aglomerado

Nucleolar pontilhado

Citoplasmtico fibrilar linear

Citoplasmtico fibrilar filamentar

Citoplasmtico fibrilar segmentar

Citoplasmtico pontilhado polar

anticorpo anti-Nor 90. Inicialmente descrito na esclerose sistmica. Atualmente descrito em outras doenas do tecido conjuntivo, porm sem relevncia clnica definida.(34) Decorao pontilhada nucleolar e 5 a 10 anticorpo anti-rNa polimerase i. Esclerose pontos distintos e brilhantes ao longo da sistmica de forma difusa com tendncia para placa metafsica cromossmica. Ncleo e comprometimento visceral mais frequente e grave. (34) citoplasma no corados. anticorpo anti-ase (anti-sense to ercc-1). Frequentemente encontrado em associao a anticorpos anti-NOR-90. A associao mais frequente parece ser o lpus eritematoso sistmico. anticorpo antiactina. Encontrado em hepatopatias: Fibras de estresses que constituem o citoesqueleto decoradas de forma retilnea, hepatite autoimune, cirrose. cruzando toda a extenso da clula e no anticorpo antimiosina. Hepatite C, hepato-carcinoma, respeitando os limites nucleares. Ncleos e miastenia gravis. Quando em ttulos baixos ou moderados nuclolos no fluorescentes. podem no ter relevncia clnica definida.(1,28) anticorpo antivimentina e antiqueratina. Anticorpo antiqueratina o anticorpo mais importante em Decorao de filamentos com acentuao uni doena heptica alcolica. Descritos em vrias ou bipolar em relao membrana nuclear. doenas inflamatrias e infecciosas. Quando Ncleos e nuclolos no fluorescentes. em ttulos baixos ou moderados podem no ter relevncia clnica definida.(27) Apenas segmentos curtos das fibras de estresse se encontram fluorescentes. Ncleo antialfa-actinina, antivinculina e antitropomiosina. e nuclolos negativos. Nas clulas em Anticorpos encontrados na miastenia gravis, diviso, podemos observar eventualmente doena de Crohn e colite ulcerativa. Quando mltiplos grnulos intensamente em ttulos baixos ou moderados podem no ter fluorescentes que correspondem forma relevncia clnica definida.(27) globular das protenas do citoplasma. anticorpo antigolginas (cisternas do aparelho de golgi). Esse tambm um laudo obrigatrio, pois Raro no lpus eritematoso sistmico, sndrome evidencia cisternas do aparelho de Golgi. de Sjgren primria e outras doenas autoimunes A decorao apenas citoplasmtica em sistmicas. Relatado em ataxia cerebelar idioptica, pontos agrupados de situao perinuclear, degenerao cerebelar paraneoplsica e infeces normalmente em apenas um plo nuclear. virais pelo vrus Epstein Barr (EBV) e pelo vrus da Ncleo, nuclolo e clula em diviso no imunodeficincia humana (HIV). Quando em ttulos fluorescentes. baixos ou moderados podem no ter relevncia clnica definida.(31,40)
(continuao da Tabela na prxima pgina)

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Tabela Padres

Padres de PAAC-IFI em HEp-2, descrio, principais autoanticorpos associados e associaes clnicas mais frequentes (continuao) Descrio Relevncias clnicas por autoanticorpos
anticorpo anti-eea1 e antifosfatidilserina. No h associaes clnicas bem definidas. anticorpo anti-gWB. Associado sndrome Sjgren primria, embora observado tambm em diversas outras condies clnicas.(18) anticorpo anti-pl7/pl12. Esse padro de fluorescncia pode raramente estar associado a anticorpos encontrados na polimiosite.(38) anticorpo antiprotena p-ribossomal. Esse padro ocorre no lpus eritematoso sistmico e est particularmente associado ao anticorpo antiprotena P-ribossomal.(8)

Citoplasmtico Pontos definidos de nmero varivel por toda pontilhado a extenso do citoplasma. Ncleo, nuclolo e pontos clula em diviso no fluorescentes. isolados Fluorescncia de pontos finos, densos e confluentes, chegando quase homogeneidade. O ncleo no est corado, mas pode ou no Citoplasmtico apresentar uma leve decorao homognea na pontilhado rea do nuclolo. A clula em diviso no fino denso fluorescente. No caso de haver fluorescncia concomitante de citoplasma e nuclolo, o padro classificado como misto.

anticorpo anti-histidil t rNa sintetase (Jo1). Citoplasmtico Pontos definidos em grande nmero e Anticorpo marcador de polimiosite no adulto. pontilhado densidade, clula em diviso e nuclolo no Descrito raramente na dermatomiosite. Outros fino fluorescentes. anticorpos anti-tRNA sintetases podem gerar o mesmo padro.(38) anticorpo antimitocndria. Marcador da cirrose Fluorescncia em mltiplos pontos dispostos sob biliar primria. Raramente encontrado na esclerose Citoplasmtico forma de retculo irradiando a partir da periferia sistmica. Devido ao encontro relativamente pontilhado do ncleo por todo o citoplasma. Ncleo, comum de padro assemelhado e no relacionado reticulado nuclolo e clula em diviso no fluorescentes. a anticorpos antimitocndria, fundamental a confirmao por teste especfico.(2,11) Aparelho Ponto fluorescente isolado no citoplasma em anticorpo antialfa-enolase. Em baixos ttulos no mittico tipo um polo na clula em repouso (intrfase) que tm associao clnica definida. Em altos ttulos centrolo se divide em dois e migra ao polo oposto do pode estar associado esclerose sistmica.(16) ncleo medida que a clula entra em diviso. anticorpo antibeta-tubulina. Podem ser encontrados Antgenos que formam a unio entre clulas no lpus eritematoso sistmico e na doena mista Aparelho me/filha ao final da telfase. Podem ser do tecido conjuntivo. Outros anticorpos ainda mittico observados com fluorescncia intensa na no bem definidos podem gerar o mesmo padro. tipo ponte ponte citoplasmtica que sofrer clivagem ao Associado a diversas condies autoimunes com intercelular final da diviso celular. baixa especificidade tendo relevncia clnica somente em altos ttulos.(5) Clulas em intrfase se encontram no anticorpo anti-Hseg5/Numa-2. Associado a Aparelho fluorescentes em todas as suas estruturas. mittico tipo H decorao extensa e grosseira nos diversas condies autoimunes com baixa fuso mittico plos mitticos das clulas em metfase especificidade, tendo relevncia clnica somente (NuMa-2) e as pontes intercelulares so positivas na em altos ttulos.(39) telfase. Citoplasma no fluorescente.
(continuao da Tabela na prxima pgina)

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Tabela Padres
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescncia do aparelho mittico Misto do tipo nuclear pontilhado grosso e nucleolar homogneo Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado fino com placa metafsica corada Misto do tipo nuclear pontilhado fino e nucleolar pontilhado Misto do tipo citoplasmtico pontilhado fino denso a homogneo e nucleolar homogneo

Padres de PAAC-IFI em HEp-2, descrio, principais autoanticorpos associados e associaes clnicas mais frequentes (continuao) Descrio
As clulas em intrfase apresentam o ncleo corado como um pontilhado bem fino, geralmente em alto ttulo. Clulas mitticas em metfase e anfase apresentam colocao bem definida e delicada da regio pericentrossmica e das partes proximais do fuso mittico. Na telfase j se v novamente a colorao pontilhada dos ncleos neoformados e no se v colorao da ponte intercelular.

Relevncias clnicas por autoanticorpos

anticorpo anti-Numa1. Associado sndrome de Sjgren, podendo ocorrer tambm em outras condies autoimunes ou inflamatrias crnicas. Quando em ttulos baixos ou moderados, pode no estar associado evidncia objetiva de doena inflamatria sistmica.(5)

Clulas em intrfase apresentam o ncleo anticorpo anti-Ku. Marcador de superposio, corado como pontilhado grosso e o nuclolo polimiosite e esclerose sistmica. Podem ocorrer corado de forma homognea. Na metfase h no lpus eritematoso sistmico e esclerodermia.(20) colorao ao redor da placa metafsica.

Clulas em intrfase apresentam o ncleo corado de forma pontilhada fina e o nuclolo sobressai tambm com padro pontilhado fino. Na metfase, a placa metafsica apresenta padro pontilhado fino. Clulas em intrfase apresentam o ncleo corado de forma pontilhada fina delicada e sobressaindo o nuclolo corado com padro pontilhado (pontos individuais). O citoplasma no corado. Na metfase, observam-se cinco a 10 pontos isolados e brilhantes na placa metafsica, correspondentes s regies organizadoras de nuclolo (NOR). O ncleo totalmente no corado e o nuclolo corado fracamente. O citoplasma apresenta intensa colorao com pontilhado muito fino e muito denso, quase homogneo. As clulas mitticas no so coradas.

anticorpo anti-dNa topoisomerase i (scl-70). Associado a esclerose sistmica forma difusa, em que indica formas de maior comprometimento visceral. Mais raramente pode ocorrer na sndrome CREST e superposio.(25) anticorpos anti-rNa polimerase i e ii. Esses dois autoanticorpos usualmente aparecem em combinao, sendo a RNA pol I responsvel pela distribuio nucleolar e em NOR, enquanto a RNA pol II responde pela distribuio nuclear. Anti-RNA pol I considerado marcador de esclerose sistmica e anti-RNA pol II aparece em diversas condies autoimunes.(25) anticorpo anti-rrNp (antiprotena p ribossomal). Marcador de lpus eritematoso sistmico e mais frequentemente relacionado psicose lpica. Tambm parece estar associado atividade da doena.(8,24)

minao do padro ficou estabelecida como padro nuclear pontilhado do tipo pontos isolados. Essa mudana decorre do fato de que o nmero de corpos nucleares corados por anticorpos anti-p80-coilina e anti-sp-100 sofre considervel variao conforme o substrato celular em uso. Embora o

observador experiente consiga, na maioria dos casos, sugerir com segurana o autoanticorpo mais provvel, o nmero de pontos por ncleo no um critrio absoluto. Esta alterao foi implementada na rvore de classificao dos padres nucleares, conforme pode ser observado na Figura 2.

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Figura 2 rvores de classificao dos padres nucleares, nucleolares, citoplasmticos, do aparelho mittico e mistos

Padres no-caracterizados ou com caractersticas novas

O III Consenso reconhece que h padres no caracterizados ou com caractersticas no-definidas, conforme a classificao existente. Nesses casos, a recomendao que se descreva morfologicamente o padro observado, que se acrescente uma observao especificando que o mesmo no faz parte da nomenclatura do consenso e que suas associaes imunolgicas e clnicas ainda no esto definidas. Recomenda-se fortemente que o suposto novo padro seja testado e confirmado em kit comercial de marca

diferente daquela em que originalmente se observou o padro, evitando assim que condies artefatuais induzam uma falsa interpretao. Dois novos padres de fluorescncia foram comunicados por participantes do III consenso e vrios outros membros testemunharam j haver observado esses padres. O primeiro refere-se a um padro nuclear pontilhado fino, aproximando-se da textura homognea e com placa metafsica corada da mesma forma. Sua associao clnica e identidade imunolgica no esto definidas. Sua importncia deriva do fato de que pode ser facilmente confundido com o

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padro pontilhado fino denso e com o padro homogneo (Figura 3). O segundo refere-se a um padro citoplasmtico em forma de pequenos bastes (rods) e crculos (rings) que, aparentemente, est associado infeco pelo vrus da hepatite C (HCV). H estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a finalidade de estabelecer sua identidade imunolgica (Figura 4). Como ainda no esto definitivamente caracterizados, esses dois novos padres foram considerados preliminares e o III Consenso recomendou que os mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na prxima verso do consenso.

Substratos base de clulas geneticamente modificadas

O III Consenso no realizou estudos sistematizados com substratos geneticamente modificados, sendo este estudo possvel objeto de debate nos prximos encontros.

Controle de qualidade
O III Consenso recomenda e incentiva a busca por programas de controle de qualidade. Essa recomendao visa fazer frente s dificuldades em garantir a qualidade do teste, dada a necessidade de profissionais com treinamento especializado, heterogeneidade dos kits comerciais e no-padronizao de equipamentos pticos entre laboratrios. Entre os programas de qualidade institucionais, foram citados o do College Of American Pathologists (CAP) e o programa educativo PAAC-IFI em HEp-2 da Controlab. Tambm foram citados programas e reagentes para controle de qualidade de em-

Figura 3 Padro nuclear pontilhado fino tendendo a homogneo (B). As clulas apresentam nucleoplasma com textura de tendncia homognea e placa metafsica corada. Pode ser confundido com o padro nuclear pontilhado findo denso (C), porm no positivo para a protena de 75Kda e para ser observado o padro nuclear homogneo. Imagens obtidas por imunofluorescncia indireta em clulas Hep-2

Figura 4 Padro citoplasmtico com fluorescncia em forma de bastes e anis (rods and rings). Aparentemente associado infeco pelo HCV e tratamento com interferon. Os antgenos alvos desses anticorpos ainda esto sendo definidos

presas privadas, como o PCQAUTO da GMK Diagnsticos, o Conexo HEp-2 da Hemagen Diagnsticos e a lmina FITC-QC da ALKA Tecnologia em Diagnsticos.

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Um ponto considerado fundamental pelos membros do consenso foi a necessidade de realizao da titulao do conjugado por parte dos laboratrios como medida essencial para ajustar a quantidade do ensaio. Esta medida foi formalmente recomendada e teve como objetivo adequar a orientao do I Consenso, que sugeria a diluio de 1/40 como triagem, o que gerou muita dvida em sua execuo, tendo em vista a heterogeneidade de equipamentos para a leitura do teste nos laboratrios. Visando adequar essa inconformidade, o III Consenso recomenda como etapa primordial para a realizao do controle de qualidade a titulao do conjugado a partir do uso de soros de referncia. A titulao do conjugado com base no soro de referncia permite equiparar os resultados obtidos em diferentes servios utilizando microscpios com diferente potncia da lmpada. Foi ressaltado ainda que esse procedimento deve ser realizado para cada novo kit de lote diferente. A manuteno dessa titulao nos kits do mesmo lote pode ser realizada a partir do uso de controles de baixa intensidade. Nesse quesito, ressalta-se a utilidade de lminas comerciais com microesferas pr-calibradas para diversas intensidades de fluorescncia e que podem ser utilizadas para treinamento e calibrao interna da leitura. Para promover a melhoria na qualidade dos diversos servios e garantir a obteno de resultados fidedignos, o III Consenso recomenda adeso de todos os laboratrios aos programas de controle de qualidade. de fundamental importncia recordar que a reao de IFI depende de cinco fatores: o sistema ptico (microscpio), a potncia da lmpada (20, 50 ou 100W), a concentrao do conjugado, os soros controles de reatividade mnima (1/80) e o observador. A concentrao do conjugado permite equiparar sistemas pticos diferentes, lmpadas de potncias diferentes e a capacidade de interpretao do observador, por exemplo: se a potncia da lmpada baixa, recomendada a utilizao de um conjugado mais concentrado para se obter a mesma fluorescncia de uma lmpada de potncia maior. Para estabelecer a concentrao ideal do conjugado (ttulo do conjugado), devemos utilizar a tcnica de titulao em bloco em que vrias diluies do conjugado so cruzadas com diversas concentraes de um soro de referncia, procurando a maior diluio do conjugado capaz de reproduzir o ttulo nominal do soro de referncia. O soro de referncia pode acompanhar o kit pronto e o laboratrio passar a se referenciar a sistema ptico, lmpada e leitor, de acordo com o padro estabelecido pelo fabricante. O soro de referncia pode tambm ser adquirido comercialmente, obtido de instituies de controle de qualidade ou

ainda o laboratrio poder enviar o seu soro a um outro laboratrio de sua referncia e, de posse dos resultados, passar a se referenciar a esse laboratrio. Uma vez feita a primeira referncia, ele poder armazenar semanalmente alquotas de soros de ttulos determinados no prprio laboratrio. O procedimento de titulao do conjugado est representado na Figura 5.

Figura 5 Representao esquemtica da titulao do conjugado

recomendado que o laboratrio mantenha em sua soroteca amostras para controle com ttulo de reatividade mnima (por exemplo: 1/80), a serem diludas em 1/40, 1/80, 1/160 e 1/320. A cada bateria diria o laboratrio dever processar o controle baixo e dever considerar a bateria vlida se a variao de ttulos for de mais ou menos uma diluio. Se for observada inconformidade do controle, por exemplo se uma amostra com ttulo mdio de 1/80 apresentar-se como

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negativa, a bateria dever ser invalidada. Utilizando o controle de reatividade mnima (1/80), uma bateria de testes somente ser validada com a leitura de um ttulo a mais ou a menos de 80. No caso de ocorrer queda superior a um ttulo, provvel que o sistema tenha entrado em instabilidade. Recomenda-se, ento, que seja verificado primeiramente se houve problema na alquota armazenada, nesse caso repetindo o teste com a alquota armazenada na semana anterior. Se ao trmino da repetio o ttulo encontrado foi o previsto, chegaremos concluso de que a alquota do controle em uso havia se deteriorado. Se a nova alquota apresentou tambm queda do ttulo de mais de uma diluio, deveremos checar o sistema ptico (deteriorao do filtro UV, inundao da objetiva com glicerina tamponada e desempenho da lmpada). Caso no seja encontrada alterao nesses componentes e no nmero de horas de uso da lmpada, a causa mais provvel ser degradao do conjugado, que deve ento ser submetido a novo processo de titulao, como descrito anteriormente. Na Figura 6 est representado o fluxograma do controle de qualidade dirio das reaes. Como recomendaes importantes para manuteno do controle de qualidade adequado temos:

a realizao do controle do conjugado a cada 15 dias e nova titulao sempre que um novo kit for aberto;

checagem rotineira das objetivas e dos filtros do microscpio que interferem na definio do ttulo do conjugado;
alm da checagem do tempo de lmpada, necessrio checar se a lmpada est centrada. Isso pode ser feito utilizando uma folha de papel branca colocada na mesa do microscpio e observado com objetiva de 10 se a lmpada est centrada. Caso seja observado escurecimento de parte do campo, o manuseio dos botes de centragem direita e esquerda, superior e inferior e foco da lmpada devero ser acionados a fim de realizar o ajuste.

Associaes clnicas e descrio dos padres

O III Consenso conduziu ampla discusso para validao e reavaliao das associaes clnicas e imunolgicas referentes aos padres de PAAC-IFI em HEp-2. As recomendaes advindas dessa atividade esto listadas na Tabela anterior. Em sua vasta maioria, as associaes anteriormente descritas foram acordadas por unanimidade entre os participantes do consenso. Nos raros casos em que no houve unanimidade, acatou-se a opinio majoritria. Essa iniciativa reflete a vigorosa atividade de pesquisa no campo de autoanticorpos em geral, e de anticorpos antincleo em particular, em nosso pas. Deve ser enfatizado que essa atividade tem proporcionado uma evoluo progressiva e marcante de nossa comunidade cientfica e profissional, firmando uma posio nacional independente com relao forma de realizar e interpretar o ensaio para determinao de autoanticorpos em clulas HEp-2. Essa caracterstica tem beneficiado tambm os clnicos que lanam mo desse exame laboratorial e, por conseguinte, os pacientes que a eles recorrem. Finalmente, necessrio que fique claro que esse um processo de amadurecimento contnuo e progressivo e que o mesmo depende da interao de toda a comunidade envolvida com as vrias etapas do processo.

Agradecimentos
s sociedades Brasileira de Reumatologia (SBR), Brasileira de Patologia Clnica e Medicina Laboratorial (SBPC), Brasileira de Anlises Clnicas (SBAC) e ao Conselho Regional de Biomedicina da 3 regio (CBRM-3).

Figura 6 Fluxograma geral do controle de qualidade das reaes

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Endereo para correspondncia Laboratrio de Apoio Didtico Departamento de Biomedicina da Universidade Catlica de Gois (UCG) Avenida Universitria, 1.069 Setor Universitrio CEP: 74605-010 Goinia-Go Tel.: (62) 3946-1393 e-mail: lad@ucg.br

9. Professor de Reumatologia da Faculdade de Medicina da Pontifcia Universidade do Rio Grande do Sul (FMPUCRS); doutor em Medicina pela Faculdade de Medicina da Rheinisch-Westfalische Technische Hochschule/Aachen, Alemanha; ps-doutorado no The Scripps Research Institute, La Jolla, EUA; diretor tcnico do Metanalysis Centro de Diagnsticos Mdicos, Porto Alegre. 10. Mdico e biomdico; especialista em Patologia Clnica; especialista em Sade Pblica; mestrando em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitrios pela Universidade Federal do Par (UFPA); supervisortcnico do Laboratrio Amaral Costa; professor de Patologia Clnica do Centro de Educao Tcnica do Estado do Par (CESEP). 11. Assessor cientfico da NewLife Comrcio de Produtos Laboratoriais. 12. Laboratrios de Investigao Mdica do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo (FMUSP). 13. Mestra em Medicina Tropical pela Universidade Federal de Gois; Professora assistente da disciplina de Imunologia da UCG. 14. Mdico patologista clnico e reumatologista; doutor em Patologia pela FMUSP; mdico da seo de Imunologia da Diviso de Laboratrio Central (LIM 03) do Hospital das Clnicas da FMUSP; gerente mdico do Departamento de Patologia Clnica (Diretoria de Medicina Diagnstica e Preventiva) do Hospital Israelita Albert Einstein. 15. Mdica patologista clnica de Imunologia do Instituto Hermes Pardini. 16. Biologia celular e molecular; suporte tcnico-cientfico da Biometrix Diagnstica. 17. Professora titular de Reumatologia da FMUSP. 18. Mdico patologista clnico do Laboratrio Atalaia. 19. Exame medicina laboratorial do Distrito Federal. 20. Mdico patologista clnico e virologista; ps-graduao em Biologia Parasitria pela Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ); consultor cientfico do setor de Imunoensaios do Srgio Franco Medicina Diagnstica. 21. Mdica reumatologista e coordenadora do laboratrio de Imuno-Reumatologia do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da UCG (FMUCG). 22. Mestra em Cincias Mdicas pela Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC); professora da Universidade do Sul de Santa Catarina (UNISUL); professora da Universidade do Vale do Itaja (UNIVALI); patologista clnica do Laboratrio Mdico Santa Luzia. 23. Mestra em Biomedical Science pela San Francisco State University, Califrnia; bioqumica dos Laboratrios Sade e Hospital e Maternidade e Jardim Amrica. 24. Assessora cientfica da Hemagen Diagnsticos. 25. Ps-Doutorado pela University of Calgary; mdico reumatologista da Universidade Federal da Bahia (UFBA); professor adjunto da Fundao Bahiana para Desenvolvimento das Cincias; chefe do servio de reumatologia do Hospital Santa Izabel. 26. Mdica patologista clnica; mestra pediatria pela USP; professora da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT). 27. Doutor em reumatologia pela USP; professor titular de reumatologia da FMUCG. 28. Mestra em Medicina Tropical pela UCG; biomdica do Padro Laboratrio Clnico. 29. Assessor Cientfico da Alka. 30. Doutor em Cincias Biolgicas (Biofsica) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ); estatutrio da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ); professor adjunto de reumatologia da UERJ; coordenador do Centro de Autoimunidades do Hospital Pr-cardaco; consultor cientfico do Diagnsticos da Amrica SA. 31. Doutora em Imunologia pelo Instituto de Cincias Biomdicas (ICB) da USP; formada pela FMUSP; especializao em Reumatologia pela FMUSP; mdica do setor de Imunologia do Laboratrio Diagnsticos da Amrica SA. 32. Mdica patologista clnica; doutora em Cincias pela FIOCRUZ; professora adjunta da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais (FMUFMG); coordenadora do setor de SoroImunologia do Servio de Medicina Laboratorial do Hospital das Clnicas da UFMG. 33. Mdico reumatologista; coordenador do Laboratrio de Reumatologia do Hospital Universitrio de Braslia e doutor em Reumatologia pela UNIFESP. 34. Mestra em Patologia Molecular/Imunologia pela Universidade de Braslia (UNB); professora da Unio Educacional do Planalto Central e do Centro Universitrio Euro-Americano (UNIEURO); assessora cientfica da Imunotech Sistemas Diagnsticos Importao e Exportao.

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