Sebenta de Biologia Molecular Da Celula

Faculdade de Medicina de Lisboa
Mdulo I.I
Biologia Molecular da Clula

In Cooper 2 Edio
2007/2008
Biologia Molecular da Clula Mod. I.I
ndice
ndice ............................................................................................................................... 2 Capitulo Um (pg. 27 44) Uma Viso Geral das Clulas e Pesquisa Celular ..... 8 Origem e Evoluo ....................................................................................................... 8 Evoluo de Metabolismos ........................................................................................... 9 Procariontes Actuais ..................................................................................................... 9 Clulas Eucariticas ..................................................................................................... 9 Evoluo dos Eucariontes .......................................................................................... 10 Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares...................................................... 10 Captulo Um (pg. 52-57) ............................................................................................. 12 Crescimento de Clulas Animais em Cultura ............................................................. 12 Cultura de Clulas Vegetais ....................................................................................... 13 Vrus ........................................................................................................................... 13 Captulo Dois A Qumica das Clulas ..................................................................... 14 A composio Molecular das Clulas ........................................................................ 14 Glcidos ....................................................................................................................... 14 Lpidos ........................................................................................................................ 15 cidos Nucleicos ........................................................................................................ 16 Protenas .................................................................................................................... 17 Enzimas ...................................................................................................................... 18 Mecanismo de Catlise Enzimtica ........................................................................... 18 Coenzimas .................................................................................................................. 19 Regulao da Actividade Enzimtica ......................................................................... 19 Energia Metablica ..................................................................................................... 19 Membranas Celulares ................................................................................................ 19 Transporte Atravs das Membranas Celulares .......................................................... 20 Captulo Trs (pg. 113 138) Fundamentos de Biologia Molecular .................. 22 Hereditariedade, Genes e DNA .................................................................................. 22 Genes e Cromossomas .............................................................................................. 22 Genes e Enzimas ....................................................................................................... 24 Replicao do DNA .................................................................................................... 24 Expresso da Informao Gentica ........................................................................... 24 Funo do RNA Mensageiro ...................................................................................... 24 O Cdigo Gentico ..................................................................................................... 25 Vrus de RNA e Transcrio Reversa ........................................................................ 25 DNA Recombinante .................................................................................................... 25 Endonucleases de Restrio ...................................................................................... 26
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Electroforese em Gel .................................................................................................. 26 Gerar Molculas de DNA Recombinante ................................................................... 27 Vectores para DNA Recombinante ............................................................................ 28 Sequenciao do DNA ............................................................................................... 28 Expresso dos Genes Clonados ................................................................................ 29 Amplificao de DNA pela Reaco em Cadeia de Polimerase (PCR) ..................... 30 Transferncia de Genes em Plantas e Animais ......................................................... 30 Mutagnese de DNA Clonados .................................................................................. 31 Captulo Quatro A Organizao dos Genomas Celulares ..................................... 32 A complexidade dos Genomas Eucaritas ................................................................ 32 Intres e Exes ........................................................................................................... 32 Famlias Gnicas e Pseudogenes .............................................................................. 32 Sequncias de DNA Repetitivas ................................................................................ 33 Cromossomas e Cromatina ........................................................................................ 33 Cromatina ................................................................................................................... 33 Centrmeros ............................................................................................................... 34 Telmeros ................................................................................................................... 34 O Genoma Humano ................................................................................................... 34 Captulo Cinco Replicao, Manuteno e Rearranjos do DNA Genmico ........ 36 DNA Polimerases ....................................................................................................... 36 A Forquilha de Replicao ......................................................................................... 37 Fidelidade da Replicao ........................................................................................... 38 As Origens e a Iniciao da Replicao ..................................................................... 39 Os Telmeros e a Telomerase ................................................................................... 39 Reparao do DNA .................................................................................................... 40 Reverso Directa de Leses do DNA ........................................................................ 40 Reparao por Exciso .............................................................................................. 41 Reparao Ps-Replicao ........................................................................................ 41 Recombinao entre Sequncias Homlogas de DNA ............................................. 42 Molculas de DNA Recombinam-se por meio de Quebras e Rejunes .................. 42 Modelos de Recombinao Homloga ...................................................................... 42 Enzimas Envolvidas na Recombinao Homloga .................................................... 43 Rearranjos do DNA .................................................................................................... 44 Recombinao Stio-Especifica .................................................................................. 44 Transposio Atravs de Intermedirios de DNA ...................................................... 44 Transposio Atravs de Intermedirios de RNA ...................................................... 45 Amplificao Gnica ................................................................................................... 45 Captulo Seis Sntese e Processamento de RNA ................................................... 46 Transcrio em Procaritas ........................................................................................ 46
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A RNA Polimerase e a Transcrio ............................................................................ 46 Os Repressores e o Controlo Negativo da Transcrio ............................................. 46 Controlo Positivo da Transcrio................................................................................ 47 Atenuao da Transcrio.......................................................................................... 47 As RNA Polimerases Eucaritas e os Factores Gerais de Transcrio .................... 47 As RNA Polimerases Eucaritas ................................................................................ 47 Os Factores Gerais da Transcrio e a Iniciao da Transcrio pela RNA Polimerase II............................................................................................................................ 48 A Transcrio pelas RNA Polimerase I e III ............................................................... 49 Regulao da Transcrio em Eucaritas ................................................................. 49 Sequncias Regulatrias com Actuao em Cis: Promotores e Enhancers ............. 49 Protenas Regulatrias Transcricionais ...................................................................... 50 Estrutura e Funo dos Activadores Transcricionais ................................................. 50 Repressores Eucaritas ............................................................................................. 51 Relao entre Estrutura da Cromatina e a Transcrio ............................................. 51 Metilao do DNA ....................................................................................................... 51 Processamento e Reciclagem de RNA ...................................................................... 52 Processamento do rRNA e do tRNA .......................................................................... 52 Processamento do mRNA em Eucaritas .................................................................. 52 Mecanismo de splicing ............................................................................................... 53 Splicing Alternativo ..................................................................................................... 54 Edio do RNA ........................................................................................................... 55 Degradao de RNA .................................................................................................. 56 Captulo Sete (pg. 297 325) Sntese, Procesamento e Regulao Proteicos . 57 Traduo do mRNA .................................................................................................... 57 RNAs de Transporte ................................................................................................... 57 O Ribossoma .............................................................................................................. 57 A Organizao de mRNAs e Inicio da Traduo........................................................ 58 O Processo de Traduo ............................................................................................ 58 A Regulao da Traduo .......................................................................................... 59 Dobramento e Processamento Proteicos ................................................................... 59 Chaperonas e Dobramento Proteico .......................................................................... 59 Enzimas e Dobramento Proteico ................................................................................ 59 Clivagem Proteica ...................................................................................................... 60 Glicolizao ................................................................................................................ 60 Ligao de Lpidos ..................................................................................................... 60 Captulo Nove Seleco e Transporte de Protenas .............................................. 62 Retculo Endoplasmtico ............................................................................................ 62 O Retculo Endoplasmtico e a Secreo de Protenas ............................................ 62 Direccionando Protenas para o Retculo Endoplasmtico ........................................ 62
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Insero de Protenas na Membrana do Retculo Endoplasmtico ........................... 63 Dobramento de Protenas e Processamento no Retculo Endoplasmtico ............... 63 O Reticulo Endoplasmtico ........................................................................................ 64 Exportao de Protenas e Lpidos do Retculo Endoplasmtico .............................. 64 O Complexo de Golgi ................................................................................................. 64 Organizao do Complexo de Golgi .......................................................................... 64 Distribuio de Protenas e Exportao do Complexo de Golgi ................................ 65 Protenas de Revestimento e de formao de Vesculas .......................................... 65 Fuso Vesicular .......................................................................................................... 65 Lisossomas ................................................................................................................. 66 Hidrolases Lisossomais cidas .................................................................................. 66 Captulo Dez (pg. 411-415) Bioenergtica e Metabolismo: Mitocondrias .......... 67 Mitocndrias ............................................................................................................... 67 Organizao e Funo das Mitocndrias ................................................................... 67 O Sistema Gentico das Mitocndrias ....................................................................... 67 Captulo Dez (pg. 437-441) Bioenergtica e Metabolismo: Peroxissomas ........ 68 Peroxissomas ............................................................................................................. 68 Funes do Peroxissomas ......................................................................................... 68 Captulo Onze O Citoesqueleto e o Movimento Celular ........................................ 69 O Citoesqueleto .......................................................................................................... 69 Microtbulos ............................................................................................................... 69 Constituio dos Microtbulos.................................................................................... 69 Transporte Celular e Protenas Motoras .................................................................... 70 Protenas Associadas aos Microtbulos .................................................................... 70 Drogas que Intreferem com os Microtbulos ............................................................. 71 Filamentos Intermdios .............................................................................................. 71 Diferentes Tipos de Filamentos Intermdios .............................................................. 72 Formao dos Filamentos Intermdios ...................................................................... 72 Filamentos de Actina .................................................................................................. 73 Polimerizao/Despolimerizao ............................................................................... 73 Protenas que Regulam a Polimerizao e Despolimerizao da Actina .................. 73 Drogas que Afectam o Citosqueleto de Actina........................................................... 74 Organizao do Citoesqueleto de Actina ................................................................... 74 Miosina ....................................................................................................................... 75 Contraco Muscular .................................................................................................. 75 Captulo Treze Sinalizao Celular .......................................................................... 76 Sinalizao de Molculas e seus Receptores ............................................................ 76 Modelos de Sinalizao Clula-Clula ....................................................................... 76
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Hormonas Esterides e Superfamlia de Receptores Esterides .............................. 76 Hormonas Peptdeas e Factores de Crescimento ..................................................... 76 Funes dos Receptores de Superfcie Celular ......................................................... 77 Receptores Acoplados Protena G .......................................................................... 77 Receptores de Protena-Tirosina Cinase ................................................................... 77 Vias de Transduo de Sinal Intracelular................................................................... 78 A Via do cAMP: Segundo Mensageiro e Fosforilao de Protenas .......................... 78 GMP Cclico ................................................................................................................ 79 A Via das Ras, Raf e MAP Cinase ............................................................................. 79 Regulao da Morte Celular Programada .................................................................. 79 Caspases e Apoptose ................................................................................................ 80 Receptores de Morte Celular e Activao de Caspases ............................................ 81 Sinalizao de Sobrevivncia Celular ........................................................................ 81 Captulo Catorze (pg. 596-617) O Ciclo Celular .................................................... 83 O Ciclo Celular dos Eucaritas................................................................................... 83 Fases do Ciclo Celular ............................................................................................... 83 Regulao do Ciclo Celular pelo Crescimento Celular e Sinais Extracelulares ........ 84 Pontos de Verificao do Ciclo Celular ...................................................................... 84 Ligao da Fase S para a Fase M ............................................................................. 85 Reguladores do Curso do Ciclo Celular ..................................................................... 85 MPF: Um Dmero de Cdc2 e Ciclina .......................................................................... 85 Famlia das Ciclinas e Cinases Dependentes de Ciclinas ......................................... 85 Factores de Crescimento e Ciclinas do Tipo D .......................................................... 86 Inibidores do Curso do Ciclo Celular .......................................................................... 87
Correlaes Clnicas ............................................................................................. 88

ndice ............................................................................................................................. 89 Vrus e Cancro .............................................................................................................. 90 A Doena .................................................................................................................... 90 Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 90 Preveno e Tratamento ............................................................................................ 90 Fenilcetonria ............................................................................................................... 91 A Doena .................................................................................................................... 91 Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 91 Preveno e Tratamento ............................................................................................ 91 HIV e SIDA ..................................................................................................................... 92 A Doena .................................................................................................................... 92 Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 92 Preveno e Tratamento ............................................................................................ 92
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Terapia Gnica para a Deficiencia de Adenosina Desaminase ............................... 93 A Doena .................................................................................................................... 93 Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 93 Preveno e Tratamento ............................................................................................ 93 Cancro do Clon e Reparao do DNA ...................................................................... 94 A Doena .................................................................................................................... 94 Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 94 Preveno e Tratamento ............................................................................................ 94 Factor de Transcrio Pit-1 e a Deficincia da Hormona do Crescimento ............ 95 A Doena .................................................................................................................... 95 Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 95 Preveno e Tratamento ............................................................................................ 95 Antibiticos e Sntese Proteica ................................................................................... 96 A Doena .................................................................................................................... 96 Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 96 Preveno e Tratamento ............................................................................................ 96 Doena de Gaucher ...................................................................................................... 97 A Doena .................................................................................................................... 97 Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 97 Preveno e Tratamento ............................................................................................ 97 Doenas das Mitocndrias: Neurapatias pticas Heredittia de Leber ................. 98 A Doena .................................................................................................................... 98 Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 98 Preveno e Tratamento ............................................................................................ 98 Distrofia Muscular e Citoesqueleto ............................................................................ 99 A Doena .................................................................................................................... 99 Bases Celulares e Moleculares .................................................................................. 99 Preveno e Tratamento ............................................................................................ 99 Fibrose Cstica ............................................................................................................ 100 A Doena .................................................................................................................. 100 Bases Celulares e Moleculares ................................................................................ 100 Preveno e Tratamento .......................................................................................... 100
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Capitulo Um (pg. 27 44)

Origem e Evoluo
Eucariticas (com ncleo que armazena o DNA) Clulas Procariticas citoplasmticos e citoesqueleto) icos (menores, sem ncleo, organitos
Os mecanismos moleculares bsicos que controlam a vida de ambas as clulas so os mesmo, o que nos sugere a existncia de um ancestral comum. Em seguida a sequncia de acontecimentos que levaram 1 clula:
Atmosfera Primitiva Atmosfera
Macromolculas
Polimeros
Capacidade de Auto Capacidade Auto-Replicarem-se Proteinas ou Acidos Nuncleicos ? Apenas os acidos Nucleicos so capazes de controlar a sua autoreplicao Apenas
RNA (Sistema Gentico Inicial) RNA
1 Clula
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A formao da primeira clula apenas foi possvel devido formao de membranas de fosfolpidos, que permitiram isolar do restante meio ambiente as molculas com a capacidade de se auto-replicar e assim ter um metabolismo independete, devido s suas propriedade fsicas e qumicas. Os fosfolpidos so compostos por uma cabea hidrfila e uma cauda hidrofbica:
Evoluo de Metabolismos
A capacidade de obter alimentos e energia directamente do meio ambiente um dos factores limitadores para as clulas primordiais, foi assim necessrio criar mecanismos de desenvolvimento prprio. Houve assim uma evoluo da gliclise que permitiu a existncia de energia qumica (ATP), surgiram os primeiros organismos fotossintticos o que levou a um grande aumento da quantidade de oxignio na atmosfera e desencadeou a evoluo dos mecanismos oxidativos (Respirao Aerbia).
Procariontes Actuais
Os procariontes actuais podem dividir-se em: - Arqueobactrias (Bactrias em Ambientes Extremos) - Eubactrias (Bactrias Actuais) Os procariontes so constitudos pela membrana celular, alguns por uma parede celular rgida, pelo nucloide (agregado de DNA) e pelos ribossomas.
Clulas Eucariticas
So mais complexas, possuem ncleo limitado por uma membrana porosa, vrios organitos citoplasmticos e citoesqueleto.
Complexo de Golgi: organizao e transporte de protenas, sintese de lpidos e alguns polissacarideos (em plantas)
Mitocndrias: respirao aerbia
Retculo Endoplasmtico: organizao e transporte de proteinas, sintese de lpidos
Cloroplasto: fotossntese
Lisossomas e Peroxissomas: digesto e reaces oxidativas
Clula Eucaritica
Citoesqueleto: rede de filamentos proteicos que se estende pelo citoplasma
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O citoesqueleto, apesar de no ser um organito propriamente dito , desempenha uma importante funo, fornece estrutura clula, determina o seu formato, gera organizao celular, responsvel pelos movimentos, responsvel pelo transporte intracelular e pelo posicionamento dos organitos e nsporte outras estruturas.
Evoluo dos Eucariontes

A Hiptese Endossimbitica a que melhor explica o aparecimento plica das clulas eucaritas, e que se baseia na relao endossimbitica entre s, bactrias aerbias que vieram a originar as mitocndrias e cianobactrias que bias originaram cloroplastos quando ingeridas por outras clulas. Esta hiptese apoiada pelos seguintes factos: - Mitocndrias e Cloroplastos so similares a bactrias; - Estes reproduzem reproduzem-se por diviso binrias; - Contm o seu prprio DNA; - Tm ribossomas prprios; - O seu cdigo gentico diferente do usado pelo genoma celular nuclear; - Os seus Ribossomas e rRNA so mais prximo do das bactrias do que dos eucariticas. Estas relaes endossimbiticas foram vantajosas e positivamente endossimbiticas seleccionadas e por isso perduraram permitindo assim que houvesse perduraram, evoluo, originando-se clulas eucariticas. se
Desenvolvimento dos Organismos Multicelulares
Com uma cada vez maior necessidade de nutrientes e consequente da aumento da rea de contacto com o exterior, tornou se evidente que o simples tornou-se aumento da clula no era eficaz, iniciou se assim uma srie de associaes iniciou-se entre clulas de organismos idnticos, de forma a permitir uma maior rea sem 10 2007/2008
que para isso aumentassem o seu volume. Desta associao surgiram as colnias que apesar de serem clulas independentes eram favorecidas pelo facto de estarem agrupadas. Progressivamente comeou a existir uma diferenciao e especializao de determinados grupos de clulas e que mais tarde viriam a originar os seres pluricelulares. Nestes existem grupos de clulas com diferente funes, mas todos eles interdependentes e fazendo parte do mesmo organismos.
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Captulo Um (pg. 52-57)

O microscpio electrnico no permite estudar as vrias funes dos inmeros componentes da clula eucaritica e por isso necessrio isolar os organelos (por tamanho e densidade) atravs da centrifugao diferencial. Inicialmente feita a ruptura da membrana plasmtica que pode ser feita por exposio a ultra-sons, triturao com homogeneizadores mecnicos ou atravs de liquidificadores; de seguida a suspenso de clulas rompidas, lisado ou homogenato, sujeita a uma srie de centrifugaes de velocidade crescente, em cada uma possvel separarmos determinado componente. Existem outros mtodos para obter de forma isolada os organelos: - Centrifugao em gradiente de concentrao: separados por sedimentao atravs de uma substncia densa (ex. sacarose); - Centrifugao por velocidade: o material colocado no topo do gradiente de sacarose, partculas de tamanhos diferentes sedimentam atravs do gradiente em taxas diferentes, permitindo separar organitos com tamanhos semelhantes; - Centrifugao de Equilbrio: pode ser usada para separar organitos com base nas suas densidades de flutuao, independentemente do seu tamanho ou forma.
Crescimento de Clulas Animais em Cultura

Este processo mais complexo do que em bactrias e leveduras, no entanto atravs dele que podemos estudar o crescimento e a diferenciao celular. Permite-nos ainda manipulaes genticas necessrias para a compreenso da estrutura e funo dos genes. O processo consiste em retirar uma clula de um tecido, coloca-la num meio de cultura nutritivo numa placa de cultivo, algumas das clulas aderem e crescem formando colnias, a placa de cultivo assim preenchida dando origem a uma cultura primria, desta retirado um conjunto de clulas que so colocadas noutra placa de cultivo, dando origem a uma cultura secundria, este processo repete-se at cerca de 50 a 100 vezes, aps isto as clulas perdem a capacidade de se duplicarem. frequente o uso de tumores ou clulas de embries como material de partida, j que contm clulas de crescimento rpido, e no caso dos tumores no possuem limitaes quanto ao nmero de duplicaes que possvel realizar. Um dos inconvenientes deste processo que ele muito mais demorado, cerca de 10x, do que quando realizado em bactrias e leveduras. Meio de Cultura Nutritivo no caso da cultura de clulas animais bastante mais complexo do que para as bactrias e leveduras, pois necessrio incluir factores de crescimento e de regulao, aminocidos essenciais no sintetizados pelo organismo, e os habituais nutrientes.
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Cultura de Clulas Vegetais

As clulas vegetais podem ser cultivadas desde que no seu Meio de Cultura Nutritivo sejam adicionados os factores de crescimento adequados. O processo iniciado com a recolha de uma clula que por divises mitticas ir originar um conjunto de clula, o calo; contrariamente ao que ocorre nos animais, as clulas restauram a totipotncia, sendo assim possvel originar de uma s clula toda uma planta nova.
Vrus
Os vrus no considerados seres-vivos, so parasitas intracelulares que necessitam de uma clula hospedeira para originarem descendncia, fazendo uso dos mecanismos dessa mesma clula. Existem retrovrus cujo material gentico no , como seria de esperar, o DNA, mas sim o RNA. Este vrus fazem uso da transcriptase reversa para originarem cDNA que possa ser incorporado no genoma da clula hospedeira, visto que esta enzima menos eficiente, os vrus tm elevadas taxas de mutao. Os bacterifagos so altamente eficientes chegando em apenas 20 a 30 minutos, infectada apenas uma clula, a originarem cerca de 200 novas partculas virais.
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Captulo Dois
A composio Molecular das Clulas
As clulas so genericamente compostas por gua, ies inorgnicos e molculas orgnicas, sendo a molcula de gua a mais abundante (cerca de 70% da massa da clula). A interaco entre a gua e as restantes molculas de elevada importncia: destaca-se o facto de ser uma molcula polar, podendo formar pontes de hidrognio e interagir com ies carregados electricamente. Assim sendo as molculas polares (hidrfilas) so muito solveis em gua, enquanto as molculas apolares (hidrofbicas) so fracamente solveis em gua. Devido ao facto de serem fracamente solveis, as molculas apolares tendem a associar-se entre si de modo a minimizar o contacto com a gua efeito hidrofo. Os ies inorgnicos (sdio, potssio, magnsio, clcio, cloro e bicarbonato) constituem 1% ou menos da massa da clula e esto envolvidos em vrios aspectos do metabolismo e funes da clula. As molculas orgnicas podem ser na sua maioria divididas da seguinte forma: - Protenas (Aminocidos); - Glcidos (Oses); - Lpidos (cidos Gordos); - cidos Nucleicos (Nucletidos). So macromolculas formadas por polimerizao dos seus monmeros e que constituem entre 80% a 90% da massa restante da clula, de seguida iremos falar individualmente de cada um dos grupos anteriormente referidos.
Glcidos
Os seus monmeros so as oses, a mais conhecida a glicose, e tm como funo o consumo no organismo, enquanto os polmeros, como o caso do glicognio, tm uma funo de armazenamento. Os glcidos associados a outras macromolculas, como exemplo as protenas, podem funcionar como marcadores em vrios processos de reconhecimento celular. Dentro dos glcidos destaca-se a glicose pois a principal fonte energtica das nossas clulas, esta pode ocorrer na sua forma linear ou na sou forma cclica. Quando se encontra na sua forma cclica pode encontrar-se em conformaes diferente ou (respectivamente trans ou cis) que dependem da conformao do carbono um. Estas diferentes conformaes vo
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ter implicaes ao nvel da sua interaco nomeadamente nos metabolismos celulares.
Os vrios monossacardeos so unidos por intermdio de uma reaco de desidratao e ficam unidos por uma ligao glicosdica. Quando o nmero de monossacardeos unidos reduzido denomina-se oligassacardeos, se forem cadeias muito longas denominam-se polissacardeos. A ligao ocorre geralmente entre C1---C4, mas pode ocorrer esporadicamente entre C1--C6; a ligao denomina-se ou dependendo da conformao do carbono anumrico que intervm na ligao.
Lpidos
As principais funes dos lpidos so: - Armazenamento de Energia; - Sinalizao Celular (Hormonas); - Principais componentes das membranas. Os lpidos mais simples so os cidos gordos, mais frequentes as cadeias com 16 ou 18 carbonos, estes podem ser insaturados (uma ou mais ligaes duplas entre carbonos) ou saturados (sem ligaes duplas entre carbonos).
A natureza hidrofbica das cadeias de cidos gordos responsvel pelo comportamento dos lpidos mais complexos, nomeadamente na formao de 15 2007/2008
membranas, como o caso das membranas plasmticas formadas por uma bicamada fosfolipdica. Os lpidos so armazenados sob a forma de triacilglicerois e constituem a forma mais eficiente de armazenar energia pois quando degradados, pela oxidao, originam mais do dobro de energia (ATP) do que os glcidos. Os fosfolpidos so os principais componentes da membrana, no entanto encontramos ainda glicolpidos e colesterol.
Ao grupo fosfato de um fosfolpido pode estar ligada outra molcula polar, como o caso da colina, em cima na imagem, que pode ser um glcido e funcionar como receptor de membrana ou marcador. Existe ainda uma excepo em que o fosfolpido no contm glicerol, a esfingomielina.
cidos Nucleicos
Existem dois tipos de cidos nucleicos, o DNA (desoxirribonucleico) e o RNA (ribonucleico), que diferem entre si apenas no acar (ose), que num caso a desoxiribose e noutro a ribose, respectivamente. Existem vrios tipo de RNA: - mRNA (RNA mensageiro) - rRNA (RNA ribossmico) - tRNA (RNA transferncia) - RNAs envolvidos no processamento e transporte de protenas Os monmeros dos cidos nucleicos so o nucletidos, que so constitudos por uma base purina ou pirimidina, um acar (ose) e um fosfato. As bases purinas so a: Adenina e a Guanina; e as pirimidinas a: Citosina e a Timina/Uracilo. importante referir que a Adenina e a Timina/Uracilo se ligam por apenas duas pontes de hidrognio, enquanto a Guanina e a Citosina se ligam por trs pontes de hidrognio. A polimerizao feito por intermdio de ligaes fosfodister entre o grupo fosfato no C5 e grupo hidroxilo no C3 da base que se segue, no esquecer que este processo 16 2007/2008
ocorre sempre no sentido 5 3 e por isso mesmo, por conveno, se escreve sempre nesse mesmo sentido. Os nucletidos so importantes para a formao os cidos nucleicos, no entanto eles intervm noutros processos de elevada importncia, como o caso do ATP (adenosina 5 trifosfato), usada como energia qumica da clula, ou do AMPc, que um dos sinalizadores intracelulares.
Protenas
Os cidos nucleicos guardam a informao, as protenas tm como principal funo executar as tarefas contidas nessa informao, e ainda funes de estrutura, de transporte e armazenamento de pequenas molculas, transmisso de informao, defesa e em situaes extremas podem ser utilizadas para produzir energia. A principal capacidade das protenas a de agirem como enzimas, catalisando as reaces nos sistemas biolgicos. As protenas so polmeros de aminocidos, existem cerca de 20 aminocidos, e cada um deles possui caractersticas especiais. Os aminocidos podem ter diversas conformaes, dependendo da posio relativa do grupo amina em relao ao carbono , como verificamos na imagem ao lado. Estando a cadeia lateral localizada inferiormente e o grupo amina e hidroxilo no mesmo plano, se o grupo amina estiver esquerda, temos um L aminocido, so os nicos encontrados nas protenas humanas; se o grupo amina estiver direita do carbono , temos um D aminocido (ter em conta que este raciocnio apenas vivel se o radical se encontrar representado inferiormente).
O aminocido cistena importante pois atravs do seu grupo lateral, mais especificamente do grupo SH conseguem com outro resduo do mesmo aminocido formam pontes dissulfeto.
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Os aminocidos podem ser divididos quanto s suas caractersticas qumicas, como sendo cidos/bsicos ou polares/apolares, estas esto dependentes da sua cadeia lateral. Os aminocidos formam protenas ligando-se entre si por intermdio de ligaes peptdicas, e so sempre sintetizados no sentido de um grupo amina para um grupo hidroxilo. A sequncia de aminocidos apenas o primeiro elemento da estrutura das protenas, estas adaptam estruturas tridimensionais que so crticas para a sua funo. Assim sendo existe uma estrutura primria que consiste numa sequencia linear de aminocidos; a estrutura secundria pode dividir-se em duas estruturas: - Folha Pregueada, quando duas cadeias esto lado a lado formamse pontes de hidrognio entre elas, geram-se fitas paralelas ou anti-paralelas; - Hlice, a cadeia de aminocidos gira em torno de si mesma e o grupo carboxilo de um resduo de aminocido liga-se por ponte de hidrognio ao grupo amina do resduo de aminocido localizado 4 posies abaixo na cadeia. A associao de estrutura -hlice e -pregueada, conectados pela cadeia lateral dos seus resduos de aminocidos, leva formao de estruturas globulares, denominadas de domnios, formando a unidade bsica da estrutura terciria. Na estrutura terciria os aminocidos hidrofbicos encontram-se no interior. Por fim temos a estrutura mais complexa, denominada por estrutura quaternria, que consiste na interaco de cadeias polipeptdicas de diferentes protenas, originando protenas constitudas por diversos domnios.
Enzimas
As enzimas catalisam, aumentam a velocidade, das reaces que ocorrem no interior das nossas clulas. Estas possuem duas caractersticas que as tornam adequadas para a sua funo, aumentam a velocidade da reaco sem se consumirem e sem alterar o equilbrio qumico da mesma. O princpio de funcionamento das enzimas consiste em diminuir a energia de activao, aumento a velocidade da reaco tanto no sentido directo como no sentido inverso.
Mecanismo de Catlise Enzimtica

A ligao Enzima + Substrato muito especifica, existindo para explicar esta especificidade dois modelos: 18 2007/2008
- Modelo Chave-Fechadura, onde o substrato encaixa perfeitamente com o centro activo da enzima que catalisa a reaco; - Encaixe Induzido, a conformao da enzima e do substrato so modificados pela ligao do substrato, a conformao de tal forma alterada que idntica do estado de transio, o que pode facilitar a sua converso no produto final.
Coenzimas
Para que o complexo enzima e substrato posso estar activo necessria a ligao de um grupo prosttico enzima, que pode ser uma vitamina ou ies metlicos. Uma das diferenas das coenzimas que estas so alteradas durante a reaco, no entanto so recicladas de modo a poderem ser utilizadas de novo.
Regulao da Actividade Enzimtica

Existem diversos tipos de regulao enzimtica, destacando-se os seguintes: - Inibio por retroalimentao, o produto de uma das reaco da via metablica, geralmente o produto final, vai se ligar enzima que catalisa a primeira reaco desta via de forma a que esta fique inibida. assim possvel que haja um controlo dos gastos energticos e de substrato, pois havendo muito produto no necessrio que haja continuao da produo, podendo o substrato ser utilizado para outra via; - Regulao Alostrica, a enzima regulada pela ligao de pequenas molculas ao seu centro alostrico, inibindo-a ou activando-a, no entanto esta substncia pode ou no ser um produto da via metablica em questo; - Fosforilao, a adio de grupos fosfato activa ou inibe a actividade enzimtica.
Energia Metablica
Este tema referido no nosso programa de bioqumica e por isso no o vou referir aqui devido sua extenso e no ser muito relevante para a Biologia Molecular da Clula, mas aqui ficam algumas palavras-chaves centrais deste tema: - ATP - Gliclise - Respirao Aerbia - Fotossntese - Oxidao - Sntese de Protenas, Glcidos e Lpidos
Membranas Celulares
As membranas so barreiras entre o meio intracelular e o extracelular; dentro da clula definem os diversos compartimentos existentes. A sua origem 19 2007/2008
Biologia Molecular da Clula Mod. I.I e estrutura deriva das propriedades dos lpidos, em grande parte dos fosfolpidos. Todas as membranas possuem uma estrutura comum composta por uma bicamada fosfolipdica e protenas, que podem desempenhar funo de transporte, receptoras e de controlo. A percentagem de lpidos e de protenas aproximadamente equitativa, dentro dos lpidos destaca-se ainda a presena de colesterol e de glicolpidos. Esta estrutura em bicamada permite que molculas individuais estejam livres para girarem e se moverem em direces laterais, pois uma estrutura fluida.
A fluidez depende da temperatura, mas tambm da composio lipdica da membrana. As cadeias de cidos gordos insaturados juntamente com cadeias curtas de cidos curtos contribuem para uma maior fluidez, por sua vez o colesterol torna-a menos fluida, no entanto permite que a fluidez seja mantida mesmo a temperaturas baixas. As protenas de membrana tm um papel diminuto na estrutura da membrana, sendo a sua actividade executar funes especficas de cada membrana. Podemos distinguir dois tipos de protenas nas membranas: - Protenas Transmembranares ou Integrais, que esto includas dentro da bicamada fosfolipdica; - Protenas Perifricas, no esto inseridas na membrana, mas associadas bicamada fosfolipdica perifericamente, geralmente ligadas a protenas integrais. As pores que atravessam a bicamada so geralmente de estrutura em -hlice de 20 a 25 aminocidos no polares e esto geralmente associadas a glcidos, permitindo a interaco entre clulas. importante referir que existem ainda estruturas denominadas de Barris , que consistem em vrias protenas com estrutura de folha -pregueada de forma a formarem um poro na membrana permitindo a entrada de diversas molculas.
Transporte Atravs das Membranas Celulares

As membranas possuem permeabilidade selectiva, o que permite clula manter e controlar a sua composio interna. Apenas as molculas pequenas e apolares atravessam prontamente a membrana; as que no o conseguem por si s fazem-no por intermdio de protenas transmembranares especificas que agem como transportadores, o que origina a permeabilidade selectiva das membranas. 20 2007/2008
As protenas de transporte podem ser divididas em protenas de canal, consistem em poroso abertos selectivamente, ou em protenas transportadoras, que se ligam e transportam selectivamente, facilitam a passagem por elas mudando a sua conformao. O transporte pode ser feito de forma passiva, a favor do gradiente de concentrao, ou de forma activa, com gasto energtico e contra o gradiente de concentrao, permitindo o controlo da composio interno da clula.
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Captulo Trs (pg. 113 138)

Hereditariedade, Genes e DNA
Todos os organismos herdam dos seus progenitores a informao gentica especificando estrutura e funo das suas clulas. Visto que todas as clulas so originadas de outras pr-existentes, o material gentico replicado e passado da clula parental para a descendente em cada diviso.
Genes e Cromossomas
Os princpios bsicos genticos foram deduzidos por Gergor Mendel em 1865: Alelo cpia de um gene, que especifica uma determinada caracterstica. Existem dois alelos para cada gene, sendo que um herdado do pai e outro da me. Dominante demonstra-se sempre, quer em homozigotia, quer em heterozigotia. Recessivo expressa-se apenas quando em homozigotia. Gentipo constituio de um indivduo em genes. Fentipo caractersticas fsicas que advm do seu gentipo. Cromossomas so como que carregadores de genes. Diploide (2n) existem no organismo duas cpias do genoma, existem cromossomas homlogos. Haploides (n) apenas existe uma cpia do genoma.
Existem dois tipos de diviso celular, sendo que uma a mitose e outra a meiose. Na mitose existe uma conservao numrica do material gentico 22 2007/2008
da clula, onde uma clula diploide origina duas igualmente diploides. Na meiose encontramos duas divises, sendo que a primeira reducional, ou seja, de uma clula diploide originam-se duas haploides, que por sua vez se iro dividir, mantendo a quantidade de genoma, originando-se assim quatro clulas haploides. Apenas na formao dos gmetas existe a diviso meitica, pois necessrio que estes sejam haploides, para que a quando da fecundao se possa formar uma clula diploide e por divises mitticas, que conservaro o nmero de cromossomas, surgir um individuo diploide. Durante a meiose ocorrer recombinao entre os genes, sendo mais frequente entre genes distantes do que prximos.
Ao longo da nossa vida ocorrem alteraes nosso genoma, que podem ser chamadas num contexto biolgico de mutaes, no entanto no ponto de vista clnico apenas as que originam uma patologia, e se encontram sob uma presso selectiva negativa e por isso ocorrem numa percentagem menor da populao, so designadas de mutaes; as restantes e que ocorrem geralmente numa percentagem entre 1% a 3% da populao, no sendo prejudiciais, no sofrem uma presso selectiva negativa e por isso so transmitidas descendncia, designam-se por polimorfismos. Atravs do estudo dos polimorfismos possvel estudar migraes, e relaes entre pessoas ao longo de muitas geraes, como identificar corpos ou realizar testes de paternidade. 23 2007/2008
Genes e Enzimas
Atravs de vrias experiencias chegou-se concluso que uma determinada mutao alterava uma determinada via metablica, logo alterava uma enzima, e que diferentes mutaes em genes diferentes afectavam diferentes vias ou diferentes pontos de uma mesma via e dai conclui-se que cada gene correspondia a uma protena. Este princpio de que a cada gene corresponde uma protena um dos grandes pilares da actual gentica.
Replicao do DNA
A descoberta das cadeias duplas de DNA originou uma soluo para a questo de como o material gentico se replicaria, as duas cadeias poderiam separar-se e servir de molde para a sntese de uma nova cadeia atravs da complementaridade de bases hiptese semiconservativa. A replicao do DNA na clula mediada pela enzima DNA polimerase e ocorre sempre no sentido de 5 para 3.
Expresso da Informao Gentica

Os genes determinam a estrutura (sequncia de aminocidos) das protenas, as quais so responsveis por direccionar o metabolismo; estas actuam como enzimas e tornam as reaces na clula possveis, no sentido em que aumentam a sua velocidade. As protenas so polmeros de aminocidos, cuja sequncia determina a sua estrutura e funo.
Funo do RNA Mensageiro

Apesar de ser o DNA que determina a sequencia de aminocidos, no o faz directamente, o que se prova pelo facto do DNA se localizar no ncleo e a sntese proteica se realizar no citoplasma, logo preciso uma molcula que transporte a informao para os ribossomas mRNA. O RNA similar ao DNA, apenas difere no facto de ser uma cadeia simples, o seu acar ser a ribose e possuir uracilo no lugar de timina. Apesar das diferenas possvel sintetizar uma molcula de RNA a partir de um molde de DNA, logo o RNA mensageiro originado tendo como molde o DNA num 24 2007/2008
processo denominado transcrio. A transcrio catalisada pelo RNA polimerase, no entanto para a sntese proteica ainda importante o RNA ribossomal e o RNA de transferncia.
O Cdigo Gentico
Como que a sequncia de nucletidos do mRNA traduzida numa sequncia de aminocidos? Visto que os aminocidos e nucletidos no so estruturalmente relacionados, no possvel o emparelhamento directo entre o mRNA e os aminocidos. Assim sendo o tRNA serve de adaptador, permitindo a relao entre o mRNA e os aminocidos. Cada aminocidos ligado a um tRNA especfico, que tem uma sequncia (anticodo) que emparelha com uma sequncia do mRNA (codo), permitindo desta forma direccionar correctamente a sntese de protenas. Atravs da determinao da sequncia de nucletidos que origina determinado aminocido foi criado o cdigo gentico. Todos os organismos tm o mesmo cdigo gentico, sendo que os dois primeiros nucletidos iniciais so mais especficos do que o 3, ou seja, uma alterao no 3 nucletido menos propcia a provocar uma mutao patognica. UAA, UAG e UCGA so codes de finalizao, indicam ao ribossoma que a traduo deve terminar. Existem apenas 4 nucletidos, que se agrupam 3 a 3 (tripletos), o que origina 43 combinaes possveis, temos assim 64 codes possveis. Visto que apenas existem 20 aminocidos, e temos 64 codes, indica-nos que o cdigo gentico redundante, sendo um aminocido codificado por mais do que um codo.
Vrus de RNA e Transcrio Reversa

Apesar do DNA ser o material gentico de eleio para quase todas os organismos, devido sua maior estabilidade, existem alguns vrus cujo genoma constitudo apenas por RNA Retrovrus. Surgiu ento a questo de como poderia este vrus incluir o seu genoma no da clula, assim sendo, estes vrus possuem uma enzima, a transcriptase reversa, que faz o inverso da transcrio, sintetizando uma molcula de DNA tendo como molde uma de RNA. A transcrio reversa no ocorre apenas nestes vrus, mas tambm nas nossas clulas e responsvel pela transposio de sequncias de DNA de uma localizao cromossmica para outra. Este processo, a transcrio reversa, permite ainda aos investigadores originar de qualquer molcula de RNA uma de DNA, o que facilita o estudo das clulas eucariticas.
DNA Recombinante
A tcnica de DNA recombinante permitiu aos cientistas isolar, sequenciar e manipular os genes individuais de qualquer clula, revolucionando assim a Biologia Molecular e Celular. Esta tcnica inclui alguns 25 2007/2008
conceitos como as endonucleases de restrio, vectores recombinantes, sequenciamento, entre outras que abordaremos de seguida.
Endonucleases de Restrio
So enzimas que clivam o DNA em sequencias especificas, de quatro a oito pares de bases, e que foram pela primeira vez identificadas em bactrias, onde clivam o DNA estranho como modo de defesa contra vrus. Existe uma enorme variedade de endonucleases de restrio, mais de uma centena, cada um reconhece apenas uma sequncia especifica, sendo esta uma das suas caractersticas. Aps a clivagem num ponto desta determinada sequencia, no maior parte dos casos, originam-se extremidades coesivas, que so complementares; porm existem excepes, em que ao clivarem, estas enzimas, no originam extremidades com cadeia simples, , que surgem neste caso, so complementares com qualquer outra extremidade cega, no entanto mais difcil fazer com que estas se unam.
Electroforese em Gel
O mtodo mais comum em que as molculas so separadas com base na razo da sua migrao num campo elctrico, tendo em conta que se usam gis de agarose ou de policrilamida. Este gel colocado num compartimento contendo uma soluo tampo e elctrodos, a amostra pipetada em poos abertos no gele o campo elctrico ligado. Os cidos nucleicos, carregados negativamente, devido ao grupo fosfato, migram em direco ao plo positivo. O gel funciona como que uma peneira, retardando o movimento das molculas maiores e facilitando a passagem de molculas menores, o que permite a sua separao pelo seu tamanho e peso molecular.
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Gerar Molculas Recombinante
de
DNA
A estratgia bsica da clonagem de molculas inserir o DNA de interesse num vector, que consiste numa molcula de DNA com a capacidade de se auto-replicar, independentemente do DNA da clula hospedeira. Resulta ento uma molcula recombinante que composta pelo insert de DNA (molcula de interesse) ligado sequencia de DNA do vector. Este vector pode ser inserido numa clula hospedeira e originar inmeras cpias.
Os fragmentos de DNA usados para criar molculas recombinantes so normalmente gerados por digesto com enzimas de restrio, deixando extremidade coesivas que podem ligar-se a outras por complementaridade. O restabelecer entre estas extremidades pode ser mediado pelas DNA ligases, assim sendo dois fragmentos de DNA clivados pelo mesma enzima de restrio podem ser unidos, originando uma molcula de DNA recombinante. As sequencia de RNA tambm podem ser clonadas, primeiro atravs da transcriptase reversa, que origina cDNA (DNA complementar), podendo assim ser ligada a um vector como j foi descrito anteriormente. Este mtodo permite um melhor estudo da estrutura e funo gentica dos eucaritas, viste que permite estudar as sequencias de DNA sem os seus intres, sequencias no codificantes e que so removidas na clula por splicing, visto que originamos cDNA a partir de mRNAs maduros (j sem os seus intres).
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Vectores para DNA Recombinante

Existem diversos tipos de vectores, como o caso dos vectros bacterifagos , cosmdeos, cromossomas artificiais de leveduras (YAC), no entanto os que mais amplamente utilizados so os plasmdeos. Os plasmdeos permitem uma mais fcil manipulao, sendo molculas circulares de DNA com capacidade de ser auto-replicarem. Para um vector de clonagem necessrio: - Origem de Replicao: local onde se liga a DNA polimerase e que permite a replicao; - Gene de Resistncia a Antibiticos: permite seleccionar as clulas hospedeiras onde foi ou no incorporada o vector; - Local de Policlonagem: local onde existem sequencias de corte para vrias enzimas de restrio, o nico local onde estas clivam, e na maior parte dos casos clivam neste local apenas uma vez; - Promotor: permite a expresso, pois aqui que se ir ligar a RNA polimerase, e a sua presena distingue um vector de expresso de um de clonagem. Nota: importante ter em conta que a ligao entre o insert de DNA e o vector de clonagem no um processo muito eficaz, por isso colocase o insert de DNA em excesso. Mesmo que este processo ocorra, e haja uma recirculao da molcula de DNA, existem trs situao possveis e apenas uma delas a pretendida: plasmideo no-recombinante, plasmideo recombinante com o insert na posio correcta (5 3) ou na posio incorrecta (3 5). Esta situao solucionvel com a anlise das colnias que se formam, podendo assim determinar qual a que tem o plasmdeo recombinante com o insert na posio correcta. Esta situao analisada com a digesto dos plasmideo de vrias colnias, com a mesma enzima de restrio, e posterior electroforese, que atravs do tamanho dos fragmentos nos permite saber qual o correcto.
Sequenciao do DNA
A clonagem de DNA permite o isolamento de sequncias de DNA em quantidades suficientes para a sua caracterizao detalhada, incluindo a determinao da sua sequencia. O mtodo mais utilizado o baseado na terminao prematura da sntese de DNA resultante da incluso de didesoxinucleotdeos (no contm o grupo hidroxilo no carbono 3).
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A sntese de DNA comea com um primer, pois a DNA polimerase no capaz de iniciar a sntese a partir de uma cadeia simples de DNA, este primer marcado com um radioistopo. So feitas quatro reaces separadas, cada uma delas contento um didesoxinucleotdeo, alm dos restantes componentes comuns (primers, DNA de interesse, nucleotdeos e DNA polimerase). A incorporao de um didesoxinucleotdeo bloqueia a sntese da restante cadeia, existem assim em cada reaco diversos fragmentos com diversos tamanhos, no entanto todos eles terminam num didesoxinucleotdeo (A,G,C ou T). Estes fragmento so separados por electroforese, em gel de policrilamida (que permite uma maior resoluo), o gel exposto a um filme raio-X. visto que o tamanho de cada fragmento determinado pelo didesoxinucleotdeo terminal, a sequencia do DNA corresponde ordem dos fragmentos lidos a partir do gel. Actualmente a sequenciao em grande escala feito por sistemas automticos que contendo primers ou didesoxinucleotdeos florescentes, so submetidos electroforese e ao passarem num laser so excitados e emitem luz, que detectada por um fotomultiplicador e analisada por um computador, assim feita a sequencia do DNA (em fluorogramas de sequenciao). Se forem utilizados didesoxinucleotdeos florescentes, desde que cada um emita uma luz distinta, a reaco pode ser toda efectuada num mesmo microtubo.
Expresso dos Genes Clonados

A clonagem molecular alm de permitir sequenciar os genes, permite ainda a obteno de grandes quantidades de protena, tanto para o seu estudo, como para o uso teraputico. Para expressar um gene eucaritico em E.Coli, o cDNA de interesse clonado dentro de um vector plasmidial ou fago que contenha sequncia que dirijam a transcrio, promotor, o que origina um vector de expresso. Visto que se trata de uma protena eucariotica til expressa-la num organismo eucariotico, para que as modificaes ps-traducionais possam ocorrer de forma normal. Por norma, nos vectores de expresso, existe uma sequncia de reguladora, para que a expresso de determinada protena possa ser controlada, de modo a preservar a clula hospedeira. Podemos ainda adicionar ao vector determinadas sequncias, como o caso da sequencia de Shine 29 2007/2008
Delgarno, onde se liga a RNA polimerase procaritica, de modo a aumentar a produo de uma determinada protena.
Amplificao de DNA pela Reaco em Cadeia de Polimerase (PCR)

Para realizarmos a PCR, que consiste numa DNA polimerase usada repetidas vezes, produzindo de forma exponencial; no entanto necessrio conhecer alguma sequencia da molcula de DNA que desejamos amplificar. So usados primers de DNA, de 15 a 20 nucletidos, que flanqueiam a regio em ambos os lados e que hibridem apenas uma vez na molcula de DNA presente. A soluo contendo DNA, DNA polimerase, nucletidos e primers aquecida (95C) para que haja a separao das cadeias duplas de DNA. A temperatura diminuda para permitir a hibridao dos primers, permitindo assim que a DNA polmeras inicie a sntese de novas cadeias, o que feito a uma temperatura ptima (75C). Estes ciclos so repetidos cercas de 30 vezes e permitem originar de uma nica molcula de DNA inmeras molculas de DNA, cerca de 230.
Transferncia Plantas e Animais
de
Genes
em
Apesar de o estudo em clulas eucaritas ser complexo possvel, recorrendo transferncia gnica, estudar os mecanismos de regulao da expresso genica e processamento proteico. O DNA introduzido nas clulas animais juntamente com um coprecepitado de fosfato de clcio. Inicialmente o processo era feito atravs de DNA infecciosos virais e por isso este processo muitas vezes designado como transfeco. Este DNA absorvido e transportado at ao ncleo onde transcrito por vrios dias, no entanto numa pequena fraco das clulas o DNA integrado no seu genoma e transmitido aos seus descendentes. As clulas que contem este gene podem ser isoladas se este conferir resistncia a determinados antibiticos, podendo assim ser estudado o efeito destes genes no comportamento celular. Existem outros mtodos para a incorporao de DNA em clulas de mamferos: - Microinjeco directa de DNA no ncleo; - Incorporao de DNA em vesculas lipdicas;
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- Impulso elctrico que abre os poros transientes na membrana (electroporao); - Vrus usados como vectores, especialmente retrovrus, pois no seu ciclo est includa a integrao estvel do DNA viral no genoma das clulas hospedeiras.
Mutagnese de DNA Clonados

Os genes mutados so detectados porque resultam em mudanas fenotpicas observveis. O isolamento de genes pelo DNA recombinante tem aberto novas fronteiras, agora possvel introduzir qualquer alterao desejada num gene, clona-lo e determinar o efeito dessa mutao, esta tcnica designa-se por gentica reversa. A mutagnese in vitro tem permitido a caracterizao detalhada das actividades funcionais de sequencias regulatrias e codificantes para protenas dos genes clonados.
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Captulo Quatro
A complexidade dos Genomas Eucaritas
Os genomas eucaritas so maiores e mais complexos do que os procaritas, o tamanho pode estar relacionado com uma maior complexidade, no entanto no parece que assim seja, pois organismos menos complexos possuem mais DNA que outros mais complexos. Este paradoxo foi solucionado pela descoberta que no genoma eucaritico no existe somente genes funcionais, mas sim uma grande quantidade de sequencias de DNA que no codificam protenas. Apenas cerca de 3% do DNA codifica protenas. Isto deve-se ao facto de existirem intres e exes, juntamente com as famlia de genes e as sequencias repetitivas, que aprofundaremos de seguida.
Intres e Exes
Parte do DNA no-codificante situase entres os genes e denomina-se por sequncias espaadoras. No entanto sequencias no codificantes so encontradas nos genes, assim sendo temos os exes, que codificam realmente as protenas, e os intres, que no codificam as protenas e so removidos do mRNA aps o seu processamento. O gene inteiro transcrito, e seguidamente atravs de splicing os intres so removidos. Os intres no entanto esto em grande quantidade, e so geralmente maiores que os exes, o que ajuda a manter uma baixa taxa de mutaes; pois mais provvel que esta ocorra em sequncias no codificantes. Apesar de a real funo dos intres ainda no ser conhecidos, alguns deles codificam pequenos RNAs. Em todos os genes existem ainda sequencias que os flanqueiam, e que so transcritas, no entanto no so traduzidas, as UTR 5 e 3.
Famlias Gnicas e Pseudogenes

Outro factor que contribui para o grande tamanho dos genomas eucaritas a presena de alguns genes repetidos muitas vezes, a estas mltiplas cpias de uma mesmo gene chamamos famlias gnicas. Este facto justificado pela necessidade de grandes quantidades de determinada protenas ou RNAs, existem ainda diferentes membros da famlia que podem ser transcritos em clulas diferentes ou em estgios diferentes do desenvolvimento. O ltimo acontecimento pensa-se que deriva da existncia de mutaes que surgiram em diferentes membros da famlia, originados por 32 2007/2008
duplicao de um gene, que se podem ter tornado optimizados em diferentes tecidos ou estgios de desenvolvimento. No entanto como era de esperar nem todas as mutaes melhoram a funo dos genes, outras tornam-nos inactivos, originando pseudogenes.
Sequncias de DNA Repetitivas

Uma parte substancial do genoma constitudo por sequencias repetitivas de DNA no-codificante. Sequencias simples de DNA contendo milhares de cpias de sequencias curtas, de 5 a 20 nucletidos, ordenados em srie, designam-se por DNAs Satlites e so responsveis por 10% a 20% do genoma. Outras sequncias encontram-se espalhadas pelo DNA genmico, em vez de estarem agrupadas. Se forem elementos curtos dispersos repetidos, designam-se SINEs e temos como exemplo os elementos Alu; se forem elementos longos dispersos repetidos, designam-se LINEs.
Cromossomas e Cromatina
O genoma dos eucaritas muito mais complexo do que o dos procaritas, mas tambm organizado de forma diferente. O genoma dos procaritas est contido num nico cromossoma e que usualmente circular. Nos eucaritas o genoma composto por vrios cromossomas, contendo cada um uma molcula linear de DNA, que se encontra associado a protenas, as histonas, que o empacotam de modo ordenado.
Cromatina
A cromatina composta pelo DNA eucaritico juntamente com as protenas associadas a este, sendo que estas se encontram numa proporo de 1:2, existindo na cromatina uma maior proporo de protenas do que de DNA. Alm das histonas existem outras protenas que contribuem para o empacotamento do DNA nuclear e ainda as que participam nos processos de replicao e de expresso do DNA. A unidade estrutural bsica da cromatina o nucleossoma, cuja parte central constituda pela cromotossoma e uma histona. Fazem ainda parte do nucleossoma protenas no histnicas que esto flanqueando a parte central deste, sendo duas, e que esto separadas por cerca de 200 pb. Os nucleossomas so empacotados em fibras com cerca de 30 nm, cuja estrutura ainda no foi determinada, no entanto sabe-se que o grau de condensao da cromatina varia ao longo do ciclo celular; podemos assim distinguir a eurocromatina, quando esta se encontra descondensada, e a heterocromatina, quando esta se encontra condensada. 33 2007/2008
Centrmeros
Os centrmeros so uma regio especializada do cromossoma que assegura a distribuio correcta dos cromossomas duplicados durante a mitose, aqui que se ligam os microtbulos do fuso acromtico, e garantem ainda que os cromatdeos esto unidos. Os centrmeros so compostos por sequencias altamente repetitivas e outras no repetitivas, nos seres humanos composto por DNA satlites e protenas associadas. Os centrmeros humanos formam grande cinetocoros que se ligam entre 30 a 40 microtbulos durante a mitose.
Telmeros
Os telmeros so as sequncias nas extremidades dos cromossomas, que desempenham um papel crucial na replicao e manuteno do cromossoma, sendo compostos por repeties de uma nica sequncia do DNA que contem em uma das cadeias um agrupamento de guanina. Estas sequncias so repetidas milhares de vezes e terminam com uma extremidade de cadeia simples. A DNA polimerase no capaz de iniciar a sua funo numa cadeia simples, sendo a sequencia dos telmeros replicada usando a actividade de uma transcriptase reversa, que juntamente com outras protenas constitui um complexo, a telomerase. Esta enzima apenas se encontra activa na fase embrionria e inicio da vida A manuteno dos telmeros importante na determinao do tempo de vida e capacidade de reproduo das clulas. Pensa-se que, a fim de evitar que as extremidades dos cromossomas de degradem, a extremidade do telmero se dobra sobre si mesmo de forma a forma uma estrutura circular.
O Genoma Humano
O genoma humano constitudo por cerca de 3 x 109 pares de bases, e estima-se que existam cerca de 100.000 genes humanos. Existem 24 cromossomas (2n), sendo que 22 so autossomas e 2 so cromossomas sexuais. Todos as nossas clulas so diploides, ou sejam possuem 12 pares de cromossomas, com excepo dos gmetas que apenas possuem 12 cromossomas, so por isso haploides. No nosso genoma existem polimorfismos, que so sequncias diferente de individuo para individuo, que se originaram por alterao no DNA, mas que ocorreram em zonas no codificantes ou no originaram nenhuma patologia. Existem diversos tipos de polimorfismos: 34 2007/2008
- STRs existem a repetio de uma sequencia curta, varia de individuo para individuo o nmero de repeties que existem; - VNTRs repetio de uma sequencia de tamanho varivel, mas maior do que em STRs, e que varia igualmente entre os indivduos; - SNPs polimorfismos que so originados devido a uma alterao em um nico nucletido. Os genes humanos podem ser mapeados por hibridao de clulas somticas, hibridao in situ fluorescente e anlise de ligao gentica. Tm sido usados clones de YAC para construir mapas do genoma humano. O sequenciamento aleatrio de genes de cDNA tem fornecido marcadores para sequencias presentes nos mRNAs. Marcadores de DNA de mais de 30000 genes humanos tm sido usados para construir um mapa fsico e gentico integrado do genoma humano.
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Captulo Cinco
DNA Polimerases
A capacidade desta enzima de copiar um molde de DNA prova a base bioqumica para a hiptese de replicao proposta inicialmente, hiptese semiconservativa. Existem vrias DNA polimerases que desempenham diferentes papeis na replicao e reparao do DNA. Conclui-se aps vrias experiencias que a DNA polimerase I e III so necessrias, e de grande importncia, para a replicao na E.Coli. As clulas eucaritas contm as DNA polimerases ,,, e . A DNA polimerase localiza-se na mitocndria e responsvel pela replicao do seu DNA. As restantes localizam-se no ncleo e so possveis intervenientes na replicao do genoma nuclear. As polimerases encontram-se activas tanto em clulas que esto diviso como em clulas que no esto, o que nos sugere que pode primariamente estar envolvida em mecanismos de reparao. O papel das polimerases , e na replicao foi comprovada em vrias experiencias, como exemplo a replicao do vrus SV40 em clulas livres, que nos mostrou a importncia a importncia das polimerases e ; e o facto das , e serem encontradas em leveduras e clulas de mamferos demonstrou que sem qualquer uma delas no ocorre replicao em leveduras, mas foi igualmente demonstrado que as polimerases possuem um papel especifico nas leveduras, concluindo que as polimerases e so as grandes responsveis pela replicao nas clulas eucaritas em geral. Todas as polimerases possuem duas caractersticas indispensveis para a replicao do DNA: - Sintetizam DNA somente na direco de 5 3, adicionando um dNTP no grupo hidroxilo da cadeia nascente; - Apenas conseguem adicionar um novo desoxirribonucleico a uma cadeia de DNA dupla; assim sendo as DNA polimerases no so capazes de iniciar, por si s, a replicao sem a existncia prvia de uma cadeia dupla; um dos aspectos em que difere da RNA polmeras, pois esta consegue ligar-se a uma cadeia simples e iniciar a sua funo. Estas caractersticas parecem ser criticas na manuteno da alta fidelidade da replicao do DNA para a reproduo celular. Nota: O facto de a DNA polimerase apenas sintetizar no sentido de 5 3 deve-se ao facto de o grupo fosfato que clivado, de modo a fornecer energia para a formao da ligao do nucletido que se ir juntar de novo. Se fosse sintetizada no sentido 3 5, o grupo fosfato clivado seria o do nucletido na extremidade na cadeia que est a ser sintetizado, assim sendo se houver um erro e for necessrio substituir este nucletido no existe j o grupo fosfato que permita a formao de uma nova ligao, se a sntese for 36 2007/2008
feita no sentido 5 3, a energia para a formao da nova ligao provem do novo nucletido, o que nos permite a reparao do DNA.
A Forquilha de Replicao
Durante a replicao das molculas circulares de DNA podiam ser observadas duas forquilhas de replicao, que representam as regies activas na sntese de DNA e so constitudas por duas cadeias de DNA parental separadas e duas filhas sendo sintetizadas. Surgiu ento um problema devido ao facto de as cadeias terem que ser sintetizadas em sentidos opostos, no entanto a DNA polimerase apenas consegue sintetizar na direco 5 3, como poderiam duas cadeias ser sintetizadas em simultneo? Ficou ento demonstrado que apenas uma das cadeias sintetizada de forma contnua, no sentido da forquilha, a outra cadeia sintetizada de forma descontinua, sendo composta por fragmentos descontnuos que so sintetizados no sentido oposto ao da forquilha, permitindo que sejam sintetizados no sentido de 5 3. Estes fragmentos so denominados por fragmentos de Okazaki e so posteriormente unidos por uma DNA ligase. A cadeia que sintetizada no sentido da forquilha designa-se por cadeia de sntese continua, enquanto que a outra cadeia de sntese descontinua. Outro dos problemas que surgiu foi: como conseguiria a DNA polimerase sintetizar os fragmentos de Okazaki, se esta necessita de primers? Existem pequenos fragmentos de RNA que actuam como primers e so sintetizados (fragmentos de 3 a 10 nucletidos) por uma enzima especifica primase. ento necessrio remover os fragmentos de RNA que existem nos fragmentos de Okazaki, esta aco realizada pela DNA polimerase I na E.Coli, que tem o papel de uma exonuclease, nas clulas eucaritas desempenhada por outras exonucleases e o espao que surge preenchido pela DNA polimerase .
Funo Eucaritas Sntese de cadeias DNA Polimerase continua e alongamento da descontinua Remoo de Primers Exonucleases Sntese de pequenos fragmentos DNA-RNA Unio dos Fragmentos de DNA DNA Polimerase + Primase DNA Ligases Procaritas DNA Polimerase III
RNase H + DNA Polimerase I DNA Polimerase II DNA Ligases
Alm da DNA polimerase e das primases existem mais protenas envolvidas na replicao do DNA; um grupo de protenas liga-se DNA polimerase aumentando a sua actividade e fazendo que permaneam ligados cadeia de modo a que continuem a sintetizar; existem ento dois tipos de
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protenas acessrias, as de carregamento do grampo (RFC em mamferos) e as de deslizamento do grampo (PCNA em mamferos): - RFC, complexo C no eucaritas, reconhecem e ligam-se especificamente ao DNA no local do primer; - PCNA, antignio nuclear de clulas em proliferao nos eucaritas, ligam-se s adjacncias das protenas de carregamento de grampo (RFC), formando um anel em torno da cadeia molde do DNA, este anel mantm a associao entre a cadeia de DNA e o complexo da DNA polimerase e as protenas acessrias, permitindo a sntese ininterrupta de milhares de nucleotdeos. Existem ainda as helicases que catalisam o desenrolamento da cadeia dupla do DNA parental, e as protenas SSB (protenas de ligao ao DNA de cadeia simples), que estabilizam a cadeia molde desenrolada, mantendo-a como cadeia simples para que possa ser copiada. medida que as cadeias vo sendo desenroladas, as regio frente da forquilha de replicao so obrigada a rodar, o que levaria a um bloqueio da replicao, devido ao enrolamento excessivo das cadeias. Este problema foi resolvido por uma enzima, a topoisomerase, que catalisa a reaco reversvel de quebra e juno de cadeias de DNA; existem dois tipos desta enzima: - Topoisomerase I, que clivam em apenas uma das cadeias; - Topoisomerase II, que clivam simultaneamente as duas cadeias. Estas quebras permitem molcula girar livremente evitando a supertoro do DNA frente da forquilha de replicao, permitindo que a replicao prossiga. Apesar de os cromossomas eucaritas serem lineares, eles tambm requerem a interveno de topoisomerases, de modo a evitar o continuo girar do cromossoma. A topoisomerase II est tambm envolvida na condensao do DNA mittico. As enzimas envolvidas na replicao actuam de forma coordenada permitindo a sntese simultnea tanto da cadeia continua, como da descontinua. Esta simultaneidade conseguida pela formao de dmeros das DNA polimerases, estando uma envolvida na sntese da cadeia continua e outra na cadeia descontinua.
Fidelidade da Replicao
A exactido da replicao do DNA crucial para a reproduo celular, as estimativas indicam que apenas existe uma nica base incorrecta a cada 109 ou 1010 nucleotdeos incorporados. Esta fidelidade nos dada pela simples complementaridade de bases, no entanto ela to elevada devido s actividades da DNA polimerase. A DNA polimerase no catalisa apenas a incorporao de qualquer nucleotdeo, mas ela evita a incorporao de uma base erra, mal-pareada, atravs de uma presumvel adaptao conformao da base correcta, este mecanismo permite aumentar em 100x a fidelidade da replicao. Outro mecanismo a correco dos erros pela DNA polimerase, que atravs das 38 2007/2008
suas funes de exonuclease remove a base mal-pareada e substitui-a pela correcta. Esta actividade est associada s DNA polimerases e , e aumenta a fidelidade entre 100 a 1000 vezes. A importncia do mecanismo de correco explica a existncia de primers e do DNA ser apenas sintetizado no sentido de 5 3.
As Origens e a Iniciao da Replicao

A replicao tanto em eucaritas como em procaritas inicia-se em uma sequencia particular, a origem de replicao. Esta consiste numa sequencia de nucletidos onde se ligam protenas. Inicialmente a protena iniciadora que recruta as helicases e a SSB (que desenrolam a cadeia dupla e expem a cadeia molde), seguidamente a primase inicia a sntese da cadeia continuam, surgem assim duas forquilhas de replicao que se movem em sentidos opostos. Nas clulas eucaritas existem milhares de origens de replicao, contrariamente E.Coli, onde apenas existe uma, de modo a que apesar do tamanho do genoma e de uma sntese mais lenta, a replicao em eucaritas seja feita em poucas horas. Estas diversas origens de replicao nos eucaritas existem em intervalos de 50 a 300 kb. Nas leveduras encontram-se sequncias que podem sustentar a replicao de plasmdeos, sem necessidade de incorporao no cromossoma. Estas sequncias de auto-replicao (ARS), existem igualmente no DNA cromossomal da levedura, e nelas est contida o complexo da origem de replicao (ORC), onde se vo ligar as protenas envolvidas na replicao. Apesar de ainda pouco conhecidas as sequncias de iniciao da replicao nos eucaritas mais complexos, pensa-se que sejam idnticas s das presentes nas leveduras.
Os Telmeros e a Telomerase
Visto que a DNA polimerase no capaz de copiar as extremidades dos cromossomas, visto que apenas sintetiza no sentido 5 3 e com inicio numa cadeia dupla; por isso necessrio a presena de mecanismos especiais para replicar as sequncias dos telmeros. Os telmeros so sequencias repetidas directas, que so sintetizadas por intermdio da telomerase, que capaz de catalisar a sntese de DNA na ausncia de um molde de DNA. A telomerase uma transcriptase reversa e que como tal sintetiza DNA apartir de um molde de RNA, que est contido nela e complementar s sequencias repetitivas dos telmeros. Este molde permite que a telomerase estenda a extremidade 3 do DNA cromossomal uma unidade de comprimento alm do seu tamanho original, podendo assim a cadeia complementar ser sintetizada pelo complexo DNA polimerase + primase. A remoo do primer de RNA deixa a extremidade 3 numa cadeia simples, o que pode levar a formao de laos nos cromossomas eucaritas.
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A telomerase, e os telmeros, permitem que haja a replicao do material gentico sem perda de sequncias significativas, visto que em cada replicao existe a perda de uma parte da extremidade da cadeia. A telomerase no se encontra sempre activa, pensa-se que apenas na fase embrionria, o que nos leva a pensar que os telmeros determinam o nmero de vezes que uma clula se pode replicar e desta forma a nossa longevidade.
Reparao do DNA
O DNA, como qualquer molcula, pode sofrer reaces qumicas, sendo alterado, o que no deve acontecer pois ela responsvel pelo nosso material gentico. As mutaes vo desde a incorporao incorrecta de base durante a replicao, alteraes qumicas espontneas ou como resultado de exposio a agentes mutagnicos. Os mecanismos de reparao do DNA pode dividir-se em dois grandes grupos: reverso directa da reaco qumica responsvel pelo dano e remoo de bases alteradas por substituio com DNA recm-sintetizado. Onde a reparao do DNA falha, desenvolveram-se mecanismos para que a clula posso lidar com o dano provocado.
Reverso Directa de Leses do DNA

Poucos tipos de leses so reparados por este mecanismo, particularmente os dmeros de timina devido exposio a UV e os resduos de guanina alquilados, que foram modificados pela adio de grupos metilo ou etilo na posio O6 do anel purnico. A radiao UV das maiores fontes de dano do DNA e na sua maioria leva formao de dmeros de pirimidinas, estas formaes destorcem a cadeia de DNA e bloqueiam a transcrio e replicao. A reparao feita de forma directa por uma reaco de dimerizao, e o processo denomina-se por fotoreactivao, pois a energia da luz visvel que permite a quebra da estrutura do anel formado entre dos dois nucleotdeos. de salientar que este processo no ocorre nos humanos. Outra forma directa de reparao lida com os danos resultantes da reaco de agentes alquilantes do DNA, que transferem grupos metilo e etilo para bases do DNA, temos o caso especifico da O6-metilguanina, que se emparelha com a timina em vez da citosina. Esta leso pode ser reparada por uma enzima, que remove o grupo metilo para um resduo de cistena no seu centro activo.
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Reparao por Exciso

Apesar da reparao directa ser uma forma eficiente de lidar com tipos particulares de leses no DNA, a forma mais utilizada a reparao por exciso. Esta pode dividir-se em: - Reparao por exciso de base: uma nica base lesada, identificada e removida, sendo depois substituda pela correcta. A exciso do nucleotdeo catalisada por enzimas especificas, formando um local AP. As endonucleases AP clivam as regies adjacentes ao sitio AP e a falha preenchida pela DNA polimerase e pelas DNA ligases. - Reparao por base de nucleotdeo: as bases lesadas so removidos como parte de um oligonucleotdeo contendo a leso. Na E.Coli esta exciso catalisada pelo complexo UvrABC, a UvrA idfentifica a leso e recruta a UvrB e a UvrC que cliva nas posies 3e 5, respectivamente, o local lesado, excisando um nucleotdeo com 12 ou 13 bases. Este complexo geralmente designado por excinucleases. A helicase e a DNA polimerase completam este processo. Nas clulas eucaritas existe um modelo bsico para explicar este processo, apesar de este ainda no se encontrar completamente elucidado. As protenas XPA identificam a leso e recrutam as protenas XPB e XPD (funcionam como helicases); o complexo XPF/ERCC1 5 e a protena XPG 3, clivam um oligonucleotdeo (com cerca de 30 bases) contendo a leso. O restante processo e concludo pela DNA polimerase ou juntamente com as protenas RFC e PCNA. - Reparao por malpareamento: bases malpareadas durante a replicao, estes erros so muitas vezes corrigidas pela DNA polimerase. Existem enzimas que reconhecem na cadeia recm-sintetizada as bases malpareadas. A reparao iniciada pela MutS, a qual identifica o malpareamento e recruta a MutL e a MutH, estas direccionam a remoo do DNA entre a quebra na cadeia e o malpareamento. O reconhecimento da cadeia recm-sintetizada possvel devido existncia de quebras nesta. Mutaes nos genes MutS e MutL so responsveis por uma das formas cancro do clon.
Reparao Ps-Replicao
Os mecanismos de reparao referidos anteriormente ocorrem antes da replicao ser concluda de forma a que esta possa ocorrer de forma correcta. A replicao geralmente bloqueada a quando do aparecer de uma leso, no entanto esta pode recomear logo aps a leso atravs da sntese de um fragmento de Okazaki. Este tipo de falhas pode ser reparada por dois processos: - Reparao por recombinao: necessrio que uma das cadeias parentais estivesse integra, originando uma cadeia filha normal. A cadeia parental pode por recombinao entre sequencias homlogas preencher a regio lesada. A falha localiza-se oposta a uma regio integra, podendo ser preenchida pela DNA polimerase. A outra cadeia apresenta ainda uma leso, mas pode ser corrigida por exciso; - Reparao sujeita a erros: uma falha oposta a uma sitio lesado preenchido com DNA recm-sintetizado, este DNA foi sintetizado usando uma 41 2007/2008
cadeia lesada como molde, o que pode levar a mutaes. usada apenas em bactrias e em condies extremas.
Recombinao entre Sequncias Homlogas de DNA

importante a exactido da replicao e reparao do DNA de modo a manter a informao gentica, no entanto igualmente importante a recombinao de forma a que genes sejam rearranjados de diferentes formas, contribuindo para uma diversidade gentica das espcies.
Molculas de DNA Recombinam-se por meio de Quebras e Rejunes

Um dos modelos defende que existe uma escolha de cpia onde uma molcula teria como molde uma cadeia parental e que a certo momento essa molcula molde passaria a ser outra cadeia parental. Outros modelos dizem-nos que existe uma quebra de uma cadeia parental que depois se junta com outra igualmente quebrada, diferindo no facto de no existir sntese de novas cpias. Aps vrios estudos conclui-se que o modelo mais aceite seria o da quebra e juno.
Modelos de Recombinao Homloga

Um dos problemas do modelo de quebra e juno era como seria possvel ambas as cadeias serem clivadas no mesmo ponto, de modo a que no houvesse perdas ou ganhos no ponto de quebra. O alinhamento entre duas cadeias conseguido por intermdio de pareamento, estas cadeias simples de DNA que se sobrepem so trocadas entre molculas homlogas, levando formao de uma regio heteroduplex, onde as duas cadeias da molcula duplas so oriundas de molculas parentais diferentes. Caso exista um mal pareamento nesta regio, ele pode ser corrigido pela reparao de malpareamento. Aps vrios estudos reformolou-se este modelo, originando-se o modelo de Holiday, que ainda hoje a base dos pensamentos sobre estes mecanismos. O modelo de Holiday propunha que os cortes eram feitos posies idnticas das duas molculas de DNA parental. As cadeias de DNA cortados sofriam um desenrolamento parcial, e cada uma deles juntava-se outra por complementaridade com a cadeia no cortada. Originar-se-ia um intermedirio com cadeias entrecruzadas, conhecido como juno de Holiday. Para se gerarem molculas recombinantes necessrio que de seguida a juno de Holiday seja quebrada e depois haja a rejuno das cadeias entrecruzadas, o que pode ocorrer de duas formas diferentes: no ismero resultante da troca inicial de cadeias, as cadeias entrecruzadas so as que foram clivadas no inicio, no entanto com uma rotao desta estrutura gera-se 42 2007/2008
um ismero em que as cadeias cruzadas so aquelas que no foram clivadas. Cada uma destas formas ir ter consequncias genticas diferentes, na primeira as molculas originadas tm regio heteroduplex, mas o DNA que a flanqueia no recombinante, na segunda resultam molculas que tm DNA recombinante flanqueando a regio heteroduplex. A questo de ambas as cadeias serem cortadas no mesmo local foi resolvida tendo em conta que inicialmente apenas uma cadeia cortada, esta deslocada, permitindo que a outra cadeia simples gerada posso parear por complementaridade com a outra molcula parental. Este processo produz uma ala deslocada de DNA , a qual pode ser clivada e reunida com outra molcula parental, originando-se ento a juno de Holiday.
Enzimas Envolvidas na Recombinao Homloga

So necessrias enzimas especificas alm de outras que funcionam em aspectos mltiplos do metabolismo do DNA. A enzima central no processo de recombinao homloga a RecA, que promove a troca de cadeias entre DNAs homlogos, levando formao da regio heteroduplex. Na E.Coli a aco da RecA pode ser dividida em trs estgios: - Liga-se ao DNA de cadeia simples, recobrindo-o e formando um filamento de DNA com protena; - Visto que a RecA tem dois locais de ligao ao DNA, a enzima j ligada a uma cadeia simples capaz de se ligar a outra molcula de DNA de cadeia dupla, formando um complexo entre duas molculas de DNA; - Segue-se um pareamento especifico, por complementaridade de bases, da cadeia simples de DNA com o seu complemento. A enzima catalisa a troca de cadeias de modo a que a cadeia revestida pela RecA desloca a sua cadeia homloga para formar uma regio heteroduplex. Em leveduras, uma das protenas relacionada com a RecA, a RADS1 necessria para a recombinao e para a reparao de quebras duplas de DNA. Protenas relacionadas com a RADS1 foram encontradas em eucaritas complexos, como o caso do humano. No entanto existem ainda o complexo RecBCD que responsvel por fornecer RecA a cadeia simples qual esta se liga. Quando o complexo RecBCD encontra um sitio chi , actua como um nuclease e cliva uma das duas cadeias de DNA, de seguida desenrola a dupla hlice, permitindo que a RecA se ligue cadeia simples. Aps a aco do complexo RecBCD e da enzima RecA forma-se a juno de Holiday, sobre a qual iro actuar trs enzimas (RuvA, B e C). RuvA e B actuam como um complexo que direcciona a migrao do sitio da juno de Holiday na qual as cadeias se entrecruzam. Por sua vez RuvC actua clivando as cadeias entrecruzadas, aps a juno das cadeias clivadas so geradas duas molculas recombinantes. Em leveduras RAD1 e RAD10 desempenham estas funes, enquanto que em humanos so as protenas XPF e ERCC1 catalisam o processo, como de igual modo contribuem para a reparao do DNA.
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Rearranjos do DNA
A recombinao homloga produz rearranjos entre cromossomas homlogos (crossing-over), no entanto no altera a disposio dos genes ao longo do genoma. Outro tipo de recombinaes levam a rearranjos do DNA genmico, estes so importantes para a regulao gnica ou tm um papel importante na evoluo e contribuem para a biodiversidade.
Recombinao Stio-Especifica
Em contraste com a recombinao homloga, que ocorre em qualquer regio com ampla homologia entre as sequncias, a recombinao stioespecifica ocorre entre sequncias especificas do DNA, normalmente homlogas em apenas uma pequena parte do DNA. Esta interaco mediada por protenas e no por complementaridade de bases. exemplo desta recombinao stio-especifica a integrao e remoo do DNA viral a quando a infeco da E.Coli pelo bacterifago . Esta recombinao ainda importante para os rearranjos programados que ocorrem nos genomas celulares, como o caso do desenvolvimento do sistema imune. Os anticorpos so resultado da recombinao stio-especifica entre os genes para as imunoglobulinas e os receptores de clulas T, o que lhes permite identificar um grande nmero de antignios. RAG 1 e RAG 2 esto envolvidos em processos de clivagem e juno na recombinao stio-especifica para a formao de anticorpos.
Transposio Atravs de Intermedirios de DNA

A transposio envolve o movimento de sequncias atravs do genoma e no requer homologia entre estas. Os elementos transponveis ou transposes so aqueles que se movem atravs de transposio e podem ser de dois tipos: atravs de intermedirios de DNA ou de RNA. Os transposes mais simples so as sequencias de insero que consistem em um gene para a enzima envolvida na transposio (a transposase), flanqueado por curtas sequncias repetias e invertidas, que correspondem aos locais onde age a transposase. Os mais complexos so compostos por duas sequncias de insero flanqueados por outros genes, movendo-se como uma unidade. As sequncias de insero movem-se de uma localizao cromossomal a outra sem replicar o seu DNA, a transposase introduz uma quebra assimtrica na molcula alvo de DNA e cliva nas extremidades das repeties invertidas do transposo. Aps clivar a transposase junta as extremidades do DNA alvo com o elemento transponvel. A falha resultante no sitio alvo do DNA reparado pela sntese de DNA, seguido de ligao outra ligao do transposo. De ambos os lados do elemento transponvel ficam como marca uma curta sequncia repetitiva.
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O mecanismo referido faz com que o transposo se mova de sitio um cromossomal a outro, no entanto existem outro tipo de transposes que se movem atravs de mecanismos mais complexos, havendo uma replicao do transposo em combinao com a sua integrao, ficando uma cpia no stio original e outra na nova localizao.
Transposio Atravs de Intermedirios de RNA

Muitos transposes em clulas eucaritas movem-se em intermedirios de RNA em vez de DNA, o seu mecanismo de transposio similar replicao dos retrovrus. LTRs sequncias repetidas em vrias centenas de nucleotdeos em ambas as extremidades do DNA viral. Retrotransposes classe I so idnticos a retrovrus e possuem LTRs, enquanto que retrotransposes classe II no possuem LTRs. Nos mamferos a principal classe desses retrotransposes consiste em elementos longos dispersos altamente repetitivos LINEs. Outros elementos que no codificam as suas prprias transcriptases reversas e que tambm transpem atravs de RNA so os elementos repetitivos dispersos curtos SINEs. Estes no codificam protenas, logo representam pseudogenes que surgem atravs de transposio mediado por RNA. Os pseudogenes processados correspondem a pseudogenes que surgiram, similarmente, por transcrio reversa de pequenos mRNAs.
Amplificao Gnica
Os rearranjos at agora discutidos alteram a posio de uma dada sequencia de DNA dentro do genoma, a amplificao gnica modifica a estrutura do genoma, gerando cpias mltiplas de uma regio. As sequncias amplificadas do DNA podem ser encontradas como molculas extracromossomais ou como sries repetidas no cromossoma, ambas contribuem para uma maior expresso do gene amplificado. A amplificao genica pode ser benfica ou prejudicial para a clula, como o caso de uma amplificao dos genes que codificam o ribossoma no ocito de modo a que posso existir uma resposta necessidade de produzir grandes quantidades de protena, mas por outro lado pode ocorrer como um evento anormal em clula cancerosas provocando um aumento da expresso genica que leva a uma intensa e descontrolada diviso celular.
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Captulo Seis
Transcrio em Procaritas
Os mecanismos de transcrio foram estudados na E.Coli, tal como os mecanismos de regulao da mesma, que permitem clula responder a variaes no meio ambiente.
A RNA Polimerase e a Transcrio

A RNA polimerase catalisa a sntese de RNA a partir de um molde de DNA, esta age de forma idntica DNA polimerase, sintetizando apenas no sentido 5 3, mas no necessita de primers para iniciar a sntese. A RNA polimerase inicia o processo num local especifico, que representa o primeiro ponto onde a transcrio pode ser regulada. A RNA polimerase constituda por mltiplas cadeias polipeptdicas, formando as subunidades , , e , sendo que as trs primeiras catalisam a sntese de RNA e a ltima reconhece os stios especficos onde se liga o complexo. A sequncia que marca o inicio da transcrio chamada de promotor, sendo o primeiro nucleotdeo transcrito denominado de nucletido +1, e a subunidade liga-se na regio -35 e -10. Na ausncia desta subunidade a enzima liga-se com baixa afinidade e inespecificamente. A polimerase medida que vai avanando desenrola a dupla hlice do DNA e ao fim de 10 nucletidos a subunidade desprende-se e a polimerase continua o alongamento da cadeia de RNA. Tal como desenrola a dupla hlice medida que vai avanando enrola o que fica para trs, deixando uma regio de cerca de 17 pb desenroladas. A RNA polimerase prossegue at encontrar um sinal que lhe indique para terminar, que pode ser uma regio repetida e invertida, rica em GC, seguida de quatro ou mais resduos de A. A transcrio desta regio forma uma estrutura estvel semelhante a um loop que rompe a associao entre a RNA polimerase e o seu molde de DNA. Existem outro tipo de sinais que consistem na ligao de protenas em sequencias especificas do DNA que terminam a transcrio.
Os Repressores e o Controlo Negativo da Transcrio

Estudos pioneiros na E.Coli demonstraram que o gene que expressa a -galactosidade, que cliva a lactose, apenas transcrito quando os nveis de lactose se encontram elevados, o que permite clula na ausncia de lactose economizar energia. Os genes que codificam a -galactosidade, a permease e a transacetilase so expresso como uma unidade, denominada de opero e a 46 2007/2008
sua transcrio controlada pelo operador (o) que est adjacente ao stio de inicio da transcrio. O gene regulador codifica uma protena que regula a transcrio ligando-se ao operador. O produto normal do gene um repressor que bloqueia a transcrio quando ligado ao operador (o), por exemplo a lactose liga-se ao repressor inibidor e impedindo que este se ligue ao operador e a transcrio posso ocorrer. O operador chamado de elemento de controlo em cis, porque apenas afecta a expresso de genes ligados fisicamente na mesma molcula de DNA, enquanto que o repressor apelidado de elemento de controlo com actuao em trans afecta a transcrio de genes em outros cromossomas.
Controlo Positivo da Transcrio

O exemplo mais bem estudado de controlo positivo em E.Coli o efeito da glicose na expresso de genes ligados quebra de outros aucares. Quando existe glicose, que preferencialmente usada, os genes que codificam as enzimas envolvidas no catabolismo de outros aucares no so expressos, ou seja, a glicose reprime o opero lac m na presena do seu indutor lactose. A represso pela glicose mediada por um sistema positivo de controlo, que est dependente dos nveis de cAMP. A enzima que converte em ATP em cAMP activado quando os nveis de glicose esto baixos, o cAMP liga-se a uma protena reguladora da transcrio, a CAP, que por sua vez se liga sua sequencia alvo (localizado antes do inicio do opero) e faz com que a subunidade da RNA polimerase se liga mais facilmente ao promotor.
Atenuao da Transcrio
Os mecanismos atrs referidos interagem, activando ou bloqueando, no inicio da transcrio, no entanto a atenuao da transcrio age impedindo o alongamento a partir de determinados stios, que no so mais do que sequncias especificas.
As RNA Polimerases Eucaritas e os Factores Gerais de Transcrio

Apesar de a transcrio ocorrer de forma idntica em quase todas as clulas, ela mais complexa em clulas eucaritas, e tem duas grandes diferenas: - Os eucaritas possuem mltiplas RNA polimerases que transcrevem genes distintos; - Em vez de se ligarem directamente ao promotor, as RNA polimerases eucariticas interagem com uma variedade de protenas adicionais de modo a serem mais especificas.
As RNA Polimerases Eucaritas
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As clulas eucarioticas contm trs RNA polimerases nucleares distintas: - RNA polimerase II, transcreve os genes que correspondem a protenas; - RNA polimerase I e III, transcreve os RNAs ribossomais e de transferncia. Alguns pequenos RNAs, como os envolvidos no splicing e transporte de protenas, so transcritos pela RNA polimerase III. As duas maiores subunidades da RNA polimerase eucarita esto relacionadas com a e a das procaritas, e existem cinco subunidades que so comuns s trs, o que faz com tenham um funcionamento muito similar entre si. Existem ainda RNA polimerases, idnticas s das bactrias, nos cloroplastos e mitocndrias que transcrevem o seu DNA.
Os Factores Gerais da Transcrio e a Iniciao da Transcrio pela RNA Polimerase II

A RNA polimerase II apenas capaz de iniciar a transcrio se as protenas adicionais foram adicionas reaco, estas protenas designam-se por factores de transcrio. Existem dois tipos de factores de transcrio: os esto envolvidos na transcrio de todos os promotores de RNA polimerase II e os factores de transcrio adicionais, que se ligam s sequencias de DNA que controlam a expresso dos genes individuais e so, portanto, responsveis pela regulao da expresso gnica. Antes do local de inicio de transcrio existe uma sequencia, a TATA box, qual se vai ligar um factor geral de transcrio, o TFIIF, sendo composto por vrias subunidades. Uma dessas subunidades a protena de ligao a TATA, que se liga a TATA box e aos factores associados da TBP, os ltimos ligam-se a outro factor geral de transcrio, o TFIIB. o complexo TBP-TFIIB que recruta a RNA polimerase II e promove a sua ligao ao promotor. Para que se inicie a transcrio necessria a ligao de dois factores 48 2007/2008
adicionais, o TFIIE e o TFIIH. O TFIIH tem duas subunidades, uma com funo de helicase e outra que fosforila sequencia repetitivas permitindo a quebra de ligao com o complexo de iniciao e que a RNA polimerase prossiga. Alm da TATA box, os promotores de vrios genes que so transcritos pela RNA polimerase II contm uma sequncia que cobre o sitio de inicio da transcrio, a Inr; no entanto alguns genes apenas possuem a Inr e no possuem a TATA box.
A Transcrio pelas RNA Polimerase I e III

As RNA polimerases I e III so responsveis pela transcrio de rRNAs e tRNAs, e precisam igualmente de factores de transcrio adicionais. A RNA polimerase I responsvel pela transcrio do rRNA e existem dois factores, o UBF e o SL1, que reconhecem a sequencia promotora e formam o complexo de iniciao. Na RNA polimerase III, o promotor encontra-se no meio da sequencia a transcrever, a transcrio inicia-se com a ligao sequencial de TFIIC, TFIIB e da RNA polimerase III. Todas as RNA polimerases referidas precisam da interaco do factor adicional TBP, que permite a ligao do complexo de iniciao sequencia sinal.
Regulao da Transcrio em Eucaritas

Embora a regulao seja muito complexa, em eucaritas e procaritas os mesmos princpios so aplicveis. Em eucaritas a expresso controlada em termos de iniciao da transcrio, em alguns casos pode se atenuada e regulada em etapas posteriores. Este controlo desempenhado primariamente pelas aces combinadas de mltiplas protenas transcricionais regulatrias diferentes, mas o empacotamento do DNA na cromatina e a sua modificao por metilao acrescentam um nvel ainda maior de complexidade ao controlo da expresso gnica eucarita.
Sequncias Regulatrias Promotores e Enhancers
com
Actuao
em
Cis:
Tambm nos eucaritas a expresso de determinados genes controlada pela ligao de protenas sequncia com actuao em cis, que so adjacente ao gene que controlam, e geralmente antecedem a sequncia TATA box e Inr. A estas sequncias com actuao em cis ligam-se factores gerais de transcrio que permitem a regulao da expresso de genes individuais.
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Existem sequncias regulatrias localizadas mais longe do local de inicio da transcrio, que funcionam pela ligao de factores transcricionais que regulam a RNA polimerase, cuja actuao possvel devido formao de alas no DNA; estes factores designam-se por Enhancers, e o seu funcionamento igual ao dos factores de controlo da transcrio adjacentes ao promotor. Um aspecto importante dos Enhancers que eles usualmente contm sequncias funcionais mltiplas que ligam diferentes protenas regulatrias transcricionais.
Protenas Regulatrias Transcricionais

O isolamento de protenas regulatrias transcricionais foi baseado na habilidade destas se ligarem especificamente em sequncias de promotores ou Enhancers. A ligao de protenas a determinadas sequncias geralmente analisada por dois processos: footprinting e ensaio de alterao de mobilidade electrofortica. Footprinting uma amostra de DNA contendo fragmentos radioactivamente marcados em uma das extremidades dividida em duas, sendo uma delas incubada com a protena que se liga a uma sequencia especifica. Ambas so digeridas com DNase, sendo que esta cliva uma vez por molcula em mdia e tendo em conta que a regio onde se liga a protena se encontra protegida, no sendo clivada. Os complexos de DNA-Protena so desnaturados e aos fragmentos analisados por electroforese. Na amostra incubada com a protena, os fragmentos correspondentes a essa sequencia esto ausentes. Ensaio de alterao de mobilidade electrofortica uma amostra contendo fragmentos de DNA tratada como no processo anterior, no entanto no feita a desnaturao do complexo DNA-Protena, mantendo-se este complexo que migra mais lentamente quando analisado por electroforese.
Estrutura e Funo dos Activadores Transcricionais

Os factores de transcrio so centrais para a regulao da expresso gnica, os mais bem estudados so os activadores transcricionais. Geralmente estes activadores, que so protenas, possuem dois domnios: um que se liga especificamente a uma sequencia de DNA e outro que activa a transcrio por interaco e recrutamento de outros factores e da maquinaria de transcrio. Existem domnios, chamados em dedo de zinco, que se ligam ao DNA, dos quais se destacam os receptores para as hormonas, que regulam 50 2007/2008
a transcrio gnica em resposta a hormonas. Outros exemplos de domnios de ligao ao DNA so o modelo hlice-volta-hlice, o ziper leucina e a hliceala-hlice.
Repressores Eucaritas
A expresso gnica tanto regulado por activadores como por repressores, que equivale aos inibidores procaritas, inibindo a transcrio. Alguns repressores intreferem com a ligao de outros factores de transcrio, outros competem com activadores (alguns apenas diferem deste por no possurem o domnio que recruta outros complexos) pela ligao com a sequncia regulatria; existem ainda os repressores activos que inibem a transcrio atravs de interaco protena-protena, sendo criticas na regulao do crescimento e diferenciao celular.
Relao entre Estrutura da Cromatina e a Transcrio

O DNA no ncleo encontra-se empacotado em cromatina, o que tem consequncias importantes em termos da sua disponibilidade como molde para a transcrio. Activadores e Repressores interagem no s com os factores transcricionais e maquinaria de transcrio, mas tambm atravs da induo de mudanas de estrutura da cromatina. Estes facto confirmado pelo descondensar das regies que so activamente transcritas. No entanto o descondensar da cromatina no suficiente para que os genes possam ser transcritos, pois o DNA continua ligado s histonas. Existem ento protenas adicionais, designadas factores de remodelamento dos nucleossomas, que facilitam a ligao de factores transcricionais cromatina por alterao da estrutura dos nucleossomas. Outro dos processos a acetilao que reduz a carga liquida positiva das histonas e diminui a sua afinidade com o DNA, permitindo um mais fcil acesso ao DNA por parte das protenas de regulao da transcrio. No entanto importante que para a RNA polimerase a compactao do DNA seja um obstculo mais facilmente ultrapassado, do que para a DNA polimerase, mas que igualmente auxiliado pela acetilao e pela interaco de protenas cromossomais no-histnicas.
Metilao do DNA
A metilao outro mecanismo geral pelo qual o controlo da transcrio em vertebrados est ligado estrutura da cromatina. O DNA especificamente metilado nos Cs que precedem Gs na cadeia (dinucleotdeos CpG), o que est 51 2007/2008
relacionado com uma reduzida actividade transcricional nos genes que contm alta frequncia de CpG na vizinhana, pois uma protenas especifica liga-se ao DNA metilado e inibe a transcrio. Apesar do seu baixo significado em termos de regulao gnica, a metilao do DNA, no caso da marcao genmica parece adquirir uma extrema importncia. Em muitas clulas ambos os alelos de uma gene so transcritos, mas h alguns poucos genes marcados cuja expresso depende se foram herdados da me ou do pai. Apesar do papel da metilao do DNA na marcao ser incerto, parece distinguir entre os alelos maternos e paternos de genes marcados.
Processamento e Reciclagem de RNA

Embora a transcrio seja o primeiro, e mais altamente regulado, passo na expresso gnica, preciso uma srie de processos para se produzir um RNA funcional e maduro. Os mRNAs bacterianos so uma excepo, pois desde, pois nas clulas eucaritas desde os rRNAs, aos tRNAs que sofrem processos de alterao para serem funcionais; o caso especial do mRNA que sofre diversos processos, como o splicing, at poder servir de molde para a sntese de protenas. A regulao de todas as etapas brevemente referidas em cima gera um elevado controlo sobre a expresso gnica.
Processamento do rRNA e do tRNA

Todos os RNAs ribossomais e de transferncia, excepo do RNA 5S eucaritico que transcrito de um gene separado, provm de um mesmo prRNA. Este pr-RNA ento processado atravs de sucessivas clivagens e adio de grupos metilo nas bases e aucares de nucleotdeos especficos. Sabe-se que o pr-tRNA clivado na sua extremidade 5 pela RNase P. Na extremidade 3 a RNase uma convencional e existe a adio de uma sequncia CCA, que corresponde ao local de ligao do aminocido. Alguns pr-tRNAs, e poucos pr-rRNAs, sofrem splicing, havendo remoo de intres, e possibilidade de splicing alternativo.
Processamento do mRNA em Eucaritas

O processamento do mRNA tem uma maior distino entre eucaritas e procaritas. Nos procaritas aps a transcrio o mRNA encontra-se pronto para ser traduzido, enquanto nos eucaritas o pr-mRNA surge aps a transcrio e extensamente modificado antes de ser transportado para o citoplasma e ser traduzido. O processamento do pr-mRNA d-se atravs de modificaes em ambas as extremidades e atravs da remoo de intres.
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A extremidade 5 modificada imediatamente aps a sntese pela adio de uma estrutura chamada de cap 7-metilguanosina. A colocao da cap iniciada pela adio de GTP, em orientao inverso, no nucleotdeo 5 terminal, e de seguida so adicionados grupos metilo a este resduo de G e s riboses de um ou dois nucleotdeos da extremidade 5 da cadeia de pr-mRNA. A extremidade 3 de muitos dos mRNAs no determinada pelo fim da transcrio, mas sim pela clivagem do transcrito primrio e adio de uma cauda poli-A, numa reao de processamente chamada de poliadenilao. Esta reaco permite uma maior estabilidade da molcula. No entanto a modificao mais marcante do pr-mRNA a remoo de intres pelo mecanismo de splicing.
Mecanismo de splicing
O splicing do pr-mRNA ocorre em duas fases: primeiro o pr-mRNA clivado no sitio 5 de splicing, sendo a extremidade 5 do intro unida a um nucleotdeo de adenina dentro do intro; forma-se uma estrutura em lao; de seguida ocorre em simultneo a clivagem do sitio 3 de splicing e a ligao dos dois exes. Existem trs sequncias criticas no prmRNA que esto relacionadas com o splicing: - Stio 5 de Splicing; - Stio 3 de Splicing; - Ponto de Ramificao. O splicing ocorre em grandes complexos denominados spliceossomas, compostos vrias subunidades, que por sua vez so complexos de protenas e RNA. Os RNA que constituem o spliceossoma so pequenos RNAs nucleares (snRNA) chamados de U1, U2, U4, U5 e U6; estes associam-se a pequenas protenas e formam particulas de ribonucleoproteinas (snRNPs) que desempenham um papel central no splicing. Cada snRNP contem apenas uma molcula de snRNA, excepo dos snRNAs U4 e U6 que esto associados na mesma snRNP. A primeira etapa do mecanismo de splicing a ligao do complexo U1 ao stio 5 seu reconhecimento feito atravs de
de splicing (SS 5), o complementaridade de bases.
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De seguida o complexo U2 liga-se ao ponto de ramificao. Os complexos U4/U6 e U5 so incorporados no spliceossoma, dissociando-se U4 e U6, e sendo U1 deslocado do SS 5. Ser o complexo U5 que ir reconhecer a sequncia do SS 3, havendo de seguida uma simultaneidade de acontecimentos. Assim sendo, o complexo U1 e U4 dissociam-se do spliceossoma, sendo o SS 5 clivado, a extremidade 5 do intro unida ao ponto de ramificao, formando-se um lao. Aps a formao de uma estrutura em forma de lao, ocorre a clivagem do SS 3, e a unio dos exes. Estando assim o processo de splicing concludo. Visto que a complementaridade entre as sequncias dos snRNAs e os SS, ou do ponto de ramificao, no completa, o que resulta numa baixa afinidade, existem protenas auxiliares de splicing. Estas protenas ligam-se a sequncias perto dos locais SS e recrutam as subunidades do spliceossoma, o que permite uma regulao do splicing, pois existem protenas que inibem ou estimulam a ligao a estes locais. O papel central do splicing no processamento do mRNA possibilita um controlo da expresso gnica adicional, por aco destas protenas. A existncia destas protenas veio ainda abrir caminho para o splicing alternativo, de que iremos tratar de seguida. Existem alguns RNA com capacidade de catalisar a sua prpria reaco de splicing, que neste caso se denomina auto-splicing. importante salientar ainda que os snRNA por si s possuem a capacidade de catalisar a reaco de splicing, no entanto de modo a torn-la mais eficiente existe a associao de protenas a estes.
Splicing Alternativo
O pr-mRNA contem mltiplos intres, o que permite atravs de diversas combinaes entre eles, de um pr-mRNA originar distintas protenas. importante referir que a ordem dos exes nunca alterada, sendo as combinaes possveis apenas aquelas que so criadas pela incluso total ou parcial de determinados exes. Existem ento as protenas acessrias de splicing que iro permitir estas diversas combinaes entre os vrios exes. Tanto podemos ter uma protena que estimule a ligao do spliceossoma ao SS ou uma que o iniba, sendo assim iremos ter diferentes padres de splicing. da competio destas duas protenas que ir surgir um determinado padro, pois se estiver a protena indutora em excesso, o intres poder ser removido, se esta estiver em menor quantidade, muito possivelmente este ser includo total ou parcialmente. Estas protenas ligam-se a sequncias e recrutam geralmente a subunidade U1, pois esta que inicia o mecanismo de splicing, sendo a juno das outras um mecanismo em cascata. No entanto existem outros que estimulam a ligao das outras subunidades em outros locais, o que permite assim que o inicio do intro se mantenha, no entanto este pode terminar precocemente, ou ser alongado.
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O splicing tem um papel preponderante na maneira como regulada a expresso especfica de determinadas protenas consoante o tecido em questo, sendo que em clulas diferentes existem mecanismos de splicing com padres diferentes. A existncia de mecanismos de splicing alternativo permitiu originar soluo para a existncia de to poucos genes comparativamente com o nmero de protenas existentes no nosso organismo.
Edio do RNA
A edio do RNA consiste num processo de processamento diferente do splicing, comum em mRNA mitocndrial, mRNA de cloroplastos e alguns mRNAs nucleares. um mecanismo onde existe a mudana de uma base simples, como exemplo a desanimao da citosina em uridina. Este fenmenos, ou um de substituio, podem originar protenas com sequencias diferentes, ou um codo de STOP prematuro, o que ir originar protenas diferentes com funes e estrutura que podem ser idnticas, ou diferentes. exemplo deste mecanismo a edio do mRNA que codifica uma Apo protena, que no fgado e expressa por um determinado mRNA, e que nas outras clulas por edio do RNA surge um codo de STOP prematuro, que origina uma protena truncada, mas que funcional e mais especifica para a clula onde se encontra.
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Degradao de RNA
A nvel celular a quantidade de RNA mantida atravs de equilbrio entre a sua sntese e degradao. Os RNAs ribosomais e de transferncia so bastante estveis e por isso encontram-se em grande quantidade, em contraste com os mRNAs que so rapidamente degradados, o que permite clula responder rapidamente s mudanas no ambiente, podendo sintetizar novos mRNAs que sejam necessrios. A degradao dos mRNAs iniciada pelo encurtamento da caude de poli-A, segue-se a remoo do cap 5 e posterior degradao do restante RNA por nucleases. A estabilidade de alguns mRNAs pode ser determinada por factores exteriores de modo a que a clula pode responder s necessidades consoante o meio extracelular.
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Captulo Sete (pg. 297 325)

Traduo do mRNA
Todos os mRNAs so lidos de 5 3 e as cadeias polipeptdicas so sintetizadas da extremidade amina para o carboxilo terminal, sendo cada aminocido especificado por trs bases, tripleto (codo), no mRNA. A traduo realizada nos ribossomas, com os tRNAs servindo de adaptadores entre o molde de RNA e os aminocidos. No entanto a sntese de uma protena envolve a interaco de muitas outras protenas.
RNAs de Transporte
Os tRNAs possuem aproximadamente 70 a 80 nucleotdeos e tm uma estrutura de trevo devido ao pareamento de bases complementares em diferentes regies da molcula. Os tRNAs tm duas regies distintas, uma sequencia CCA na extremidade 3, onde os aminocidos se liga covalentemente ribose do A terminal, e uma sequncia de 3 bases, que ir reconhecer o condo, localizada na ala, sendo chamada de anticodo. A ligao entre o aminocido e o tRNA catalisada por um conjunto de enzimas designadas tRNA aminoacil sintetases. Em caso de existir um aminocido incorrectamente ligado, existe uma reviso, que hidrolisa em vez de serem ligados definitivamente no segundo passo deste reaco; este processo torna o reconhecimento do aminocido altamente fivel. Os aminocidos so alinhados no molde atravs da complementaridade entre o codo e o anticodo, no entanto existem tRNAs capazes de reconhecer mais do que um codo, atravs de um pareamento atpico entre o anticodo e a terceira posio de alguns codos complementares.
O Ribossoma
Tantos os ribossomas eucaritas, como os procaritas, so compostos por duas subunidades, uma subunidade grande e outra pequena, que por sua vez so constitudas por protenas caractersticas e RNAs ribossomais (rRNAs). Os ribossomas eucaritas e procaritas so similares no seu funcionamento, a sua grande diferena reside no seu tamanho. Uma das caractersticas a destacar que estes podem ser formados in vitro espontaneamente da juno do seu RNA com os constituintes proteicos. Atravs de sucessivas experiencias, que consistiam na omisso sucessiva de protenas que constituem o ribossoma, constatou-se que apenas havia um decrscimo da actividade do ribossoma; conclui-se ento que a reaco catalisada pelos rRNAs e que as protenas facilitam o dobramento do rRNA e posicionam-no correctamente. 57 2007/2008
A Organizao de mRNAs e Inicio da Traduo

Embora os mecanismos de sntese proteica sejam idnticos em eucaritas e procaritas, estes diferem principalmente nos sinais que determinam as posies onde se inicia a traduo. A traduo no se inicia na extremidade 5, como era de esperar, existem stios especficos de iniciao, pois na extremidade 5 temos a regio 5 no-traduzida (5 UTR), que existe igualmente na extremidade 3 (3 UTR). O codo que indica a iniciao o AUG, que codifica uma metionina, que nos procaritas modificada. Nos procaritas a sequencial sinal, que determina a ligao do ribossoma ao mRNA, a sequencia de Shine-Delgarno, enquanto que nos eucaritas o ribossoma se liga ao cap 7-metilguanosina da extremidade 5.
O Processo de Traduo
A traduo geralmente dividida em trs etapas: iniciao, alongamento e terminao. Um iniciador especfico de tRNA metionil e o mRNA ligam-se subunidade ribossomal pequena. A subunidade grande liga-se ao complexo e o alongamento prossegue. A iniciao em eucaritas mais complexa do que em procaritas e requer no mnimo dez protenas que so designadas de IFs. Os factores de iniciao eucaritas reconhecem tanto a extremidade 5, como a extremidade 3. O alongamento similar tanto em eucaritas, como em procaritas, tendo o ribossoma 3 stios para ligao do tRNA, o sitio iniciador (P), segue-se o sitio A e o sitio E, este ultimo antecede o P. O alongamento continua at que um codo STOP seja translocado no sitio A do ribossoma, as clulas no possuem anticodes complementares para estes codes, t, antes factores de libertao que terminam a traduo. Os mRNAs podem ser traduzidos por vrios ribossomas, assim que um abandona o sitio de iniciao outro pode-se ligar e iniciar a traduo. Nota: Existe na clula mecanismos que controlam a transcrio de forma a que, no caso de existir um codo STPO precoce devido a uma mutao, o mRNA que se forma degradado. este fenmeno que explica que muitas das vezes no so originados protenas, nem detectados mRNAs, de genes mutados. Este mecanismo apenas eficaz de o codo de STOP for originado no inicio da sequencia, pois os que se localizam no final so mais dificilmente detectados e do geralmente origem a uma protena truncada.
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A Regulao da Traduo
Um dos mecanismos de regulao a ligao de protenas repressoras, que bloqueiam a traduo, em sequncias especficas do mRNA. Outro mecanismo envolve a modulao da actividade dos factores de iniciao, particularmente o IF-2, no entanto este processo tem efeitos globais na actividade de traduo, em vez de ser especifico. Contrariamente a estes processo, existe um que envolve o factor IF-4E que se vai ligar extremidade 5 dos mRNAs e age como uma protena reguladora da traduo, estimulando o inicio da traduo, pelo recrutamento da pequena subunidade do ribossoma.
Dobramento e Processamento Proteicos

A traduo completa o fluxo de informao gentica entro da clula, no entanto temos agora uma sequencia de aminocidos que no corresponde a uma protena funcional. Para que uma protena seja funcional a cadeia de aminocidos vai-se dobrar sobre si mesmo e adquirir uma conformao tridimensional, e possivelmente associar-se a outros polipeptdeos formando complexos funcionais. Muitas protenas sofrem ainda outras modificaes ps-traducionais, como a clivagem, ligaes covalente a lpidos e glcidos, que vo determinar a sua funo e localizao correcta dentro da clula.
Chaperonas e Dobramento Proteico

Toda a informao necessria para uma protena adaptar a conformao tridimensional correcta fornecida pela sua sequncia de aminocidos. No entanto existem protenas que facilitam esse dobramento, denominadas de chaperonas, que apenas catalisam o dobramento de cadeias, pois a forma como este feito determinado unicamente pela sequncia de aminocidos. Na ausncia de chaperonas cadeias polipeptdicas dobradas ou no dobradas seriam instveis, dobrando-se incorrectamente ou agregando-se em complexos insolveis. Existem protenas que funcionam como chaperonas, mas que inicialmente foram designadas como protenas de choque trmico, pois encontram-se em organismos que vivem em condies extremas. Estas protenas, da classe das chaperonas, evitam que em meios extremos de acidez ou basicidade, altas temperaturas e presena de outros factores desnaturantes, as protenas destes organismos desnaturem, podendo assim realizar as suas funes normais.
Enzimas e Dobramento Proteico

A formao de ligaes dissulfeto entre os resduos de cistenas importante na estabilizao de estruturas dobradas de muitas protenas, a protena dissulfeto isomerase catalisa a quebra e a formao destas ligaes. 59 2007/2008
As ligaes dissulfeto so restritas a protenas destinadas a serem segregadas ou incorporadas na membrana, porque o citosol contem agentes redutores que mantm a cistena na sua forma reduzida, impedindo que se formem pontes dissulfeto. A peptidil prolil isomerase, que catalisa a isomerizao entre as formas cis e trans nas ligaes que precedem resduos de prolina, que de outra forma dificilmente permitiriam a criao de alterao na conformao desta ligao, que pode ser fundamental para uma correcta conformao tridimensional e funo da protena.
Clivagem Proteica
A clivagem proteica da cadeia polipeptdica, designada de protelise, um passo importante na maturao de muitas protenas. So frequentemente adicionadas sequncias sinalizadoras, que marcam o destino da protena, pois preciso clivar essa sequncia para que a protena se torne madura, exemplo a peptidase sinalizadora. interessante notar que muitas protenas de vrus tal como hormonas humanas, derivam da clivagem de precursores maiores. exemplo a insulina, que sintetizada contendo uma nica cadeia, tendo uma sequncia sinal. Inicialmente clivada essa sequncia sinal, a restante cadeia estabelece as ligaes que iro dar origem a sua conformao tridimensional e no sim esta cadeia cliva em dois pontos, sendo retirado um segmento intermdio, originando dois domnios diferentes. A presena daquele segmento no para a funo da protena, mas sim para a sua correcta conformao, permitindo que as ligaes se formem entre os resduos de aminocidos correctos.
Glicolizao
Muitas protenas so modificadas por adio de glcidos, num processo denominado de glicolizao, e passam a designar-se glicoproteinas. As pores de glcidos desempenham um papel importante no dobramento no reticulo endoplasmtico, na marcao de protenas e como stios de reconhecimento nas interaces clula-clula. As glicoproteinas so geralmente segregagas ou incorporadas na membrana, e o processo de glicolizao ocorre no reticulo endoplasmtico, geralmente, durante a traduo. Existe a N ou O glicolizao, dependendo do local onde est ligado o glcido, e isso faz com que difira o local onde realizada a glicolizao, este tema ser abordado mais afrente.
Ligao de Lpidos
Algumas protenas so modificadas pela ligao de lpidos cadeia polipeptdicas, que geralmente marcam e ancoram essas protenas membrana plasmtica. 60 2007/2008
Existem trs tipos gerias de adio de lpidos: N-miristoilao, prenilao e palmitoilao. Um quarto tipo, a adio de glicolipidos, tem um papel importante no ancoramento de algumas protenas na face extracelular da membrana. Em baixo iremos descrever brevemente os quatro tipos de ligao de lpidos referenciados anteriormente: - N-miristoilao um cido gordo ligado amina terminal dos resduos da cadeia polipeptdica em formao, durante a traduo; - Prenilao consiste na ligao de lpidos s cadeias laterais dos resduos de cistena, serina e treinuna; so lpidos especficos (grupos prenil) que so ligados ao enxofre da cadeia lateral destes resduos de aminocidos; - Palmitoilao o cido palmtico adicionada ao tomo de enxofre nas cadeias laterais de resduos internos de cistena; - Os glicolpidos so ligados ao carbono do grupo carboxilo terminal de algumas protenas.
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Captulo Nove
O primeiro passa para a distribuio das protenas ocorre ainda durante a traduo, visto que vrias protenas com destino ao reticulo endoplasmtico, ao complexo de Golgi, membrana ou aos lisossomas so traduzidas em ribossomas associados ao reticulo endoplasmtico, dentro ocorre o seu processamento.
Retculo Endoplasmtico
O retculo endoplasmtico (RE) uma rede de tbulos envolvidos por uma membrana e vesculas que se estendem desde o membrana nuclear por todo o citoplasma. Existem dois tipos de RE, estando cada um envolvido em funes diferentes: - Retculo Endoplasmtico Rugoso, possui ribossomas associados e funciona no processamento das protenas; - Retculo Endoplasmtico Liso, sem ribossomas associados e est envolvido no metabolismo de lpidos.
O Retculo Endoplasmtico e a Secreo de Protenas

Atravs de vrias experiencias definiu-se a via secretora de protenas: RE Rugoso Exterior Complexo de Golgi Vesculas Secretoras
Esta via no restricta a protenas que sero excretadas, mas igualmente comum a protenas da membrana plasmtica e lisossomais. Algumas protenas iniciam esta via secretoras, no entanto nunca chegam a conclui-la, ficando retidas no RE Rugoso ou no complexo de Golgi. A entrada de protenas no RE Rugoso representa o ponto principal de ramificao para o trfego de protenas dentro da clula. Protenas que tm como destino final a excreo ou incorporao nos organitos so inicialmente direccionadas para o RE Rugoso ou sintetizadas em ribossomas associados a este. As protenas restantes so sintetizadas em ribossomas livres e libertadas no citosol.
Direccionando Endoplasmtico
Protenas
para
Retculo
As protenas podem ser transportadas para dentro do RE durante a sua sntese nos ribossomas associados ao RE ou aps a sua traduo em ribossomas livres ter sido completada. Nos mamferos, a maior parte das protenas, entram no RE simultaneamente sua traduo. 62 2007/2008
Os ribossomas so levados a associarem-se membrana do RE pela sequncia de aminocidos que est a ser sintetizados e no pelas propriedades intrnsecas do ribossoma. As sequncias sinais no terminal amina da protena que est a ser sintetizada, so curtas sequncias de aminocidos hidrofbicas que so clivadas durante a sua transferncia para o lmen do RE. As sequencias sinais so reconhecidas pela partcula de reconhecimento de sinal (SRP), que se ligam a esta e ao ribossoma, sendo de seguida, ligado a um complexo proteico de transporte na membrana do RE e a sequencia sinal inserida num canal de membrana. Quando o transporte inicado, aps a traduo, a sequencial sinal clivada por uma peptidase sinal e o polipptido libertado no lmen do RE. No caso de protenas que so sintetizadas em ribossomas livres, s depois da traduo so incorporados no RE, no entanto esta no mediada por SRP, mas sim por receptores de protenas especficos.
Insero de Protenas na Membrana do Retculo Endoplasmtico

As protenas destinadas incorporao na membrana plasmtica so inicialmente incorporadas na membrana do RE e no libertados no lmen. Seguem a via das restantes protenas secretadas, mas so transportadas como componentes da membrana e no como protenas solveis. As protenas podem estar inseridas na membrana de diversas formas, apenas uma vez ou diversas vezes, podem ter diferentes orientaes, tendo o seu terminal amina para o lado do citosol ou para o interior, o que determinado a quando da sua incorporao na membrana do RE. Visto que o lmen do RE , topologicamente, idntica ao exterior das clulas, os domnios das protenas que esto expostos no exterior da clula correspondem aos que so transportados no lmen do RE. A maneira mais simples de insero de protenas nas membrana do RE resulta da sntese de protenas transmembranares com o ser terminal carboxilo exposta para o citosol e a sua sequencia sinal para o lmen, que posteriormente clivada.
Dobramento de Protenas e Processamento no Retculo Endoplasmtico

O dobramento de cadeias polipeptdicas nas suas conformaes tridimensionais, para protenas que entram na via secretora, ocorre durante o transporte atravs na membrana do RE ou no seu lmen. Na verdade o principal papel das protenas do lmen do RE catalisar o dobramento e o processamento das protenas que se encontram a ser transportadas.
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O Reticulo Endoplasmtico
Os lpidos so sintetizados no RE Liso devida s suas caractersticas, sendo estes hidrofbicos, so sintetizados em associao com as membranas j existentes e no no citosol; so de seguida transportadas por vesculas ou protenas para os seus destinos. Alm do seu papel na sntese dos glicerol fosfolipidos, o RE tambm serve como principal local de sntese de outros dos lipidos de membrana: o colesterol e a ceramida. So aqui produzidas igualmente as hormonas esteroides, a partir do colestrol, so por isso muito desenvolvidos (RE Lisos) em clulas secretoras de hormonas esteroides. Para manter a membrana do RE Liso estvel alguns dos lpidos sintetizados de novo so transferidos para a poro exterior da bicamada, este processo catalisado pelas flipases.
Exportao Endoplasmtico
de
Protenas
Lpidos
do
Retculo
As molculas so exportadas do RE em vesculas que derivam deste e transportam o contedo at ao compartimento intermedirio RE Golgi; e depois at ao complexo de Golgi. J no complexo de Golgi so transportados entre diferentes compartimentos do Golgi e do Golgi para lisossomas ou membranas plasmticas, ou para vesculas excretoras. O primeiro ponto de ramificao que surge nesta via exportao para o Golgi versus reteno no RE, surgem outros como exportao para os lisossomas ou membrana plasmtica versus reteno no Golgi; todos este pontos de ramificao so regulados por sequencias sinal presentes na cadeia polipeptdica. Como exemplo de sequencias que determinam qual o caminho a seguir pela protena, temos os sinais KDEL ou KKXX que determinam que as protenas sejam recuperadas do intermedirio RE Golgi de novo para o RE.
O Complexo de Golgi
O complexo de Golgi funciona como uma fbrica na qual as protenas recebidas do RE so processadas e separadas para que sejam transportadas para os seus destinos. No entanto neste que ocorre a sntese de alguns lpidos, como glicolipidos ou esfingomielinas, ou de polissacarideos.
Organizao do Complexo de Golgi

O complexo de Golgi composto por sacos (cisternas) envoltas por membranas achatadas e vesculas associadas. Possui uma face cis, que convexo e habitualmente orientado na direco do ncleo, e a outra face trans. Este encontra-se dividido em quatro regies funcionalmente distintas: a rede de Golgi cis, pilha de Golgi medial e trans, rede de Golgi trans. As 64 2007/2008
protenas entram pela rede Golgi cis, sofrem a maior parte das alteraes na pilha de Golgi e saiem pela rede de Golgi trans, sendo distribudas e direccionadas para os seus destinos.
Distribuio de Protenas e Exportao do Complexo de Golgi

As protenas, assim como os lpidos e os polissacarideos, so transportados do complexo de Golgi para os seus destinos pela via secretora, o que envolve a sua incorporao em diferentes tipos de vesculas transportadoras, que saiem da rede Golgi trans e entregam os seus contedos nos locais apropriados da clula. Sinais responsveis pela reteno de algumas protenas dentro do Golgi formam localizadas pelo seu domnio transmembranares, que retm a protena dentro do Golgi. A via secretora constitutiva leva secreo continua e descontrolada de protenas, no entanto algumas clulas possuem uma via secretora regulada, na qual protenas especificas so secretadas em resposta a sinais do meio; seguem o processo normal da via secretora constitutiva, mas so armazenadas em vesculas especializadas.
Protenas de Revestimento e de formao de Vesculas

O primeiro passo no transporte vesicular a formao de uma vescula por alteraes na membrana, que revestida por protenas. Existem trs tipos de vesculas recobertas, que parecem funcionar em diferentes tipos de transporte vesicular: - Vesculas recobertas por clatrinas, so responsveis pela captao de molculas extracelulares da membrana celular por endocitose; - Vesculas recobertas por COP, que se dividem em COPI, funcionam na via de recuperao para reter protenas no Golgi ou RE, e em COPII, que saiem do RE e transportam molculas para o complexo de Golgi.
Fuso Vesicular
A fuso de uma vescula de transporte com o seu alvo envolve dois tipos de eventos: a vescula transportadora deve reconhecer especificamente a membrana alvo-correcta; e a vescula e a membrana-alvo devem fundir-se, libertando assim o contedo para o interior do organito-alvo. A hiptese de SNARE diz-nos que a fuso vesicular mediada por interacces entre pares especficos de protenas, designados de SNAREs, na vescula (v-SNARE) e na membrana alvo (t-SNARE). A interaco entre as vSNARE e a t-SNARE leva fuso das membranas atravs de mecanismos ainda no conhecidos.
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Existe ainda o complexo NSF/SNAP que actua depois da fuso entre as membranas para desagrupar o complexo SNARE, para que possa ser reutilizado.
Lisossomas
So organitos envolvidos por membranas que contm uma variedade de enzimas capazes de hidrolizar todos os tipos de polmeros biolgicos. Servem para digerir tanto o material captado do exterior como componentes da clula absolentos.
Hidrolases Lisossomais cidas

Os lisossomas possuem cerca de 50 enzimas, que degradam todos os polmeros biolgicos. Mutaes nos genes que codificam estas enzimas so responsveis por mais de 30 patologias, que so chamadas de doenas de armazenamento dos lisossomas, pois o material no degradado e acumula-se nos lisossomas. Como exemplo temos a Doena de Gaucher, que originado pela mutao no gene que codifica uma enzima responsvel pela degradao de glicolpidos. Todas as enzimas lisossomas so activas em pH baixo, que mantido dentro dos lisossomas, mas inactivas em pH neutro. O que permite evitar uma digesto descontrolada dos componentes da clula, o pH mantido cido no interior dos lisossomas por transporte activo de ies H+ para o interior do lisossoma.
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Captulo Dez (pg. 411-415)

Mitocndrias
A mitocndrias tm um papel crucial na produo de energia metablica das clulas eucaritas. Estas possuem o seu prprio DNA que codifica tRNAs, rRNAs e algumas protenas mitocndriais; as restantes so sintetizadas em ribossomas livres e importadas para o interior do organito por sinais especficos.
Organizao e Funo das Mitocndrias

As mitocndriais so delimitadas por um sistema de dupla membrana, composta por uma membrana interna e uma externa, separadas por um espao intermembranares. A membrana interna apresenta cristas que se estendem para o interior, que se designa de matriz. nesta que encontramos o genoma mitocndrial e as enzimas responsveis pelas reaces centrais do metabolismo oxidativo. No entanto na membrana interna que se localiza o principal local de gerao de ATP, que possui caractersticas que tornam este processo mais eficiente, como exemplo o aumento da sua superfcie devido s cristas e a sua impermeabilidade maioria dos ies e molculas pequenas. Contrariamente membrana interna, a externa, permevel a algumas molculas pequenas, devido a protenas que formam canais, as porinas.
O Sistema Gentico das Mitocndrias

As mitocondrias possuem o seu prprio genoma, distinto do nuclear. Considera-se que estas evoluram de bactrias que desenvolveram um relacionamente simbitico com outras clulas. O genoma mitocndrial constitudo por molculas circulares de DNA, que esto presentes em mltiplas cpias por organito, o que nos indica que existe na clula uma muito maior percentagem de genoma mitocndrial do que nuclear. importante realar que na mitocndria usado um cdigo gentico, ligeiramente, diferente do cdigo gentico universal. Tal como o DNA nuclear, o DNA mitocndrial pode sofrer mutaes, no entanto a mitocndria no possui mecanismos de correco, o que origina uma elevada taxa de mutao do DNA mitocndrial. importante destacar o facto de a quando da fecundao todas a mitocndrias derivam o ocito, o que faz com as doenas mitocndriais sejam apenas transmitidas por via materna.
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Captulo Dez (pg. 437-441)

Peroxissomas
Os peroxissomas so organitos pequenos delimitados por uma membrana e que contm enzimas envolvidas em uma grande variedade de reaces metablicas, incluindo vrios aspectos do metabolismo energtico. Apesar de serem idnticos aos lisossomas, diferem na sua formao, sendo este formados apartir de protenas sintetizadas nos ribossomas livres. Apesar de no possurem genoma so idnticos s mitocndrias e aos cloroplastos, pois reproduzem-se por diviso.
Funes do Peroxissomas
Os peroxissomas possuem, pelo menos, 50 enzimas diferentes envolvidas em uma variedade de metabolismos. Como o perxido de hidrognio txico para as clulas, os peroxissomas possuem tambm a enzima catalase, que decompe esse composto, convertendo-o em gua, ou utilizando-o para oxidar outros compostos orgnicos. Diversos compostos so degradados nos peroxissomas, um exemplo a oxidao dos cidos gordos, que representa a principal fonte energtica metablica. Os peroxissomas esto ainda envolvidos na biossintese de lpidos, de cidos biliares. Nas plantas desempenham dois papeis importantes , a converso dos cidos gordos em glcidos, atravs do ciclo do glioxilato; esto ainda envolvidos na fotorespirao, que serve para metabolizar produtos secundrios formados durante a fotossntese.
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Captulo Onze
O Citoesqueleto
Citosqueleto uma rede complexa, dinmica e interdependente de filamentos proteicos que se estendem ao longo do citoplasma. As suas funes so: - Suporte de organitos celulares; - Sustentao da membrana plasmtica; - Importante para a mobilidade celular; - Mantm a forma e confere elasticidade clula; - Permite o transporte de vesculas. Existem trs tipos de filamentos proteicos, dos quais iremos falar em particular de seguida, os microtbulos, os filamentos intermdios e os microfilamentos ou filamentos de activa. A ordem a cima descrita est por tamanho decrescente.
Microtbulos
Encontram-se dispersos pelo citoplasma. Podem participar na constituio de organitos (clios, flagelos e centrolos), que desempenham um papel importante nalguns tipos de mobilidade celular. Tambm esto presentes nas dendrites e nos axnios. Os microtbulos desempenham funes de: - Estabelecem a forma da clula; - Fornecem fora mecnica; - Locomoo da clula; - Trfego intracitoplasmtico de vesculas e organelos durante a interfase; - Construo do fuso mittico e movimento dos cromossomas; - Criao e manuteno de domnios citoplasmticos.
Constituio dos Microtbulos

Constitudos pela polimerizao de um heterodmero de tubulina e tubulina , originando uma parede de 13 protofilamentos alinhados longitudinalmente. Os microtbulos so estruturas com polaridade, sendo que a extremidade positiva, onde se encontra a tubulina , o local onde ocorre a associao de novas subunidades; assim sendo nesta extremidade que ocorre uma polimerizao mais acelerada. Na extremidade oposta, de polaridade negativa, estando exposta a tubulina , ocorre uma fraca polimerizao. Os microtbulos que entram na constituio de clios, flagelos e centrolos so estveis, j os microtbulos citoplasmticos so estruturas 69 2007/2008
Faculdade de Medicina de Lisboa rapidamente por
dinmicas, que podem formar-se e desmontar-se polimerizao e despolimerizao. Os microtbulos citoplasmticos tm um importante papel na diviso celular, sendo que nesta fase que a sua instabilidade mais notvel. Os microtbulos irradiam e crescem a partir de focos de material denso , situados nas imediaes dos centrolos. Neles encontra-se tubulina , esta responsvel pela funo dos focos de polimerizao. O processo de polimerizao dos microtbulos mediado pelo GTP e o GDP, sendo que um se liga a uma subunidade e outro a outra. inibida por baixas temperaturas e ies Ca2+ e favorecida pela presena de GTP ou GDP e ies Mg2+.
Transporte Celular e Protenas Motoras

Os microtbulos esto no s associados estrutura e aos movimentos da clulas, mas so igualmente responsveis pelo transporte intracelular. Existem duas protenas associadas aos microtblos e que desempenham essa funo de transporte: Dinenas possibilitam o movimento em direco extremidade negativa; Cinesinas possibilitam o movimento em direco extremidade positiva. A produo de fora motriz por parte deste sistema tambm se pode basear na despolimerizao dos microtbulos, sendo um exemplo a deslocao dos cromossomas durante a anafase.
Protenas Associadas aos Microtbulos

Podem interferir com a ligao dos microtbulos a outras estruturas celulares, ou com a dinmica de polimerizao e despolimerizao, permitindo a modulao das suas funes. As MAP baixam a concentrao crtica de tubulina necessria formao dos MT, favorecem o seu crescimento e diminuem a taxa da sua dissociao; como exemplo destas temos as protenas tau.
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Drogas que Intreferem com os Microtbulos

Existem drogas que intreferem com a estabilidade, ou os processos de polimerizao e despolimerizao dos microtbulos, como exemplo: Colchicina inibe in vitro a polimerizao da tubulina e provoca in vivo a dissociao dos microtbulos citoplasmticos. As suas molculas ligam-se com grande afinidade aos dmeros de tubulina inibindo a sua polimerizao. Vinblastina liga-se s molculas de tubulina impedindo a sua polimerizao, originando a formao de agregados paracristalinos desta protena. Taxol associa-se a polmeros de tubulina, tendo uma aco estabilizadora. Baixa a concentrao crtica de tubulina necessria polimerizao, que promove mesmo em condies desfavorveis (ausncia de MAP e GTP, baixas temperaturas).
Filamentos Intermdios
Os filamentos intermdios tm um dimetro entre o dos microtbulos e o dos microfilamentos. Formam uma rede perinuclear, donde se estendem at membrana celular. Ocorrem sob a forma de pequenos feixes ou constituindo feixes muito compactos nas clulas epiteliais. Constitudos por protenas fibrosas, cujo domnio central constitudo por uma hlice , com cerca de 310 a 350 aminocidos e duas pores globulares em ambas as extremidades, de dimenses e sequncia muito variveis. Podemos assim dividi-a em dois domnio distintos: Domnio central responsvel pela idntica organizao estrutural dos diferentes tipos de filamentos intermdios. Domnios terminais muito variveis em tamanho e nas sequncias de aminocidos, conferem-lhes especificidades prprias. As suas principais funes so: - Desempenham funes estruturais (papel de suporte): - Reforam as clulas (resistncia mecnica); - Participam na organizao das clulas em tecidos; - Reforam a membrana celular nos locais de contacto com outras clulas; - Transporte de macromolculas e vesculas.
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Diferentes Tipos de Filamentos Intermdios

Os filamentos intermdios so classificados segundo a estrutura molecular e a organizao dos genes. So agrupados juntamente com as lminas nucleares numa grande famlia multignica. Consideram-se 5 tipos diferentes de famlias de protenas que os constituintes: - Tipo I Citoqueratinas acdicas* epitlios - Tipo II Citoqueratinas bsicas/neutras* epitlios - Tipo III: Vimentina mesnquimas Desmina msculo Protena acdica fibrilar glial clulas gliais e astrcitos Periferina neurnios do SN perifrico - Tipo IV: Protenas dos neurofilamentos NF-L Tecido nervoso perifrico maduro; associadas NF-M aos MT neuronais aumentam o tamanho do axnio. NF-H Nestina clulas neuroepiteliais internexina tecido nervoso em crescimento - Tipo V Lminas nucleares A, B e C constituem o invlucro nuclear, so exclusivas do ncleo
Formao dos Filamentos Intermdios

A formao dos filamentos pode ser dividida em quatro acontecimentos sequenciais, que so os seguintes - Um monmero emparelha com um monmero idntico para formar um dmero (estrutura entrelaada), que conserva as regies homlogas emparelhadas paralelamente na forma helicoidal; - Dois dmeros alinham-se para formar lado a lado um tetrmero, que contm 4 cadeias polipeptdicas; - Cada tetrmero constitui um protofilamento de 2 a 3 nm. Quatro Protofilamentos (tetrmeros) enrolados helicoidalmente formam protofibrilhas de 4 a 5 nm; - A associao de 4 protofibrilhas constitui filamentos intermdios de 10 nm.
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Filamentos de Actina
Os filamentos de Actina tm aproximadamente 7nm de espessura e alguns m de comprimento, a aparncia da dupla hlice, so polares e organizam-se em forma de feixes ou de redes.
Polimerizao/Despolimerizao
A actina G ou globular forma estruturas com 3 unidades, a unio destas estruturas forma a actina F ou filamentosa. Os monmeros de actina podem ligar-se a ATP, que facilita a polimerizao e dificulta a despolimerizao, e a ADP, que dificulta a polimerizao. Existe um equilbrio entre a actina G e a actina F, assim sendo quando a concentrao de actina G superior, a polimerizao favorecida, quando inferior, a despolimerizao favorecida. Na extremidade positiva existe uma velocidade de polimerizao cerca 5 a 10 vezes superior do que na extremidade negativa, sendo que na positiva se ligam o monmeros associados a ATP e na negativa os associados ao ADP. Visto que a polimerizao numa extremidade favorece a despolimerizao na outra, para que haja uma estabilidade dos filamentos de actina, existe o efeito treadmilling, que favorece igualmente a adio na extremidade positiva e a remopo na extremidade negativa.
Protenas que Regulam Despolimerizao da Actina
Polimerizao
Existem protenas que regulam a polimerizao e a despolimerizao da actina, elas denominam-se por ABPs. Alguns dos exemplos de ABPs so os seguintes: - Complexo Arp 2/3 Conduz nucleao de actina, criando ramos nos filamentos ou aumentando a sua taxa de treadmilling; - Formina Leva nucleao de actina, determinando onde so iniciados e para onde elongam os filamentos;
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- ERM Promovem a polimerizao dos microfilamentos; so associadas a protenas da membrana; - Famlia ADF/cofilina Liga-se actina-F-ADP, aumentando a taxa de despolimerizao na extremidade negativa, mantm a actina-G-ADP formada nessa forma, impedindo a polimerizao - Profilina Estimula a passagem de actina-G-ADP para actina-G-ATP, aumentando a taxa de polimerizao - Gelsolina Cliva a actina F em partes, pela separao de monmeros num determinado ponto; Timosina 4 liga-se individualmente aos monmeros de actina, reduzindo a sua concentrao no citosol, induzindo a despolimerizao de actina F. Existem ainda protenas que regulam a polimerizao/despolimerizao formando um cap numa das extremidades, inibem a polimerizao ou a despolimerizao consoante se ligam a extremidade positiva ou negativa, respectivamente.
Drogas que Afectam o Citosqueleto de Actina

As principais drogas que intreferem com a estabilidade e o equibilibro entre despolimerizao e polimerizao dos filamentos de actina so: - Citocalasinas Ligam-se extremidade positiva dos filamentos, impedindo a sua elongao; - Lantrunculina Bloqueia a actina-G, impedindo a polimerizao de actina F; - Faloidina Liga-se aos filamentos de actina, impedindo a sua dissociao em monmeros, bloqueando assim os microfilamentos.
Organizao do Citoesqueleto de Actina

Os filamentos de actina podem organizar-se de duas formas distintas: em rede ou em feixes. Os feixes de actina podem estar organizados de duas formas distintas: - Feixes Paralelos, poucos espaos entre os filamentos e a fimbrina que une os filamentos; - Feixes Contrcteis, existe um maior espaamento entre os feixes de actina e a -actina que une as extremidades de cada filamento. Os filamentos de actina organizados em redes consistem em arranjos tridimensionais, onde a ligao entre feixes realizada por filamina, que liga os filamentos numa orientao tridimensional, flexvel no seu arranjo global. Esta configurao encontra-se junto membrana plasmtica.
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Miosina
A miosina funciona geralmente em associao com filamentos de actina e protenas motoras, estando envolvida no transporte celular e nos movimentos da clula. A miosina pode ser divida em dois domnios: - Cabea, liga-se actina; - Cauda, liga-se a cargas a transportar ou a outras subunidades de miosina.
Contraco Muscular
Msculos esquelticos so constitudos por fibras musculares compostas por clulas alongadas, contendo miofibrilas: filamentos de actina e filamentos de miosina; que se dividem em sarcmeros, ou seja, unidades contrcteis responsveis pelo aspecto estriado dos msculos. As miosinas das clulas musculares so do tipo miosina II. As fibras de miosina so constitudas pela unio das suas caudas, ficando as suas cabeas, que se associam a actina, livres para o fazer. Existem diversas teorias para explicar a contraco muscular, a mais aceite consiste no seguinte: - Filamentos de miosina ligados actina; - Ligao do ATP; - Filamentos de miosina desligam-se da actina; - Hidrlise do ATP; - Mudana de conformao da cabea da miosina, permanncia do ADP + P i; - Ligao da miosina a um novo local do filamento de actina, mais prximo da extremidade positiva; - Libertao do ADP e do Pi; - Retoma da conformao inicial; - Avano do filamento de miosina em direco extremidade positiva da actina; - Contraco Muscular, ou seja diminuio entre as miofribilas.
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Captulo Treze
Sinalizao de Molculas e seus Receptores
Diferentes tipos de molculas transmitem informaes entre clulas de organismos multicelulares, embora a sua funo seja idntica, a sua estrutura varivel. Umas transportam sinais a longas distncias, outras para locais especficos e outras paras as clulas vizinhas. Certas molculas atravessam a membrana e ligam-se a receptores no citoplasma ou no ncleo, enquanto a maior parte se liga a receptores expressos na membrana da clula. Existem diversas formas de sinalizao e de receptores, cujos mais importantes sero abordados de seguida.
Modelos de Sinalizao Clula-Clula

A sinalizao celular pode resultar tanto da interaco directa de uma clula com a clula vizinha como da segregao de uma molcula sinalizadora. Este ultimo caso pode ser divido em trs grandes grupos consoante o seu destino final: - Sinalizao Endcrina, as molculas sinalizadoras so secretadas por clulas endcrinas especializadas e transportadas atravs da circulao para actuarem em clulas alvo localizadas em rgos distantes; - Sinalizao Parcrina, uma molcula libertada actua sobre as clulasalvo vizinhas; - Sinalizao Autcrina, as clulas respondem a sinalizaes que elas mesmo produzem, como exemplo temos alguns linfcitos T.
Hormonas Esterides e Superfamlia de Receptores Esterides

Todas as molculas sinalizadoras actuam por meio de ligao a receptores expressos por clulas-alvo, em grande parte dos casos eles esto expressos a superfcie celular, no entanto alguns encontram-se no interior do citoplasma ou ncleo. Visto que as hormonas so pequenas molculas hidrfobas, capazes de se difundirem atravs da membrana plasmtica, elas actuam em receptores expressos no citoplasma ou ncleo. Temos o exemplo da hormona da tireide que sintetizado na glndula tireide e desempnha um papel importante no desenvolvimento e regulao do metabolismo; a vitamina D3 regula o metabolimos do Ca+2 e o crescimento sseo; o cido retiico e composto relacionados, sintetizados apartir da vitamina A, desempenham um papel importante no desenvolvimento.
Hormonas Peptdeas e Factores de Crescimento

A mais amplas variedade de molculas sinalizadoras nos animais constituda por pptidos. Existem diversos tipos de pptidos sinalizadores dos 76 2007/2008
quais se destacam as hormonas peptdeas, os neuropeptdeos e os factores de crescimento. Os factores de crescimento controlam o crescimento e a diferenciao das clulas, como exemplo no caso especifico do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). Este factor armazenado nas plaquetas e libertado durante a coagulao sangunea no local do ferimento. Ele estimula a proliferao dos fibroblastos nos tecidos perifricos leso. Existem ainda os factores de crescimento ancorados membrana, que permanecem na membrana da clula e actuam a quando das interaces clula. Visto que as molculas peptdeas sinalizadoras no so capazes de atravessar a membrana, logo necessrio que existem receptores nas membranas para que a clula possa captar os sinais por eles transmitidos.
Funes dos Receptores de Superfcie Celular

Como j foi referido, as molculas sinalizadoras, muitas delas no conseguem atravessar a membrana e precisam por isso de receptores de membrana. A maior parte dos receptores actuam controlando a abertura/fecho de canais inicos ou atravs da transmisso de sinais intracelulares que iro interferir com factores de transcrio e regular a transcrio de determinados genes.
Receptores Acoplados Protena G

A famlia mais ampla de receptores de superfcie celular transmite sinais para alvos intracelulares por intermdio de protenas de ligao ao nucleotdeo guanidina, denominadas de protenas G. Os receptores acoplados protena G so estrutural e funcionalmente protenas, caracterizados por sete -hlices paralelas atravessando a membrana. As protenas G so compostas por trs subunidades, , e . A primeira est ligada aos nucleotdeos guanidina, que regulam a actividade desta protena; no seu estado de repouso esta subunidade encontra-se ligado ao GDO em complexo com a subunidade e . Quando a hormona se liga ao receptor, este altera a sua conformao e leva a que o GDP ligado subunidade seja substitudo por GTP. Com a presena de GTP a subunidade e formam um complexo que ir desempenhar as suas funes, sendo que todo este ciclo se encerra com a hidrlise do GTP a GDP, passando a subunidade a estar de novo ligada a GDP, ou seja, inactiva, e o complexo e junto a esta.
Receptores de Protena-Tirosina Cinase

Contrariamente ao receptores acoplados protena G, existem outros que se encontram ligados directamente a enzimas intracelulares. A grande 77 2007/2008
famlia deste grupo a dos receptores protena-tirosina cinase. Desta famlia fazem parte os receptores para os factores de crescimento polipeptdeos. A estrutura destes receptores caracterizada por um domnio N terminal extracelular de ligao ao ligante, uma nica -hlice transmembranar e um domnio C no citosol, onde est ligada a enzima com actividade protenatirosina cinase. A primeira etapa em sinalizao de muitos deste receptores a dimerizao do receptor induzida pelo ligante. Esta dimerizao leva a uma autofosforilao do receptor medida que as cadeias polipeptdeas dimerizadas se fosforilam umas s outras. Este processo de autofosforilao constitui um importante ponto de regulao e permite que se criem stios especficos para a ligao de protenas adicionais, que iro transmitir a cadeia de sinais intracelulares dos receptores activados. Os mais bem conhecidos destes domnios so os domnios SH2.
Vias de Transduo de Sinal Intracelular

A maioria dos receptores de superfcie celular estimula enzimas-alvo intracelulares, as quais podem, ou no, estar acopladas aos receptores por protenas G. essas enzimas so elementos da cascata de sinalizao que propaga e amplifica o sinal iniciado pela ligao do ligante. Ao conjunto de reaces que transmitem o sinal desde a superfcie at ao seu alvo chamamos transduo de sinal intracelular.
A Via do cAMP: Segundo Mensageiro e Fosforilao de Protenas

Aps vrios estudos conclui-se que a aco de muitas das hormonas era mediada por um aumento da concentrao de AMP Cclico (cAMP), o que nos levou a considerar o cAMP como o segundo mensageiro na sinalizao hormonal. O cAMP formado apartir do ATP pela aco de adenial ciclase e degradado a ATP por cAMP fosfodiesterase. Grande parte dos processos em que o cAMP actua como segundo mensageiro funcionam de forma a que as protenas que necessitam de ser acivadas possuem subunidades regulatrias ligadas a elas, que as inibem, e que so removidas a quando da ligao de cAMP. No caso dos animais este efeito verifica-se maioritariamente nas protenas cinases dependentes de cAMP, ou protenas cinase A. Com este mecanismo possvel uma enorme amplificao do sinal desde o receptr at ao alvo, pois cada molcula ligante activa um nico receptor, que por sua vez pode activar mais de uma centena de molcula G, que estimulam a actividade da adenil cinase, que por sua vez pode catalisar a sntese de muitas molculas de cAMP. 78 2007/2008
Muitas vezes o cAMP vai interferir directamente na regulao da transcrio de determinados genes, estes possuem uma sequncia regulatria (CRE), ao qual se ir ligar a protena CREB aps ter sido fosforilada por uma protenas cinase A.
GMP Cclico
O GMP Cclico igualmente um segundo mensageiro, no entanto no se encontra to bem estudado como o cAMP. A sua sntese mediada pela guanilil ciclase e a sua degradao a GMP por uma fosfodiesterase. Quando existe a ligao do ligante, as guanilil cilcase so estimuladas a sintetisar cGMP, que por sua vez ir desencadear respostas bio-fisiolgicas.
A Via das Ras, Raf e MAP Cinase

A via da MAP cinase refere-se a uma cascata de protenas cinases que foram altamente conservadas durante a evoluo e desempenham funes centrais na transduo de sinal em todas as clulas eucaritas. As ERK desempenham um papel central na sinalizao da proliferao celular induzida por factores de crescimento que actuam por meio de receptores protena-tirosina cinase ou receptores acoplados protena G. A activao da ERK mediada por duas protenas cinases contracorrente, que so acopladas a receptores de factores de crescimento por uma protena de ligao ao GTP denominada Ras. Por sua vez a activao da Ras leva activao da proteina cinase Raf e que vai activar uma outra protena cinase a MEK. A MEK vai por sua vez activar membros da famlia das ERK. Receptor + Ligante Transcrio Ras Raf MEK ERK Factores de
Regulao da Morte Celular Programada

A morte celular programada uma forma fisiolgica normal de morte celular que desempenha um papel-chave tanto na manuteno de tecidos adultos como no desenvolvimento embrionrio. A morte celular programada permite no s fazer uma renovao dos tecidos, como evitar que clulas potencialmente perigosas para o organismos proliferem. Como exemplo disto temos as clulas infectadas por vrus ou com leses no seu DNA que induzem a sua prpria morte para o bem de todo um organismo. Esta uma das formas do nosso organismo evitar que clulas que possam originar um cancro proliferem, por isso um importante mecanismo celular, apesar de a palavras morte estar quase sem associada a uma aco negativa.
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A sobrevivncia das clulas assegurada, na sua maioria, pelos factores de crescimento extracelulares, tambm a morte celular programada mediada por um conjunto de vrias vias de sinalizao.
Caspases e Apoptose
Em contraste com a morte acidental de clulas, a morte celular programada um processo activo caracterizado por mudanas morfolgicas distintas conhecidas como apoptose. Durante este processo o DNA cromossomal normalmente encontra-se muito condensado e fragmentado. O ncleo fragmenta-se, sendo de seguida a clula que diminui de tamanho e se fragmenta; os fragmentos que dai surgem denominamse de corpos apoptticos. Estes fragmentos so facilmente reconhecidos e digeridos pelos macrfagos, o que faz com que a apoptose seja muito diferente da necrose celular, onde no existe uma eficaz remoo dos fragmentos de clula que se originam. So as caspases que so responsveis por desencadear todo este processo a nvel celular, sendo elas proteases que tm no seu centro activo resduos de cistena e clivam depois de resduos de acido asprtico. Os principais alvos das caspases so: um inibidor de um DNase, que ir fragmentar o DNA nuclear; as lminas nucleares, o que provoca a alterao da membrana nuclear; e as protenas do citoesqueleto, levando sua destruio e fragmentao celular. As caspases so sintetizadas sob forma inactiva, a sua activao feita por clivagem proteoltica, o que por sua vez catalisado por outras caspases. O Apaf-1 um dos activadores das caspases, promovendo a clivagem de outras caspases e dos substratos alvo; em contraste temos a Bcl-2 que inibe a activao de caspases. Nos mamferos existe a chamada famlia Bcl-2, onde se inclui o Bcl-2, no entanto dentro deste grupo existe elementos prapoptticos e anti-apoptticos. Uma das caspases iniciadoras a Caspase-9, que para ser activada no basta que existe Apaf-1, ainda preciso que a este complexo se junto o citocromo c. O que em condies normais no possvel, pois o citocromo c encontra-se dentro da mitocndria. A quando da estimulao pr-apopttica, ou na ausncia de factores de crescimento, as clulas induzem danos na membrana da mitocndria, sendo o citocromo c libertado. Forma-se ento o complexo caspase-9/Apaf-1/citocromo c que activo e inicia a clivam de outras caspases, as efectoras, e dos seus alvos.
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Esta situao evitada pelas Bcl-2 que se vo ligar membrana da mitocndria, mantendo a sua estabilidade, ficando o citocromo c longe da caspase-9. No entanto existem elementos pr-apoptticos que induzem danos na membrana de modo a que haja libertao de citocromo c.
Receptores de Morte Celular e Activao de Caspases

Existem polipeptdeos segregados que activam receptores que induzem a apoptose factores de necrose tumoral (TNF) que iro activar directamente as caspases. Neste caso a caspases activa a Caspase-8,que se auto-cliva, e que por sua vez vai activar a cadeia das caspases. Uma das aces da caspase-8, alm de clivar outras caspases, clivar um membro das Bcl-2, o Bid, que um elemento pr-apopttico, e vai induzir a degradao da membrana mitocndrial e consequente libertao de citocromo c; com a presena de citocromo c a capase-9 igualmente activa.
Sinalizao de Sobrevivncia Celular

A sinalizao referida anteriormente vai induzir a apoptose, no ento existem outras vias que inibem a apoptose e promovem a sobrevivncia da clula. Estas vias so controladas por factores de crescimento factores de sobrevivncia ou por interaco clula-clula. Na realidade quase todas as clulas esto programadas para induzirem a apoptose caso haja ausncia e factores de sobrevivncia. Uma das principais vias de sinalizao intracelular responsvel por promover a sobrevivncia celular iniciada pela enzima PI-3 Cinase, que activada por receptores de membrana. A PI-3 cinase responsvel por activar a protena Ark que interfere com as protenas reguladoras da apoptose. Um dos seus alvos uma protena da famlia da Bcl-2, a Bad, que induz a libertao de citocromo c, a Ark promove a sua inactivao. Pode ainda fosforilar a capase-9, impedido que esta fique activa, mesmo na presena de citocromo c e Apaf-1. Regula a expresso de factores de transcrio importantes para manter a sobrevivncia celular. A sobrevivncia celular pode ser assegurada no s pelas PI-3 cinases/Ark, mas igualmente pela via Ras/Raf/MAP.
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Captulo Catorze (pg. 596-617)

O Ciclo Celular dos Eucaritas
O ciclo da diviso da maioria das clulas consiste em quatro processos coordenados: crescimento celular, replicao do DNA, distribuio dos cromossomas duplicao s clulas-filhas e diviso celular.
Fases do Ciclo Celular

O ciclo celular pode ser dividido em duas fases principais: mitose e interfase. A mitose corresponde separao dos cromatdeos e termina geralmente a diviso celular, atravs da citocinese. No entanto grande parte do ciclo compreendido na interfase, tanto o crescimento celular, como a replicao do DNA, ocorrem de forma ordenada e estritamente reguladas. Interfase G1 Mitose G2 Citocinese Mitose Mitose
Fase S
Citocinese
A interfase caracterizada pelo crescimento celular e pela replicao do DNA; na fase G1 a clula encontrase metabolicamente muito activa e cresce continuamente; na fase S ocorre a replicao do DNA, passando cada cromossoma a ter dois cromatdeos; em seguida na fase G2 o crescimento continua e so sintetizadas as protenas necessrias para o inicio da Mitose. Contrariamente ao que acontece nas clulas embrionrias, no adulto algumas clulas cessam completamente a diviso e outras apenas se dividem quando necessrio. Estas clulas passam de um estado G2 para G0, no qual permanecem metabolicamente activas mas no proliferam, a no ser que recebam estmulos para tal.
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As diferentes fases do ciclo celular podem ser distinguidas pelo seu contedo em DNA: - G1 (2n) - Fase S (2n-4n) - G2/M (4n)
Regulao do Ciclo Celular pelo Crescimento Celular e Sinais Extracelulares

O ponto principal da regulao do ciclo celular ocorre no final de G1 e controla a passagem de G1 para S START. Uma vez ultrapassado este ponto as clulas esto destinadas a entrar em fase S e consequente diviso celular, a sua regulao feita quer por sinais extracelulares, quer pela disponibilidade de nutrientes no meio. No entanto nas clulas animais o ponto START regulado quase exclusivamente pelos factores de crescimento extracelulares. Na ausncia de estmulos para a proliferao as clulas passam de G1 para G0, onde podem permanecer indefinidamente.
Pontos de Verificao do Ciclo Celular

Na maioria das clulas a coordenao entre as diversas fases do ciclo celular dependente de um sistema de controlo de pontos de verificao e retroalimentao que previnem a entrada na prxima fase do ciclo at que eventos da fase anterior tenham sido completados A funo de grande parte dos pontos de verificao assegurar que os cromossomas incompletos ou danificados no se repliquem e sejam passados para as clulas-filhas. Um dos mais bem marcados pontos de verificao ocorre em G2, evitando que a clula passe para a Mitose sem que todos os cromossomas estejam replicados. A continuao do ciclo celular igualmente bloqueada em G2 caso existam erros no DNA, quer sejam estes resultantes de agente mutagnicos ou se erros na replicao, o que previne a passem de DNA mutado para as clulas-filhas. Os danos no DNA no bloqueiam apenas o ciclo em G2, mas tambm diminuem a continuao do ciclo em S e evitam que a clula passe de G1 para S. Assim sendo a clula pode reparar o DNA antes de prosseguir para a prxima fase. Em clulas de mamferos o ponto de bloqueio em G1 mediado pela aco de uma protenas, a p53, cuja expresso induzida em respostas ao DNA danificada (uma no replicao dos cromossomas encarada como um dano do DNA). Este um dos genes que se encontra regularmente mutado em paciente com cancro, pois permite a proliferao das clulas mesmo que estas possuem danos no seu genoma. Outro ponto de verificao ocorre no final da mitose, este assegura-se que os cromossomas se encontram correctamente posicionados no fuso 84 2007/2008
mittico, para que estes sejam distribudo de forma exacta para as clulasfilhas.
Ligao da Fase S para a Fase M

O ponto de verificao em G2 evita a iniciao da mitose antes da concluso da fase S, assegurando-se que todos os cromossomas so replicados uma nica vez e de forma integra. A sntese do DNA no ncleo em G2 bloqueada por um mecanismo que evita nova replicao do genoma at que ocorra uma mitose. O mecanismo que regula esta replicao do DNA envolve um conjunto de protenas designadas MCM que se ligam s origens de replicao.
Reguladores do Curso do Ciclo Celular

Como j nos foi dito anteriormente existem um conjunto de pontos de verificao, que por sua vez regulam o avano ou o retardo do ciclo celular. Esta regulao feita por um variado conjunto de protenas que asseguram que o ciclo ocorra de forma coordenada, que haja uma correcta replicao e distribuio do DNA; caso isto no se verifique a clula induz a sua prpria morte, por um proceso de apoptose.
MPF: Um Dmero de Cdc2 e Ciclina

A caracterizao molecular de MPF em diversos laboratrios mostrou ento que este factor conservado de regulao do ciclo celular composto por duas subunidades Cdc2 e Ciclina B. A actividade do MPF controlada pela peridica acumulao e degradao da ciclina B durante o ciclo celular, e ainda pela fosforilao e desfosforilao de Cdc2. A regulao deste complexo em S e G2 conseguida por duas fosforilaes, sendo que uma delas a inactiva, e por isso leva a sua acumulao. Na transio para M causada pela activao do complexo como resultado da desfosforilao de um resduo de tirosina que outrora mantinha o complexo inactivo, este processo mediado pela Cdc25.
Famlia das Ciclinas e Cinases Dependentes de Ciclinas
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Nos eucaritas a passagem de G1 para a fase S regulada por Cdk2 e Cdk4 em associao com as ciclinas D e E. Sendo que a associao de Cdk4 e ciclinas D so necessrias para ultrapassar o ponto STAR, enquanto que a Cdk2 e ciclinas E so necessrias para a transio para a fase S e o inicio da replicao do DNA. Durante a fase S existe uma associao entre a ciclina A e Cdk2, enquanto que a transio de G2 para M promovida pela associo de Cdc2 com ciclina B.
Factores de Crescimento e Ciclinas do Tipo D

A proliferao das clulas animais regulada por uma variedade de factores de crescimentos extracelulares que controlam as clulas atravs do ponto de restrio no ponto de restrio no final de G1. Na ausncia de factores de crescimento as clulas so incapazes de ultrapassar o ponto STAR e entram em G0. A sntese de ciclina D induzida em resposta estimulao dos factores de crescimento como resultado da sinalizao atravs de Ras/Raf/ERK. As ciclinas do D so continuamente sintetizadas enquanto existirem factores de crescimento no meio, no entanto elas degradam-se com facilidade, e na ausncia de factores de crescimento o seus nveis descem rapidamente.
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A protena Rb actua como um supressor de tumores, pois o complexo Rb/E2F suprime a transciro do gene que regula E2F. A fosforilao de Rb pelo complexo Cdk4/Ciclina D resulta numa dissociao de E2F, que activa a transcrio dos seus genes-alvo (um deles o da ciclina E).
Inibidores do Curso do Ciclo Celular

Agentes que danificam o DNA resultam num bloqueio do ciclo celular, permitindo assim clula reparar os danos que surgiram. Um bom exemplo deste processo o bloqueio do progresso do ciclo celular por inibio dos Cdk, o que mediado pelo p53. O p53 vai regular a transcrio, estimulando a expresso de p21, que um inibidor de Cdk. Na presena de p21 muitos dos complexos Cdk/Ciclina no se conseguem formar, logo existe um bloqueio no ciclo celular. O p53 alm de bloquear o ciclo celular induz ainda a apoptose, activando a via das caspases, pois uma forma de assegurar que as mutaes ou possveis oncogenes no sero transmitidos s clulas descendentes.
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Correlaes Clnicas
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ndice
ndice ............................................................................................................................. 89 Vrus e Cancro .............................................................................................................. 90 Fenilcetonria ............................................................................................................... 91 HIV e SIDA ..................................................................................................................... 92 Terapia Gnica para a Deficiencia de Adenosina Desaminase ............................... 93 Cancro do Clon e Reparao do DNA ...................................................................... 94 Factor de Transcrio Pit-1 e a Deficincia da Hormona do Cresc. ....................... 95 Antibiotico e Sntese Proteica ..................................................................................... 96 Doena de Gaucher ...................................................................................................... 97 Doenas das Mitocndrias: Neurapatias pticas Heredittia de Leber ................. 98 Distrofia Muscular e Citoesqueleto ............................................................................ 99 Fibrose Cistica ............................................................................................................ 100
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Vrus e Cancro
A Doena
O cancro um grupo de doenas caracterizado pela proliferao incontrolada de clulas. Em contraste com um crescimento regulado normal, no cancro as clulas crescem de forma no-regulada, acabando por invadir e interferir com a funo de tecidos e rgos normais. O cancro uma das maiores causas de morte nos nossos dias, e por isso alvo de estudos por parte da Biologia Molecular.
Bases Celulares e Moleculares

Sabe-se que o cancro resulta de mutaes nos genes que normalmente controlam a proliferao celular, podendo estas inibir mecanismos de controlo ou estimular a diviso celular, actividando factores envolvidos na regulao do ciclo celular. O estudo de vrus que provocam cancro, como o caso do RSV, permitiram concluir que o cancro uma doena gentica, no entanto ela no resulta da alterao de um nico gene. Era pois muito mais fcil estudar o genoma do vrus, do que o de animais, levando identificao de um gene causador de cancro, um oncogene. Encontram-se nas nossas clulas genes semelhantes a este encontrado no RSV, estes quando vtimas de alteraes, originam ento um oncogene. Que pode causar o cancro, no ento so necessrias mais alteraes do que apenas a formao de um nico oncogene.
Preveno e Tratamento
Os cancro humanos que so causados por vrus incluem o cervical e outros cancros anogenitais, como exemplo o papilomavrus e os vrus da Hepatite B e C. Este cancros podem ser prevenidos atravs de uma vacina contra o vrus responsvel, como o caso da vacina eficaz contra o vrus da Hepatite B. A maior parte das mutaes que causam cancro so adquiridas durante a nossa vida e no herdadas.
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Fenilcetonria
A Doena
A fenilcetonria, ou PKU, um erro inato do metabolismo dos aminocidos com efeitos devastadores. Se no for tratada resulta em um grave atraso mental, no entanto j possvel o seu diagnstico precoce e o seu tratamento.

A fenilcetonria causada por uma defeciencia na enzima fenilalanina hidroxilase que converte fenilalanina em tirosina. Esta deficincia leva ao acumular de elevados nveis de fenilalanina, que passa por outras reaces como a converso para fenilpiruvato. Estes produtos txicos para o organismos so excretados pela urina, devido sua elevada concentrao no sangue. Embora a causa bioqumica seja desconhecida, o retardo mental causado por um acumular anormal deste metabolitos anormais de fenilalanina.
A deficincia da enzima no causa nenhum problema enquanto o feto est dentro do tero, de modo que crianas com fenilcetonria so normais ao nascimento. Se no tratadas tornam-se gravemente e permanentemente afectados antes de completarem um ano de vida. Felizmente o diagnostico pode ser feito por testes de rotina, conhecido por teste do pezinho, no entanto um diagnostico mais especifico deve ser feito atravs de testes genticos, para verificar de outras enzimas foram afectadas igualmente. O tratamento desta doena baseia-se numa alimentao controlada, com baixa ingesto de fenilalanina, o que permite manter, os nveis desta, aceitveis, abaixo do limite txico.
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HIV e SIDA
A Doena
A Sindrome da Imunodeficincia Adquirida (SIDA) uma doena recente, descrita pela primeira vez em 1981. No entanto rapidamente se tornou numa pandemia mundial, que j provocou vrios milhes de mortes. As manifestaes clnicas da SIDA resultam, principalmente, da falha do sistema imune, o que torna o paciente vulnervel a infeces oportunista, que de outro modo seria facilmente resistente. Existe ainda uma grande incidncia de cancro nestes pacientes, no entanto a grande causa de morta so as infeces oportunistas.

A SIDA causada por um retrovrus, o HIV, que infecta preferencialmente os linfcitos CD4, que necessrio para uma resposta imune normal. Contrariamente a muitos outros retrovrus, o HIV, no induz as clulas a tornarem-se cancerosas. Ele destri as clulas que infecta, o que leva a um reduo drstica do linfcitos CD4 e uma deficiente resposta do sistema imune, o que permite s infeces oportunistas alojarem-se.
At ao presente a nica forma de prevenir a SIDA evitando a contaminao pelo HIV. O HIV um vrus que no exterior se perde rapidamente. O HIV pode ser transmitido por contacto sexual, atravs de contacto com produtos contaminados com sangues e de me para filho durante a gravidez ou no aleitamento. Quanto ao seu tratamento, este pouco eficaz, no entanto actualmente j possivel prolongar a vida dos pacientes infectados com a combinao de diversos frmacos. Um dos mais utilizados o AZT, que consiste num nucleotdeo modificado que no possui na extremidade 5 o grupo OH de modo a permitir a ligao ao nucleotdeo seguinte, inibindo assim a transcrio do DNA viral.
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Terapia Gnica para a Deficiencia de Adenosina Desaminase

A Doena
A deficincia de adenosina desminase uma das causas de imunodeficincia grave combinada (SCID), um grupo de doenas hereditrias nas quais os linfcitos falham ao desenvolver-se. Os indivduos doentes tm todas as suas funes imunes deficientes, logo defesas quase ausentes. Devido s inmeras infeces que afectam estes indivduos, as crianas, a menos que tratadas, no ultrapassam os 2 anos de idade.

Cerca de 20% dos casos de SCID ocorrem por deficincia gentica na enzima adenosina desaminase, a qual catalisa a desaminao da adenosina e da desoxiadenosina. Esta deficincia na enzima leva a uma acumulao de dATP, que em altas concentraes prejudicial para clulas em proliferao, pois o dATP inibe a ribonucleotdeo redutase, necessria para a sntese dos desoxirribonucleotdeos trifosfatados. Logo uma elavada concentrao de dATP inibe a transcrio. Este deficincia afecta mais severamente os linfcitos pois estes no possuem outras enzimas que degradam o dAMP e evitam desta forma o acumular de dATP. Mais concretamente a deficincia de adenosina desaminase intrefere com a replicao do DNA dos linfcitos, evitando que estes se dividam.
Algumas crianas com deficincia na enzima adenosina transaminase podem ser curadas pelo transplante de medula ssea. Em outros casos esta doena por ser tratada pela terapia de reposio enzimtica, na qual a adenosina transaminase funcional administrada por injeco endovenosa. Embora este procedimento seja benfico e atenue a patologia, ele no cura a doena. Foi ento criada a primeira tentativa clnica de terapia gnica no tratamento de duas crianas com esta doena. Foram obtidos linfcitos destas crianas e estimulados a proliferarem; um cDNA de adenosina desaminase funcional clonado num vector retroviral foi introduzido nesses linfcitos, os quais, retornaram aos pacientes. Estes tratamentos foram repetidos 11 a 12 vezes num perodo de 2 anos, e verificou-se que o vector era mantido aps o tratamento e um dos pacientes produziu cerca de 25% do nvel normal de adenosina transaminase. Estes resultados so sustento para o sucesso da terapia gnica como tratamento neste tipo de doenas.
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Cancro do Clon e Reparao do DNA

A Doena
Os cancros do clon e recto so um dos tipos de cancro mais comuns em pases ocidentais, a maioria deles no so hereditrios. No entanto existem j duas formas de cancro do clon que foram descritas, e so hereditrias. Em ambos os casos ele resulta do facto de herdar um gene de susceptibilidade ao cancro, que determina uma elevada probabilidade de contrair cancro. A mais comum o Cancro do Clon Hereditrio sem Polipose (HNPCC). A presena destes genes de susceptibilidade ao cancro aumentam igualmente, mas de forma menos significativa, a probabilidade de contrair outros cancros.

Assim como outros cancros, o cancro do clon, resulta de mutaes em genes que regulam a proliferao celular e provocando um crescimento descontrolado dessas clulas. Esporadicamente estas mutaes ocorrem em clulas somticas, no entanto, como era de esperar, em cancro hereditrios elas ocorrem em clulas da linha germinativa. Foi descoberto que cerca de 50% dos casos de HNPCC resulta de mutaes num gene que codifica uma enzima responsvel pela correco do malpareamente de bases durante a transcrio. Este gene em questo homlogo do MutS da E.Coli, e existem ainda outros que so homlogos do MutL, estando igualmente ligados reparao do DNA. Leses nos genes responsveis pela reparao do DNA vo influenciar o aparecimento de outras mutaes em genes diferentes, e que provavelmete iro alterar a proliferao celular, podendo dar origem a cancro.
A identificao dos genes responsveis pelo HNPCC permite, atravs de testes genticos, identificar os indivduos com alto risco. Esta identificao pode ainda ser til na preveno da doenas em indivduos com maior predisposio ou para o diagnostico pr-natal, para casais portadores que pretendam ter filhos. importante um diagnostico precoce, pois com o avanar do cancro as hipteses de sobrevivncia diminuem. No entanto existem frmacos que esto a ser testados, e que podero inibir o desenvolvimento destes cancros.
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Factor de Transcrio Pit-1 e a Deficincia da Hormona do Crescimento

A Doena
A hormona do crescimento uma protena produzida pela glndula pituitria que necessria para um crescimento e desenvolvimento normal. Com uma deficiente produo desta hormona as crianas ficam com uma baixa-estatura. Esta deficincia muitas vezes originada por uma mutao que afecta a produo desta hormona, e geralmente de outras do mesmo grupo.

As deficientes humanas combinadas de hormonas pituitrias lembram fentipos de indivduos anes, que no possuem o tipo de clulas responsveis pela secreo da hormona do crescimento. No entanto foi descoberto que as deficincias humanas combinadas de hormonas pituitrias resultam de uma mutao de um gene responsvel por um factor de transcrio, o Pt-1. Aps novas experiencias verificou-se que este factor no afecta apenas a transcrio da hormona de crescimento, mas sim de todas as hormonas pituitrias.
Crianas com deficincia em hormonas de crescimentos podem ser eficazmente tratadas por injeces desta hormona. At muito recentemente esta hormona apenas era possvel de obter de crebros humanos, no entanto a partir de 1979 foi possvel expressar com sucesso na E.Coli esta hormona de crescimento, passando ser usado para fins clnicos a partir de 1985. Quando esta deficincia em hormonas de crescimento de origem gentica, importante a existncia de testes genticos para um diagnstico mais correcto.
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Antibiticos e Sntese Proteica

A Doena
As bactrias so responsveis por uma ampla variedade de doenas infecciosas potencialmente letais. At 1940 os mdicos no tinham medicamentos para combater estas infeces, at ao aparecimento dos antibiticos, que tornaram curveis muitas doenas at ai letais.

Para ser efectivo clinicamente um antibitico deve matar ou inibir o crescimento de bactrias sem ser txico para humanos. Ento assim sendo, os alvos dos antibiticos esto apenas presentes nas bactrias, e no nas clulas humanas. Por exemplo, a penicilina, inibe a sntese da parede celular bacteriana. Muitos outros antibiticos inibem outros passos na sntese proteica, sendo especficos para os ribossomas.
O uso de medicamentos teve um grande impacto na medicina moderna por permitir curar infeces, que de outra maneira levariam um individuo morte. No entanto mutaes no genoma bacteriano podem levar a uma multiresistencia das bactrias aos antibiticos. Esta situao preocupante pois surgem muitas vezes em hospitais bactrias deste tipo e que levam os mdicos a no encontrar uma maneira rpida e eficaz de controlar as infeces por elas causadas.
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Doena de Gaucher
A Doena
A doena de Gaucher a mais comum das doenas de armazenamento dos lisossomas, que so causadas por uma falha dos lisossomas em degradar substancias que eles normalmente degradam. A acumulao de compostos leva a uma aumento do tamanho e nmero de lisossomas dentro da clula, resultanto falncia das clulas onde isto acontece. Existem trs tipos da doena que diferem na gravidade e no envolvimento do sistema nervoso. A forma mais comum (tipo I), o sistema nervoso no est envolvido; a doena aparece com o aumento do bao e do fgado e o desenvolvimento de leses sseas. As formas mais graves da doena (tipo II e III) so mais raras, sendo a mais devastadora a do tipo II, onde o envolvimento neurolgico detectado logo na infncia e os indivduos morrem precocemente. A doena do tipo III intermediria e caracterizada pelos sintomas neurolgicos por volta dos 10 anos.

A doena de Gaucher causada pela deficincia da enzima lisossomal glicocerebrosidade que catalisa a hidrlise de glicocerebrosdeo para glicose e ceramida. Foram identificadas mais de 30 mutaes responsveis por esta patologia, sendo que a gravidade da doena por ser determinada pela natureza dessas mutaes. A doena do tipo II e III pode ter origem na substituio de uma prolina por uma leucina. Excepto os tipos II e III, a doena de Gaucher apenas detectado nos macrofagos, pois estes so responsveis pela hidrlise de muitos componentes, levando assim a uma grande acumulao de compostos.
Esta patologia pode ser tratada pela terapia de reposio enzimtica, na qual a administrao exgena da enzima utilizada para corrigir o defeito enzimtico. Atravs de diversas experincias descobriu-se que os macrfagos expressam receptores na superfcie celular que ligam resduos de manose em glicoprotenas extracelulares e depois internalizam estas protenas. assim possvel dirigir especificamente a glicocerebrosidade para os macrfagos atravs de modificaes que expusessem os resduos de manose.
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Doenas das Mitocndrias: Neurapatias pticas Heredittia de Leber

A Doena
um doena hereditria que causa a cegueira devido degenerao do nervo ptico. A perda de viso ocorre entre os 15 e os 35 anos, sendo geralmente o ncio sintoma da doena. As mulheres so menos afectadas, o que nos poderia sugerir que uma doena ligada ao sexo, no entanto neste caso os homens nunca transmite a doena. A doena apenas transmitida por via materna, o que nos leva a concluir que uma doena de herena citoplasmtica, visto que o citiplasma resulta quase na sua totalidade do ocito.

Foi identificada nos pacientes com LHON uma mutao no seu DNA mitocndrial que afecta uma das subunidades do complexo I da cadeia transportadora de electres. Foram diagnosticadas outras mutaes nos pacientes com esta doena, no entanto todas elas reduzem a capacidade mitocndrial de realizar fosforilao oxidativa. Os efeitos desta falncia so sentidos nos tecidos mais dependentes de fosforilao oxidativa, como o caso do sistema nervoso, como o caso do nervo ptico. Esta doena est associada s mitocndrias, o que nos faz ter que mudar um pouco os parmetros de intrepertao. Nas nossas clulas possumos diversas mitocndrias com genomas diferentes, por isso possvel que tenhamos a mutao, mas sendo o nmero de mitocndrias mutadas diminuto, a doena no se manifesta.
A identificao das mutaes no DNA mitocndrial pode ser decisiva para o diagnostico precoce de pacientes com historial familiar de LHON. No entanto a identificao da mutao no genoma mitocndrial pouco conclusiva, pois no possvel determinar com certeza de o individuo sofre ou no da patologia, o que contraste com a identificao de mutaes no DNA nuclear. Uma das terapias consiste na terapia metablica, ou seja, administrar substratos ou cofactores da via de fosforilao oxidativa; outra das hipteses seria a terapia gnica, introduzindo um gene saudvel para a protena em falta no DNA nuclear, com a particularidade que essa protena possuiria um sinal que a levaria at mitocndria.
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Distrofia Muscular e Citoesqueleto

A Doena
As distrofias musculares so um grupo de doenas hereditrias caracterizadas por uma perda progressiva de clulas musculares. A distrofia muscular de Duchene (DMD) a mais frequente e grave. Os sintomas aparecem por volta dos 3 a 5 anos, por volta dos 12 anos so confinados a uma cadeira de rodas e poucos so os que ultrapassam a idade adulta dos 20 anos, acabam por morrer com falncia respiratria.

Existe uma maior incidncia em indivduos do sexo masculino, o que nos indica que se trata de uma doena ligada aos cromossomas sexuais; este facto foi confirmado por testes genticos que indicaram que o gene responsvel pela DMD se encontra no cromossoma X. O gene mutado condifica uma protena denominada de distrofina, esta encontra-se ligada membrana das clulas musculares, o que lhes permite resistir ao stress da contraco muscular. Existem mutaes que levam a uma ausncia completa na expressam de distrofina, e outras a uma protena mutada, este factor vai condicionar a gravidade da doena.
A identificao do gene DMD possibilitou o desenvolvimento de testes diagnsticos sensveis. Mulheres portadoras do alelo mutante para este gene podem ser identificadas, e as suas geraes monotorizadas a fim de preceber de houve transmio do alelo mutado. assim possvel identificar em embries in vitro a presena desta mutao, antes que estes sejam implantados no tero da me. A combinao do aconselhamento gentico e o diagnostico pr-natal representa uma medida potencial de preveno de DMD hereditria. Infelizmente a eficincia destes procedimentos limitada pelo facto de que aproximadamente um tero dos doentes de DMD no so hereditrios. assim necessrio desenvolver terapias para os doentes que se encontram nestes casos, e para os restantes que sofrem de DMD hereditria; actualmente existe o esforo para desenvolver uma terapia gentica para restabelecer a produo de distrofina no musculo.
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Fibrose Cstica
A Doena
A fibrose cistca uma doena gentica recessiva que afecta crianas e adultos jovens. a doena hereditria mais comum em brancos, que caracterizada pela produo de um fino muco por vrios tipos de clulas epiteliais, incluindo as que envolvem as vias respiratrias e gastrintestinal. Os primeiros sintomas consistem numa obstruo das vias areas superiores por acumulao de muco e uma consequente infeco bacteriana. As glndulas sudorparas apresentam-se igualmente alteradas, sendo caracterstico uma presena excessiva de sal no suor. Os procedimentos para esta doena incluem terapia fsica para promover drenagem bronquial, administrao de antibiticos e reposio de enzimas pancreticas.

A caracterstica marcante da fibrose cstica um defeito no transporte de Cl nos epitlios afectados. A sequncia que codifica uma protena da famila dos transportadores ABC est mutada, denominada CFTR. Vrios estudos demonstram que a CFTR funciona como um canal de Cle que as mutaes responsveis pelo estabelecimento da fibrose cstica resultam directamente no transporte deficitrio de Cl-.
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O isolamento do gene da fibrose cstica possibilitou identificar os indivduos portadores do alelo mutado; o que juntamente com a compreenso do funcionamento da CFTR como canal de Cl- tem sugerido novas abordagens para o tratamento. Uma das possibilidades a utilizao de drogas que estimulem a abertura dos canais de Cl-; outras das alternativas a terapia gnica com a reposio do gene da CFTR nas clulas afectadas.
100 2007/2008

Sebenta de Biologia Molecular Da Celula

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