Captulo 5.

Crecimiento Microbiano

CAPITULO

Crecimiento microbiano
5.1 Crecimiento de poblaciones 5.2 Curva de crecimiento 5.3 Medidas directas del crecimiento microbiano 5.4 Medidas indirectas del crecimiento microbiano 5.5 Cultivo continuo: Quimiostato 5.6 Efectos ambientales sobre el crecimiento microbiano 5.7 Control del crecimiento microbiano 5.8 Control fsico del crecimiento microbiano 5.9 Control qumico del crecimiento microbiano 5.10 Referencias bibliogrficas

Los filtros de membrana son usados para el conteo de microorganismos.

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El crecimiento es un componente esencial de la funcin microbiana, ya que en la naturaleza cualquier clula tiene un perodo finito de vida y la especie se mantiene como resultado del crecimiento de la poblacin. En la mayora de los procariotas, el crecimiento de una clula individual contina hasta que se divide en dos clulas nuevas, un proceso que se denomina fisin binaria (Figura 5.1). En un cultivo en crecimiento de Escherichia coli, se observa que las clulas se alargan hasta aproximadamente el doble de la longitud de la clula ms pequea y luego forman un tabique que separa la clula en dos clulas hijas. Este tabique se conoce como septo y es el resultado del crecimiento hacia dentro de la membrana citoplasmtica y la pared celular desde direcciones opuestas hasta que las dos clulas hijas se separan. Durante el ciclo de crecimiento, todos los constituyentes celulares aumentan, de modo que cada clula hija recibe un cromosoma completo y suficientes copias de todas las macromolculas, monmeros e iones inorgnicos, para existir como clula independiente. El reparto del ADN replicado entre las dos clulas hijas depende de la unin del ADN a la membrana durante la divisin, y la segregacin real de las dos copias es facilitada por la formacin del septo. 5.1 Crecimiento de poblaciones El crecimiento se define como un aumento en el nmero de clulas microbianas de una poblacin y tambin puede medirse como un incremento de la masa celular. La velocidad de crecimiento es el cambio en el nmero de clulas o en la masa celular experimentado por unidad de tiempo. El intervalo para la formacin de dos clulas a partir de una supone una generacin y el tiempo transcurrido para que esto ocurra se llama tiempo de generacin (tiempo que se requiere para que la poblacin se duplique por lo que tambin se llama tiempo de duplicacin). Los tiempos de generacin varan. Algunas bacterias tienen tiempos de generacin comprendidos entre 1 a 3 horas, unas cuantas crecen muy rpidamente y se dividen en slo 10 minutos mientras que otras requieren de varios das. 5.2 Curva de crecimiento En un sistema cerrado o cultivo en medio no renovado, tambin conocido como cultivo batch o monofsico, se observa una curva de crecimiento tpica en donde se distinguen las fases de latencia, exponencial, estacionaria y de muerte (Figura 5.2). a. Fase de latencia: Cuando se inocula una poblacin microbiana en un medio fresco, por lo general el crecimiento no comienza inmediatamente sino tras un perodo de tiempo que constituye la fase de latencia, la cual puede ser breve o larga dependiendo de la procedencia del cultivo y de las condiciones de crecimiento. b. Fase exponencial: Es una consecuencia de que cada clula se divide para formar dos, cada una de las cuales a su vez forma otras dos y as sucesivamente. El modelo de incremento de la poblacin en el que en cada perodo fijo de tiempo se duplica el nmero de clulas se denomina crecimiento exponencial y una de sus caractersticas es que la velocidad del incremento del nmero de clulas es inicialmente lenta pero aumenta cada vez ms con el tiempo. c. Fase estacionaria: En un sistema de cultivo cerrado o batch, el crecimiento exponencial no se puede prolongar de modo indefinido debido a que un nutriente esencial del medio de cultivo se agota y llega a ser un factor limitante del crecimiento o se acumulan en el medio algunos productos de desecho hasta nivel inhibitorio, alcanzndose la fase estacionaria. No hay aumento ni descenso neto en el nmero de clulas. En algunos casos puede ocurrir un lento crecimiento, pero otras clulas mueren y los dos procesos se equilibran de modo que no hay aumento ni disminucin en el nmero de clulas.

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Figura 5.1 Proceso de divisin binaria de una bacilo.

Figura 5.2 Curva de crecimiento bacteriano.

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d. Fase de muerte: Si la incubacin prosigue despus que la poblacin alcanz la fase estacionaria, las clulas pueden continuar vivas y metablicamente activas, pero tambin pueden morir. Si ocurre esto ltimo se dice que la poblacin est en fase de muerte que en algunos casos se puede acompaar de lisis celular. 5.3 Medidas directas del crecimiento microbiano: recuento de clulas totales y viables El crecimiento de poblaciones se mide estimando los cambios en el nmero de clulas a travs del recuento de clulas totales y recuento de clulas viables. El recuento directo de clulas o recuento de clulas totales se puede hacer en muestras secas en porta objetos o en muestras lquidas; sin embargo, no se pueden distinguir las clulas vivas de las muertas; las clulas pequeas son difciles de ver en el microscopio y algunas posiblemente se pierden en el recuento; en ocasiones la precisin es difcil y el mtodo no es adecuado para suspensiones con baja densidad celular (Figura 5.3). En el recuento de clulas viables o clulas capaces de dividirse y originar una descendencia se cuenta el nmero de clulas de la muestra que es capaz de formar colonias sobre un medio slido adecuado. Por esta razn, el recuento de clulas viables tambin es llamado recuento en placa o recuento de colonias y se puede realizar a travs de los mtodos de extensin en placa y vertido en placa. En este procedimiento se supone que cada clula viable forma una colonia (Figuras 5.4 y 5.5). 5.4 Medidas indirectas del crecimiento microbiano : Turbidez Un mtodo muy rpido y til de obtener estimaciones del nmero de clulas es la medida de la turbidez. Una suspensin celular aparece turbia porque las clulas dispersan la luz que atraviesa la suspensin. Cuanto ms clulas estn presentes, mayor ser la luz dispersada y, por tanto mayor la turbidez (Figura 5.6). La turbidez puede medirse con aparatos como el fotmetro y espectrofotmetro que hacen pasar la luz a travs de suspensiones celulares y detectan la cantidad de luz emergente no dispersada. Ambos instrumentos se diferencian en que un fotmetro emplea un filtro simple para generar luz incidente en longitud de onda relativamente corta, mientras que un espectrofotmetro emplea un prisma o red de difraccin para generar luz incidente en una banda muy estrecha de longitud de onda.

Figura 5.3 Contaje de clulas totales utilizando cmara de Neubauer.

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Figura 5.4 Mtodos para realizar contaje de clulas viables.

Figura 5.5 Procedimiento para contar clulas viables utilizando diluciones de la muestra.

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Figura 5.6 Turbidez: determinacin de la masa microbiana por la medida de absorcin de luz. 5.5 Cultivo continuo: Quimiostato Cultivo continuo es un sistema abierto, con volumen constante al que se aade continuamente medio fresco y del que se retira continuamente medio con clulas a una velocidad constante. Una vez que se alcanza el equilibrio en el sistema, el nmero de clulas y el estado metablico permanecen constantes y se dice entonces que el sistema est en equilibrio (Figura 5.7). El aparato ms comn que se utiliza para obtener un cultivo continuo es el quimiostato, que controla la densidad de la poblacin celular y la velocidad de crecimiento del cultivo de modo independiente. En el quimostato se puede obtener cualquier velocidad de crecimiento deseada simplemente variando la velocidad de dilucin y anlogamente la densidad de poblacin puede definirse variando la concentracin de un nutriente conocido como factor limitante. Si se eleva la concentracin de este nutriente en el medio entrante, manteniendo la velocidad de dilucin, la densidad celular aumentar.

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Figura 5.7 Esquema de un sistema de cultivo continuo: quimiostato.

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Efectos ambientales sobre el crecimiento microbiano a. Temperatura La temperatura es uno de los factores ms importantes que afectan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos. Para cada organismo existe una temperatura mnima por debajo de la cual no es posible el crecimiento, una temperatura ptima a la que se produce el crecimiento ms rpido, y una temperatura mnima por encima de la cual no es posible el crecimiento. La temperatura ptima est siempre ms cerca de la mxima que de la mnima. Estas tres temperaturas denominadas temperaturas cardinales o fundamentales son caractersticas de cada tipo de microorganismo pero no son completamente fijas y pueden ser ligeramente modificadas por otros factores del ambiente, en particular por la composicin del medio. Con relacin a la temperatura ptima se distinguen cuatro grupos de microorganismos: psicrfilos, con temperaturas ptimas bajas (Polaromonas vacuolata, 4 C), mesfilos, con temperaturas ptimas moderadas (Escherichia coli, 39C); termfilos con temperaturas ptimas elevadas (Bacillus stearothermophilus, 60 C) e hipertermfilos con temperaturas ptimas muy elevadas (Thermocossus celer, 88 C, Pyrolobus fumarii, 106 C). Los microorganismos cuyos hbitats pueden ser extremadamente calientes o fros se conocen como extremfilos. Un organismo psicrfilo es definido como un organismo que tienen una temperatura ptima de crecimiento de 15 C o inferior, una temperatura mxima por debajo de 20 C y una mnima de 0C o ms baja. Los organismos que crecen a 0 C pero tienen temperaturas ptimas de 20 a 40 C se llaman psicrotolerantes. Los microorganismos cuya temperatura ptima est por encima de 45 C (45 a 80 C) se llaman termfilos y aquellos cuya temperatura ptima est por encima de 80 C son los hipertermfilos. Estos microorganismos ofrecen importantes ventajas en procesos industriales y biotecnolgicos. Las enzimas de microorganismos termfilos e hipertermfilos catalizan reacciones a temperaturas elevadas y por ser ms estables que las de los mesfilos, la vida media de estas preparaciones enzimticas es ms prolongada. Un ejemplo de enzima termorresistente es la ADN polimerasa aislada del termfilo Thermus aquaticus, y conocida como Taq polimerasa. Se usa para la automatizacin de los pasos repetitivos que tienen lugar en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para la amplificacin de secuencias especficas de ADN. b. pH Cada organismo tienen un rango de pH dentro del cual es posible el crecimiento y normalmente posee un pH ptimo bien definido. La mayora crece en un margen de pH de 2 a 3 unidades. Generalmente los ambientes tienen un valor de pH entre 5 a 9, y los organismos con pH ptimo de este orden son los ms comunes. Los organismos que crecen mejor a pH bajo constituyen un tipo de extremfilos llamados acidfilos. El grupo de los hongos son ms acidfilos que las bacterias. Muchos hongos crecen de forma ptima a pH 5 o inferior e incluso algunos crecen bien a pH 2. Algunas bacterias tambin son acidfilas: Thiobacillus y algunos gneros de Archaea como Sulfolobus, Ferroplasma y Thermoplasma. Unos cuantos extremfilos presentan un pH ptimo de crecimiento muy elevado, a veces tan alto como pH 10 y se denominan alcalfilos. Algunos tienen aplicaciones industriales porque producen enzimas hidrolticas como proteasas y lipasas que funcionan a pH alcalino y se usan como aditivos de los detergentes domsticos.

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c. Actividad de agua El agua es el solvente de la vida. La disponibilidad de agua no slo es funcin del contenido que est presente en un medio, es decir, de la humedad o sequedad de un determinado hbitat, sino que tambin depende de la concentracin de solutos, como sales, azcares y otras sustancias que pueden estar presentes en el agua. La disponibilidad de agua se expresa en trminos fsicos como actividad de agua (a w) y es el cociente entre la presin de vapor del aire en equilibrio con una sustancia o solucin y la presin de vapor del agua pura a la misma temperatura. Los valores de a w varan entre 0 y 1 (actividad de agua de terrenos agrcolas: 0,90 a 1; Streptococus y Escherichia en sangre: 0,995; Pseudomonas y Vibrio en agua de mar : 0,980; Penicillum en pastel : 0,800; Halococcus en pescado salado : 0,750). El agua difunde desde una regin con alta concentracin (baja concentracin de solutos) hasta una regin con menor concentracin de agua (mayor concentracin de solutos) per el proceso denominado smosis. En la mayora de los casos el citoplasma tiene una concentracin de solutos mayor que el medio, por lo que el agua tiende a entrar en la clula, dicindose entonces que existe un balance de agua positivo; sin embargo, cuando una clula est en un medio con baja actividad de agua, existe una tendencia del agua a salir de la clula. El agua de mar contiene aproximadamente 3 % de cloruro de sodio adems de pequeas cantidades de minerales y elementos. Los microorganismos marinos tienen una dependencia del ion sodio, adems de tener un crecimiento ptimo al valor de actividad de agua propio del agua de mar. Tales microorganismos se llaman halfilos discretos y halfilos moderados, con requerimientos bajos (1- 6 %) y moderado (6-15 %) de NaCl respectivamente. La mayora de microorganismos son incapaces de existir en ambientes con actividad de agua muy baja y mueren, o se deshidratan y pasan a un estado de latencia en tales circunstancias. Los organismos halotolerantes (Staphylococcus aureus) pueden soportar alguna reduccin en el valor de aw del medio, pero generalmente crecen mejor en ausencia de solutos aadidos. Por el contrario, algunos organismos se desarrollan con muy baja actividad de agua, y stos son de gran inters desde el punto de vista aplicado en la industria alimentaria, donde solutos como la sal y sacarosa se emplean frecuentemente como conservantes para inhibir el crecimiento microbiano. Los organismos capaces de crecer en ambientes muy salinos se llaman halfilos extremos (Halobacterium salinarium) y segn la especie requieren 15 a 30 % de NaCl para su crecimiento ptimo. Los organismos capaces de crecer con alta concentracin de azcares se denominan osmfilos y aquellos que pueden crecer en ambientes muy seos se llaman xerfilos. d. Oxgeno Los microorganismos son muy variados en cuanto a la necesidad o tolerancia al oxgeno. Los aerobios (Micrococcus luteus) son especies capaces de crecer a tensiones de oxgeno normales (21 % del aire es oxgeno). Los microaeroflicos, (Spirillum volutans) son aerobios que pueden usar el oxgeno, slo cuando est presente en niveles ms bajos que en el aire. Muchos aerobios son facultativos (Escherichia coli), lo que significa que en condiciones nutritivas y de cultivo apropiadas pueden crecer tanto en condiciones aerobias como anaerobias.

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Algunos microorganismos no pueden respirar oxgeno y se les llama anaerobios, distinguindose dos clases: los anaerobios aerotolorenates (Streptococcus pyogenes), que crecen en su presencia aunque no pueden usarlo y los anaerobios estrictos (Methanobacterium formicium) que son inhibidos o incluso mueren en su presencia. Para conocer cules son los requerimientos de oxgeno de un microorganismo en laboratorio, se aade a un medio caldo de tioglicolato un agente reductor tioglicolato, capaz de reaccionar con el oxgeno y reducirlo (agua). Despus que el tioglicolato reacciona con el oxgeno a lo largo del tubo, el oxgeno atmosfrico slo puede penetrar en la parte superior donde el medio contacta con el aire. Los aerobios estrictos crecern slo en la parte superior del tubo, los facultativos crecern en todo el tubo, pero con preferencia en la parte superior. Los microaeroflicos lo harn cerca del extremo superior, pero no en la superficie del tubo y los anaerobios crecern fundamentalmente cerca del fondo del tubo, donde el oxgeno no penetra (Figura 5.8). Es frecuente aadir al medio un colorante indicador redox como la resarzurina, que cambia de color en presencia de oxgeno y por lo tanto seala el grado de penetracin del oxgeno en el medio de cultivo.

Aerobio estricto

Facultativo

Aerotoloerante anaerobio

Anaerobio estricto

Microaerfilo

Figura 5.8 Oxgeno y crecimiento bacteriano El oxgeno es un poderoso oxidante y un aceptor de electrones en la respiracin. En estado basal normal se llama triplete de oxgeno; sin embargo, una forma txica importante es el singlete de oxgeno, en la que la capa electrnica externa que rodea al ncleo es muy reactiva y capaz de llevar a cabo oxidaciones indeseables en la clula. Otras formas altamente txicas son el anin superxido (02-), el perxido de hidrgeno (H202) y el radical hidroxilo (OH-), cada uno de los cuales se produce durante la reduccin del oxgeno hasta agua en la respiracin. Frente a estas formas txicas los organismos han desarrollado enzimas que los destruyen como las catalasas y peroxidasas, superxido dismutasas y superxido reductasas.

5.7 Control del crecimiento microbiano El control de microorganismos puede realizarse limitando su crecimiento, proceso llamado inhibicin o destruyendo los organismos por esterilizacin, muerte o eliminacin de todos los organismos viables de un medio de cultivo. Los agentes que destruyen o matan bacterias son bactericidas.

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En la prctica, a veces la esterilidad no se puede alcanzar, pero en muchos casos se puede inhibir el crecimiento rpido de los microorganismos mediante mtodos de descontaminacin y desinfeccin. Los agentes que inhiben el crecimiento bacteriano se dice que son bacteriostticos. Las medidas de control de los microorganismos son la descontaminacin, desinfeccin y esterilizacin.

5.8 Control fsico del crecimiento microbiano Los mtodos fsicos se usan a menudo para lograr la descontaminacin microbiana, la desinfeccin y la esterilizacin. El calor, la radiacin y la filtracin son mtodos estndar que se emplean para destruir o eliminar microorganismos no deseables. a. Esterilizacin por calor Los microorganismos son eliminados con vapor de agua bajo presin en el autoclave (1,1 kilogramos / centmetro cuadrado o 15 libras por pulgada de presin de vapor, lo que permite alcanzar una temperatura de 121 C. El tiempo de esterilizacin es de 15 a 20 minutos. No es la presin del autoclave lo que mata a los microorganismos, sino la elevada temperatura que puede alcanzar cuando el vapor de agua se somete a presin.

b. Pasteurizacin La pasteurizacin es un proceso que reduce la poblacin microbiana en leche y otros alimentos sensibles al calor. Impide la transmisin de patgenos como algunas especies de Salmonella y Escherichia coli 0157:H7 a travs de fuentes comunes como leche y zumos. La pasteurizacin tambin impide el crecimiento de organismos alterantes e incrementa considerablemente la vida media de los lquidos perecederos. La pasteurizacin de la leche se realiza a 71 C durante 15 segundos, seguida de un enfriamiento rpido (pasteurizacin alta). Tambin se puede realizar a 63-66 C durante 30 minutos (pasteurizacin baja), aunque el proceso es menos satisfactorio porque la leche debe mantenerse a temperaturas altas por largos perodos de tiempo.

c. Esterilizacin por radiacin En condiciones apropiadas, la radiacin electromagntica (microondas, radiacin ultravioleta, rayos x, radiaciones gamma y electrones) controla eficazmente el crecimiento microbiano. La radiacin ultravioleta no penetra las superficies slidas, opacas, absorbentes de luz y su utilidad se limita a la desinfeccin de las superficies expuestas, aire y agua. La radiacin ionizante penetra los materiales absorbentes slidos o ligeros y es muy eficaz para esterilizar y descontaminar. La radiacin ha sido aprobada por la Organizacin Mundial de la Salud como medida de descontaminacin para alimentos particularmente susceptibles de contaminacin microbiana, como especias y productos crnicos frescos (hamburguesas y pollo) y est aprobada para la descontaminacin de carne molida.

d. Filtracin La esterilizacin por filtracin consiste en la eliminacin de microorganismos vivos en muestras lquidas. Los filtros de membrana se utilizan generalmente para esterilizar volmenes pequeos de muestras termosensibles en el laboratorio.

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5.9 Control qumico del crecimiento microbiano Un agente antimicrobiano es un compuesto qumico, natural o sinttico, que mata o inhibe el crecimiento de los microorganismos. Los agentes que matan se denominan agentescida, con un prefijo que indica el tipo de microorganismo que mata. As tenemos, agentes bactericidas, fungicidas y viricidas. Un agente bactericida mata bateras, aunque puede matar o no otros microorganismos. Los agentes que no matan pero inhiben el crecimiento se denominan agentesestticos, as se habla de agentes bacteriostticos, fungistticos y virustticos. Los antispticos son aquellos agentes qumicos que matan o inhiben el crecimiento de los microorganismos y pueden aplicarse en tejidos vivos dada su escasa toxicidad .La mayora de los compuestos que se encuentran en esta categora se utilizan en el lavado de manos para tratar heridas superficiales. Los desinfectantes son productos qumicos que matan microorganismos y se usan en objetos inanimados. Los agentes esterilizantes son desinfectantes que en condiciones apropiadas, matan todos los tipos de vida microbiana, y se usan para esterilizar objetos inanimados y superficies. Los desinfectantes qumicos frecuentemente denominados microbicidas tienen una gran aplicacin en los casos en donde no se puede usar calor o radiacin. La esterilizacin fra se lleva a cabo en dispositivos cerrados parecidos a los autoclaves, pero emplean un agente qumico como el xido de etileno, formaldehido, cido per-actico o perxido de hidrgeno. El agua se desinfecta con leja o con derivados de cloro, a fin de eliminar los organismos potencialmente patgenos.

5.10 Referencias bibliogrficas Schlegel, H. (1997). Microbiologa General (9.ed.). Espaa: Ediciones Omega, S.A. Madigan, M.; Martinko, J. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los Microorganismos (10. ed.) Madrid, Espaa: Parson Educacin, S.A. Prescott, L, Harley J., y Klein, D. (1999). Microbiologa. Espaa: McGraw Hill Interamericana.

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