1. OBJETIVOS Extraer el ADN de una muestra vegetal (tomate) y una fruta (pltano). 2.

FUNDAMENTO TEORICO El cido desoxiribonucleico o ADN (DNA) es la molcula que guarda el cdigo gentico de todas las clulas. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el DNA como vehculo de su cdigo gentico. Muchas de las tcnicas de biologa molecular incluyen algn tipo de manipulacin del material gentico. Estos procedimientos han logrado adelantar hasta tal grado el conocimien-to del cdigo gentico, que ya es posible clonar organismos enteros. Los procedimientos iniciales eran largos y tediosos y podan pasar varios das antes de saber con certeza que se haba logrado obtener DNA en calidad y cantidad suficiente para poder manipularlo. Adems algunos de los reactivos usados para estos procesos son txicos y mutagnicos. Hoy da podemos obtener suficiente DNA de buena calidad en unas horas. Los cidos nucleicos estn siempre asociados con protenas, de all que una vez hecha la ruptura de las clulas se proceda a la desproteinizacin. Esta puede realizarse agitando suavemente la mezcla cido nucleico-proteina con una solucin de fenol y/o una mezcla de cloroformo-alcohol isoamlico a fin de precipitar las proteinas, la que se remueven por centrifugacin. Las proteinas pueden tambin disociarse de los cidos nucleicos con detergentes, cloruro de guanidina o altas concentraciones salinas, pueden tambin degradarse mediante proetasas, tal como la pronasa. Se obtiene as una mezcla de RNA y DNA que puede aislarse precipitando con etanol. El RNA se recupera de estos precipitados tratndolo con DNAsa pancretica para eliminar el DNA, y el DNA puede liberarse del RNA tratando el precipitado con RNasa. El DNA y RNA pueden tambin separase por ultracentrifugaciones. En todo este proceso y las maniulaciones subsecuentes, los cidos nucleidos deben protegerse de la accin degradativa de las nucleasas. Estas pueden inhibirse por agentes quelantes como el EDTA que secuestra los iones metlicos divalentes que son esenciales para la actividad de las nucleasas. Los cidos nucleicos son generalmente de ms fcil

manipulacin que las protenas por carecer, en la mayora de los casos, de estructura terciaria, hacindolas ms tolerantes a condiciones extremas. 3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL a. Se tritur la muestra con un poco de agua destilada en el mortero. b. Se tamiz el triturado celular en un recipiente limpio. Se tom 5 ml del triturado celular tamizado en un recipiente limpio y se agreg 5 ml del tampn fro. Se agit vigorosamente durante 2 minutos. c. Se tom 5 ml de la suspensin molecular en un tubo de ensayo (el sobrenadante) y se aadi 5 ml de alcohol isoamlico a 0C. d. Se dejo reposar e. Se realiz los pasos a, b, c y d, para el pltano. 4. OBSERVACIONES Y DATOS TABULADOS FALTA 5. RESULTADOS Y CALCULOS Muestra 1: Tomate Muestra 1, despus de agregar alcohol

Despus de 5 minutos de reposo:

Muestra 2: Pltano Muestra 2, despus de agregarle alcohol

Muestra 2, despus de 5 minutos de reposo

6. DISCUSIN La extraccin de ADN empieza cuando se rompen las clulas mediante un detergente, vertiendo a este contenido molecular una disolucin tampn. El tampn ahora contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN, de gran longitud, se fraccionan en cadenas ms pequeas y separadas de l por accin del detergente. El alcohol se utiliza para precipitar el ADN que es soluble en agua pero, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. 7. CONCLUSIONES La extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al ncleo de la clula. A continuacin debe romperse tambin la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por ltimo hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol. 8. BIBLIOGRAFA

FALTA

10.CUESTIONARIO 1. Cul es la funcin del cloruro de sodio, detergente, alcohol isoamilico? a. Cloruro de Sodio: El NaCl tiene como funcin de proteger y guardar el ADN. b. Detergente (shampoo): El detergente es utilizado para realizar una mezcla homognea de los tejidos utilizados. c. Alcohol Isoamlico: El ADN se precipita en el alcohol fuera de la solucin, donde puede ser visto. Adems de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solucin acuosa. 2. Cul es la funcin del detergente sobre la membrana celular? La funcin del detergente sirve para romper la membrana plasmtica y nuclear e incluso la pared celular. 3. Por qu el ADN precipita en alcohol? El alcohol se utiliza para precipitar el ADN que es soluble en agua pero, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. 4. Por qu se debe trabajar a bajas temperaturas? A menor temperatura menor solubilidad. El ADN es muy poco soluble en alcohol, y menos aun en alcohol frio, por lo que precipita ms rpido. 5. Por qu el azul de metileno tie las fibras del ADN? El azul de metileno tie el ADN, porque este posee un grupo fosfato en su estructura. 6. Qu otros colorantes que pueden ser utilizados para teir las fibras de ADN? Se puede utilizar el verde de metilo para teir las fibras del ADN.

7. Explique, cmo se puede determinar la concentracin del ADN. Para determinar la concentracin del ADN obtenido, se puede utilizar el siguiente procedimiento: a. Diluir 20 ml de muestra de DNA en 980 ml de agua desionizada y esteril (dilucin 1/50) b. Medir absorbancia a 260 nm usando cubetas de 1 ml, que puedan usarse a luz ultravioleta. c. La concentracin de DNA a A260 = 1.0 en una cubeta de 1 cm equivale a 50 mg de DNA por ml de agua. Para calcular la concentracin de la muestra: [DNA] = 50 mg / ml x A260 x factor de dilucin (50) [DNA total] = [DNA] x volumen eludo en ml