LABORATORIO N4 Enzimologa 1.

Caracterizacin de la Fosfatasa cida de Aorta de Bovino; efecto del pH y de la temperatura

Introduccin Las enzimas son catalizadores biolgicos, que aumentan la velocidad de una reaccin, disminuyendo la energa de activacin de la misma. Se caracterizan por medio de Km: constante de Michaelis-Menten y de la Vmx: velocidad mxima de reaccin. La velocidad de una reaccin se puede estimar: a) midiendo la desaparicin de sustrato en el tiempo o b) midiendo la aparicin de producto en el tiempo. El termino fosfatasa se utiliza para describir a aquellas enzimas que catalizan la hidrlisis de derivados del cido ortofosfrico. Dependiendo del tipo de enlace que se hidroliza se clasifican en: a) Fosfomonoesterasa (enlace fosfoester) b) Fosfodiesterasa (enlace fosfodiester) b) Anhdrido fosfrico hidrolasa (enlace pirofosfato). Las fosfomonoesterasas se clasifican en especficas (un nico sustrato) y no especificas (reconocen a varios sustratos distintos). Estas ltimas, a su vez, dependiendo del pH ptimo, se clasifican en alcalina o cida. Las fosfatasas estn presentes en prcticamente todos los rganos animales. Se encuentran involucradas en el metabolismo de carbohidratos, cidos nucleicos, fosfolpidos y en la formacin de los huesos. En este prctico se estudiar una fosfomonoesterasa no especfica que se extraer de la aorta de bovino y cuyo pH ptimo est en el rango cido (fosfatasa cida).

Mecanismo de reaccin:

En este prctico se usar como sustrato p-nitrofenilfosfato el que al hidrolizarse genera para-nitrofenol. Este compuesto a pH alcalino presenta un color amarillo el cual puede ser cuantificado por espectrofotometra a 410 nm. A esta longitud de onda el coeficiente de extincin molar, eM, es = 17500 M-1 cm-1.

Para determinar la concentracin del producto coloreado, se mide la absorbancia a 410 nm, frente a un blanco que contiene todos los reactivos menos el sustrato. Aplicando la ley de Lambert y Beer, se calcula la concentracin molar del producto formado. Ley de Lambert - Beer : A = ecl, donde A es la absorbancia, e es el coeficiente de extincin molar, c es la concentracin en moles/L y l es el dimetro de la celda. La velocidad de reaccin se obtiene al relacionar la cantidad de producto formado en el tiempo, mediante la siguiente ecuacin: V = [p-nitrofenol] / Dt. Donde v es la velocidad de la reaccin enzimtica, Dt es el tiempo de incubacin. Para determinar los parmetros caractersticos de una enzima con comportamiento de Michaelis Menten, se realiza el estudio del efecto de la concentracin de sustrato frente a la velocidad de la reaccin. En un principio se observa que al aumentar la [S] aumenta la velocidad de reaccin, hasta que llega

un momento en que aunque se aumente la [S], la velocidad se mantiene constante. Esta es la Vmx y se alcanza cuando la enzima se satura con sustrato:

Sin embargo la determinacin de Km y Vmx desde este grfico no es muy adecuada, ya que se requiere de gran cantidad de puntos para construir la zona curva. En cambio si se tratar de una lnea recta, esta queda determinada con tres puntos y es ms fcil, extrapolar o interpolar, o calcular una pendiente o una interseccin. Es as como Lineweaver y Burk, linealizaron el comportamiento de Michaelis-Menten obteniendo una recta que queda representada en el siguiente grfico:

Objetivos * Cuantificar la velocidad de una reaccin enzimtica * Aplicar los conceptos tericos adquiridos en la caracterizacin de una enzima. * Encontrar el pH y la temperatura optima de la fosfatasa cida de aorta de bovino * Determinar Km y Vmx de la fosfatasa cida de aorta de bovino grficamente y de la ecuacin de la recta * Cuantificar la velocidad de la reaccin enzimtica en presencia de un inhibidor Materiales por Grupo Reactivos 30 tubos de ensayos solucin tampn citrato pH: 3; 4,5; 5,6; 7,5; 9. 3 gradillas solucin p-nitrofenilfosfato 30 mM 1 juego de micropipetas P1000, P200,P20 Solucin MgCl2 50 mM puntas azules y amarillas solucin de TCA al 30% 3 cubetas solucin de NaOH 0,1 M pipeta vidrio 5 Ml + propipeta cronometro Calculadora Material General 6 espectrofotmetros 4 baos termorregulados ( a 20C, 37C, 60C, 80C)

4 placas calefactoras con vaso pp de 250 mL Hielo Parafilm Procedimiento Experimental A: Efecto de pH Para determinar el efecto del pH en la actividad enzimtica se realizarn reacciones en distintos soluciones tampn citrato de pHs: 3,0; 4,5; 5,6; 7,5 y 9,0 Prepare una serie de tubos segn indica la tabla 1. La enzima debe agregarse en ltimo lugar. Tabla N1
Volumen (mL) p-nitrofenilfosfato MgCl2 1,25 mL buffer pH H2O Enzima B 0,25 0 2,25 0,5 C 0,5 0,25 0 2,25 0 1 0,5 0,25 3,0 0,5 0,5 2 0,5 0,25 4,5 0,5 0,5 3 0,5 0,25 5,6 0,5 0,5 4 0,5 0,25 7,5 0,5 0,5 5 0,5 0,25 9,0 0,5 0,5

B: blanco no contiene sustrato C: Control: No contiene enzima y mide la hidrlisis espontnea del sustrato MgCl2: La enzima es dependiente del magnesio para su actividad. Cada tubo debe mezclarse por inversin suavemente e incubar a 37C por 30 min.

Terminada la incubacin, realice los siguientes pasos para cada tubo: 1. Agregar 1 mL de solucin de TCA al 30%, mezclar por inversin y dejar en hielo. El cido tricloro actico (TCA) detiene la accin enzimtica por desnaturalizacin cida de la enzima. 2. Transferir una alcuota de 1mL a un tubo que contenga 5 ml de NaOH 1,0 M. A pH bsico el producto p-Nitrofenol tiene un mximo de absorcin a 410 nm. 3. Lea en el Espectrofotmetro cada tubo a 410 nm, usando el tubo B como blanco. Anote los valores de absorbancia ledos con tres cifras. Al valor de la absorbancia de cada tubo experimental debe restarle la absorbancia del tubo C. 4. Una vez realizado los clculos necesarios grafique V (velocidad) versus pH. Se deber obtener un valor mximo de velocidad que corresponder al pH ptimo. Resultados Actividad Efecto pH

Tabla resultados N1 N tubo a pH Absorbancia a pH 3.0 4.5 5.6 7.5 9.0 Concentracin Producto mM Velocidad de la reaccin

B: Efecto de la temperatura en la reaccin enzimtica Se estudiar la reaccin a las temperaturas 0C, 20C; 37C; 60C; 80C y 100C. Prepare los siguientes tubos segn la tabla 2 Tabla N 2
Volumen (mL) B 0 0,25 1,25 1,0 0,5 C 0,5 0,25 1,25 1,0 0 T 0,5 0,25 1,25 1,0 0,5

p-nitrofenilfosfato
MgCl2 buffer pH 5,6 H2O Enzima

1. Prepare seis veces el tubo C (C1, C2,C6) y seis veces el tubo T (T1, T2T6). Mezcle cada tubo por inversin suavemente e incube 30 min. a las temperaturas indicadas. Es decir un tubo C y tubo T para cada temperatura ( Ej. C1 y T1 a 0C) 2. Una vez terminada la incubacin se procede para cada tubo en forma idntica a la descrita para el efecto del pH (desde el punto 1). Es decir: 1. Agregar 1 mL de solucin de TCA al 30%, mezclar por inversin y dejar en hielo. El cido tricloro actico (TCA) detiene la accin enzimtica por desnaturalizacin cida de la enzima. 2. Transferir una alcuota de 1mL a un tubo que contenga 5 ml de NaOH 1,0 M. A pH bsico el producto p-Nitrofenol tiene un mximo de absorcin a 410 nm. 3. Lea en el Espectrofotmetro cada tubo a 410 nm, usando el tubo B como blanco. Anote los valores de absorbancia ledos con tres cifras. Al valor de la absorbancia de cada tubo (discuta con sus profesores la factibilidad de usar el

tubo C como blanco). Una vez realizados los clculos correspondientes corregir los valores de cada tubo Ti con el correspondiente Ci, grafique V (velocidad) versus TC. Determine la temperatura ptima para la enzima 4. Una vez realizado los clculos necesarios grafique V (velocidad) versus temperatura. Se deber obtener un valor mximo de velocidad que corresponder a la temperatura ptima.

Resultados Actividad Efecto Temperatura Tabla resultados N2

N tubo a T C 0 20 37 60 80 100

Absorbancia a T T C B

Absorbancia corregida

Concentracin Producto mM

Velocidad de la reaccin

Una vez realizados los clculos correspondientes corregir los valores de cada tubo Ti con el correspondiente Ci, grafique V (velocidad) versus TC. Determine la temperatura ptima para la enzima.

LABORATORIO N 5: DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS 1. Determinacin enzimtica de glucosa 2. Determinacin qumica de la glucosa Objetivos Que el alumno: 1. Conozca y domine un mtodo de cuantificacin de glucosa 1. Relacione sus conocimientos tericos con la aplicacin prctica y la clnica 2. Domine el fundamento de la reaccin 3. Adquiera habilidades y destrezas para realizar la tcnica

1. Determinacin enzimtica de glucosa

Fundamento: La glucosa es oxidada por la enzima glucosa-oxidasa a gluconato y perxido de hidrgeno de acuerdo a la siguiente ecuacin

Glucosa + O + HO

HO + gluconato

(GOD)

2HO

+ fenol + 4-AP

Quinonimina

4 H O

(POD)

Reactivos Reactivo 1 : Compuesta por solucin buffer tris 92 mmol/l pH 7.5 y fenol 0.3 mmol/l Reactivo 2 : Compuesto por glucosa oxidasa 15.000 U/L . peroxidasa 1000 U/l y 4 aminofenazona 2.6 mmol/l.

Preparacin y estabilidad de las soluciones: Mezclar ambas soluciones (Reactivo 1 + Reactivo 2) como lo indica el fabricante As tenemos listo el reactivo de trabajo el cul es estable 1 mes entre 2 y 8C o 7 das a temperatura ambiente Muestra: suero, plasma o lquido-cfalo-raqudeo (LCR.). La glucosa en el plasma o suero es estable hasta 3 das mantenida entre 2 a 8 C

Procedimiento: Blanco Estndar Muestra 2 ml Reactivo 1. Mezclar e incubar ambiente. 2. Medir la absorbancia a 505 nm, sin olvidar ajustar el espectrofotmetro con el blanco de reactivos. 3. El color es estable por 30 minutos. por 10 minutos a 37 C o 30 minutos a temperatura 2 ml Estndar 20 l Muestra 20 l 2 ml

Clculos: Absorbancia de la muestra Glucosa (mg/dl ) = Absorbancia del estndar x concentracin Estndar

Mg/dl x 0.0555 = mmol/l Linealidad: El mtodo es lineal hasta 500 mg/dl Si la concentracin de la glucosa en mayor que 500 mg/ dl, diluir la muestra con solucin salina y repetir la determinacin multiplicando por el factor de dilucin. Valores de referencia Nota: No interfieren en la determinacin la presencia de: hemoglobina (4 g/l) ; bilirrubina (20 mg/l ; creatinina (100 mg/l) ; galactosa 81g/l) y edta (2 g/l) Bibliografia : Trinder,P.Ann.Clin.Biochem. 6,24(1969). Dingeon, B.Ann.Biol.Clin. 33,3(1975) Lott, J.A.Clin.Chem. 21,1754(1975)

Determinacin qumica de la glucosa Objetivos 1. Demostracin de la Ley de Lambert-Beer. 2. Realizar una Curva de calibracin para cuantificar azucares reductores 2. Aplicar la espectrofotometra para la determinacin de azucares reductores por el Mtodo del 3,5-dinitrosalicilato (DNS)

Materiales por grupo Espectrofotmetro mg/mL 4 cubetas 20 tubos de ensayos de 10 mL

Reactivos Solucin Patrn Glucosa 2

Solucin 3,5-Dinitrosalicilato Muestra Problema Glucosa (Suero humano)

Placa calefactora Vortex 2 vasos pp de 250 mL Micropipetas P1000, P200, P20 1 pipeta graduada de 5 mL Pizeta

Procedimiento experimental

Curva de Calibracin: Determinacin de Azucares Reductores por el Mtodo DNS Este mtodo se basa en la capacidad de los monosacridos y algunos disacridos en reducir al 3,5-dinitrosalicilato (color amarillo) en medio alcalino caliente. El compuesto reducido 3-amino-5-nitrosalicilato es de color anaranjado. La intensidad de este color es directamente proporcional a la cantidad de agente reductor presente en la muestra.

1. Prepare 8 tubos de ensayos, mrquelos y proceda a agregar segn la tabla N1 2. Coloque simultneamente todos los tubos en bao Mara hirviente por 5 minutos 3. Enfre rpidamente colocando los tubos en agua fra corriente

4. Agregue 3,5 mL de H2O destilada a todos los tubos 5. Lea en el espectrofotmetro a 540nm 6. No olvide ajustar con el Blanco

El tubo rotulado como blanco contiene agua (el solvente del patrn de glucosa) y el reactivo DNS. Recuerde que este compuesto es coloreado, lo cual significa que absorbe luz. La absorbancia del blanco debe restarse a la absorbancia de los tubos que contienen las muestras. Otra forma de proceder es ajustar el espectrofotmetro con el tubo blanco llevando la lectura de absorbancia a cero. El tubo rotulado MP corresponde a un suero humano que Ud. deber determinar la concentracin de glucosa. Realice una dilucin 1 en 10, tome 100 L de esta dilucin, agregue 900 L de H2O y 500 L de DNS. S la lectura de la MP est fuera del rango de la curva de calibracin deber repetir con otra dilucin. El rango donde la concentracin es directamente proporcional a la absorbancia de la solucin va de 0,05 a 0,50 mg de glucosa. (Para calcular la concentracin de glucosa en cada tubo no debe olvidar que el patrn tiene concentracin 2 mg/mL y la relacin para el clculo de concentracin cuando se realiza una dilucin: V1 x C1 = V2 x C2) Tabla N 1 N Tubo Vol. L Patrn Volumen glucosa 5 mg/ml H2O L 1 2 3 4 5 6 MP blanco 0 1000 10 20 40 60 80 100 990 980 960 940 920 900 Volumen DNS L 500 500 500 500 500 500 500 500 Absorbancia a 540 nm Concentracin Glucosa

Resultados

1. Construya una curva de calibracin para Glucosa, en papel milimetrado, Absorbancia (eje y) versus Concentracin Glucosa en mg/ml (eje x) 2. Determine la concentracin de la muestra problema desde el grfico curva de calibracin para Glucosa 3. Determine una ecuacin que le permita calcular la concentracin de cualquier muestra conocida su absorbancia. 4. Determine la concentracin de la muestra problema usando la ecuacin deducida por Ud. Compare los valores encontrados (no olvide que realiz una dilucin) 5. Calcule la concentracin de glucosa en suero y exprsela en g / dL 6. Compare los resultados obtenidos por ambos mtodos y disctalos.

LABORATORIO N6: LIPIDOS Y ENZIMAS Determinacin de Colesterol, GOT y GPT

Determinacin de Colesterol Libre

Objetivos: que el estudiante: 1. Conozca y domine un mtodo de cuantificacin de colesterol 2. Relaciones sus conocimientos tericos con la aplicacin prctica y la clnica 3. Conozca y domine el fundamento de la tcnica 1. Adquiera habilidades y destrezas para manejar la tcnica 2. Relacione sus conocimientos tericos en el uso de las enzimas en los mtodos de bioanlisis clnico. 3. Investigue sobre la importancia de la determinacin de colesterol

Fundamento o principio: El colesterol y los steres del colesterol son liberados desde las lipoprotenas por detergentes. La enzima colesterol esterasa hidroliza los steres de colesterol formndose HO en la siguiente reaccin enzimtica de oxidacin del colesterol por la colesterol oxidasa segn la siguiente ecuacin:
Colesterol Oxidasa

Ester de colesterol + HO
Peroxidasa

colesterol + cidos grasos

Colesterol + O

colesterol-4-en-ona + HO

HO + 4AP + fenol
Colesterol esterasa

quinonimina + HO

La cantidad de quinonimina proporcional a la concentracin de colesterol

de

color

rojo

formada

es

Reactivos: Reactivo 1: Pipes pH 6.9 Fenol Peroxidasa Colesterol Esterasa Colesterol Oxidasa 4-aminofenazona 90 mmol/l 26 mmol/l 1250 U/l 300 U/l 300 U/l 0,4 mmol/l

Preparacin y estabilidad del reactivo: Reactivo listo para usar, el reactivo es estable entre 2 y 8C hasta la fecha de expiracin como se especifica en el frasco. Evitar la luz directa del sol. Muestra: suero. Estable hasta 3 meses a 20C y hasta 7 das mantenido a +4C Procedimiento Blanco Standard Muestra Reactivo trabajo de 2 ml 2 ml Estndar 20 l Muestra 20 l 2 ml

1. Mezclar e incubar a 37C por 5 minutos o 10 minutos entre 15 y 25C 2. Medir la Absorbancia del estndar y la muestra, ajustando el espectrofotmetro con el blanco de reactivo a 505 nm. El color es estable por 30 minutos. Clculos: Abs. de la muestra Concentracin de colesterol = estndar Abs. del estndar x concentracin del

mg/dl x 0.0258 = mmol/l Concentracin del estndar: 200 mg/dl Linealidad del mtodo: El mtodo es lineal hasta una concentracin de 600 mg/dl (15.4 mmol/l) Si la concentracin de colesterol es mayor de 600 mg/dl en el suero o plasma diluir la muestra con solucin salina y repetir la determinacin, multiplicando el resultado por el factor de dilucin.

Bibliografia Trinder P.Ann.Clin. Biochem 6.24(1969) Flegg H. M. Ann.Clin Biochem 10,79 (1972) Richmond W. Scand J.Clin. Lab. Supp. 26 Abstract 3,25 (1972) Deeg R. And Ziegenohrm, J.Clin. Chem 28,1574 (1982)

Determinacin de Transaminasas Sricas

Introduccin A: Determinacin de GOT La enzima Glutmico oxalactico transaminasa, GOT, (E.C. 2.6.1.1) cataliza la reaccin de transferencia del grupo amino del aminocido cido asprtico al aceptor -cetoglutarato, segn la siguiente reaccin: GOT -cetoglutarato oxalacetato + cido asprtico cido glutmico +

S acoplamos la reaccin anterior a la reaccin de reduccin del oxalacetato a travs de la enzima malato deshidrogenasa (MDH), podemos cuantificar la actividad de GOT. La enzima MDH requiere de NADH+H+ como cofactor.

MDH oxalacetato + NADH+H+ malato + NAD

A 340 nm NADH+H+

presenta el mximo de absorcin en tanto que el cofactor

oxidado, NAD, prcticamente no absorbe a esa longitud de onda. La disminucin de la absorbancia por unidad de tiempo del NADH+H+ a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de la enzima GOT. Para realizar esta actividad prctica Ud. recibir un kit reactivo que contiene las siguientes sustancias:

Reactivo A: Tampn Tris-HCl pH 7,7 30 mM, Aspartato de sodio 280mM, EDTA 7 mM Reactivo B: NADH+H+ 0,25 mM, MDH 600 U/L, LDH 250 U/L, -cetoglutarato, sal sdica 12 mM.

Al momento de usar se mezclan ambos reactivos y se conservan entre 2 y 8 C y es estable durante 5 das conservado a esta temperatura. Se incluye LDH para eliminar el piruvato endgeno durante la fase final. Se usa como muestra suero o plasma obtenido con heparina, EDTA o citrato. El suero no debe presentar hemlisis.

Materiales por grupo Espectrofotmetro Cubetas Pizeta Vaso pp de 250 Micropipetas p1000, p200

Reactivos Reactivo A Reactivo B

Procedimiento Experimental Mezclar segn se indica en la siguiente tabla Volumen (mL) Reactivo A y B a 37C Suero 1,0 0,1

Despus de 1 minuto medir la absorbancia a intervalos de 1 min. durante 10 minutos a 340 nm. Cuide que la temperatura permanezca estable a 37C. Es posible operar a 30 C. Determine A / min desde un grfico Absorbancia versus tiempo en minutos. Use este valor para determinar la actividad GOT en el suero

que esta analizando.

Clculos: a 37 C UI/L = A / min x 2570 a 30C UI/L = A / min x 1770

Valores de Referencia Hombres hasta 40 UI/L a 37 C (y 25 UI/L a 30 C) Mujeres hasta 35 UI/L a 37 C (y 23 UI/L a 30 C)

B: Determinacin de GPT: La glutmico pirvico transaminasa, GPT (E. C. 2.6.1.2.) es la enzima que cataliza la transferencia del grupo amino del aminocido alanina a -cetoglutarato, liberando piruvato segn la siguiente reaccin:

GPT -cetoglutarato + alanina cido glutmico + piruvato

S acoplamos la reaccin anterior a la reaccin de reduccin del piruvato a travs de la enzima lctica deshidrogenasa (LDH), podemos cuantificar la actividad de GPT. La enzima LDH requiere de NADH+H+ como cofactor.

LDH Piruvato + NADH+H+ lactato+ NAD

A 340 nm NADH+H+

presenta el mximo de absorcin en tanto que el cofactor

oxidado, NAD, prcticamente no absorbe a esa longitud de onda. La disminucin de la absorbancia por unidad de tiempo del NADH+H+ a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de la enzima GPT. Para realizar esta actividad prctica Ud. recibir un kit reactivo que contiene las siguientes sustancias:

Reactivo A: Tampn Tris-HCl pH 7,7 30 mM, Alanina 450 mM, EDTA 6 mM Reactivo B: NADH+H+ 0,25 mM, LDH 250 U/L, -cetoglutarato, sal sdica 12

mM. Al momento de usar se mezclan ambos reactivos y se conservan entre 2 y 8 C y es estable durante 5 das conservado a esta temperatura. Se usa como muestra suero o plasma obtenido con heparina, EDTA o citrato. El suero no debe presentar hemlisis.

Materiales por grupo Espectrofotmetro Cubetas Pizeta Vaso pp de 250 Micropipetas p1000, p200

Reactivos Reactivo A Reactivo B

Procedimiento Experimental Mezclar segn se indica en la siguiente tabla Volumen (mL) Reactivo A y B a 37C Suero 1,0 0,1

Mezclar e incubar 5 a 10 minutos a 37C. Despus de 1 minuto medir la absorbancia a intervalos de 1 min. durante 10 minutos a 340 nm. Cuide que la temperatura permanezca estable a 37C. Es posible operar a 30 C en este caso debe emplear 0,1 mL de suero y 1,0 mL de reactivo. Determine A / min. desde un grfico Absorbancia versus tiempo en minutos. Use este valor para determinar la actividad GOT en el suero que esta analizando.

Clculos: a 37 C UI/L = A / min x 3570 a 30C UI/L = A / min x 1770

Valores de Referencia Hombres hasta 40 UI/L a 37 C (y 25 UI/L a 30 C)

Mujeres hasta 35 UI/L a 37 C (y 23 UI/L a 30 C)

Cuestionario 1. Investigue por qu se deben conocer los valores de GOT y GPT 2. Investigue como interfiere y en que concentracin citrato y EDTA (usado como anticoagulante). 3. Qu diferencia hay entre suero y plama sanguneos? 4. Da lo mismo utilizar suero o plasma en las determinaciones de GOT y GPT? Explique 5. Investigue como es el espectro de absorcin del NAD y del NADH. Cmo se relacionan con esta actividad experimental?

INFORME LABORATORIO N1 Titulacin de aminocidos. Determinacin de pKa1, pKa2, pI.

INTEGRANTES GRUPO:

SECCION: FECHA:.

1.. 2.. 3..

RESULTADOS 1. Complete siguiente tabla: (debe adjuntar los grficos correspondientes y los clculos en el grafico o al reverso del) (2 puntos) aa pK1 pK2 pKR pI

2. Dibuje la estructura predominante a cada pH de cada aminocido estudiado en la titulacin (2 puntos): Aminocido 1:

Aminocido 2:

Aminocido 3:

Discusin: (2 puntos): Busque en bibliografa los valores de pKa1, pKa2 , pKR y pI, informados para los aminocidos que Ud. titul y compare con sus resultados.

Conclusin:

INFORME LABORATORIO N2 Espectrofotometra. Determinacin de Protenas sricas por los mtodos de Biuret y Bradford

INTEGRANTES GRUPO: SECCION: FECHA:. 1.. 2.. 3.. Resultados (4 puntos) 1. Curva de Calibracin: Determinacin de Protenas por el Mtodo de Bradford N Tubo Vol. L Patrn Albmina 1 mg/ml Volumen H2O L Volumen Bradford L 1 2 3 4 5 6 MP blanco 0 1000 2 4 6 8 10 15 998 996 994 992 990 985 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Absorcin a 595 nm Concentracin Protena

Grafico N1: Curva de Calibracin: Determinacin de Protenas por el Mtodo de Bradford (Papel Milimetrado) Clculos: Ejemplo de clculo de dilucin y de la determinacin de la concentracin de protenas en suero humano.

2. Curva de Calibracin: Determinacin de Protenas por el Mtodo de Biuret Vol. L Patrn Albmina 20 mg/ml 1 2 3 4 5 6 MP blanco 0 1000 2 4 6 8 10 15 998 996 994 992 990 985 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

N Tubo

Volumen H2O L

Volumen Biuret L

Absorcin a 540 nm

Concentracin Protena

Grafico N2: Curva de Calibracin: Determinacin de Protenas por el Mtodo de Biuret (Papel Milimetrado) Discusin (2 puntos)

Conclusin

INFORME LABORATORIO N3 Electroforesis de Protenas Determinacin de la Masa Molar de una Protena

INTEGRANTES GRUPO: SECCION: FECHA:. 1.. 2.. 3.. 1. Resultados. Incluya la Fotografa Rf estndar 1 2 3 4 5 6 Clculos: Ejemplo de clculo para un estndar y clculos para la Muestra problema MM estndar Rf MP MM protena Problema

Discusin (2 puntos)

Conclusin

INFORME LABORATORIO N4 : Enzimologa. Extraccin y Caracterizacin de la Fosfatasa cida de Aorta de Bovino; efecto del pH y de la temperatura INTEGRANTES GRUPO: SECCION: FECHA:. 1.. 2.. 3.. Resultados ( 1. Efecto del pH sobre la Actividad enzimtica N tubo a pH Absorbancia a pH 3.0 4.5 5.6 7.5 9.0 blanco control Concentracin Producto mM Velocidad de la reaccin

Clculos. Efecto de pH

Grfico: Efecto del pH sobre la actividad enzimtica

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica N tubo a T C Absorbancia a T 0 20 37 60 80 100 blanco control Clculos. Efecto de la Temperatura sobre la actividad enzimtica Concentracin Producto mM Velocidad de la reaccin

Grafico: Efecto de la Temperatura sobre la actividad enzimtica

INFORME LABORATORIO N 5: DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS 1. Determinacin enzimtica de glucosa 2. Determinacin qumica de la glucosa

INTEGRANTES GRUPO: SECCION: FECHA:. 1.. 2.. 3.. Resultados Determinacin Enzimtica de Glucosa

Blanco Absorbancia Concentracin Glucosa Clculos:

Estndar

Muestra

Determinacin qumica de la glucosa: Escriba la reaccin entre Glucosa y 2,4 dinitrosalicilato en medio alcalino

TABLA N1 N Tubo Vol. L Patrn glucosa 5 mg/ml 1 2 3 4 5 6 MP blanco 0 10 20 40 60 80 100

Volumen H2O L 990 980 960 940 920 900

Volumen DNS L 500 500 500 500 500 500 500

Absorbancia a 540 nm

Concentracin Glucosa

1000

500

Clculos:

Discusin (2 puntos)

Conclusin

INFORME LABORATORIO N6 : LIPIDOS Y ENZIMAS Determinacin de Colesterol, GOT y GPT INTEGRANTES GRUPO: SECCION: FECHA:. 1.. 2.. 3.. Resultados 1. Determinacin de Transaminasas Sricas: GOT y GPT A. Determinacin de GOT Tiempo (min) Absorbancia

Grfico Absorbancia vs tiempo

Clculos: Determinacin actividad GOT

2. Determinacin de GPT: Tiempo (min) Absorbancia

Grfico Absorbancia vs tiempo

Clculos: Determinacin actividad GOT

1. Determinacin de Colesterol Libre Blanco Absorbancia Concentracin Colesterol Clculos: Estndar Muestra

Discusin

Conclusin

Anexo 1 Uso de micropipetas Las micropipetas se utilizan para tomar pequeos volmenes que van de 0,01 a 1000L Partes de la pipeta A) B) C) D) E) F) G) H) Embolo Empuadura Expulsor de puntas Mango Pantalla Collar Cono Punta o tips A C B D E

F G

Ajuste del volumen: El volumen de la pipeta se muestra claramente en la pantalla situada en el mango. El ajuste del volumen se lleva a cabo girando fcilmente el mbolo o la rueda en direccin de las agujas del reloj o en contra las agujas del reloj (dependiendo de la cantidad que se requiera).

IMPORTANTE: Cada pipeta tiene un rango en el cul se puede trabajar, si se fuerza el embolo o rueda fuera del rango, se daa el mecanismo de la pipeta descalibrndola (lo que significa que despus no toma el volumen que seala la pantalla). Las pipetas que utilizaremos en el laboratorio son:

p20 p200

tiene un rango de entre 2 y 20 L tiene un rango de entre 20 a 200 L

p1000 tiene un rango de entre 200 a 1000 L

No pipetear por debajo y por sobre el volumen que tiene cada una de las pipetas, ejemplo: si est usando la p20 y necesita tomar 21 L, debe pasar a la pipeta siguiente que sera la p200 que va de 20 a 200 L.

En la pantalla usted podr ver el orden de los nmeros y significan lo siguiente p20 0 decena 2 unidad 5 decimal 2,5 L p200 1 centena 2 decena 5 unidad 125 L p1000 0 unidad de mil 9 centena 9 decena 990 L

ejemplo

Insercin y expulsin de puntas: Antes de insertar la punta asegrese que el cono est limpio. Presione la punta en el cono de la pipeta firmemente para asegurar su correcta insercin. El ajuste es correcto cuando se forma un anillo visible entre la punta y el cono de la micropipeta.

Cada pipeta viene provista de un dispositivo expulsa puntas que reduce el resigo de contaminacin por manipulacin. El dispositivo expulsa puntas debe ser presionado con firmeza, para asegurar su expulsin, asegrese que esta se realiza en un contenedor de desechos. Pipeteo: Certifique que la punta est firmemente insertada en el cono. Para que los resultados sean satisfactorios deber presionarse el mbolo de forma suave y lenta, particularmente con lquidos viscosos.

Mantenga la pipeta verticalmente mientras tenga lquido en la punta. Asegrese que el contenedor donde va a realizar la dispensacin est limpio y que la pipeta, la punta y el lquido estn a la misma temperatura. a) Presione el botn del mbolo hasta la primera parada o tope. b) Site la punta (2 a 3 mm) debajo de la superficie del lquido y suavemente libere el mbolo. Retirar cuidadosamente la punta del lquido, tocando contra la pared del recipiente para libera el exceso de lquido. c) El lquido es dispensado presionando el mbolo hasta la primera parada. Luego de una corta interrupcin continuar presionando en mbolo hasta la segunda parada o tope. d) Este procedimiento vaciar completamente la punta asegurndonos la precisin de la dispensacin.

Posicin de partida

Primera parada

Segunda parada

Recomendaciones para un buen pipeteado: a) Mantener la pipeta verticalmente y situar la punta unos mm por debajo de la superficie del lquido. b) Cuando se dispensen lquidos espesos o viscosos es conveniente aspirar y dispensar por lo menos 5 veces antes de realizar el pipeteo definitivo. c) Controlarlos movimientos de la mano mantenindolos constante. d) Cuando se pipeteen lquidos que tienen temperatura diferente a la del medio ambiente, enjuagar varias veces la punta antes e usarla.

Anexo 2 Uso de espectrofotmetro

Enchufar y encender el espectrofotmetro al menos 10 minutos antes de se utilizado. (para que se caliente la fuente de luz).

Seleccionar el filtro que corresponda a la determinada longitud de onda. Girando la rueda.

Una vez escogida la longitud de onda, seleccione la opcin de absorbancia apretando la tecla (1), y lleve el espectro a cero apretando la tecla (2).
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Para realizar las mediciones le cubeta o celdilla debe ubicarse de acuerdo a la direccin del haz de luz, para verificar la direccin levantando la tapa y mirando en el interior. La cubeta se debe usar por el lado transparente, no por el lado achurado.