JOO RICARDO MALERES ALVES COSTA

PADRONIZAO DE METODOLOGIAS PARA O USO DE BIOMARCADORES DE CONTAMINAO AMBIENTAL EM TRARA (Hoplias malabaricus, ERYTHRINIDAE): -ALAd, metalotionena e vitelogenina
Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular, Departamento de Biologia Celular, Setor de Cincias Biolgicas da Universidade Federal do Paran, como requisito parcial para obteno do ttulo de Doutor em Cincias Biolgicas com rea de Concentrao em Biologia Celular e Molecular. Orientador: Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro Co-orientadora: Prof. Dr. Helena Cristina da Silva de Assis

CURITIBA 2006

TERMO DE APROVAO

Esta tese dedicada Cincia Pura de outrora (episteme), apoltica, imparcial, no corrutvel, ou seja, objeto conceitual sem referentes materiais, quase inexistente, e em extino na grande maioria das mentes humanas.

AGRADECIMENTOS
a meu prezado orientador, no Dep.to de Biologia Celular, UFPR, Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro, a minha querida co-orientadora, no Dep.to de Farmacologia, UFPR, Prof.a Dr.a Helena Cristina da Silva de Assis, os meus mais sinceros agradecimentos pela confiana e amizade incondicionais; a meu colega de profisso e do Programa de Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular, Francisco Filipak Neto, M.Sc., que com sua mente brilhante de cientista nato, me ajudou, me orientou e me ensinou aspectos e tcnicas imprescindveis para a realizao desta tese. a minha famlia, meu adorvel filho, Caiman Arajo Alves Costa, minha esposa, Samanta Luiza de Arajo, M.Sc. pela compreenso e condescendncia a respeito do tempo que deixei de estar com eles; ao ilustre Prof. Marco Antonio Ferreira Randi, M.Sc., por ser um paulista de personalidade divertida e por sua grande vocao docncia, o que por anos vem instigando mentes e dando alguma esperana a estudantes inteligentes desta academia, mesmo frente s inmeras adversidades que so bices para o desenvolvimento da Pesquisa e da Universidade Pblica brasileiras. Outrossim, sou grato a todos da UFPR que de alguma forma tambm me ajudaram na realizao desta tese: toda a equipe do Lab.o Toxicologia Celular, Dep.to Biologia Celular, SCB. Em especial, Alberto Katsumiti, revelado um verdadeiro amigo em situaes muito desfavorveis. nos Lab.os Central e de Toxicologia, Dep.to de Farmacologia, SCB, respectivamente: Silvia C. Genrio, Prof. Dr. Paulo Roberto Dalsenter, por cederem o espao fsico e o tempo, ambos pblicos, mesmo que a contragosto de seus colegas. Prof. Dr. Silvio Marques Zanata, e sua competente equipe de pesquisadores, da nata, por sua constante disponibilidade orientao cientfica no oficial, at mesmo no corredor. no Ncleo de Fixao Biolgica do Nitrognio, Dep.to Bioqumica, SCB: Luiza Maria de Arajo, M.Sc., pelos ensinamentos tcnicos de biologia molecular, mesmo sob o risco intenso de repreenso inapta, desnecessria, no profissional e devida ao acirrado corporativismo departamental, daquela instituio pblica inarmoniosa. Um grande abrao a toda equipe de Funcionrios do Biotrio do SCB, UFPR, em especial a Antonio Luiz de Andrade, pela importante ajuda na conteno dos coelhos, inoculao do imungeno e coletas de sangue. Agradeo finalmente: Ao PARQUE ECOLGICO COSTA, Curitiba e PISCICULTURA GUAS VERDES, Araucria, por disponibilizarem os exemplares de animais para pesquisa cientfica. Ao PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR da UFPR, Ministrio da Educao. Ao CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTFICO E TECNOLGICO, Ministrio da Cincia e Tecnologia, pelo apoio financeiro.

E o vento no tocar as flores porque elas esto no viscoso limbo da manifestao material do dio que faz o homem sujar suas guas.

SUMRIO
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................................... viii LISTA DE GRFICOS ................................................................................................................... viii LISTA DE TABELA E QUADRO..................................................................................................... ix LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS ............................................................... ix RESUMO............................................................................................................................................... x ABSTRACT.......................................................................................................................................... xi INTRODUO GERAL ..................................................................................................................... 1 1 O USO DE BIOMARCADORES EM PEIXES ............................................................................ 1 2 HOPLIAS MALABARICUS COMO MODELO EXPERIMENTAL................................................... 6 3 INTERAES ENTRE BIOMARCADORES ............................................................................. 9 CAPTULO I: BIOMARCADORES NO SANGUE DE TRARA................................................ 23 I.1 INTRODUO............................................................................................................................ 24 I.1.1 INIBIO DA -AMINOLEVULINATO DESIDRATASE...................................................... 24 I.1.2 PARMETROS HEMATOLGICOS ....................................................................................... 26 I.2 MATERIAIS E MTODOS ....................................................................................................... 28 I.2.1 BIOENSAIOS............................................................................................................................. 28 I.2.1.1 Experimento I.......................................................................................................................... 29 I.2.1.2 Experimento II ........................................................................................................................ 29 I.2.2 QUANTIFICAO DA ATIVIDADE DA -ALAd ERITROCITRIA .................................... 30 I.2.2.1 Anlises Estatsticas para -ALAd ........................................................................................ 32 I.2.3. PARMETROS HEMATOLGICOS ...................................................................................... 33 II.2.3.1 Anlises Estatsticas para os Parmetros Hematolgicos .................................................. 34 I.3 RESULTADOS ............................................................................................................................ 35 I.3.1. ATIVIDADE DA -ALAd ERITROCITRIA ........................................................................... 35 I.3.2 PARMETROS HEMATOLGICOS ....................................................................................... 39 I.4 DISCUSSO ................................................................................................................................ 40 CAPTULO II: TEORES TECIDUAIS DE METALOTIONENA EM TRARA...................... 48 II.1 INTRODUO .......................................................................................................................... 49 II.2 MATERIAIS E MTODOS...................................................................................................... 51 II.2.1 BIOENSAIO............................................................................................................................... 51 II.2.2 QUANTIFICAO INDIRETA DE MT.................................................................................. 51 II.2.3 ANLISE ESTATSTICA ........................................................................................................ 53 II.3 RESULTADOS .......................................................................................................................... 53 II.4 DISCUSSO .............................................................................................................................. 56 CAPTULO III: ESTUDOS COM A VITELOGENINA DE TRARA ........................................ 59 III.1 INTRODUO......................................................................................................................... 60 III.1.1 EXPRESSO DA VTG COMO BIOMARCADOR MOLECULAR ........................................ 60 III.1.2 NDICE VITELOGNICO ..................................................................................................... 62 III.1.2.1 IVTG para Populaes Naturais.............................................................................................. 63 III.1.2.2 IVTG para a Vitelognese, com Fmeas como Controle Referencial (IVTGf) ........................... 66 III.1.2.3 IVTG para Bioensaios de Induo Experimental da VTG (IVTGe) ........................................... 68 III.1.2.4 IVTG para Ensaios in vitro de Estrogenicidade (IVTGh)........................................................... 69 III.1.2.5 Consideraes Gerais dos ndices ....................................................................................... 71 III.2 MATERIAIS E MTODOS .................................................................................................... 73 III.2.1 PRODUO DA VTG IN VIVO POR INDUO ESTROGNICA .................................... 73 III.2.1.1 Bioensaio............................................................................................................................... 73 III.2.1.2 Isolamento da VTG Plasmtica por Precipitao............................................................... 74 III.2.2 ANTICORPOS POLICLONAIS PARA A IMUNO-DETECO .......................................... 75 III.2.2.1 Produo de Anti-Soro contra VTG de Hoplias malabaricus (HOPL) .............................. 75 III.2.2.2 Imuno-Deteco por Western Blot ....................................................................................... 76

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III.2.3 EFEITO DO CHUMBO SOBRE A EXPRESSO DA VTG IN VIVO .................................. 77 III.2.4 CULTIVO PRIMRIO DE HEPATCITOS E INDUO IN VITRO ................................ 78 III.2.4.1 Isolamento e Cultivo Primrio de Hepatcitos................................................................... 78 III.2.4.2 Induo Experimental da VTG in vitro .............................................................................. 79 III.3 RESULTADOS......................................................................................................................... 82 III.3.1 INDUO DA EXPRESSO DA VTG IN VIVO .................................................................. 82 III.3.2 EFEITO DO CHUMBO SOBRE A EXPRESSO DA VTG IN VIVO .................................. 82 III.3.3 ESTROGENICIDADE IN VITRO .......................................................................................... 86 III.3.3.1 Anlises das Amostras de Meio de Cultivo......................................................................... 86 III.3.3.2 Anlises das Amostras de Hepatcitos do Macho (HPs) ................................................. 89 III.3.4 APLICAO DO IVTG PARA ESTROGENICIDADE IN VITRO........................................... 91 III.4 DISCUSSO............................................................................................................................. 95 CONCLUSES GERAIS ................................................................................................................ 102 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................................................... 106 APNDICE 1 PROTOCOLO EMPREGADO PARA QUANTIFICAO DA ATIVIDADE DA -ALAd ERITROCITRIA ....................................................... 117 APNDICE 2 PROTOCOLO EMPREGADO PARA QUANTIFICAO INDIRETA DA METALOTIONENA EM BRNQUIAS E FGADO DE PEIXES ..................... 118 APNDICE 3 PROTOCOLO EMPREGADO PARA O ISOLAMENTO DA VTG PLASMTICA POR PRECIPITAO........................................................................................... 119 APNDICE 4 PROTOCOLO EMPREGADO PARA SDS-PAGE, WESTERN BLOTTING E IMUNO-DETECO ............................................................................................ 120 ANEXO 1 ESTUDOS COM A -ALAd DE PEIXES ..................................................................... 121

LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 INTERAES MOLECULARES ENTRE ALGUMAS RESPOSTAS BIOMARCADORAS UTILIZADAS EM PEIXES ....................................................... 11 FIGURA 2 ROTA DE SNTESE DO GRUPO HEME ................................................................... 12 FIGURA 3 ESPCIES REATIVAS DE OXIGNIO (PARCIALMENTE REDUZIDAS ............. 17 FIGURA 4 AO CATALTICA DA GLUTATIONA PEROXIDASE.......................................... 18 FIGURA 5 AO ESQUEMTICA DO COMPLEXO CITOCROMO P450 ................................ 19 FIGURA 6 ELETROFORESE DESNATURANTE EM GEL DE POLIACRILAMIDA PARA ANLISE DA VITELOGENINA PLASMTICA DE HOPLIAS MALABARICUS .......... 83 FIGURA 7 EFEITO AGUDO DO Pb++ IN VIVO (96 HORAS) SOBRE A PRODUO DE VITELOGENINA PLASMTICA DE HOPLIAS MALABARICUS, APS 15 DIAS DE INDUO COM 17-ESTRADIOL (E2) ..................................................................... 84 FIGURA 8 IMUNO-DETECO DA VITELOGENINA PRODUZIDA EM CULTIVO PRIMRIO DE HEPATCITOS DE HOPLIAS MALABARICUS (ANTI)ESTROGENICIDADE IN VITRO.................................................................... 87 FIGURA 9 ANLISE DO MEIO DE CULTIVO PRIMRIO DE HEPATCITOS DE HOPLIAS MALABARICUS ................................................................................................................. 88 FIGURA 10 ANLISE PILOTO DO MEIO DE CULTIVO PRIMRIO DE HEPATCITOS DE HOPLIAS MALABARICUS FMEA................................................................................. 88 FIGURA 11 ANLISE DAS CLULAS DO CULTIVO PRIMRIO DE HEPATCITOS DE HOPLIAS MALABARICUS MACHO, APS DEZ DIAS DE CULTIVO ........................ 90 FIGURA 12 NDICE VITELOGNICO PARA ENSAIOS IN VITRO DE ESTROGENICIDADE (IVTGh): APLICAO DA EQUAO (11) ................................................................ 94

LISTA DE GRFICOS
GRFICO 1 CURVA DE SATURAO DE SUBSTRATO (-ALA) PARA A -ALAd ERITROCITRIA DE HOPLIAS MALABARICUS ......................................................... 37 GRFICO 2 ATIVIDADE DA -ALAd ERITROCITRIA DE HOPLIAS MALABARICUS EM FUNO DA TEMPERATURA DE INCUBAO ................................................. 37 GRFICO 3 INIBIO DA ATIVIDADE DA -ALAd ERITROCITRIA DE TRARA (HOPLIAS MALABARICUS) EXPOSTAS POR VIA TRFICA AO Pb++ E AO H3C-Hg+, POR 70 DIAS (14 DOSES) ...................................................................................................... 38 GRFICO 4 CURVA PADRO (REGRESSO LINEAR) DE CONCENTRAES DE GLUTATIONA ([GSH]) USADA COMO REFERNCIA NA QUANTIFICAO DAS AMOSTRAS DE FGADO DE HOPLIAS MALABARICUS, POR INTERPOLAO.............................................................................................. 54 GRFICO 5 TEORES TECIDUAIS DE SULFIDRILA (nmol de SH) POR UNIDADE DE MASSA DA AMOSTRA DE FGADO (g) DE HOPLIAS MALABARICUS EM INDIVDUOS EXPOSTOS A 75 ng H3C-Hg+.g-1 DE BIOMASSA, POR 70 DIAS (14 DOSES) ................................................................................................................ 54 GRFICO 6 CURVA PADRO (REGRESSO LINEAR) DE CONCENTRAES DE GLUTATIONA ([GSH]) USADA COMO REFERNCIA NA QUANTIFICAO DAS AMOSTRAS DE BRNQUIAS DE HOPLIAS MALABARICUS, POR INTERPOLAO ...................................................................................................... 55 GRFICO 7 TEORES TECIDUAIS DE SULFIDRILA (nmol de SH) POR UNIDADE DE MASSA DA AMOSTRA DE BRNQUIA (g) DE HOPLIAS MALABARICUS EM INDIVDUOS EXPOSTOS A 75 ng H3C-Hg+.g-1 DE BIOMASSA, POR 70 DIAS (14 DOSES) ................................................................................................................ 55 GRFICO 8 CITOMETRIA DE FLUXO APS EXPERIMENTOS IN VITRO........................... 93

LISTA DE TABELA E QUADRO

TABELA 1 PARMETROS HEMATOLGICOS ANALISADOS EM HOPLIAS MALABARICUS APS EXPOSIO TRFICA S DOSES DE 75 ng H3C-Hg+.g-1 E 21 g Pb++.g-1, A CADA 5 DIAS, POR UM PERODO TOTAL DE 70 DIAS (14 DOSES)................ 39 QUADRO 1 INTERAES RECPROCAS ENTRE DUAS RESPOSTAS BIOLGICAS OBTIDAS COMO BIOMARCADORES..................................................................... 104

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

17-EE2 (ou EE2) 17-etinil-estradiol: C20H24O2 -ALAd -aminolevulinato desidratase, ou porfobilinognio sintase ou -aminolevulinato hidroliase; E.C.: 4.2.1.24 17-E2 (ou E2) 17-estradiol: C18H24O2 DA dopamina DTNB cido 5,5-DiTiolbis(2-NitroBenzico): [-SC6H3(NO2)CO2H]2 EC50 50% of effective concentration 10% of effective concentration EC10 50% of effective dose ED50 ED10 10% of effective dose EROD 7-ethoxyresorufin-O-deethylas ESxH hormnios sexuais esterides. GR (ou GSSGr) glutationa redutase GSH glutationa reduzida GSSG glutationa oxidada GSt glutationa S-transferase GP (ou GSHp) glutationa peroxidase GtRH hormnio liberador de gonadotropinas GtH gonadotropina 6HB-E2 hexa-hidrobenzoato de estradiol: BENZO-GINOESTRIL AP* SARSA LOEC low observed effective concentration LOED low observed effective dose MT metalotionena MTs isoformas da metalotionena P450 complexo citocromo oxidase P450 PBG porfobilinognio PMSF cido fenil-metil-sulfonil fluordrico: C7H7FO2S SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis SOD superxido dismutase TMX citrato de tamoxifeno: C26H29NO.C6H8O7 VTG vitelogenina WB Western Blot

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RESUMO
Biomarcador aqui considerado uma resposta fisiolgica individual do organismo, como conseqncia (efeito) da exposio (causa) do animal a um agente exgeno, contaminante ou substncia txica. Esta tese trata da padronizao de metodologias que envolvem tcnicas laboratoriais bioqumicas e de biologia molecular para o emprego de biomarcadores em Hoplias malabaricus (trara), a saber: cintica enzimtica e constatao de inibio da aminolevulinato desidratase, esta associada ao monitoramento de parmetros hematolgicos; quantificao indireta dos teores teciduais (fgado e brnquias) de metalotionena; e quantificao relativa da vitelogenina plasmtica (in vivo) ou sintetizada in vitro por cultivo primrio de hepatcitos, atravs da imunodeteco da protena por anti-soro policlonal produzido em coelhos. Outrossim, no que concerne expresso da vitelogenina, foi descrita a definio conceitual, bem como realizada a demonstrao emprica de um modelo matemtico (ndice Vitelognico utilizado como biomarcador) para a quantificao de efeitos estrognicos ou anti-estrognicos em peixes. A trara foi utilizada como modelo experimental para bioensaios, nos quais foram consideradas condies fisicoqumicas prximas a de ambientes tropicais, a exposio via alimento por longos perodos (subcrnica) e a busca de respostas detectveis e consistentes, que permitam a utilizao da espcie em futuros estudos de biomonitoramento ambiental. Ensaios in vitro permitiram estabelecer um teste de estrogenicidade empregando hepatcitos de trara, e a quantificao dessa resposta, considerando diferentes mecanismos moleculares de citotoxicidade. Os resultados aqui obtidos e comparados com outros estudos em peixes revelam que a eficincia do uso de biomarcadores dependente de estudos prvios (in vivo e in vitro) que considerem os vrios processos celulares e fisiolgicos como relacionados reciprocamente e integrantes de um sistema nico, o organismo. Palavras-chave: trara; Hoplias malabaricus; biomarcadores; chumbo inorgnico; metilmercrio; -aminolevulinato desidratase; metalotionena; vitelogenina; teste de estrogenicidade in vitro; ndice vitelognico.

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ABSTRACT
A biomarker is defined as a change in a biological response (ranging from molecular through cellular and physiological responses) which can be related to exposure to or toxic effects of environmental chemicals or any biological response to an environmental chemical at the subindividual level, indicating a deviation from the normal status that cannot be detected in the intact organism. This thesis concerns about methodology standardizing of biochemical and molecular procedures that allows the employment of biomarkers in Hoplias malabaricus (trara), as follows: enzymatic kinetics and inhibition of -aminolevulinic acid dehydratase; hematological measurements; indirect quantifying metallothioneins in liver and gill tissues; estrogenic priming, isolation and immunochemical detection (polyclonal antisera) of vitellogenin from plasma (bioassays), or from in vitro vitellogenin production by hepatocytes. This protein production has also been used in in vitro experiments, which showed the vitellogenic index as applicable screening method for determining (anti)estrogenic activity of xenobiotics. The use of those parameters as sensitive and long-term biomarkers for sublethal, subchronic, and trophic exposures to inorganic lead (II) or methylmercury was investigated in Hoplias malabaricus, as well as a sensitive biomarkers discussed here in relation to their feasibility in fish exposure to metals assessment. According to the current results, due to its high-level trophic position and wide geographical distribution in South America, we are suggesting the use of these biomarkers in biomonitoring programs of freshwater areas impacted by lead and mercury. Keywords: trara; Hoplias malabaricus; biomarkers; inorganic lead (II); methylmercury; -aminolevulinic acid dehydratase; metallothioneins; vitellogenin; cultured primary hepatocytes; vitellogenic index.

INTRODUO GERAL

1 O USO DE BIOMARCADORES EM PEIXES

Um biomarcador uma resposta fisiolgica individual ou um padro morfolgico alterado num organismo e, em ambos os casos, a conseqncia (efeito) da exposio (causa) do organismo a um agente exgeno, este doravante denominado xenobitico. Portanto os biomarcadores integram sistemas biolgicos operacionais indicando processos de contaminao ou intoxicao, em diferentes nveis de organizao biolgica. Ao representar um processo constitutivo do organismo, o biomarcador compreende uma resposta biolgica que pode ser mensurada ou detectada por diversos mtodos que empreendem o processo per se (como a expresso de uma protena ou alguma atividade cataltica), ou que se utiliza de alguma estrutura do sistema biolgico para se inferir alteraes na organizao do organismo, como por exemplo, uma alterao morfolgica em nvel tecidual, celular ou at molecular. Os mtodos no campo da bioqumica e da biologia molecular so, portanto, os mais utilizados para o estabelecimento e uso de uma resposta biomarcadora (OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003). Contudo anlises de carter subjetivo como alteraes macroscpicas ou de variveis discretas (p. ex.: presena ou ausncia de um componente molecular) podem ser teis caso haja alguma especificidade causa/efeito e se conhea o histrico da espcie em questo e de suas interaes no meio ambiente. Embora baseando-se em anlises individuais, um biomarcador de grande utilidade indica a exposio subletal de um grupo de organismos que, por propriedades inerentes ao mesmo, pem em risco uma comunidade natural. Como exemplo a capacidade reprodutiva e de procura de alimento podem sofrer alteraes que tornam invivel a continuidade de uma populao de uma espcie biolgica. Em contrapartida ao monitoramento qumico-analtico de ambientes impactados, processos biolgicos alterados permitem um diagnstico anacrnico dentro de um espao geogrfico considerado. O poder de predio que possa advir

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de um sistema altamente complexo superior ao de processos estritamente inanimados, pois aquele menos sujeito a intervenientes ambientais, j que possui um mecanismo pr-determinado para a manuteno da ordem de nvel molecular, celular, individual e, dependendo do biomarcador usado, populacional. Este ltimo caso deve ser a ferramenta pretendida, que deve alocar interesse poltico e investimento financeiro para a pesquisa dirigida e para

biomonitoramentos, desenvolvidos em condies do territrio nacional. Em reviso sobre o tema, OOST, BEYER e VERMEULEN (2003), apresentam os biomarcadores subdivididos em: a) biomarcador de exposio: detecta e quantifica a presena do xenobitico, de seus metablitos ou de sua interao com componentes moleculares ou celulares em compartimentos do organismo; infere exposio prvia e fornece os ndices de bioacumulao da biota, estes determinados por mtodos bioqumicos e de qumica analtica; b) biomarcador de efeito: parmetros bioqumicos ou fisiolgicos mensurveis que correspondam a alteraes em nveis molecular, celular ou tecidual que permitam inferir efeito adverso, prejudicial ao operar normal do organismo saudvel, efeito pr-clnico, subletal ou at letal; c) biomarcador de susceptibilidade: indica a habilidade inerente ou adquirida por um organismo de responder exposio a um xenobitico; elucida variaes no grau de resposta diferencial entre organismos e demonstra a tolerncia fisiolgica adquirida ou controlada por expresso gnica hereditria. Os biomarcadores aqui tratados possuem caractersticas que a priori permitem inser-los na classe da alnea (b), muito embora envolvam processos que podem estar relacionados com uma tolerncia adquirida ou hereditria. Contudo h uma restrio para tal inferncia, j que este trabalho baseia-se fundamentalmente em condies experimentais controladas. A mesma reviso supracitada compila e discute a exeqibilidade dos biomarcadores atualmente utilizados em peixes, para que possveis predies e

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medidas de saneamento possam sustentar os Estudos de Impacto Ambiental (EIAs) associados a alteraes antrpicas cada vez mais freqentes, intensas e danosas aos ecossistemas naturais e integridade da biodiversidade do planeta. Prope-se aqui portanto a padronizao de tcnicas e procedimentos que possam ser teis e que devem preceder o estabelecimento de respostas biolgicas de organismos como indicativas do efeito adverso de metais xenobiticos. Os ecossistemas aquticos em geral constituem o receptculo final de substncias produzidas e despejadas no meio pela atividade antrpica e, ou por processos naturais. Um xenobitico passa a integrar um organismo aqutico quando este quele est exposto, podendo ser absorvido e bioacumulado. Este um conceito que, por extenso, pode ser aplicado a toda a biota, considerando-se o modelo de bioacumulao proposto por OOST, BEYER e VERMEULEN (2003), onde ocorrem: a) bioconcentrao: acmulo direto do xenobitico a partir da gua, pelas brnquias ou pela pele, que pode ser mensurado como o fator de bioconcentrao, ou seja, a razo entre a concentrao da substncia no organismo pela concentrao da mesma na gua; b) biomagnificao: acmulo por via trfica, a partir da alimentao, que pode ser mensurado como o fator de biomagnificao, ou seja, a razo no equilbrio entre a taxa constante de acmulo pela taxa constante de eliminao (por excreo ou metabolismo); ou ainda: um incremento progressivo de concentraes, a partir da fonte de exposio e atravs dos nveis trficos de organismos vivos, em ascendncia (PAIN, 1995). O chumbo inorgnico divalente (Pb++) e o metilmercrio (H3C-Hg+) so as substncias aqui investigadas como xenobiticos que causem efeitos subletais, para o estabelecimento de biomarcadores sensveis sua exposio. No pretende-se aqui o estudo dos parmetros farmacocinticos, e relaes como doseresposta ou tempo-resposta para com essas substncias. O foco central das trs subdivises principais desta tese (captulos) relacionado ao mtodo, bem como s relaes entre duas respostas obtidas por duas tcnicas de observao

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emprica. Assim, O Pb++ e o H3C-Hg+ so empregados para se obter a resposta pretendida, diferente da situao controle. No obstante, no h como prescindir de inferncias acerca da fisiologia do organismo, comprometido pelas exposies. Muito embora o Pb++ tenha sido relatado como substncia que no sofre biomagnificao, o falseamento da hiptese contrria essencial para que se sustente esse ponto de vista, em relao a ecossistemas tropicais e subtropicais. Alm disso dados obtidos in loco (ambientes contaminados) por si, isolados, so ineficazes para constatao de biomagnificao, j que a absoro do xenobitico pode no se dar exclusivamente pela via trfica (PAIN, 1995). Segundo este autor, muitos organismos aquticos, inclusive peixes, podem absorver e acumular altas concentraes de chumbo e em geral considera-se que este metal possui efeitos cumulativos em peixes (VIGHI, 1981). H um extenso conhecimento refletido em inmeras publicaes acerca da neurotoxicidade, da notria biomagnificao e de outros efeitos do H3C-Hg+ em organismos e ecossistemas. Contudo, no Brasil, a contaminao de ambientes aquticos, principalmente na regio Amaznica, sempre ser de interesse pblico devido s persistentes atividades de minerao de ouro, que incrementam os teores considerados normais para o sedimento daquela regio. Somado a isto, a transformao microbiana do Hg++ para o H3C-Hg+ (metilao) aumenta a toxicidade do metal em ambientes favorveis, dispersando o metal do interior da bactria para a coluna dgua. Quanto ao conhecimento disponvel no campo da toxicologia ambiental de metais pesados, considera-se que a investigao com espcies animais brasileiras deva ser realizada o quanto antes, para que se possa desenvolver mtodos para constatar os nveis de susceptibilidade e toxicidade a esses metais.

Biomarcadores que possam predizer conseqncias da contaminao ambiental (antes desta tornar-se um problema irreversvel ou muito caro para ser sanado) se disponveis, podem auxiliar na preveno das condies que colocam em risco a integridade de ecossistemas e de espcies biolgicas. O uso de dados importados de pases do hemisfrio norte e relativos a estudos com peixes constitui os argumentos essenciais nos quais se baseiam a

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Legislao Ambiental brasileira, porm tal uso pode estar introduzindo um grave erro na determinao dos limites mximos permissveis de metais pesados em ecossistemas aquticos brasileiros. H portanto a necessidade urgente de se gerar dados que possam auxiliar uma melhor discusso, relativa queles limites.

2 HOPLIAS MALABARICUS COMO MODELO EXPERIMENTAL

A pesquisa dirigida faz-se fundamental preservao dos ecossistemas, j que sistemas biolgicos e bioqumicos somente podem ser interpretados luz da ordenao conceitual e sistemtica dos fenmenos observados e possveis. Em pases economicamente desenvolvidos, o uso de molculas ou reaes qumicas em organismos amplamente estudado com o objetivo de se estabelecer indicadores da presena de poluentes ambientais e seus efeitos (OOST; BEYER;

VERMEULEN, 2003). No Brasil os casos de contaminao ambiental ainda no so biomonitorados adequadamente, pois no existem dados pretritos que estabeleam um histrico de diagnstico na maioria dos ecossistemas brasileiros. Precede portanto a obteno de tais dados objetivando um diagnstico evolutivo das alteraes nestes ambientes. A trara, Hoplias malabaricus (BLOCH, 1794), pertence ordem Characiformes e famlia Erythrinidae; constitui uma espcie com ampla distribuio geogrfica em Neotropica, abrangendo quase todas as bacias desde a Amrica Central at o rio Colorado (Argentina) e apresentando diferentes reas de endemismo; habita preferencialmente ambientes lnticos e apresenta comportamento territorialista. Esta espcie onvora durante o primeiro ano de desenvolvimento, com uma dieta que compreende microcrustceos, algas e insetos aquticos. Aps este perodo (normalmente aps alcanarem 12 cm de comprimento) tornam-se estritamente carnvoras, altamente especializadas piscivoria. Astyanax sp (lambaris) so seus itens alimentares preferenciais, porm em situaes de pouca abundncia de presas, enriquecem a sua dieta com outros itens, como crustceos por exemplo. Estas presas alternativas tanto podem ser animais que habitam a coluna de gua, quanto animais bentnicos. Essas informaes sobre a biologia da trara foram obtidas em LOPEZ e FENOCCHIO (1994), LOUREIRO (1995) e LOWE-MCCONNELL (1999). O comprimento padro do menor espcime de Hoplias malabaricus capturado em perodo de reproduo no reservatrio de Segredo (PR) foi de 17 cm para fmeas (n = 219) e 21,2 cm para machos (n = 169) observados por SUZUKI e

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AGOSTINHO (1997) numa variao de 3,1 a 50 cm (n = 1815). Segundo os autores vrias espcies de peixes tropicais atingem a maturidade com 40% a 50% do comprimento assinttico. A boa aceitao no mercado pode representar riscos potenciais sade humana, em casos de contaminao pela cadeia trfica (biomagnificao) o que est tambm associado ampla distribuio geogrfica de Hoplias malabaricus. Alm disso, em relao a espcies de peixes tropicais e subtropicais, considera-se que ainda h uma escassez de estudos que objetivem a padronizao de metodologias para o uso de biomarcadores. Respostas individuais obtidas em laboratrio raramente permitem que, por extenso, se possa aplic-las na interpretao de fenmenos naturais, em nvel populacional. Este o maior desafio de pesquisadores contemporneos, que se utilizam de biomarcadores. O emprego de Hoplias malabaricus como modelo experimental tem se mostrado um progresso em relao a esse desafio, pois envolve aspectos da biologia da espcie que esto relacionados com a resposta obtida e que raramente so considerados, na maioria dos estudos com biomarcadores em peixes. Tais aspectos so as condies fisico-qumicas prximas a de ambientes tropicais, a exposio via alimento por longos perodos (subcrnica) e a busca das menores quantidades de um xenobitico, que possam revelar uma resposta detectvel consistente, sem matar o animal (subletal). Assim os bioensaios e ensaios in vitro ainda so os estudos prvios necessrios para o uso de biomarcadores em biomonitoramentos e para a determinao de espcies bioindicadoras que permitam predies consistentes. A espcie Hoplias malabaricus mostrou-se como um excelente modelo biolgico experimental para estudos dos efeitos de xenobiticos administrados atravs da via trfica: em exposio subcrnica de traras ao chumbo (21 g Pb++.g1.120 h1) no se observou mortalidade e a espcie adaptou-se bem s condies laboratoriais e manipulao durante o experimento (ALVES COSTA, 2001). Alm disso, Hoplias malabaricus j foi utilizada em outras

experimentaes trficas semelhantes e com igual sucesso, servindo para o estudo de outros xenobiticos ou biomarcadores de contaminao aqutica, como

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relatado por LEMOS (2000), CESTARI et al. (2004), RABITTO et al. (2005), ALVES COSTA et al. (2006), OLIVEIRA RIBEIRO et al. (2006) e MELA et al. (submetido).

3 INTERAES ENTRE BIOMARCADORES

Alguns dos biomarcadores freqentemente utilizados em peixes e outros organismos foram compilados na figura 1, assim como as interaes entre eles. A eficincia do uso isolado de apenas um biomarcador deve ser dependente da alta especificidade da resposta ao xenobitico, ou de estudos prvios que considerem, para a espcie em questo, os vrios processos bioqumicos, celulares e fisiolgicos como relacionados reciprocamente e integrantes de um sistema nico, o organismo. A -aminolevulinato desidratase (-ALAd), tambm conhecida como porfobilinognio sintase ou -aminolevulinato hidroliase (E.C.: 4.2.1.24), exerce um papel crucial na vida biolgica da clula eucaritica, por fazer parte da rota de sntese do grupo
HEME.

Este o grupo prosttico da metaloenzima

hemoglobina, que faz o transporte de oxignio no sangue, mas em primeira instncia tambm requerido na cadeia de transferncia de eltrons da clula (respirao celular). O
HEME

est envolvido com a atrao de eltrons pelas

cargas positivas do metal ferro, tomo que muda do estado frrico (Fe+3) para o estado ferroso (Fe+2), quando esse recebe um eltron. Protenas que tm o grupo
HEME

em sua estrutura (hemoprotenas) operam de diversas formas na clula

eucaritica: catalases, complexo citocromo oxidase P450 e outros citocromos. A -ALAd pode ser encontrada na maioria das bactrias aerbicas e em plantas e animais. A atividade cataltica da -ALAd permite a transformao qumica de duas molculas de -aminolevulinato (-ALA) em um dos quatro anis pirrlicos constituintes do grupo
HEME,

o porfobilinognio (PBG); neste processo

ocorre uma condensao aldlica e uma ciclizao, com eliminao de duas molculas de gua (fig. 2). Por ser uma enzima sulfidrlica, a -ALAd tem seus grupos tilicos (no stio ativo) em estado reduzido (SH), e estes so imprescindveis para a plena atividade enzimtica. O stio ativo composto por 2 resduos de cistena, um tomo de zinco, 1 ou 2 resduos de histidina e de lisina e resduos de aminocido

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hidrofbicos; fora do stio ativo h 9 resduos de tirosina, 4 de triptofano e 6 de metionina: relatado por GIBSON (1955), RODRIGUES (1987) e BAINY (1990).

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FIGURA 1 INTERAES MOLECULARES ENTRE ALGUMAS RESPOSTAS BIOMARCADORAS UTILIZADAS EM PEIXES
SISTEMA HEPTICO HEP (HEPATCITO) (HEPAT
Expresso de METALOTIONENA METALOTIONE indut.: metais, EROS e ESxH tolerncia a EROS, p.ex.:H2O2 atividade antioxidante

-ALAd
inibio : ANEMIA PORFIRIA [ pre-HEME ] HEME [ HEME ] [ -ALA ] ESTRESSE OXIDATIVO

HOMEOSTASE DE Zn & ATIVIDADE DE METALOENZIMAS

COMPOSTOS DE OXIGNIO PARCIALMENTE REDUZIDOS e- e- e- eO2 O2 H2O2 OH H2O

CATALASE

2 H2O2

2 H2O + O2
CATALASE

HOMEOSTASE OXIDATIVA tolerncia a EROS atividade antioxidante: SOD, CATALASES, peroxidases, GSHp GSH S-t, GSHr [GSH]

SISTEMA REPRODUTOR NEUROENDCRINO NEUROEND CREBRO HIPOTLAMO HIPOT GtRH (+) / DA () HIPFISE HIP GtH I & GtH II (+) e outros (+/)

R-O-OH + AH2 O2- + O2- + 2 H+ O2 + RH

H2O + R-OH + A
superxido dismutase

H2O2 + O2
citocromo P450

ROH
Glutationa S-transf

GSH + ROH
tiol transferases

GSROH GSSR
GSH perox

GSH + R-SH 2 GSH + ROOH GS-SG + 2 NADPH

LEGENDA: (MT): metalotionena; TESTCULO/OVRIO Expresso de VITELOGENINA TEST CULO/OV (): decrscimo e aumento (); regulada por 17-Estradiol ESxH e outros fatores (EROS): espcies reativas de oxignio; xenobionte com: ativ. estrognica dimorfismo sexual (SOD): superxido dismutase; (machos e jovens) (GP): glutationa peroxidase; gametognese (Zn) ativ. anti-estrognica (GST): glutationa S-transferase; (fmeas) incorpora VT (GtH I) (GR): glutationa redutase; ([GSH]): concentrao de glutationa reduzida; ATIVIDADE ANTIOXIDANTE; (P450): complexo citocromo oxidase P450 (possui grupo HEME integrante); (MMFOS): microsomal mixed function oxidase system; (ativ.): atividade; (EROD): 7-ethoxyresorufin-O-deethylase; (VT): vitelogenina; (E2): estradiol; (Zn): zinco; (-ALAd): aminolevulinato desidratase; ([-ALA]): concentrao de -aminolevulinato; ([HEME]): concentrao de HEME; [(+) e ()]: feedback; (GtRH): hormnio liberador de gonadotropinas; (DA): dopamina; (GtH): gonadotropina; (ESxH): hormnios sexuais esterides.

Expresso de P450 uso de EROS em oxidaes catabolismo (MFOS): oxidao de esterides ativ. monoxigenases associadas p.ex.: EROD

GSSG + H2O + ROH

GSSG red

2 GSH + 2 NADP+

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FIGURA 2 - ROTA DE SNTESE DO GRUPO HEME

KREBS
PROTOPORFIRINA IX (4 anis) HEMEs HEME (4 anis)

GLICINA + SUCCINIL-CoA -ALAs -ALA

-ALA -ALA -ALA -ALA -ALA -ALA

Fe++
5 ENZIMAS 4 ETAPAS 3 COMPOSTOS INTERMEDIRIOS
-ALAs: sintase do -aminolevulinato -ALA: -aminolevulinato (linear) -ALAd: desidratase do -aminolevulinato PBG: porfobilinognio (1 anel) HEMEs: heme-sintase ou ferro-quelatase

-ALA + -ALA

4PBG

-ALAd 4X PBG
-ALA

-ALA

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A presena do metais divalentes no stio ativo da -ALAd e a interao entre o metal e seus grupos SH inibem a sua atividade enzimtica. Segundo HODSON, BLUNT e WHITTLE (1984) a -ALAd seria sensvel a vrios metais in vitro, mas somente ao chumbo in vivo. Quando h inibio da atividade da -ALAd por metais divalentes, seu substrato, o -aminolevulinato (-ALA) e outros precursores do grupo
HEME

aumentam em concentrao na clula (porfiria) podendo levar o organismo a um quadro clnico sistmico de anemia (baixa concentrao de hemoglobina funcional). Esse quadro (anemia) intensificado pela inibio causada pelo chumbo na ao da ferroquelatase (incorporao de ferro no centro de protoporfirina IX (fig. 2), conquanto que um decrscimo em concentrao de
HEME

na mitocndria,

aumente a sntese de -ALA, que em excesso exerce retro-alimentao negativa sobre a -ALA sintase. Outrossim, o substrato -ALA est envolvido com a oxidao da oxihemoglobina, o que produz compostos de oxignio parcialmente reduzidos com efeitos txicos clula, podendo lev-la a uma resposta defensiva que se revela com o aumento da atividade eritrocitria da superxido dismutase (SOD) e da glutationa peroxidase (GSHp). Essa relao entre o acmulo de precursores do grupo
HEME,

a produo de espcies reativas de oxignio e o aumento da

atividade antioxidante foi observada por MONTEIRO et al. (1985) em trabalhadores expostos ao chumbo numa fbrica em Diadema (SP). Portanto alteraes na atividade -ALAd uma resposta relacionada com os biomarcadores que indicam estresse oxidativo e, por conseguinte, com outros relacionados a esse tipo de estresse, como biomarcadores histopatolgicos (RABITTO et al., 2005) ou que indiquem danos (quebras) em macromolculas como a DNA (CESTARI et al., 2004). Recentemente a atividade da -ALAd tem sido usada como biomarcador de efeito, relacionado ao estresse oxidativo de mamferos (PEROTTONI et al., 2004a, 2004b), aps exposio ocupacional de trabalhadores ao chumbo (GURER-ORHAN, SABR e ZGNES, 2004), ou em peixes (CAMPANA; SARASQUETE; BLASCO, 2003).

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A atividade da -ALAd aferida em tecidos hematopoiticos um indicador do processo de formao do sangue, servindo para se avaliar diferentes taxas de eritropoiese em indivduos. Quando essa avaliao vem acompanhada de outros parmetros hematolgicos como a concentrao de hemoglobina no sangue total, o hematcrito percentual e a contagem de eritrcitos (ou eritroblastos), tem-se um panorama mais completo do processo renovao das clulas do sangue. J a atividade da -ALAd eritrocitria aferida a partir do sangue reflete uma condio pretrita de hematopoiese, pois a enzima no tem atividade acoplada estruturalmente ao processo de formao do sangue, ou seja, no h papel fisiolgico da -ALAd em eritrcitos maduros. Contudo a -ALAd eritrocitria pode ligar-se a metais divalentes como o chumbo (BERGDAHL et al., 1998), indicando exposio recente e constituindo-se de uma resposta biomarcadora. De acordo com RODRIGUES (1987) e BAINY (1990), o zinco compe estruturalmente a -ALAd funcional, em interaes que estabilizam a estrutura da protena (possibilitando sua conformao requerida catlise) e mantm os grupos tilicos no estado reduzido (proteo contra a inativao pelo oxignio). Embora o zinco e a apo--ALAd sejam elementos coletivamente suficientes para a catlise, o zinco no isoladamente necessrio, permitindo por ausncia que a apoenzima tenha atividade em condies anaerbicas. Isso quer dizer que da ocorrncia dos elementos causais (presena do zinco e da apo--ALAd) pode-se deduzir o efeito (catlise) mas sendo a inferncia recproca impossvel. Como revisado por VALLEE (1991), VASAK e HASLER (2000), o zinco componente integral de aproximadamente 300 enzimas encontradas em distintas espcies e filos e de aproximadamente 200 protenas que atuam como fatores de transcrio (ligantes de DNA como os fatores zinc fingers); o metal ainda atua estabilizando a estrutura de protenas e cidos nuclicos, preservando a integridade de organelas subcelulares e participando em processos de transporte celular, e em respostas do sistema imunolgico. Durante a maturidade sexual o zinco responsvel pela diferenciao dos ocitos na maturao do ovrio de peixes (KIME, 1999). Seu acmulo em clulas hepticas neste perodo vem precedido de um acrscimo em teores hepticos de

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metalotionena (polipeptdeo descrito abaixo). A vitelogenina (protena descrita no final desta introduo) um dos componentes plasmticos que transporta o zinco do fgado aos ovrios (THOMPSON et al., 2003). A homeostase dependente do zinco, a sua disponibilidade para processos celulares, bem como seu acmulo, estocagem, distribuio e liberao em tecidos diretamente dependente da expresso celular de metalotionenas (VASAK e HASLER, 2000). A metalotionena (MT) uma estrutura protica da clula, considerada um forte quelante de metais: 7 tomos-grama de metal per mol de MT. A expresso de MT induzida pela exposio a metais, aumentando a tolerncia fisiolgica de organismos a eles, segundo VALLEE (1991), KIME (1999) e ANDREWS (2000). Vertebrados contm duas ou mais isoformas de MT (famlia de protenas doravante denominada no plural MTs): MT-1 a MT-4 em mamferos (VASAK e HASLER, 2000). Assim alteraes na produo constitutiva das MTs esto relacionadas com a distribuio e estocagem de zinco pelas clulas, o que pode influir na atividade de enzimas como a -ALAd, alterando indiretamente as condies oxidativas normais. H tambm uma relao direta, quando a expresso das MTs induzida por agentes oxidantes, como as espcies reativas de oxignio (VASAK e HASLER, 2000). Culturas de clulas gonadais de truta induzidas produo de MTs (por zinco ou cdmio) apresentam acrscimo na tolerncia ao H2O2, o qual tambm capaz de induzir a expresso de MTs (KLING e OLSSON, 2000). Tambm h outros relatos de espcies reativas de oxignio relacionadas com a induo da MTs, ver KGI (1991), VASAK e HASLER (2000) em reviso, AHMAD et al. (2000) em bagres e KONDOH et al. (2001) para estresse oxidativo mitocondrial de camundongos. De outra forma, SUNTRES e LUI (2006) demonstram que clulas tumorais com altos teores de MTs induzida por cobre so mais susceptveis ao estresse oxidativo. Alm disso, a expresso das MTs sofre controle hormonal, incluindo a induo por hormnios sexuais esterides (VALLEE, 1991). KIME (1999) revisa

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que poluentes que so desreguladores neuro-endcrinos podem promover alteraes na produo de MTs de peixes, efeito que est normalmente associado a variaes sazonais, estas como intervenientes na regulao hormonal. Alm disso a produo induzida de MTs no fgado tambm est relacionada ao sistema reprodutor: disfunes na homeostase de zinco podem alterar o desenvolvimento (diferenciao) e a maturao de gametas. A utilizao de respostas biomarcadoras relacionadas s alteraes dos teores teciduais de MTs, ou de sua expresso (induo ou supresso), deve portanto considerar a ampla rede de interaes entre componentes moleculares, que pode influenciar na resposta obtida (ver fig. 1). Existem outros compostos citoslicos que esto envolvidos com aes similares a da MT, ligando-se a metais pesados e reduzindo suas interaes com outros componentes celulares. Molculas tilicas como a cistena livre ou a glutationa (GSH) devem ser consideradas no papel que a MT exerce ao aumentar a tolerncia fisiolgica de organismos aos metais pesados (VASAK e HASLER, 2000). A GSH, por sua reatividade contra eletrfilos, est relacionada com a excreo de metais pesados pela bile de mamferos, mas isso no pode ser generalizado para peixes, segundo HEATH (1995). A glutationa reduzida (GSH) um composto tripeptdico (-glutamilcisteinil-glicina) que perfaz a maior parte dos grupos tilicos livres da maioria das clulas vivas e, segundo AKERBOOM e SIES (1991), PLUMMER et al. (1991) e MANAHAM (2000), participa: da desintoxicao de xenobiticos orgnicos (reaes de conjugao: biotransformao de FASE II); da remoo de perxidos pela glutationa peroxidase; da proteo contra radiao ionizante e contra eletrfilos (ctions metlicos, por exemplo); da modulao de atividades enzimticas dependentes do equilbrio redox e da manuteno da condio reduzida dos grupos SH de protenas citoslicas. A GSH atua, portanto como um tampo oxidativo, mantendo o citosol na condio reduzida essencial para a clula. A oxidao da GSH produz o dissulfeto de glutationa (GSSG), essa forma oxidada produzida sob a ao enzimtica da glutationa peroxidase (GSHp) ou mesmo em reaes no catalisadas. A glutationa

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Stransferase (GSt) representa uma famlia de enzimas homlogas envolvidas com as reaes de FASE II no fgado: conjugao da GSH com o xenobitico ou com o metablito produzido na FASE I, gerando compostos (GSR) mais facilmente eliminados pela bile. Pela ao de tioltrasferases como a GSt, a GSH pode tambm originar compostos dissulfidrlicos (GSSR). A glutationa redutase (GSSGr) ligada a um sistema de carreadores de eltrons (NADPH/NADP+) mantm os nveis normais de GSH na clula. A GSHp, a GSt, e a GSSGr atuam juntas para o equilbrio redox do sistema GSH/GSSG. Para detalhes ver AKERBOOM e SIES (1991), PLUMMER et al. (1991), DAGGETT et al. (1998), MANAHAM (2000) e WRIGHT et al. (2000). A concentrao de GSH no necessariamente a mesma em diferentes populaes de clulas e provavelmente existam pools subcelulares de GSH. Contudo decrscimos significativos (menos que 30% dos valores normais) principalmente no fgado, so indicadores de um metabolismo alterado por xenobiticos e de um acrscimo em toxicidade causada por metablitos eletroflicos (PLUMMER et al., 1991). Usualmente a maior parte do oxignio intracelular dissolvido consumida na fosforilao oxidativa, pois a molcula o ltimo aceptor de eltrons na cadeia respiratria mitocondrial. O excedente participa de uma srie de eventos celulares: ao menos 200 enzimas usam o oxignio em reaes. O oxignio e suas formas parcialmente reduzidas (fig. 3) surgem constantemente nas clulas e so altamente txicos devido a sua alta reatividade (MATHEWS e HOLDE, 1990).
FIGURA 3 - ESPCIES REATIVAS DE OXIGNIO (PARCIALMENTE REDUZIDAS)

O2 Esses

O 2 compostos

H 2O 2 intermedirios podem

OH promover

H2 O oxidaes de

macromolculas celulares. Caso um destes componentes seja o DNA, o risco de mutagenicidade iminente. Os nveis metablicos normais de espcies reativas de oxignio so mantidos pela atividade antioxidante de diversas enzimas ou componentes

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celulares, dentre eles: catalases, SOD, GSHp, GSSGr, GSt, GSH, MT (vide fig. 1 para nomenclatura). A atividade alterada dessas enzimas e os teores fisiolgicos anormais de compostos como a glutationa (GSH) e a metalotionena (MT) podem ser usados como marcadores correlacionados para situaes de estresse oxidativo, como descrito por MONTEIRO et al. (1985), DIMITROVA, TISHINOVA e VELCHEVA (1994), PETRIVALSKY et al. (1997), DAGGETT et al. (1998), KLING e OLSSON (2000), OLIVER, JIANG e CHERIAN (2006), CHEN et al. (2006). A GSH atua como fator antioxidante pois, sob a ao da glutationa peroxidase (fig.4), serve como substrato remoo de perxidos, txicos clula.
FIGURA 4 - AO CATALTICA DA GLUTATIONA PEROXIDASE
glutationa peroxidase

2 GSH + ROOH

GSSG + H2O + ROH

Assim um decrscimo nos nveis teciduais de GSH pode ser um indicativo de estresse oxidativo. As MTs tambm possuem ao antioxidante: MT a 13 M to efetiva quanto a GSH a 10 M na proteo do DNA contra o radical OH no timo de ratos. Os possveis mecanismos para tal proteo envolvem: as propriedades da protena (reativa contra eletrfilos); a mediao da MT na reduo de radicais livres, (doao de hidrognio); a participao da MT em mecanismos de proteo do DNA e regulao da expresso gnica; e sua relao com a disponibilidade de zinco, um cofator em vrios processos celulares (TEMPLETON e CHERIAN, 1991). Como revisado por HEATH (1995), exposies crnicas de espcies de peixes marinhas ao cdmio, chumbo e mercrio causam acrscimo nas concentraes hepticas de GSH. Por outro lado o cdmio j foi observado causando o efeito contrrio em Anabas testudineus, quando em exposio aguda a altas concentraes na gua e isso foi acompanhado por um acrscimo na atividade da GSt. Como resposta a exposio in vitro de clulas de carpa a compostos oxidantes, obteve-se um decrscimo em sua toxicidade, relacionado ao aumento da quantidade de GSH e atividade do sistema redox GSH dependente, isso aps a pr-induo da MT por cdmio (WRIGHT et al., 2000).

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Em trutas expostas ao zinco por via hdrica, houve acrscimo nos teores de GSH heptica, mas no na quantidade de RNAm da MT. A situao foi inversa para a exposio ao cdmio, e a mistura dos dois metais incrementou os teores de GSH e a expresso de MT no fgado. (LANGE; AUSSEIL; SEGNER, 2002). O complexo citocromo oxidase P450 uma unidade composta por estruturas proticas predominantemente integrante da membrana do retculo endoplasmtico (RE) de clulas eucariticas (principalmente hepatcitos) e pode ser obtido na frao microssomal, aps ultracentrifugao. Sua estrutura assemelha-se a do complexo citocromo
HEME

a-a3

oxidase

(heterodmero

transmembrana) e possui o grupo

modificado (reduzido). Quando

complexado ao CO, absorve fortemente a luz com = 450 nm, da sua denominao (MATHEWS e HOLDE, 1990). A atividade do P450 acoplada a uma cadeia de transporte de eltrons e atividade de uma srie de enzimas acessrias que dispem do O2 ou do CO, inserindo um tomo de oxignio ao substrato que sofre hidroxilao (aumento da polaridade; fig. 5) e reduz um segundo tomo de oxignio gua. Assim uma variedade de compostos lipossolveis tornam-se mais hidroflicos na clula, o que ajuda na excreo e eliminao pela bile, brnquias ou rins (HEATH, 1995).

FIGURA 5 AO ESQUEMTICA DO COMPLEXO CITOCROMO P450

complexo citocromo P450

O2 + RH

ROH

Em reaes dependentes das coenzimas NADH e NADPH, o complexo citocromo oxidase P450pode transformar cidos graxos, esterides, barbitricos, benzo[a]pireno e outras drogas ou xenobiticos. A expresso do complexo citocromo oxidase P450 regulvel pela presena de seus substratos, no fgado e outros tecidos, e grande parte dos poluentes orgnicos podem servir como indutores, segundo MATHEWS e HOLDE (1990), HEATH (1995) e MELANCON (1995). Desta forma o complexo citocromo oxidase P450tem importante participao nas reaes de biotransformao de FASE I no fgado, responsveis pelo metabolismo de xenobiticos lipossolveis (MANAHAN, 2000). Contudo o acrscimo em polaridade pode aumentar a toxicidade do xenobitico, convertendo-

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o numa forma mais txica. Associadas com a induo do complexo citocromo oxidase P450esto as atividades de um amplo espectro de enzimas denominadas monoxigenases: mixed function oxidase system (sistema MFO). Essas atividades so freqentemente utilizadas como biomarcadores indiretos para a induo do complexo citocromo oxidase P450por xenobiticos. Tais mtodos, devido a sua sensibilidade, permitem a distino mais acurada entre a expresso constitutiva e a induzida do ccP450, j que em condies ambientais realsticas o xenobitico (agente indutor) usualmente ocorre em concentraes to baixas que no incrementam significativamente a quantidade total de complexo citocromo oxidase

P450(MELANCON, 1995). Em peixes, a monoxigenase associada ao complexo citocromo oxidase P450cuja atividade mais utilizada como biomarcador a 7ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD), como por STIEN et al. (1997), isso por ter baixa ou indetectvel atividade em animais no contaminados. Alguns compostos orgnicos so metabolizados no fgado (FASE I) tornando-se eletrfilos e portanto capazes de causar um decrscimo nos nveis de GSH in vivo. Indutores do sistema MFO podem contribuir nesse efeito e gerar hepato-toxicidade, caso o excesso de eletrfilos permanea aps os nveis de GSH terem sido significativamente reduzidos (PLUMMER et al., 1991). Alteraes na atividade da EROD heptica ou no sistema MFO podem estar envolvidas no somente com a exposio a xenobiticos orgnicos, mas tambm com disfunes no sistema reprodutor neuro-endcrino, estas causadas por outra classe de contaminantes. O catabolismo dos hormnios sexuais esterides dependente da atividade das monoxigenases do sistema MFO e modulao recproca constatada, ou seja, induo do sistema MFO por substncias com ao hormonal (KIME, 1999). Estudos de estrogenicidade in vitro com hepatcitos de truta demonstram reduo na atividade e na expresso do ccP450, correlacionada com o aumento da concentrao de estradiol e com o tempo de exposio das clulas. H inibio da atividade da EROD aps 72 horas e decrscimo na quantidade de RNAm do

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citocromo 1A aps 48 horas de exposio ao estradiol a 1 M (NAVAS e SEGNER 2001). A vitelogenina (VTG) uma glico-fosfo-lipoprotena de alta massa molecular (de 170 a 200 kDa, dependendo da espcie) sintetizada em hepatcitos sob controle multi-hormonal: a transcrio de seu RNAm ativada por estrgenos, principalmente o 17-estradiol (E2) aps ligao com o receptor nuclear (RE). A VTG o principal constituinte do vitelo de vertebrados ovparos, sendo liberada no sangue (aps exocitose nos hepatcitos) e incorporada pelo ocito sob controle da gonadotropina I (em peixes). A expresso heptica da VTG ou a supresso da mesma por fatores exgenos (xenobiticos ou xenoestrgenos) tm sido usadas em peixes como indicadores de efeitos (anti)estrognicos, ou seja, estrognicos em machos e jovens, ou anti-estrognicos em fmeas, respectivamente, como revisado por KIME (1999) e OOST, BEYER e VERMEULEN (2003). REIS-HENRIQUES et al. (1997, 2000) encontraram evidncias, in vitro e in vitro, de que a concentrao de VTG no ocito de Oncorhynchus mykiss regula a produo da prpria VTG no fgado, por modular a produo de E2 pelo ovrio. O sistema reprodutor neuro-endcrino de peixes pode ser definido por uma complexa organizao realizada por estruturas diversas, das quais os neurohormnios, neurotransmissores, hormnios clssicos (peptdicos ou esterides) e seus receptores tm crucial importncia na sinalizao intercelular, seja ela parcrina, sinptica, endcrina ou autcrina. Um esquema simplificado dessa organizao referida consta na figura 1. De forma geral, assume-se que esse sistema em peixes mais susceptvel a fatores exgenos (fsicos e qumicos) que em mamferos. KIME (1999) ressalta a importncia de se determinar qual processo da intrincada rede de interaes do sistema reprodutor de peixes mais susceptvel a um contaminante ambiental especfico. O alumnio causa um decrscimo na sntese de VTG (quantidade de protena e de RNAm) em culturas primrias de hepatcitos de Oncorhynchus mykiss induzidas por E2: a inibio mostrou-se dependente da concentrao de alumnio e no houve efeito de proteo pelo clcio, mas houve restaurao dos

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nveis de VTG, 7 dias depois o metal ter sido suprimido do meio de cultivo por MUGIYA e TANAHASHI (1998) e HWANG, NAGAWA e MUGIYA (2000). Resultados semelhantes foram obtidos pelo mesmo laboratrio em relao ao cdmio, contudo a resposta no foi dependente das concentraes usadas (regresso linear no significativa) e no houve restaurao da sntese aps a supresso do metal. Em reviso, HEATH (1995) relata que o cdmio tambm est envolvido com altos nveis de hormnios sexuais esterides em machos de truta expostos cronicamente, isso por inibir a atividade do ccP450, a eliminao normal pelo fgado e por estimular diretamente a sntese hormonal. O mercrio (inorgnico ou metilado) causa leses histopatolgicas nas clulas de Leydig (responsveis pela sntese de andrgenos) em Clarias sp expostos cronicamente. Isso veio acompanhado pelo decrscimo dos teores de colesterol plasmtico, sugerindo um estmulo do catabolismo heptico ou uma inibio da sntese da molcula. O chumbo foi relatado como supressor da liberao de gonadotropinas em peixes, provavelmente por alterar os nveis de dopamina no hipotlamo, o que inibe a espermatognese e a produo de andrgenos, bem como reduz o crescimento gonadal e os nveis de estradiol em fmeas.

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CAPTULO I

BIOMARCADORES NO SANGUE DE TRARA ( HOPLIAS MALABARICUS )

COLABORAO : Francisco Filipak Neto, M.Sc. Maritana Mela, M.Sc. Prof. Dr. Helena Cristina da Silva de Assis

Publicaes Relacionadas: OLIVEIRA RIBEIRO, C. A.; FILIPAK NETO, F.; MELA, M.; SILVA, P. H.; RANDI, M. A. F.; RABITTO, I. S.; ALVES COSTA, J .R. M.; PELLETIER, E. Hematological findings in neotropical fish Hoplias malabaricus exposed to subchronic and dietary doses of methylmercury, inorganic lead and tributyltin. Environmental Research (no prelo). 2006. ALVES COSTA, J .R. M.; MELA, M.; SILVA DE ASSIS, H. C.; PELLETIER, .; RANDI, M. A. F.; OLIVEIRA RIBEIRO, C. A. Enzymatic inhibition and morphological aspects of dietary lead (II) and methylmercury exposure in Hoplias malabaricus. Ecotoxicology and Environmental Safety (no prelo). 2006.

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I.1 INTRODUO

I.1.1 INIBIO DA -AMINOLEVULINATO DESIDRATASE

A -ALAd (E.C.: 4.2.1.24) um componente citoslico da clula eucaritica e que requer indiretamente o metal zinco para sua atividade normal (vide 3, figs.1 e 2). A -ALAd uma enzima no funcional em eritrcitos de mamferos, j que a formao da hemoglobina (HB) est completa antes da circulao de clulas vermelhas no sangue. Por conseqncia a inibio da atividade cataltica pode ocorrer no acompanhada do quadro clnico sistmico (anemia), do decrscimo em produo de
HEME

nas mitocndrias e do acmulo de seus precursores (porfiria)

nas clulas e tecidos (HODSON; BLUNT; WHITTLE, 1984). Em peixes a -ALAd eritrocitria tambm remanescente da sntese de HB que ocorreu em clulas hematopoiticas, e embora os eritrcitos de peixes possuam ncleo (HEATH, 1995), esta organela aparentemente inativa e a sntese de
HEME

no pode

ocorrer devido ausncia de mitocndrias (ALVES COSTA, 2001), encontradas somente nos estgios prematuros dos eritroblastos. Com o decrscimo da atividade enzimtica o substrato (-ALA) aumenta em concentrao, podendo ser excretado pela urina e nela detectado e quantificado (tcnica difcil para peixes); em peixes a enzima um bom indicador de hematopoiese e a inibio induzida pode ser medida no fgado, rins, bao e sangue (HODSON; BLUNT; WHITTLE, 1984). Alteraes da capacidade cataltica da -ALAd eritrocitria tm sido estudadas por mtodos que envolvem ensaios bioqumicos e quantificao por fotometria. Tal metodologia, aplicada a peixes por vrios autores na dcada de 70, foi considerada como uma rpida, consistente, especfica e sensvel estimativa para concentraes de chumbo causando danos subletais (HODSON, 1976). Alm disso o mtodo serviria identificao de fontes de disperso do metal, por estimar graus de exposio de populaes in natura. HODSON et al. (1977) evidenciam correlaes lineares significativas entre o logaritmo de concentraes

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de chumbo na gua e no sangue e a atividade mensurvel da enzima dos eritrcitos. Desde ento poucos trabalhos tm sido publicados, considerando estudos com a atividade desta enzima proveniente de tecidos de peixes. De fato apenas dez publicaes foram encontradas disponveis na rede internacional de computadores, em http://www.sciencedirect.com/, atravs do cruzamento de dados entre: aminolevulinic acid dehydratase e fish. O mais recente desses trabalhos (CAMPANA, SARASQUETE e BLASCO, 2003) apresenta na sua discusso uma relao de referncias (tabela), nas quais o efeito do chumbo sobre a -ALAd de peixes foi reportado. Essa tabela est reproduzida no anexo 1. Dessa relao, o trabalho mais recente de BURDEN, SANDHEINRICH e CALDWELL (1998), que descrevem um mtodo que permite a quantificao da atividade da ALAd em pequenos peixes inteiros, dos quais difcil a extrao de tecidos. A -ALAd j foi tambm utilizada em campo, juntamente com outros biomarcadores, em estudos de regies contaminadas (bioensaios in situ com Ictalurus punctatus), por MARTIN e BLACK (1996, 1998). Como fonte enzimtica de -ALAd, AISEMBERG et al. (2005) utilizam invertebrados de gua doce, num estudo acerca da sensibilidade da inibio aferida para se monitorar exposies de chumbo no ambiente. Para OGUNSEITAN, YANG e ERICSON (2000) a atividade bacteriana da -ALAd serviu como biomarcador confivel para se inferir a biodisponibilidade do chumbo em ambientes contaminados. No Brasil, a academia gacha (UFSM e UFRS) d grande contribuio com o estudo da atividade da enzima em mamferos (ratos e camundongos), a partir de vrios tecidos como crebro, rins, fgado e sangue (in vivo ou in vitro) e frente a vrios tipos de xenobiticos, demonstrando a inibio por metais divalentes como Pb++, Cd++ e Hg++ ou a restaurao da atividade da -ALAd com drogas especficas (quelantes de metais ou sais de selnio ou zinco), assim como mensurando tambm parmetros de estresse oxidativo que acompanham a porfiria: ROCHA et al. (1995); NOGUEIRA et al. (2003); FARINA et al. (2003); PEIXOTO et al. (2003); PEIXOTO, ROZA e PEREIRA (2004); PEROTTONI et al. (2004a, 2004b).

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I.1.2 PARMETROS HEMATOLGICOS

Parmetros hematolgicos mensurveis so considerados como indicadores pato-fisiolgicos para o organismo como um todo (em nvel sistmico) e portanto so importantes em diagnsticos do status estrutural e funcional de peixes expostos a xenobiticos (ADHIKARI et al., 2004). Estudos hematolgicos amide provm procedimentos para o diagnstico de doenas em mamferos (RANZANIPAIVA et al., 2000), e na aqicultura, para se avaliar interaes entre diferentes nveis de nutrientes da dieta (LIM et al., 2000). Embora as condies do sangue de peixes venham sendo cada vez mais utilizadas em programas de biomonitoramento como indicadores de alteraes fisiolgicas, segundo BOLS et al. (2001) e AFFONSO et al. (2002), o mais importante bice para o uso desses dados em estudos ambientais a falta de informao bsica sobre a resposta do sangue contra agentes exgenos e principalmente em espcies tropicais. A contagem de eritrcitos (RBC), a concentrao de hemoglobina no sangue total ([HB]), o hematcrito percentual (Ht), o volume corpuscular mdio (MCV), a quantidade de hemoglobina corpuscular mdia (MCH) e a concentrao de hemoglobina corpuscular mdia (MCHC) so alguns dos parmetros

hematolgicos comumente utilizados em peixes (HEATH, 1995), assim como o foram por CERQUEIRA e FERNANDES (2002), numa avaliao da exposio de Prochilodus scrofa ao CuSO4. Tais parmetros, do sangue de Hoplias malabaricus foram utilizados por RIOS, KALININ E RANTIN (2002) e RIOS et al. (2005) num estudo das adaptaes fisiolgicas desenvolvidas pela trara, quando sujeitas a longos perodos de jejum (at 240 dias). Anemia um quadro clnico sistmico definido pelo decrscimo de [HB] funcional, seja por uma quantidade inadequada de [HB] nos eritrcitos ou por uma reduo no nmero desses. O Pb++, o Cd++, o Hg++ foram relatados por causar anemia em peixes (HEATH, 1995). Embora mais txico que o Hg++, o H3C-Hg+ aparentemente tem um efeito mais brando sobre o sangue de peixes, como revisado por HEATH (1995) e em relao a anemia e valores de Ht de peixes.

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Contudo o organometal pode se ligar de forma reversvel com as sulfidrilas (SH) da HB de eritrcitos de truta (MASSARO, 1974). O H3C-Hg+ um xenobitico altamente lipoflico que facilmente atravessa a barreira natural imposta pelo sangue (distribuio, diluio, imobilizao, excreo, sistema porta-heptico) e sua via principal de exposio d-se pela ingesto de alimentos contaminados (LIMKE; HEIDEMANN; ATCHISON, 2004). O objetivo do trabalho apresentado neste captulo a padronizao e constatao do uso da atividade da -ALAd eritrocitria e de um conjunto de parmetros hematolgicos como biomarcadores efetivos, para indicar as condies fisiolgicas do sangue de Hoplias malabaricus frente a exposies subcrnicas por via trfica. Nesse caso o Pb++ foi utilizado pela sua conhecida ao inibitria sobre a atividade da -ALAd eritrocitria de peixes e o H3C-Hg+, como substncia teste. A -ALAd eritrocitria portanto abordada como um indicador da continuidade da exposio a metais, e da biodisponibilidade destes, aps longo perodo experimental, e o conjunto de parmetros hematolgicos, como indicadores das condies fisiolgicas momentneas do sangue.

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I.2 MATERIAIS E MTODOS

I.2.1 BIOENSAIOS

Dezoito espcimes de Hoplias malabaricus (trara) foram obtidos comercialmente de uma estao de aqicultura localizada no municpio de Toledo (PR). Outros dezoito animais foram capturados na Fazenda Experimental Canguiri da UFPR, municpio de Quatro Barras (PR), bacia da rio Iguau. Os animais de Toledo serviram exclusivamente para a exposio ao H3C-Hg+, e seu respectivo grupo controle (experimento I descrito abaixo). Os animais da Canguiri serviram para a exposio ao Pb+, e seu grupo controle (experimento II). Todos os animais (180,8 g; DP = 57,1 g) foram aclimatados nas condies experimentais por 30 dias: cada animal em um aqurio com 30 litros de gua de torneira desclorificada; limpeza do aqurio a cada 5 dias, com troca de 10 litros da gua; influxo de ar constante; temperatura de 21 2oC; e fotoperodo (12h luz : 12h escuro). Essas condies foram mantidas e controladas at o fim dos experimentos I e II. O suprimento alimentar deu-se com peixes jovens, indivduos vivos de Astyanax sp. (lambaris) da Bacia do rio Iguau (PR). Cada trara foi alimentada com um lambari (~10% de sua biomassa) a cada cinco dias. Isso para garantir a ingesto num condicionamento comportamental necessrio para a administrao das doses por via trfica. Alm disso RIOS, KALININ E RANTIN (2002) e RIOS et al. (2005), num estudo de restrio alimentar em Hoplias malabaricus (at 240 dias de jejum experimental), alimentaram suas traras do grupo controle com 2% de sua biomassa por dia, quantidade equivalente a aqui utilizada. Todas as condies experimentais para os bioensaios aqui descritos mantiveram um padro pr-estabelecido, da chegada do animal ao laboratrio at o dia em que foi sacrificado, incluindo: a aclimatao s condies experimentais (nunca inferior a 20 dias); a desinfestao do animal (ectoparasitas); a desinfeco prvia da gua (ao bactericida e fungicida antes da aclimatao); cuidados relativos a fotoperodo, qualidade da gua e suprimento alimentar; e

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manipulaes como pesagens, distribuio espacial nos aqurios e coleta de sangue e rgos (toda manipulao sempre precedida de anestesia). Ao final das exposies, aps 70 dias (14 doses) todos os indivduos foram anestesiados em gua de torneira desclorificada com MS222 (cido etil-ster-3aminobenzico, Sigma) a 0,02% (v/v), antes da extrao das amostras biolgicas, seguida de eutansia. Aproximadamente 1 ml de sangue de cada animal foi extrado do vaso caudal situado na poro ventral da coluna vertebral, com seringas contendo 0,1 ml de heparina (aps encher e esvaziar a seringa), cujas agulhas foram inseridas na regio posterior do animal, logo aps a nadadeira anal. O sangue foi congelado imediatamente em nitrognio lquido at os procedimentos do ensaio bioqumico para atividade da -ALAd eritrocitria. Outras alquotas das mesmas amostras foram sujeitas imediatamente aferio dos parmetros hematolgicos.

I.2.1.1 Experimento I

Nove traras foram contaminadas com H3C-Hg+, a partir do H3C-Hg.Cl (diludo em soluo aquosa de HCl 1 mM) e 9 traras foram mantidas como controles. A contaminao ocorreu a cada cinco dias, quando as presas foram injetadas intraperitonealmente com a soluo supracitada. Os animais do grupo controle se alimentaram com presas injetadas com HCl 1 mM em soluo aquosa. O volume de cada injeo variou de acordo com a biomassa de cada animal experimental, para o estabelecimento da seguinte dose nominal ingerida: 75 ng H3C-Hg+.g-1. Esta foi determinada por OLIVEIRA RIBEIRO et al. (1999 e 2000) de acordo com dados de estudos em reas impactadas na Amaznia.

I.2.1.2 Experimento II

Oito traras foram contaminadas com Pb++, a partir do Pb(NO3)2 diludo em soluo aquosa neutra e nove traras foram mantidas como controles. A contaminao ocorreu a cada cinco dias, quando as presas foram injetadas

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intraperitonealmente com a soluo supracitada. Os animais do grupo controle se alimentaram de presas injetadas com gua destilada. O volume de cada injeo variou de acordo com a biomassa de cada animal experimental, para o estabelecimento da seguinte dose nominal ingerida: 21 g Pb++.g-1. Esta dose foi administrada por RABITTO et al. (2005) em Hoplias malabaricus e determinada por ALVES COSTA (2001), considerando: a) fator de concentrao (FC) proposto por VIGHI (1981) para peixes que so consumidores secundrios (FC = 3.103 g.l-1) em ambientes aquticos contaminados por Pb++ (dados de biomonitoramentos); b) a mdia das concentraes de chumbo total na gua do rio Ribeira (27,88 g.l-1), municpio de Registro (SP), durante uma srie histrica de monitoramento (CETESB, 1978-97). Na poca da srie supracitada, o limite mximo permissvel para concentrao de chumbo total na gua estabelecido pela legislao brasileira, segundo a resoluo do CONAMA n. 20 (BRASIL, 1986) era de 30 g.l-1.

I.2.2 QUANTIFICAO DA ATIVIDADE DA -ALAd ERITROCITRIA

O mtodo empregado para a atividade da -ALAd eritrocitria foi modificado de HODSON (1976), HODSON et al (1977), RODRIGUES (1986) e BAINY (1990) e padronizado para Oreochromis niloticus por ALVES COSTA (2001). Uma padronizao semelhante para Hoplias malabaricus foi aqui realizada, incluindo-se parmetros de cintica enzimtica. Para os ensaios bioqumicos foram necessrias as seguintes solues: a) Tampo fosfato monossdico/dissdico: fosfato de sdio dibsico a 0,1 M e fosfato de sdio monobsico a 0,1 M, pH 6,3 (TF); b) Soluo A: Triton X-100 a 0,5% em TF; c) Soluo B: -aminolevulinato-hidrocloreto (-ALA.HCl) a 804 gml1 em A; d) Soluo P: soluo de cido tricloroactico (TCA) a 40 g.ml-1 com cloreto de mercrio (HgCl2) a 99,45 mM;

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e) Soluo E: reagente de Ehrlich (reagente de cor): 18,18 mg.ml-1 de dimetil-amino-benzaldedo; 3,18 mg.ml-1 de HgCl2; 76,36% (v/v) de cido actico glacial; e 18,18% (v/v) de cido perclrico a 70% (HClO4). O sangue total de cada peixe foi descongelado sob gelo modo e uma alquota serviu quantificao da hemoglobina (em g.dl1) pelo mtodo fotomtrico da cianometa-hemoglobina (BEUTLER et al., 1995); outra alquota (25 l) serviu hemlise (com Triton X-100) na razo final de 1:12 (v/v) no meio de reao (volume final da reao de 300 l). O substrato (-ALA.HCl) se fez presente na reao (soluo B) na concentrao final de 4 mM de -ALA, exceto nos brancos (soluo A) e o preparado foi incubado por 1 h a 37oC. A concentrao final de -ALA na incubao promoveu sensibilidade (velocidade constante de reao), garantindo a disponibilidade do substrato (saturao). Aps a interrupo da reao enzimtica com banho de gelo (0oC) seguido de precipitao com TCA/HgCl2 (adio de 700 l da soluo P, por amostra) as alquotas foram centrifugadas a 4oC, sob a fora de 5000g por 5 minutos e o sobrenadande (100 l) pipetado sobre microplaca (96 poos) de leitura em fotmetro. Para os brancos, a adio de 700 l da soluo P se deu antes da incubao, para se evitar qualquer reao com eventuais quantidades de substrato endgeno. Todo o material usado, at a parada da reao, foi mantido sobre gelo modo ou refrigerado a 4oC. O resultado final do ensaio correspondeu quantificao do produto da catlise da -ALAd, o porfobilinognio (PBG), que produz a cor vermelho-rsea quando reage com a soluo E (100 l por poo). A intensidade da cor varia com a concentrao de PBG e isto mensurvel pelo fotmetro (Tecan Sunshine) com o filtro para absoro da luz com 550 nm de comprimento de onda. Todas as amostras foram lidas exatamente 15 minutos aps a adio do reagente de cor. A atividade pde ser expressa em unidade relativa, por concentrao de hemoglobina, por tempo. Para tal empregou-se a equao:

Atividade

(absorbncia) (D) (t) ([HB])

(1)

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Onde: a) absorbncia: mdia de cada ensaio (pelo menos trs reaes por amostra de sangue) menos absorbncia mdia dos brancos; b) D: fator de diluio do reagente de Ehrlich (D = 2); c) t: tempo de incubao (em h); d) [HB]: concentrao de hemoglobina no sangue (em gdl1). Antes da quantificao das amostras experimentais (dos bioensaios), vrios ensaios foram conduzidos com amostras de sangue de 20 exemplares de Hoplias malabaricus capturados em pesque-pagues da bacia do Rio Iguau (PR), no intuito de padronizar alguns dos parmetros de cintica enzimtica, a saber: kM de -ALA e temperatura tima de reao. Esses 20 animais receberam o mesmo tratamento descrito em I.2.1, exceto pela administrao dos contaminantes.

I.2.2.1 Anlises Estatsticas para -ALAd

Os valores numricos foram analisados com uso do programa GraphPad PRISM, v.3.00, 1994-1999. Uma curva de saturao de substrato (hiprbola retangular a partir da equao de Michaelis-Menten) foi calculada, demonstrando a velocidade de reao enzimtica em funo da concentrao de -ALA. A plotagem de Lineweaver-Burke e uma curva de temperatura (polinmio de terceira ordem) tambm ilustram parmetros da cintica da enzima. A atividade da -ALAd e a concentrao de HB foram analisadas por: a) ANOVA a um critrio para comparao entre as mdias dos grupos, com nvel crtico de significncia de 5%; b) seguida do teste de Tukey, para comparaes mltiplas entre os grupos (cada qual com todos os outros), com 5% de significncia; esse teste serviu para se estabelecer (ou no) a diferena significativa entre os dois grupos controles (um para o Pb++ e outro para o H3C-Hg+); c) ou seguida do teste de Dunnett com um nvel de significncia de 1%; para comparao dos tratamentos com seu respectivo grupo controle,

33
ou com o grupo resultante da unio dos grupos controles, caso fossem estatisticamente iguais.

I.2.3. PARMETROS HEMATOLGICOS

Aps as exposies as amostras de sangue foram coletadas como descrito em I.2.1, mas no congeladas, e sim sujeitas imediatamente aferio dos seguintes seguintes parmetros hematolgicos: a) contagem de eritrcitos (RBC), expressa em 106 clulas.l-1; b) concentrao de hemoglobina no sangue total ([HB]), em g.dl-1; c) hematcrito percentual (Ht), que o volume do sangue total correspondente ao volume dos eritrcitos, expresso em v/v (%); d) volume corpuscular mdio (MCV), que o volume mdio dos eritrcitos (em m3 ou fl ), e calculado pela seguinte equao: MCV
=

Ht (absoluto) 1000 RBC (106 clulas.l-1)

(2)

e) quantidade de hemoglobina corpuscular mdia (MCH), que a quantidade mdia de hemoglobina no eritrcito, em massa (pg por clula), e calculada pela seguinte equao: MCH
=

[HB] (g.dl-1) 10 RBC (106 clulas.l-1)

(3)

f) concentrao de hemoglobina corpuscular mdia (MCHC), que a [HB] (g.dl-1) no sangue total, corrigida para o volume correspondente aos eritrcitos, calculada pela seguinte equao: MCHC
=

[HB] (g.dl-1) Ht (absoluto)

(4)

g) contagem diferencial de leuccitos (Lk), expressa em 104 clulas.l-1; h) contagem de diferencial neutrfilos (Nt), expressa em nmero (%) de neutrfilos contados a cada 100 leuccitos contados; i) contagem diferencial de clulas mononucleadas (Mn), expressa em nmero de linfcitos mais o nmero de moncitos a cada 100 leuccitos contados (%);

34
A contagem de eritrcitos (RBC) deu-se por microscopia de luz visvel, em cmara hemocitomtrica de Neubauer. O hematcrito percentual (Ht) foi determinado pelo mtodo de micro-hematcrito (HOUSTON, 1990), pelo qual as amostras foram centrifugadas por 5 min. a 2400g. A concentrao de hemoglobina no sangue total ([HB]) foi determinada pelo mtodo fotomtrico da cianometa-hemoglobina (BEUTLER et al., 1995).

II.2.3.1 Anlises Estatsticas para os Parmetros Hematolgicos

A anlise estatstica dos resultados empregou o programa Prism v. 3.0, sendo utilizado o teste t com um nvel crtico de significncia de 5%. Devido a distinta procedncia dos animais, os experimentos I e II foram analisados em separado.

35

I.3 RESULTADOS

No foi observada mortalidade em nenhuma das exposies subcrnicas, indicando que, nas doses administradas, o Pb++ e o H3C-Hg+ no apresentam efeito agudo sobre as funes vitais de Hoplias malabaricus. Outrossim, todos os animais receberam o mesmo nmero de doses, o que demonstrou que os xenobiticos, da forma como empregados, no causaram inapetncia em Hoplias malabaricus durante a exposio subcrnica e tambm no alteraram seu comportamento de captura de presas em confinamento laboratorial.

I.3.1. ATIVIDADE DA -ALAd ERITROCITRIA

O ensaio para atividade da -ALAd mostrou-se um mtodo simples, rpido e de baixo custo, para se evidenciar exposio subcrnicas comparando grupos experimentais, mesmo quando os resultados so expressos em valores relativos de absorbncia, como aqui foram. A concentrao de substrato em que a velocidade da reao corresponde 50% da velocidade mxima, para a -ALAd eritrocitria de Hoplias malabaricus foi de kM = 0,3653 mM (r2 = 0,9167; n = 7 animais), 8 reaes (concentraes de ALA) por amostra de sangue de cada animal (grf. 1). A concentrao final de ALA utilizada no meio de reao (incubao) foi de 4 mM, cerca de onze vezes o kM, valor muito prximo do utilizado por HODSON et al. (1977) para quatro espcies de telesteos (4,257 mM). Outrossim, o pH do meio de reao (6,3) tambm foi prximo ao utilizado para as mesmas quatro espcies (pH = 6,3). Aps aclimatao s condies experimentais, a atividade da -ALAd eritrocitria de Hoplias malabaricus aumenta com o acrscimo da temperatura de reao at 56oC (n = 6 animais, grf. 2), a partir da qual declina. A temperatura de reao escolhida, por razes de logstica laboratorial, foi de 37oC. Uma pr-incubao com DNase de fago (0,25 mg.ml-1; por 1 h a 37oC), ou outra sem (por 1 h a 37oC) no afetaram significativamente a absorbncia obtida,

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quando comparadas com o valor de absorbncia sem nenhuma pr-incubao (n = 5 animais; dados no ilustrados). Contudo ambos os procedimentos de princubao aumentaram o volume de sangue total disponvel para pipetagem, aps o descongelamento das amostras, sendo o uso da DNase mais eficiente. Isso porque ao se congelar o sangue (hemlise) h a liberao do DNA dos eritrcitos, o que d uma consistncia gelatinosa a uma frao da amostra. Com as amostras provenientes do bioensaio no foram realizadas as pr-incubaes supracitadas, mas o problema foi resolvido coletando-se um volume maior de sangue, do que o necessrio para o ensaio bioqumico. As exposies in vivo a ambos os xenobiticos (Pb++ e H3C-Hg+) resultaram em inibio significativa (Dunnett: p < 0,01) da -ALAd eritrocitria de Hoplias malabaricus (grf. 3). No houve mortalidade durante o bioensaio.

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GRFICO 1 CURVA DE SATURAO DE SUBSTRATO ERITROCITRIA DE HOPLIAS MALABARICUS (-ALA) PARA A -ALAd

Atividade relativa: OD/ODmax

1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3

-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

Lineweaver-Burk
2.0 1.5

1/OD

1.0 0.5

0.2 0.1 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1/[ -ALA]

[ -ALA] (mM)
FONTE: NOTAS: O autor Regresso (hiprbola retangular) a partir da Equao de Michaelis-Menten: r2 = 0,917. Mdias erro padro (n = 7 animais), 8 reaes (concentraes de -ALA) por amostra de sangue de cada animal. Velocidade da reao corresponde 50% da velocidade mxima: kM = 0,3653 mM. Grfico inserido: plotagem de Lineweaver-Burke. Incubao a 37oC por 1 hora; valores de absorbncia a 550 nm (absorbncia) divididos pelo maior valor de absorbncia obtido em cada animal. Sistema ingls de escrita numrica.
MALABARICUS

GRFICO 2 ATIVIDADE DA -ALAd ERITROCITRIA DE HOPLIAS FUNO DA TEMPERATURA DE INCUBAO

2 .8 2 .4 2 .0 1 .6 1 .2 0 .8 0 .4 0 .0 0 9 1 8 2 7 3 6 4 5 (
O

EM

OD/OD A 37 OC

5 4

6 3

7 2

8 1

T E M P E R A T U R A

FONTE: NOTAS:

O autor Polinmio de 3.a ordem (r2 = 0,59); n = 6 animais; valores de absorbncia a 550 nm divididos pela absorbncia mdia obtida a 37oC para os 6 animais; incubaes de 1 hora. Sistema ingls de escrita numrica.

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GRFICO 3 INIBIO DA ATIVIDADE DA -ALAd ERITROCITRIA DE TRARA (HOPLIAS MALABARICUS) EXPOSTAS POR VIA TRFICA AO Pb++ E AO H3C-Hg+, POR 70 DIAS (14 DOSES)

0.07

(OD).(D).([HB]) -1.(t) -1

0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 CTRL Pb ++ HgCH 3+

**

**

FONTE: NOTAS:

O autor CTRL: 2 grupos controles (n = 9 + 9 animais). Pb++: grupo exposto a 21 g Pb++.g-1 de biomassa, a cada 5 dias (n = 8 animais). H3C-Hg+: grupo exposto a 75 ng H3C-Hg+.g-1 de biomassa, a cada 5 dias (n = 9). Valores de absorbncia aferidos a 550 nm. Incubao de 1 hora a 37oC. Sistema ingls de escrita numrica.

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I.3.2 PARMETROS HEMATOLGICOS A tabela 1 demonstra as mdias dos valores obtidos para os parmetros hematolgicos aqui considerados.
TABELA 1 PARMETROS HEMATOLGICOS ANALISADOS EM HOPLIAS MALABARICUS APS EXPOSIO TRFICA S DOSES DE 75 ng H3C-Hg+.g-1 E 21 g Pb++.g-1, A CADA 5 DIAS, POR UM PERODO TOTAL DE 70 DIAS (14 DOSES)
PARMETROS

EXPERIMENTO I Origem: Toledo (PR) Controle EPM H3C-Hg+ EPM 9 1,63 5,07 25,33 155,53 31,35 20,36 0,06 0,11 1,14 5,38 1,06 1,07 9 *1,91 ***6,02 ***35,22 ***185,4 31,90 *17,23 0,09 0,19 1,27 3,87 1,33 0,69

EXPERIMENTO II Origem: FE Canguiri (UFPR) Controle EPM Pb++ EPM 6 1,90 5,62 23,33 126,21 30,74 23,90 0,13 0,60 0,80 11,12 4,78 2,02 6 1,99 5,27 25,67 129,31 26,45 20,44 0,07 0,38 1,02 5,32 1,58 0,78

n (1) RBC (2) [HB] (3) Ht (4) MCV (5) MCH (6) MCHC (7) Lk (8) Nt (9) Mn (10)

3,96 0,26 3,78 0,62 96,22 0,62

***6,40 0,31 *8,89 1,73 *91,11 1,73

0,37 0,14 3,33 1,23 96,67 1,23

0,25 0,11 3,83 0,87 96,17 0,87

FONTE: o autor NOTAS: Teste t realizado para os experimentos I e II, em separado ( *p < 0,05; ***p < 0,001). Dados expressos em mdia ( erro padro mdio). (1) n: nmero de animais no grupo. (2) RBC: contagem de eritrcitos (106 clulas.l-1). (3) [HB]: concentrao de hemoglobina (g.dl-1). (4) Ht: hematcrito percentual (%). (5) MCV: volume corpuscular mdio (m3). (6) MCH: hemoglobina corpuscular mdia (pg.clula-1). (7) MCHC: concentrao de hemoglobina corpuscular mdia (%). (8) Lk: contagem de leuccitos (104 clulas.l-1). (9) Nt: contagem de neutrfilos (neutrfilos.[100 leuccitos contados]-1). (10) Mn: contagem de clulas mononucleadas ([linfcitos + moncitos].[100 leuccitos contados]-1)

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I.4 DISCUSSO

Embora o Pb++ no sofra biomagnificao, ou seja, um aumento de concentrao com a ascendncia da cadeia trfica, muitos organismos aquticos, inclusive peixes, podem absorver e acumular altas concentraes de chumbo (PAIN, 1995) e em geral considera-se que este metal possui efeitos cumulativos em peixes (VIGHI, 1981). Contudo sua biodisponibilidade e a tendncia de organismos aquticos em acumul-lo em seus tecidos no so temas

suficientemente elucidados, quando em relao a estudos com outros metais. Sabe-se que em trabalhadores sob exposio ocupacional ao chumbo, 35 81% do metal no sangue est associado -ALAd eritrocitria, com uma capacidade limitada a 850 g.l-1 (dissociao constante de 1,5 g.l-1) e que nenhuma ligao do chumbo com a hemoglobina foi encontrada (BERGDAHL et al., 1998). Os resultados confirmam a inibio da -ALAd eritrocitria de Hoplias malabaricus, aps a exposio experimental trfica e subcrnica ao Pb++ (grf. 3). Pode-se inferir com segurana que Hoplias malabaricus absorveu pelo trato intestinal, o Pb++ contido nas doses ingeridas. ALVES COSTA (2001) encontrou inibio semelhante para Oreochromis niloticus, em exposio aguda por via hdrica (semi-esttica). De outra forma, CAMPANA, SARASQUETE e BLASCO (2003) no encontraram inibio da -ALAd do fgado, rim e sangue de Halobatrachus didactylus, sete dias aps a injeo nica (dose intraperitoneal) de 1 ng Pb++.g-1 de biomassa. O metal tambm no causou peroxidao lipdica em clulas do rim e do fgado, embora tenha se acumulado nos tecidos de acordo com a seguinte ordem: rim > fgado > sangue. Os teores de chumbo no sangue dos animais injetados se igualaram aos dos animais controles, demonstrando que a dose estudada foi muito baixa para inibir a -ALAd eritrocitria. O mercrio um poluente ubquo que desregula muitas rotas bioqumicas em organismos. Recentemente experimentos com ratos demonstraram inibio da atividade da -ALAd proveniente do rim de ratos injetados por via subcutnea

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com 17 mol HgCl2.kg-1 (PEROTTONI et al., 2004a, 2004b). A interao do Hg++ com os grupos sulfidrila (STOHS e BAGCHI, 1995) no stio ativo da enzima podem explicar tal fenmeno. Neste trabalho, uma exposio por via trfica de 75 ng H3C-Hg+.g1 de biomassa, a cada 5 dias e por 70 dias (14 doses) inibiu consistentemente (49% sobre a atividade controle; p < 0,01; grf. 3) a -ALAd eritrocitria de Hoplias malabaricus. Este o primeiro estudo experimental que demonstra o efeito do H3C-Hg+ em baixas doses sobre a atividade da -ALAd. Uma hiptese para explicar a inibio seria a ligao do organometal com os grupos sulfidrila, no stio ativo da -ALAd. Em adio pode-se deduzir danos oxidativos em tecidos hematopoiticos e outros. Como conseqncia da exposio a metais pesados j foram relatadas, por STOHS e BAGCHI (1995) e FARINA et al. (2003), a peroxidao lipdica, homeostase alterada de clcio e componentes sulfidrlicos e danos no DNA. Entre outros metais pesados o mercrio e o chumbo podem interagir com a glutationa reduzida (GSH) e outros componentes que contenham grupos SH, como cistenas (livres ou no) e muitas protenas, diminuindo os teores celulares de grupos SH em estado reduzido, os quais atuam como tampes oxidativos naturais. Isso resulta na formao de espcies reativas de oxignio (STOHS e BAGCHI, 1995). De fato, outro experimento realizado pelo Laboratrio de Toxicologia Celular (SCB-UFPR), com a mesma dose de Pb++ utilizada neste estudo e tambm administrada a cada 5 dias, demonstrou forte evidncia de danos genticos no rim anterior (tecido hematopoitico) de Hoplias malabaricus: quebras em cromtides, inverses pericntricas e fragmentos cromossmicos (CESTARI et al., 2004). A freqncia das alteraes cromossmicas aumentou com o tempo de exposio (de 4 para 8 doses) e danos no DNA de eritrcitos foram observados pelo teste cometa aps 13 doses. O acmulo celular de -ALA (precursor do grupo
HEME)

est envolvido com

danos oxidativos devido a produo de espcies reativas de oxignio (DEMASI et al., 1996). Portanto, pode-se supor com a inibio da -ALAd, um efeito adverso indireto (em relao ao efeito oxidativo direto supracitado) do Pb++ e do H3C-Hg+

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nas estruturas do DNA e cromossmica de vrios tipos celulares, notoriamente eritrcitos (ou seus precursores), hepatcitos e clulas renais. Tal efeito oxidante tambm est relacionado a uma suposta quebra da estrutura macromolecular do citoesqueleto, pois interaes qumicas com a rede de microtbulos podem gerar genotoxicidade. O surgimento de microncleos pode ser conseqncia de interaes de metais com a tubulina e/ou a quinesina. H constatao da induo dose-dependente de microncleos, por sais de chumbo e mercrio, que interferem in vitro com a formao dos microtbulos, e alteram a segregao cromossmica via interao com as protenas do citoesqueleto (THIER et al., 2003). Em adio, ALVES COSTA (2001), RABITTO et al. (2005) e MELA et al. (submetido) demonstraram que o Pb++ e o H3C-Hg+ induzem alteraes morfolgicas na ultra-estrutura de hepatcitos de Hoplias malabaricus, e que isso est relacionado ao tempo de exposio; e ainda sugerem como causa, mudanas operacionais na dinmica dos filamentos intermedirios (lmina nuclear) ou das tubulinas (microtbulos). Trutas expostas via hdrica ao chumbo, em concentraes de 10, 75 e 300 g.l-1, por 30 dias, apresentaram 21, 74 e 86% de inibio da -ALAd eritrocitria, respectivamente, apresentando anemia somente na concentrao mais alta (JOHANSSON-SJOBECK e LARSSON, 1979). Segundo os autores a enzima possui grande capacidade de reserva, j que as suas funes normais (hematopoiese em nvel sistmico) so possveis apenas com 25% de sua capacidade cataltica normal. Isso demonstra a importncia da enzima nos organismos, o que tambm est implcito no fato de sua estrutura ter sido bem conservada no processo evolutivo, j que integra sistemas imprescindveis na clula eucaritica ou em bactrias aerbicas. Desta ampla e crucial ocorrncia tm-se que sua atividade deva ser utilizada como biomarcador sensvel em programas de biomonitoramento. Nesse mbito, a inibio da -ALAd eritrocitria mostra-se como um eficiente biomarcador de efeito para danos oxidativos em sistemas hematolgicos (ou

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outros tecidos e processos celulares), como pode-se deduzir a partir de: MONTEIRO et al. (1985), STOHS e BAGCHI (1995), DEMASI et al. (1996), FARINA et al. (2003), GURER-ORHAN, SABR e ZGNES (2004), PEROTTONI et al. (2004a, 2004b), CESTARI et al. (2004). Outrossim, a atividade da -ALAd serviu como biomarcador de exposio metais pesados divalentes e suas fontes, como em JOHANSSON-SJOBECK e LARSSON (1979), MARTIN e BLACK (1996, 1998), BURDEN, SANDHEINRICH e CALDWELL (1998), OGUNSEITAN, YANG e ERICSON (2000), CAMPANA, SARASQUETE e BLASCO (2003). Os parmetros hematolgicos aferidos com o sangue de Hoplias malabaricus no apresentaram alteraes relacionadas com as exposies ao Pb++, quando este grupo foi comparado com seu controle. Contudo todos os parmetros aferidos, exceto MCH, apresentaram diferena significativa entre o grupo tratado com H3C-Hg+ e seu grupo controle. Os valores de Ht observados em sangue de Hoplias malabaricus nos grupos controles (25,33% e 23,33%) aproximam-se de outros, relatados para espcies de peixes tropicais como Ictalurus punctatus (23,9%; LIM et al., 2000) e Colossoma macropomum (2023%; AFFONSO et al., 2002); mas so distintos daqueles de outras espcies como Oncorhynchus mykiss (35,6%; MATTSSON et al., 2001) e Rhandia quelen (35,3%; LERMEN et al., 2004). Para Hoplias malabaricus da bacia do rio Mogi-Guau, So Carlos (SP), RIOS, KALININ e RANTIN (2002) e RIOS et al. (2005) encontraram valores de RBC ( 2.106 clulas por l ou mm3) e de Ht ( 26,5%), prximos daqueles aqui aferidos nos animais controles. Metais pesados divalentes, como o Pb++, o Cd++ ou o Hg++, causam anemia em peixes expostos por longos perodos (HEATH, 1995), ou a reduo do Ht de peixes expostos ao Cr++ de forma aguda (LOHNER et al., 2001); este ltimo fenmeno tambm foi observado por MATTSSON et al. (2001) em Oncorhynchus mykiss sob efeitos de restries na dieta e exposio a efluentes orgnicos de uma fbrica de papel.

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Para Barbus conchonius foi constatada a reduo de 1231% nos valores de RBC, Ht, [HB] e MCV, aps exposio hdrica a 47 g Pb++.l-1 por at 60 dias (TEWARI; GILL; PANT, 1987). Esta reduo no foi observada para Hoplias malabaricus no presente estudo. Por outro lado, para a exposio trfica ao H3CHg+ (em dose bem inferior que a usada para o Pb++) observou-se aps 70 dias um aumento nos valores de RBC, [HB], Ht, MCV, Lk, e Nt. O aumento em RBC, [HB] e Ht est relacionado exposio aguda de Prochilodus scrofa (curimbat) ao CuSO4, e os valores normais s foram reestabelecidos aps o stimo dia de transferncia dos animais para gua livre de cobre (CERQUEIRA; FERNANDES, 2002). Os resultados observados aqui para o H3C-Hg+ esto de acordo com CHOWDHURY, MCDONALD e WOOD (2004), que mencionam que um acrscimo em [HB] e Ht est relacionado com um aumento da capacidade de transporte de O2, quando ocorrem danos nas trocas gasosas em tecidos, durante hipoxia e exposies crnicas ou agudas a metais em soluo (Cd++, Zn++, Cu++, Al++ e Ni++). MASSARO (1974) relatou que o H3C-Hg+ pode se ligar de forma reversvel com as sulfidrilas (SH) da HB de eritrcitos de truta e que isso est relacionado ao transporte de O2. Um aumento em RBC, como aqui observado para a exposio ao H3C-Hg+, geralmente est correlacionado a um aumento em [HB] e Ht (HEATH, 1995), e de acordo com AFFONSO et al. (2002), o acrscimo em valores de RBC sugere um aumento na capacidade de transporte de O2 pelo sangue. Valores de RBC de peixes tambm podem ser afetados por outros poluentes, como em Oncorhynchus mykiss aps exposio aguda ao alumnio (ALLIN e WILSON, 2000) e em Labeo rohita, aps exposio a teores subletais de cipermetrina e carbofurano (ADHIKARI et al., 2004). Em adio, CHOWDHURY, MCDONALD e WOOD (2004) discutem que outros mecanismos de toxicidade podem estar associados com a capacidade de transporte de O2, como no caso em que o Cd++, aps exposio trfica de Oncorhynchus mykiss, interage com hemoprotenas em clulas que desencadeiam a expresso do hormnio

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eritropoetina, uma precursora da produo de eritrcitos e hemoglobina durante deficincia de O2 (hipoxia). Um outro mecanismo possivelmente envolvido seria a inibio da absoro de ferro a partir do intestino causada pelo Cd++ (HEATH, 1995) e a conseguinte desregulao do metabolismo desse metal, encurtando o tempo de vida dos eritrcitos (LIU et al., 1999), atrasando a maturao dos eritrcitos, ou causando o colapso dessas clulas (HOUSTON et al., 1993), por aumentar a fluidez de suas membranas causando lise, o que foi atribudo a peroxidao lipdica no sangue de peixes (PALECE; MAJEWSKI; KLAVERKAMP, 1993). De fato o acrscimo nos valores de RBC, [HB] e Ht, aqui encontrados para o grupo exposto ao H3C-Hg+, acompanhou a inibio consistente da atividade da ALAd eritrocitria de Hoplias malabaricus (55,51% sobre a atividade controle; ver I.4), indicando a presena do organometal no sangue dos animais expostos. Ressalta-se que a sntese do grupo
HEME

em tecidos hematopoiticos essencial

para o transporte de O2 pela HB no sangue. O comprometimento desse tipo de organizao tecidual, nas traras que ingeriram H3C-Hg+, parece ter sido contornado por adaptaes fisiolgicas que permitiram a sobrevida do animal. Aps 30 dias de jejum experimental de Hoplias malabaricus, RIOS et al. (2005) relatam um decrscimo em eritropoiese evidenciado pela reduo na contagem de eritroblastos. Aps 150240 dias isso se refletiu no decrscimo dos valores de Ht, e aps 240 dias, no decrscimo dos valores de RBC. Os valores normais desses parmetros no foram recuperados com a realimentao, aps 240 dias de jejum. Durante 60150 dias de jejum houve um acrscimo de [HB], que logo depois (180 dias) refletiu-se num aumento de MCH e MCHC, o que pde ser explicado com a manuteno do volume mdio dos eritrcitos (MCV). De outra forma, o aumento no tamanho dos eritrcitos (MCV), nas amostras de sangue do grupo aqui exposto ao H3C-Hg+, sugere a presena de um grande nmero de clulas com tamanho e idade avanadas, como descrito por HARDIG e HOGLUND (1983). Como a quantidade mdia de hemoglobina por clula (MCH) no sofreu acrscimo, houve uma diluio da concentrao mdia de hemoglobina por clula (decrscimo no valor mdio de MCHC), acompanhada

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de um aumento na concentrao mdia de HB no sangue total. Isso demonstra que no momento em que as amostras de sangue foram coletadas (aps 70 dias de exposio) a taxa de eritropoiese estava comprometida (decrscimo). Contudo observou-se um aumento na contagem de eritrcitos (RBC), aqui atribudo no distino, na ocasio da contagem, entre eritroblastos e eritrcitos maduros. Portanto h fortes evidncias de que o H3C-Hg+ tenha causado alteraes na atividade hematopoitica e no mecanismo de renovao do estoque de eritrcitos em circulao de Hoplias malabaricus, aps 70 dias de exposio pela dieta. Essa resposta fisiolgica no ocorreu para os animais expostos ao Pb++, pois embora tenha sido neles constatada a inibio da -ALAd eritrocitria, no houve acrscimo em valores de RBC, [HB] e Ht. Isso sugere que mecanismos adicionais estejam envolvidos com o efeito txico do H3C-Hg+ em Hoplias malabaricus. Por outro lado h evidncias histopatolgicas e ultra-estruturais

encontradas pelo Laboratrio de Toxicologia Celular (SCB-UFPR), que reportam danos causados pelo Pb++ em rim anterior e fgado (rgos hematopoiticos em peixes) de Hoplias malabaricus (ALVES COSTA, 2001; RABITTO et al., 2005). Em vista desses fatos pode-se inferir que a espcie Hoplias malabaricus bastante resistente a condies adversas, podendo contornar situaes de estresse ambiental com adaptaes fisiolgicas. A persistncia na ocorrncia de populaes de traras em locais reconhecidamente contaminados por Pb++, contribui tal deduo, como pode ser observado no Alto Vale do rio Ribeira (SP/PR), onde durante 4 dcadas o rejeito de beneficiamento (concentrao por flotao) do minrio de chumbo foi despejado diretamente no sistema de drenagem da bacia (MORAES, 1997). Sabe-se que alteraes nos valores da contagem diferencial de leuccitos (Lk) aps exposies a poluentes podem estar associadas a um decrscimo em imunidade no especfica de peixes. Como efeito do H3C-Hg+, observou-se o aumento consistente no valor de Lk, quando comparado ao grupo controle; e numa comparao paralela, quando frente ao resultado obtido em relao ao Pb++ (ver tab. 1).

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Segundo GILL e PANT (1987), SINGH e REDDY (1990), e WEDEMEYER, BARTON e MCLEAY (1990) este resultado reconhecido como um sensvel indicador de estresse em peixes, o que tambm foi constatado por ADHIKARI et al. (2004) em Labeo rohita expostos a pesticidas e por CHOWDHURY, MCDONALD e WOOD (2004) em Oncorhynchus mikiss expostos ao Cd++ de forma crnica. Ressalta-se, contudo que os valores de Lk entre os animais controles das duas regies de origem de Hoplias malabaricus so muito diferentes, o que no permite uma comparao direta (com os dados absolutos) e concomitante para o efeito dos dois xenobiticos. De fato a Lk uma varivel susceptvel a diferentes padres patolgicos encontrados em peixes de diferentes regies (HEATH, 1995). Considera-se aqui que o acrscimo em Lk causado pelo H3C-Hg+ em Hoplias malabaricus caracteriza uma imuno-estimulao, esta relacionada com a ocorrncia de danos teciduais como necroses, relatadas em diferente tecidos de traras expostas ao H3C-Hg+ (OLIVEIRA RIBEIRO et al., 2002a). Por outro lado, a imunossupresso foi observada em Astyanax bimaculatus expostos ao tributilestanho (TBT) aps doses similares administradas por via intraperitoneal (OLIVEIRA RIBEIRO et al., 2002b), mas no foi observada em Hoplias malabaricus aps exposio trfica ao TBT (RABITTO et al., 2005). De acordo com WEDEMEYER, BARTON e MCLEAY (1990), a supresso do sistema imunolgico aumenta a susceptibilidade de peixes a patgenos, um aspecto importante quando se considera a presena de metais pesados em ecossistemas aquticos.

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CAPTULO II

TEORES TECIDUAIS DE METALOTIONENA EM TRARA ( HOPLIAS MALABARICUS )

COLABORAO : Sibelle Christine Glaser Jakobi, biloga Prof. Dr. Helena Cristina da Silva de Assis

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II.1 INTRODUO

A metalotionena (MT) uma estrutura polipeptdica pequena (cerca de 6 a 7 kDa ou 60 aminocidos) com nenhum aminocido aromtico ou heterocclico e com 1/3 desses resduos representado por cistenas ( 30), da sua composio marcadamente tilica, o que faz da estrutura um forte ligante de metais pesados: 7 tomos-grama de metal per mol de MT (VALLEE, 1991). Sua expresso celular induzvel por cdmio, cobre, zinco, mercrio, cobalto, bismuto, nquel e prata (MELANCON, 1995) e por metablitos no metlicos como glicocorticides, glucagon, interleucina 1, catecolaminas, progesterona, estrgenos, etanol, interferon e espcies reativas de oxignio, como relatado por VALLEE (1991), KGI (1991), VASAK e HASLER (2000). Dentre os processos celulares e fisiolgicos em que a MT est envolvida, destacam-se: regulao do metabolismo de zinco e cobre (influxo, distribuio, estocagem e excreo); infeces e inflamaes; estresses oxidativo e fsico; fome; mobilizao de zinco como componente integral para a sntese de enzimas e protenas; apoptose; crescimento neuronal; imobilizao citoslica de metais pesados e aumento da tolerncia fisiolgica aos mesmos. Para uma ampla abordagem acerca dessas informaes sobre as MTs, ver VALLEE (1991), TEMPLETON e CHERIAN (1991), BREMNER (1991), MCDONALD e WOOD (1993), HEATH (1995), VASAK e HASLER (2000). Desde a descoberta das MTs (fim da dcada de 50) considerveis avanos no conhecimento relativo ao isolamento, purificao, caracterizao molecular, seqenciamento de aminocidos (e genes relacionados) e regulao de sua expresso na clula tm sido obtidos: cerca de 200 seqncias de aminocidos distintas so atribudas MT de diferentes espcies (VALLEE, 1991; VASAK e HASLER, 2000). Nesse mbito, grande parte dos mtodos usados para o estudo das MTs, induzida por metais exgenos, so mais caros e demorados que os mtodos que envolvem a quantificao dos metais em si (MELANCON, 1995) ou a avaliao dos efeitos desses metais em outras instncias do organismo, sem o objetivo da caracterizao molecular.

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O desenvolvimento de mtodos indiretos para quantificao de MT em tecidos forneceu uma ferramenta til ao emprego de sua expresso celular como biomarcador de exposies a metais pesados. Tais mtodos valem-se de propriedades intrnsecas da molcula de MT, como a afinidade a metais e estabilidade em altas temperaturas: saturao com a prata (SCHEUHAMMER e CHERIAN, 1991); ensaio de afinidade de Cd-hemoglobina com quantificao diferencial do
109Cd

excedente, no ligado s MTs (EATON e CHERIAN, 1991) e

ensaios fotomtricos que quantificam grupos SH nas amostras (VIARENGO et al., 1997, 2000), entre outras possveis variaes. O mercrio inorgnico tem grande afinidade MT e substitui o cobre, o zinco ou o cdmio complexados molcula (VALLEE, 1991). Em um salmondeo a exposio crnica ao HgCl2 pode diminuir a concentrao normal de cobre e zinco em tecidos; o metilmercrio aparentemente no se liga s MTs de peixes, mas pode faz-lo com outros componentes celulares de natureza protica (HEATH, 1995). O cdmio induz a transcrio do RNAm de MT em Lithognathus mormyrus (TOM et al., 1999). Da mesma forma o cobre pode induzir a produo de MT heptica em bagres (SCHLENK; DAVIS; GRIFFIN, 1999). O chumbo parece no induzir a produo de MT em peixes (HEATH, 1995) embora o faa em ratos (acetato de chumbo) (TEMPLETON e CHERIAN, 1991). O objetivo do trabalho apresentado neste captulo a padronizao do mtodo de VIARENGO et al. (1997), pois esse foi aqui modificado, para a quantificao indireta das MTs em tecidos de Hoplias malabaricus. O intuito com tal mtodo corroborar o emprego de uma resposta biolgica (expresso das MTs em tecidos) como biomarcador efetivo para exposies subletais e subcrnicas por via trfica. Nesse caso foi testado o H3C-Hg+, como agente indutor ou supressor da expresso das MTs no fgado e em brnquias.

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II.2 MATERIAIS E MTODOS

II.2.1 BIOENSAIO

Dezoito espcimes de Hoplias malabaricus (trara) do bioensaio descrito na seo I.2.1.1 foram utilizados. Nove traras foram contaminadas com H3C-Hg+ e nove serviram de controle. Amostras de fgado (lobo esquerdo posterior) e do segundo arco branquial foram excisadas e mantidas a 75oC at as anlises.

II.2.2 QUANTIFICAO INDIRETA DE MTs

Para a quantificao da MT foi utilizado o mtodo proposto por VIARENGO et al. (1997) para tecidos de moluscos, adaptado para tecidos de peixes. Este mtodo consiste no monitoramento fotomtrico da reao de ELLMAN et al. (1961), ocorrida entre as sulfidrilas das MTs e o DTNB. As MTs so purificadas numa extrao fracionada a partir do sobrenadante do homogenato tecidual, que aps tratado com etanol e clorofrmio sofre adio de HCl para precipitao das protenas. O precipitado ento centrifugado e lavado para remoo de molculas de baixa massa que contenham sulfidrilas (SH): a) endgenas: cistenas livres, GSH; b) exgenas: -mercapto-etanol acrescentado como agente redutor na homogeneizao. O mtodo indireto, pois obtm a concentrao de grupamentos sulfidrila (SH) nos tecidos, ao invs de aferir a quantidade absoluta de MTs presente nas amostras. As alteraes aqui realizadas no mtodo proposto por VIARENGO et al. (1997) foram: a) adaptao para leitura fotomtrica em microplacas de 96 poos (o autor utiliza leitura em cubetas), para tal foi calculado um fator de correo da quantidade de SH (nmol) na leitura (microplaca), em relao ao volume em que ocorreu a reao de cor (4,5 ml):

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para fgado: nmol SH = V (l) (4500 200) [SH] (mol.l-1) 109 para brnquia: nmol SH = V (l) (4500 300) [SH] (mol.l-1) 109 b) os resultados foram expressos em quantidade (nmol) de SH por unidade de massa de tecido (g), sendo que tal valor de massa foi corrigido em relao s diluies do homogenato inicial de brnquias (2,3%, v/v), e de fgado (2,9%, v/v), e em relao massa especfica (d) de cada amostra de tecido: massa final para brnquias: mf (g) = massa inicial da amostra (g) 0,023 d (g.ml-1); massa final para fgado: mf (g) = massa inicial da amostra (g) 0,029 d (g.ml-1); c) a diminuio na fora centrfuga aplicada ao homogenato, para obteno do sobrenadante com MTs (de 30.000g para 21.460g), mas com um aumento no tempo de centrifugao (de 20 para 30 min.); d) a substituio do filtro de leitura (412 nm) por um de 405 nm (disponvel no fotmetro Tecan Sunshine); tal substituio, segundo dados obtidos de VIARENGO et al. (1997), no altera os resultados de absorbncia; e) a secagem do ltimo precipitado (pellet) obtido (contendo MTs) foi sobre a bancada, com auxlio de papel filtro, e no com fluxo de gs N2, como no mtodo original. Para a quantificao das amostras por interpolao, o mtodo utiliza uma curva padro de concentraes de glutationa ([GSH]) como referncia (com regresso linear significativa: r2 > 0,95). Essa curva foi obtida durante e para cada ensaio bioqumico, tendo as mesmas variantes experimentais das amostras. O apndice 1 compila numa planilha todos os procedimentos do mtodo empregado, bem como as concentraes e volumes utilizados.

53
II.2.3 ANLISE ESTATSTICA

A anlise estatstica dos resultados empregou o programa Prism v. 3.0, sendo utilizado o teste t, com um nvel crtico de significncia de 5%.

II.3 RESULTADOS

No houve diferena significativa entre as mdias das quantidades de MTs aferidas nas amostras de fgado e brnquias, entre os grupos tratado (H3C-Hg+) e controle (figs. 5 e 7). De fato a variao dos resultados foi alta, com a sobreposio dos erros padres nas amostras de fgado, e com alto coeficiente de variao: 74% em fgado e 45% em brnquias. No houve a possibilidade de discriminao dos animais tratados, dos controles. As amostras de fgado apresentaram uma massa especfica mdia de 0,84 g.ml-1 (com desvio padro de 0,08 g.ml-1); e as amostras de brnquia se igualaram densidade da gua (com desvio padro desprezvel).

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GRFICO 4 CURVA PADRO (REGRESSO LINEAR) DE CONCENTRAES DE GLUTATIONA ([GSH]) USADA COMO REFERNCIA NA QUANTIFICAO DAS AMOSTRAS DE FGADO DE HOPLIAS MALABARICUS, POR INTERPOLAO
300 275 250 225 200

(OD).(1000)

175 150 125 100 75 50 25 0 0 60 120 180 240 300 360 420 480 540

[GSH] (M)

FONTE: O autor NOTAS: Concentraes finais de glutationa ([GSH]) diluda em EDTA a 2 mM e HCl 0,5 N. O fotmetro considera o padro de [GSH] = 0 como branco. O volume final de leitura foi de 200 l. Y = (0,5794).X 1,381; r2 = 0,9982 GRFICO 5 TEORES TECIDUAIS DE SULFIDRILA (nmol de SH) POR UNIDADE DE MASSA DA AMOSTRA DE FGADO (g) DE HOPLIAS MALABARICUS EM INDIVDUOS EXPOSTOS A 75 ng H3C-Hg+.g-1 DE BIOMASSA, POR 70 DIAS (14 DOSES)
350

tecido (p.u.)

300 250

FONTE: O autor NOTAS: n = 8 animais por grupo.

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GRFICO 6 CURVA PADRO (REGRESSO LINEAR) DE CONCENTRAES DE GLUTATIONA ([GSH]) USADA COMO REFERNCIA NA QUANTIFICAO DAS AMOSTRAS DE BRNQUIAS DE HOPLIAS MALABARICUS, POR INTERPOLAO
MICROPLACA: 300 l a 405 nm
450 425 400 375 350 325 300

(OD).(1000)

275 250 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0 0 60 120 180 240 300 360 420 480 540

[GSH] (M)

FONTE: O autor NOTAS: Concentraes finais de glutationa ([GSH]) diluda em EDTA a 2 mM e HCl 0,5 N. O fotmetro considera o padro de [GSH] = 0 como branco. O volume final de leitura foi de 300 l. Y = (0,8071).X 2,925; r2 = 0,9876 GRFICO 7 TEORES TECIDUAIS DE SULFIDRILA (nmol de SH) POR UNIDADE DE MASSA DA AMOSTRA DE BRNQUIA (g) DE HOPLIAS MALABARICUS EM INDIVDUOS EXPOSTOS A 75 ng H3C-Hg+.g-1 DE BIOMASSA, POR 70 DIAS (14 DOSES)
400

tecido (p.u.)

350 300

FONTE: O autor NOTAS: n = 8 animais por grupo.

56

II.4 DISCUSSO

O mtodo utilizado por VIARENGO et al. (1997), um mtodo indireto, pois quantifica sulfidrilas (SH) da amostra e no a quantidade absoluta de MTs. Contudo os pesquisadores ressaltam que o mtodo se mostra eficaz quando da comparao entre grupos experimentais, na tentativa de discriminao da situao controle, daquela dos tratamentos ou exposies. Fundamentam que pelo fato de a MT ser rica em cistenas (e portanto em sulfidrilas), uma alterao na sua expresso em certos tecidos pode ser detectada. De fato, no programa de biomonitoramento da costa do Mediterrneo (MED POL), VIARENGO et al. (2000) promoveram uma adaptao (simplificao) e a validao do mtodo empregado em 1997, demonstrando que oito laboratrios que dispuseram do mtodo para as mesmas amostras, puderam diferenciar de forma eficaz os grupos controles dos tratados. O mtodo proposto por VIARENGO et al. (1997) foi utilizado por CAMPANA, SARASQUETE e BLASCO (2003) para a MT de Halobatrachus didactylus, nos quais houve a induo da sntese de MT em fgado, sete dias aps a injeo nica (dose intraperitoneal) de 1 ng Pb++.g-1 de biomassa. A induo no foi considerada uma resposta imediata do organismo, mas sim dependente do acmulo do metal no fgado. Para os teores normais de MT heptica (situao controle) eles relatam valores de 411 mmol MT. g-1 tecido (p. u.), com alta variao durante os 7 dias de exposio. Supondo segundo os prprios autores, uma relao de 1 mmol MT = 20 mmol GSH, seus resultados equivaleriam aqui a uma variao de 80.000220.000 mol SH. g-1 tecido, valores muito superiores ao aqui relatado para o fgado (mdia de 0,265 mol SH. g-1 tecido), dos controles de Hoplias malabaricus. De outra forma, utilizando Mullus barbatus como espcie bioindicadora num estudo no mar da Ligria (ao N da Crsega), REGOLI et al. (2002), empregando o mtodo de VIARENGO et al. (1997) relatam valores de MT heptica prximos ao aqui encontrado ( 600 nmol SH. g-1 tecido). Ao identificar variaes no significativas, quando esses valores foram comparados em quatro

57
reas amostradas durante 19982000, os pesquisadores sugerem que isso reflete uma baixa induo da MT heptica como resposta biolgica em condies de campo, onde variaes naturais podem minimizar o efeito de contaminantes ambientais para esse parmetro. De fato, segundo TOM et al. (1999), a quantidade de RNAm da MT heptica de Lithognathus mormyrus sofre alteraes de acordo com a temperatura da gua e com flutuaes nas concentraes de metal em guas impactadas, tambm no mediterrneo. Assim comparaes entre teores de MTs tecidual entre espcies diferentes, ou at entre populaes aloptricas da mesma espcie, devem ser precedidas de estudos que demonstrem a induo da expresso das MTs, frente a diferentes condies do meio, sejam elas controladas experimentalmente em laboratrio, ou condies ambientais in loco. Neste caso, um histrico que leve em conta as variaes sazonais de parmetros fisico-qumicos do meio deve ser reportado. Contudo, mtodos diferentes empregados na quantificao das MTs podem levar a uma incongruncia na comparao de resultados obtidos. Considera-se aqui este fato como um interveniente discutido a seguir. ERK et al. (2002), fazendo uma comparao entre vrios mtodos de purificao da MT, concluiu que o mtodo proposto por VIARENGO et al. (1997), dispondo de etanol e clorofrmio como solventes, causa uma reduo drstica na quantidade de uma das isoformas da MT de Mytilus galloprovincialis, quando comparado a outros mtodos, o que interfere na quantificao da MT por mtodo eletroqumico. Duas fraes distintas de sobrenadante do homogenato tecidual foram utilizadas por VIARENGO et al. (1997) para a purificao com os solventes: uma obtida a 100.000g, correspondente frao citoslica (coeficiente de

sedimentao de 50 S na ultracentrfuga) e outra obtida 30.000g. Esta ltima serviu para a apresentao dos resultados pelos autores que, embora no demonstrem, afirmam que a frao 50 S pode ser usada alternativamente sem diferenas significativas nos resultados.

58
A centrifugao aqui utilizada (21.460g, 30 min., 4oC) esteve restrita ao equipamento disponvel e eliminou do sobrenadante as mitocndrias, lisossomos e peroxissomos. Contudo, no sobrenadante de homogenatos teciduais nessas condies, microssomos e outras pequenas vesculas permanecem. No caso do fgado, a maior parte dessas vesculas oriunda do retculo endoplasmtico liso. O contedo desses compartimentos subcelulares pode ter alterado a resposta aqui obtida, j que o interior de vesculas distinto do citosol, onde um ambiente redutor mantm a condio reduzida das sulfidrilas (SH). Alm disso, uma distribuio no uniforme da expresso das MTs ao longo do fgado (fusiforme em muitos peixes) pode gerar resultados com grande coeficiente de variao. Sugerese a utilizao do rgo inteiro, o que fcil para pequenos peixes, mas no foi possvel para Hoplias malabaricus.No presente trabalho, o mtodo de VIARENGO et al. (1997) modificado no possibilitou a discriminao dos animais tratados, dos controles. Um ou mais dos intervenientes abaixo relacionados podem ter sido a causa: a) VIARENGO et al. (1997) se utilizam de tecidos de moluscos (brnquias e glndulas digestivas) e aqui foram usados brnquias e fgado de peixes; b) uma os mais das modificaes descritas em II.2.2 podem ter gerado valores superestimados ou subestimados; c) o mtodo indireto, pois quantifica SH, e no a molcula de MT; devese considerar que outras molculas que possuam SH podem produzir resultados superestimados. As amostras de brnquias de Hoplias malabaricus apresentaram maiores valores de quantidade de SH tecidual na situao controle (313,23 nmol SH . g1

de tecido, p.u.), do que as de fgado-controle (265,55 nmol SH . g-1 de tecido,

p.u.). A menor densidade desse tecido em relao quele no foi a razo, j a que massa final foi corrigida pela densidade do tecido, e assume-se que realmente as brnquias de Hoplias malabaricus possuem mais grupos SH do que o fgado.

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CAPTULO III

ESTUDOS COM A VITELOGENINA DE TRARA ( HOPLIAS MALABARICUS )

COLABORAO : Francisco Filipak Neto, M.Sc. Prof. M.Sc. Marco Antonio Ferreira Randi Prof. Dr. Paulo Roberto Dalsenter Prof. Dr. Helena Cristina da Silva de Assis

Publicao em Preparao: ALVES COSTA, J .R. M.; FILIPAK NETO, F.; SILVA DE ASSIS, H. C.; RANDI, M. A. F.; OLIVEIRA RIBEIRO, C. A. Vitellogenic index for in vitro vitellogenin production by fish hepatocytes as biomarker screening method for determining (anti)estrogenic effects of xenobiotics. Para submisso na General and Comparative Endocrinology.

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III.1 INTRODUO

III.1.1 EXPRESSO DA VTG COMO BIOMARCADOR MOLECULAR

A vitelogenina (VTG) uma glico-fosfo-lipoprotena de alta massa molecular (de 170 a 200 kDa, dependendo da espcie) sintetizada em hepatcitos sob controle multi-hormonal: a transcrio de seu RNAm ativada por estrgenos, principalmente o 17-estradiol (E2). A VTG o principal constituinte do vitelo de vertebrados ovparos e liberada no sangue ou no meio de cultivo in vitro por exocitose dos hepatcitos. A sntese de VTG essencial para a continuidade fsica da populao natural de uma dada espcie ovpara. Para uma abordagem mais ampla acerca da produo de VTG, relacionada a outros biomarcadores e ao sistema neuro-endcrino de peixes (ver fig. 1, seo 4). A literatura cientfica extensa, quando est relacionada a estudos com a VTG de vertebrados, e principalmente com a expresso da VTG de peixes, esta utilizada como resposta biolgica para exposio a substncias que so desreguladoras endcrinas. De fato, na ltima dcada a expresso da VTG por hepatcitos, ou a supresso da mesma, tm sido amplamente empregadas em vrias espcies de peixes como indicadores de efeitos estrognicos em machos e jovens, ou anti-estrognicos em fmeas. Alguns relatos com o uso da expresso da VTG de peixes como resposta biomarcadora, in vivo ou in vitro (cultivo primrio de hepatcitos), podem ser encontrados em PELISSERO et al. (1993); LAZIER et al. (1996); MUGIYA e TANAHASHI (1998); MOSCONI et al. (1998); KIME (1999); SMEETS et al. (1999); MELLANEN et al. (1999); HWANG, NAGAWA e MUGIYA (2000); KORDES, RIEBER e GUTZEIT (2002); LATONNELLE et al. (2002); OOST, BEYER e VERMEULEN (2003); RADICE et al. (2004); SPAN et al. (2004); ZHONG et al. (2005). A seqncia de aminocidos (aa) da VTG de peixes e de outros vertebrados considerada bem conservada entre distintas categorias taxonmicas e no decorrer do tempo evolutivo. Treze seqncias completas de aa da VTG de 7 espcies de peixes (em algumas espcies h duas isoformas de VTG seqenciadas)

61
foram escolhidas entre 27 seqncias de aa da VTG de TELEOSTEI, encontradas on line no National Center for Biotechnology Information (NCBI, 2006). Dispondo dos programas BioEdit v.5.0.9 (HALL, 2001) e ClustalW (THOMPSON; HIGGINS; GIBSON, 1994) as 13 seqncias encontradas foram alinhadas em consenso, demonstrando uma mdia de 56,8% de similaridade, duas a duas. Tais seqncias demonstraram um nmero mdio de 1713 aa (desvio padro de 50 aa), correspondentes a uma massa molecular mdia de 187,95 kDa (desvio padro de 5,15 kDa). Essas caractersticas determinam uma grande probabilidade de que as distintas seqncias polipeptdicas de VTG, encontradas em diferentes espcies de telesteos, possuam epitopos similares, quando da imunizao de animais com a VTG antignica (imungeno) para produo de anticorpos policlonais contra a VTG de peixes. De fato, PETERS et al. (2001) e MONCAUT, NOSTRO e MAGGESE (2003) realizaram estudos que levam em conta o princpio da imunoreao cruzada para a deteco e quantificao da VTG de peixes. Vrios mtodos j foram desenvolvidos para a quantificao (absoluta ou relativa) da VTG de peixes, e tais mtodos foram utilizados aps a exposio desses animais a substncias potencialmente desreguladoras endcrinas. Aqui optou-se pela produo de anticorpos policlonais contra a VTG de Hoplias malabaricus, bem como pela aquisio de anticorpos policlonais comercialmente disponveis (Laboratrios Biosense, Noruega) contra a VTG de outras espcies de peixes. Tambm foi realizado um estudo da induo (in vivo e in vitro) da expresso da VTG de Hoplias malabaricus por agentes qumicos com reconhecida ao estrognica, e anti-estrognica. Em adio, os efeitos do Pb++ sobre a produo da protena in vivo foram investigados. A prxima seo trata de consideraes tericas que visam implementar, atravs do emprego de modelos matemticos, os mtodos de quantificao j existentes para VTG, em relao ao tamanho da amostra e ao ambiente ou condio laboratorial (tratamento) a partir da qual ela pde ser obtida.

62
III.1.2 NDICE VITELOGNICO

ndice vitelognico (IVTG) uma concepo terica que considera, numa unidade de tempo e numa unidade de espao pr-estabelecidos, a produo de VTG como uma resposta biolgica frente a condies extrnsecas unidade de produo (tratamento experimental ou condies ambientais), bem como relaciona tal resposta com a magnitude prpria (tamanho da amostra) do conjunto (classe) determinado parcialmente pelas condies extrnsecas

supracitadas. Assim, o IVTG pode comparar o quanto de VTG est sendo produzida (ou expressa, dependendo do mtodo de quantificao) em um grupo de organismos (populaes amostradas em campo), ou em um grupo experimental (organismos ou tecidos tratados em laboratrio). Como o IVTG pode ser empregado em dois nveis de organizao biolgica distintos, a saber, tecidual (para ensaios in vitro com cultivo primrio de hepatcitos) e populacional (com grupos de indivduos amostrados em campo, ou grupos experimentais para bioensaios), quatro interpretaes do modelo, ou equaes distintas, so aqui apresentadas. Ressalta-se que todo o mrito intelectual para a concepo original do modelo matemtico encontra-se no ndice de Atividade Reprodutiva (IAR), proposto por AGOSTINHO et al. (1991), que um modelo ecolgico de nvel populacional. Aqui, pretende-se apenas quatro novas interpretaes e possveis aplicaes para o modelo. Sendo assim apresenta-se portanto, antes do IVTG, a equao do IAR que lhe deu origem:
l n I A R = N
i

[ (

) [ (

+ n

(
m

N n

i i

) ] ) +

R ]

l n

(7)

Onde: a) Ni : nmero de indivduos na unidade amostral considerada (um valor por rea amostrada); b) ni : nmeros de indivduos em reproduo nas unidades amostrais consideradas (um valor por rea amostrada); c) Nm : nmero de indivduos da maior unidade amostral;

63
d) nm : nmero de indivduos em reproduo na maior unidade amostral; e) RGS = (massa das gnadas 100) massa total do animal; f) RGSi: RGS mdia dos indivduos em reproduo na unidade amostral i ; g) RGSe : maior valor individual de RGS.

O IAR um modelo que permite a interpretao quantitativa do panorama reprodutivo de uma populao de peixes fmeas, amostrada em seu ambiente natural. O IAR considera o tamanho da populao de fmeas em questo (h um valor de IAR para cada populao amostrada), em relao ao tamanho da populao de referncia, esta sendo a maior populao da anlise, da qual se pressupe a mxima atividade reprodutiva, expressa pela unidade (nm Nm = 1) no denominador da equao (7). Uma amostragem padronizada, com referencial de esforo de captura (geralmente m2 de rede de pesca por unidade de tempo) imprescindvel para a comparao dos valores de IAR obtidos no tempo e no espao. Machos so excludos da anlise, j que seu valor numrico de relao gnado-somtica (RGS 1) no contribui para o ndice. Da equao (7), para o estabelecimento do IVTG nas quatro interpretaes que seguem, a alterao comum a substituio do valor biomtrico individual (RGS) pela quantificao da VTG em amostras biolgicas. Esta quantificao pode revelar valores prximos ao absoluto, com emprego de imunoensaios (pstranscricional); bem como demonstrar a condio pr-transcricional da expresso de VTG (pela quantificao de seu RNAm); ou ainda quando relativa (mtodos indiretos) servir estritamente comparao de grupos experimentais.

III.1.2.1 IVTG para Populaes Naturais

Aqui, o IVTG tem interpretao similar a do emprego do IAR, podendo ser concebido segundo a seguinte equao:

64

IVTG =
Onde:

ln N [( n n ) + ( n N )] ( VTG VTGmax ) ln Nmax [ ( nmax n ) + 1 ]

100

(8)

a) N : nmero de indivduos na unidade amostral considerada (N de cada grupo); b) n : nmero de indivduos que expressam vitelogenina (VTG[+]) na unidade amostral considerada; c) Nmax : nmero de indivduos na maior unidade amostral; d) nmax : nmero de indivduos VTG[+] na maior unidade amostral; e) VTG : quantidade mdia de VTG na unidade amostral considerada; f) VTGmax : maior valor individual de VTG.

Ressalta-se que a equao tem entrada binria, ou seja: com vitelogenina (VTG[+]), ou sem vitelogenina (VTG[-]), esta geralmente quantificada no plasma. Uma produo constitutiva de VTG, detectvel pelo mtodo de quantificao, em machos ou animais jovens sexualmente imaturos, igualaria os valores de n = N e de nmax = Nmax. Portanto o IVTG representa a produo molecular de VTG em populaes naturais (h um valor de IVTG para cada populao amostrada), em relao quantidade de indivduos que expressam VTG (n), e em relao aos tamanhos (N e Nmax) das amostras analisada e de referncia (denominador), esta ltima sendo a maior amostra da anlise, da qual se pressupe a mxima atividade reprodutiva, expressa pela unidade (nmax Nmax = 1) no denominador da equao (8). Pode-se considerar diferentes reas amostradas em campo, desde que uma amostragem padronizada (com referencial de esforo de captura) seja empregada para a comparao dos valores de IVTG obtidos no tempo e no espao. A VTG uma protena expressa sob ao hormonal por hepatcitos de fmeas em idade reprodutiva, principalmente durante os estgios de vitelognese e maturao dos ocitos, quando ela incorporada nessas clulas. Contudo sabe-

65
se que peixes machos podem expressar a VTG, quando expostos a substncias com ao estrognica. Somado a isso tem-se que o tema peixes, como categoria taxonmica um grupo filogeneticamente no natural (sem ascendncia nica comum) que apresenta todos os tipos de estratgias reprodutivas encontradas em vertebrados. H pelo menos uma espcie amazonense que apresenta

partenognese ou ginognese (Poecilia formosa); h todos os tipos de hermafroditismo (espcies monicas): o simultneo (com autofecundao ou fecundao cruzada), o seqencial (ou sucessivo) com alternncia seqencial (reverso sexual completa) apresentando casos de protandria ou protoginia; h espcies gonocorsticas (diicas), com ou sem dimorfismo sexual (que em peixes seria melhor denominado como mais um tipo de polimorfismo populacional); e h casos de populaes onde ocorre a diandria: machos e fmeas gonocorsticos e fmeas com hermafroditismo seqencial que do origem a machos secundrios (protoginia). Frente a esse quadro, o emprego do IVTG teria a vantagem, em relao ao IAR, de no estar restrito a espcies gonocorsticas (diicas) e de fazer integrar a populao de machos (em casos de dioicia) na anlise. Alm disso o IVTG seria til em estudos onde se busca saber qual a condio reprodutiva de uma populao, frente a ambientes impactados por substncias que alterem o sistemas neuroendcrino e reprodutivo integrados dos indivduos. Tem assim uma ampla utilidade na rea da ecologia aplicada, como biomarcador para a deteco de substncias desreguladoras endcrinas, relacionando respostas biolgicas individuais (produo de VTG em cada organismo) com o tamanho da amostra e padronizando a comparao de grupos experimentais amostrados em diferentes reas de estudo (biomonitoramentos). Dessa forma o IVTG reflete variveis intervenientes no fluxo de energia e matria de um ecossistema, pois est relacionado com a fecundidade e, por conseguinte, com a tabela de vida de uma populao considerada. Contudo o modelo atribui uma propriedade mensurvel (condio reprodutiva) a uma populao, a partir de um nvel inferior de organizao biolgica (indivduos

66
isolados). Essa ascendncia de nvel organizacional (BUNGE, 1980),

correspondente ao aumento de complexidade do nvel individual (conjunto de organismos) para o populacional (conjunto de populaes ou amostras) deve ser validada com a demonstrao emprica, o que torne exeqvel o emprego do IVTG.

III.1.2.2 IVTG para a Vitelognese, com Fmeas como Controle Referencial (IVTGf)

Aqui, o IVTGf tem interpretao similar a do emprego do IVTG para populaes naturais, explanado na seo anterior (IV.1.2.1). Contudo no pode ser utilizado para espcies de peixes que apresentem hermafroditismo simultneo, ou seja, espcies monicas que apresentem os dois sexos no mesmo estgio de desenvolvimento. Isso porque o grupo de referncia (denominador) composto por fmeas (estando ou no em idade reprodutiva) que servem como um grupo controle para a vitelognese considerada normal para uma espcie. O IVTGf pode ser concebido segundo a seguinte equao:

ln N IVTGf =
Onde:

ln Nf

[( n n ) + ( n N )] [ ( nf n ) + ( nf N f ) ]

VTG VTGmax

100

(9)

a) N : nmero de indivduos na unidade amostral considerada (N de cada grupo); b) n : nmero de indivduos que expressam vitelogenina (VTG[+]) na unidade amostral considerada; c) Nf : nmero de indivduos do grupo controle (fmeas); d) nf : nmero de fmeas controles em reproduo, com VTG[+]; e) VTG : quantidade mdia de VTG na unidade amostral considerada; f) VTGmax : maior valor individual de VTG.

Machos e fmeas integram o IVTGf, contudo so analisados em separado (h um valor de IVTGf para cada sexo, de cada uma das populaes amostradas). Portanto o IVTGf representa a produo molecular de VTG em populaes naturais,

67
em relao quantidade de indivduos que expressam VTG (n), e em relao aos tamanhos (N e Nf) das amostras analisada e de referncia (controle de fmeas no denominador), esta ltima sendo a amostra correspondente condio natural de vitelognese, da qual no se pressupe a mxima atividade reprodutiva: nf Nf 1, pois em condies naturais nf Nf. Pode-se considerar diferentes reas amostradas em campo, desde que uma amostragem padronizada (com referencial de esforo de captura) seja empregada para a comparao dos valores de IVTGf obtidos no tempo e no espao. O IVTGf serve para a identificao de: a) efeitos estrognicos em fmeas induzidas por xenoestrgenos (Ix > If); b) efeitos anti-estrognicos em fmeas maduras (Ix < If); c) efeitos estrognicos em grupos de machos ou jovens imaturos, dos quais qualquer valor possvel de IVTGf indica produo de VTG e portanto, estrogenicidade. Portanto o IVTGf pode ser usado como biomarcador para a deteco de substncias desreguladoras endcrinas, relacionando respostas biolgicas individuais (produo de VTG em cada organismo) com o tamanho da amostra e com a condio normal de vitelognese, padronizando assim a comparao de grupos amostrados em diferentes reas de estudo (biomonitoramentos). tambm indicado para estudos sazonais da reproduo de espcies de peixes. Uma variante do uso da equao (9) seria seu emprego em condies experimentais controladas (bioensaios), onde o grupo de referncia (controle) seria composto somente por fmeas maduras, em reproduo (vitelognese). Neste caso: a) o modelo pressupe uma alta atividade reprodutiva para o grupo de referncia: nf Nf 1 (nf Nf); b) para bioensaios, com algumas excees, geralmente se trabalha com grupos reduzidos, em relao s amostragens de campo; nesse caso a transformao logartmica ( ln N e ln Nf ) prescindvel;

68
c) o ideal para bioensaios se trabalhar com grupos experimentais com o mesmo tamanho, da que N = Nf , podendo-se suprimir da equao (9) o fator ln N ln Nf = 1.

III.1.2.3 IVTG para Bioensaios de Induo Experimental da VTG (IVTGe)

Ensaios in vivo com a induo experimental da expresso de VTG, por meio de uma substncia com reconhecida ao estrognica, servem como referncia a testes posteriores, para os potenciais (anti)estrognicos de outras substncias, ou seja, estrognicos em machos e jovens, ou anti-estrognicos em fmeas. Usualmente se utiliza o 17-E2 ou uma molcula derivada. Alm disso, para o estabelecimento de uma resposta biolgica como biomarcadora, que possa ser utilizada em monitoramentos ambientais, ela deve ser previamente demonstrada com bioensaios e estudos in vitro que dispem da espcie em questo. O IVTGe pode complementar o entendimento de parmetros clssicos de farmacocintica, que indicam sensibilidade do organismo a uma substncia exgena (como EC50, ou ED50) ou a potncia dessa substncia (LOEC, LOED, EC10, ou ED10). O IVTGe pode ser concebido segundo a seguinte equao:

[( n n ) + ( n N )] IVTGe =
Onde:

[ ( NE2 n ) + 1 ]

VTG VTGmax

100

(10)

a) N : nmero de indivduos na unidade amostral considerada (N do grupo ou tratamento); b) n : nmero de indivduos que expressam vitelogenina (VTG[+]) na unidade amostral considerada (um valor por tratamento); c) NE2 : nmero de indivduos no grupo controle induzido (E2[+]); d) nE2 : nmero de indivduos VTG[+] do grupo E2[+]; NE2 = nE2 g) VTG : quantidade mdia de VTG no grupo ou tratamento; e) VTGmax : maior valor individual de VTG.

69
Ressalta-se que NE2 = nE2, por isso nE2 no figura na equao (10), em comparao com as equaes (8) e (9); a igualdade d-se pelo fato de todos os animais induzidos apresentarem VTG expressa. O modelo considera a mxima atividade reprodutiva do grupo induzido, situao que neste caso no arbitrria como nas equaes (7), (8) e (9). Isso est expresso pela unidade (nE2 NE2 = 1) no denominador da equao (10). O principal emprego do IVTGe seria para a descoberta de substncias com ao anti-estrognica (bioensaios com administrao concomitante do E2) que possam comprometer a reproduo de uma espcie considerada. O IVTGe representa a produo molecular de VTG em grupos controlados (bioensaios), onde a resposta biolgica individual (produo de VTG em cada organismo) est relacionada com a quantidade de indivduos que expressam VTG (n), e com os tamanhos (N e NE2) das amostras analisada e de referncia (controle induzido no denominador). Permite assim padronizar a comparao de grupos controlados em condies laboratoriais, ou in loco (bioensaios in situ). H um valor de IVTGe para cada tratamento experimental. Contudo ressalta-se que o IVTGe somente se faz til para bioensaios com espcies gonocorsticas (diicas) que apresentem dimorfismo sexual, ou que permitam de alguma forma a diferenciao entre os sexos, pois deve-se atribuir dois valores de IVTGe para cada tratamento, um para cada sexo. Caso contrrio, se a composio dos grupos no for de 50% machos e 50% fmeas, o ndice no ir representar uma situao real de ao (anti)estrognica.
I
V T G h

III.1.2.4 IVTG para Ensaios in vitro de Estrogenicidade (IVTGh)

Ensaios in vitro de estrogenicidade induzida, com a expresso de VTG como resposta (efeito), geralmente empregam o cultivo primrio de hepatcitos e dispem da exposio das clulas a substncias como o E2 ou o 17-etinilestradiol (EE2). Eles servem como referncia para testes posteriores, dos potenciais (anti)estrognicos de outras substncias. Alm disso, para o estabelecimento de uma resposta biolgica como biomarcadora, que possa ser

70
utilizada em monitoramentos ambientais, deve-se conhecer previamente aspectos e parmetros que indiquem a sensibilidade de um tipo celular s substncias exgenas (EC50) ou a potncia dessas substncias (LOEC, ou EC10). O IVTGh pode ser concebido segundo a seguinte equao:

ln n IVTGh =
Onde:

ln NE2

[( n n ) + 1] [( NE2 n ) + 1]

(VTG VTGC) VTGmax

100

(11)

a) n : nmero mdio de clulas viveis por unidade de cultivo (poo de microplaca, lamnula ou garrafa) no tratamento considerado; b) NE2 : nmero mdio de clulas viveis por unidade de cultivo no grupo induzido (E2[+]); c) VTG : concentrao ou quantidade de VTG aferida nas unidades de cultivo do tratamento considerado; d) VTGC : VTG aferida nas unidades de cultivo do grupo controle, sem nenhum tratamento; e) VTGmax : maior valor individual de VTG.

Ressalta-se que NE2 = nE2 e que N = n, por isso nE2 e N no figuram na equao (11). Essas igualdades do-se pelo fato de que o modelo pressupe que a expresso de VTG ocorre um todos os grupos ou tratamentos experimentais, mesmo que seja uma produo basal do grupo controle, sem nenhum tratamento (expresso constitutiva). Isso est expresso pelas unidades (nE2 NE2 = 1 e n N= = 1) no denominador e no numerador da equao (11). O principal emprego do IVTGh seria para a descoberta de substncias com ao anti-estrognica (ensaios com administrao concomitante do E2). O IVTGh representa a produo molecular de VTG por tratamento in vitro, onde a resposta a ao (anti)estrognica e est relacionada com a quantidade de clulas que expressam VTG (n) em cada unidade de cultivo e com os tamanhos (n e NE2) das amostras analisada (tratamento) e de referncia (controle induzido no

71
denominador). Permite assim padronizar a comparao de grupos controlados em condies laboratoriais. Usualmente em estudos de estrogenicidade utiliza-se tambm uma substncia antagonista ao efeito estrognico, como por exemplo, o citrato de tamoxifeno (TMX). Mtodos de citometria e aferio da viabilidade das clulas em cultivo so utilizados na contagem de clulas, para que se possa dispor da equao (11) na determinao do IVTGh relativo a cada tratamento. Estes, para o teste da ao estrognica de um xenobitico (X), devem compor os seguintes grupos sugeridos: a) grupo controle: sem nenhum tratamento; b) grupo controle do solvente (veculo) dos tratamentos (geralmente etanol ou DMSO); c) E2: grupo induzido; d) TMX: grupo controle de citotoxicidade ao TMX; e) E2+TMX: grupo controle de ao anti-estrognica; f) X: grupo controle de citotoxicidade X; g) E2+X: grupo teste de (anti)estrogenicidade de X; h) X+TMX: grupo teste de citotoxicidade (sinergismo). Ensaios-piloto devem estabelecer uma curva da resposta (VTG produzida) em funo do tempo de exposio ao indutor estrognico e outra, da resposta em funo da concentrao do indutor. Sugere-se a utilizao da EC50 do indutor para determinao do IVTGh de cada substncia testada.

III.1.2.5 Consideraes Gerais dos ndices

Foi dito ao final da seo IV.1.2.1 que o emprego da equao (8) deve ser validado com a demonstrao emprica. Isso tambm deve ocorrer para as equaes (9) e (10), principalmente devido ao fato de tais modelos matemticos atriburem a populaes um valor numrico (ndice), correspondente a propriedades inerentes a indivduos, tais como: atividade reprodutiva, condio reprodutiva, efeito estrognico, efeito anti-estrognico. Essas propriedades

72
podem seguramente ser atribudas a indivduos (organismos), mas o so, com emprego do IVTG, para populaes ou grupos de estudo. Contudo deve-se considerar a ascendncia de nvel organizacional biolgico, este concebido como um conjunto (classe matemtica) por BUNGE (1980); ascendncia essa que corresponde ao aumento de complexidade do nvel individual (concebido como o conjunto de todos os organismos possveis) para o populacional (concebido como o conjunto de populaes ou amostras experimentais possveis). Portanto a atribuio de propriedades mensurveis de um nvel para outro imediatamente superior deve sofrer validao lgica e emprica, para que o emprego das equaes supracitadas represente uma relao de causa-efeito com conexo universal, podendo ento compor o corpo de uma teoria cientfica, enunciando fenmenos naturais. No caso da equao (11) para o IVTGh, pode-se prescindir da validao lgica, mas no da emprica. Isso porque com ela, trabalha-se num mesmo nvel organizacional, manipulado e controlado: o conjunto de clulas em cultivo. Portanto no h a atribuio de uma propriedade de um nvel, para outro imediatamente superior. Haveria se fosse possvel aferir a quantidade de VTG produzida por cada clula em cultivo. Pretende-se aqui a demonstrao emprica da equao (11), com o cultivo primrio de hepatcitos de Hoplias malabaricus e com a induo experimental da expresso de VTG in vitro.

73

III.2 MATERIAIS E MTODOS

III.2.1 PRODUO DA VTG IN VIVO POR INDUO ESTROGNICA

III.2.1.1 Bioensaio

Trs

exemplares

de

Hoplias

malabaricus

(trara)

foram

obtidos

comercialmente de uma estao de aqicultura em Toledo (PR). Os animais foram aclimatados nas condies experimentais por 4 meses: cada animal em um aqurio com 15 litros de gua de torneira desclorificada; limpeza do aqurio a cada 7 dias, com troca de 5 litros da gua; influxo de ar constante; temperatura de 21 2oC; e fotoperodo (12h luz : 12h escuro). Essas condies foram mantidas e controladas at o fim do experimento. O suprimento alimentar deu-se com minhocas (para as traras menores: 25,8 e 26,1 g) ou Astyanax sp. (lambaris), para a trara maior (494,3 g). Cada trara foi alimentada com aproximadamente 10% de sua biomassa, a cada 5 dias. Durante a induo (15 dias) os animais permaneceram em jejum experimental. Aps anestesia em gua de torneira desclorificada com MS222 (cido etilster-3-aminobenzico, Sigma) a 0,02% (v/v), a trara maior (macho adulto) teve sua massa aferida e recebeu uma dose de 20 mg.kg-1 de hexa-hidrobenzoato de estradiol (6HB-E2), diludo em leo de amendoim e administrado por via intraperitoneal (iip). Aps 15 dias, a trara maior e as outras duas (macho e fmea jovens) foram anestesiadas como descrito acima e 0,5 ml de sangue (de cada trara menor) e 4 ml de sangue (trara maior) foram extrados do vaso caudal situado na poro ventral da coluna vertebral, com seringas

heparinizadas. Conforme procedimento descrito por SILVERSAND, HYLLNER e HAUX (1993), ao sangue total foi acrescentado na razo 1:10 (v/v), o anti-proteoltico PMSF a 10 mM em NaCl a 0,9%, resultando nas concentraes finais de: PMSF a 1 mM e etanol a 0,5% (da soluo estoque de PMSF a 200 mM em etanol absolto). A mistura foi centrifugadas a 4oC, sob a fora de 3000g por 30 minutos para

74
obteno do plasma, que foi aliquotado, sujeito imediatamente ao procedimento descrito a seguir, ou mantido a 75oC at anlises posteriores.

III.2.1.2 Isolamento da VTG Plasmtica por Precipitao

Segundo mtodo descrito por SILVERSAND, HYLLNER e HAUX (1993) a VTG foi isolada do plasma numa purificao parcial atravs da precipitao com soluo de EDTA (C10H14N2O8Na2.2H2O) e MgCl2. Amostras do precipitado protico (do plasma do animal induzido) foram obtidas a partir de 4 razes molares entre EDTA e Mg++, a saber: a) [EDTA] [Mg++] = 1,0 2,5 b) [EDTA] [Mg++] = 1,0 2,0 c) [EDTA] [Mg++] = 1,0 1,5 d) [EDTA] [Mg++] = 1,0 1,0 Aps a mistura do plasma com diferentes volumes das solues estoques de EDTA a 20 mM e MgCl2 a 500 mM, em microtubos de 1,5 ml, estes foram centrifugados a 4oC, sob a fora de 5000g por 15 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado foi ressuspenso em 50 l de NaCl a 1 M. Em cada tubo foram adicionados 1 ml de H2O destilada para nova precipitao, esta seguida de centrifugao a 4oC, sob a fora de 5000g por 15 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado foi ressuspenso em 50 l de NaCl a 1 M. O apndice 2 compila numa planilha todos os procedimentos do mtodo empregado, bem como as concentraes e volumes utilizados no isolamento. Amostras de plasma dos trs animais e da vitelogenina precipitada do animal induzido (VTGp) foram analisadas aps eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (doravante abreviado por SDS-PAGE) a 4% (empilhamento) e a 9% (separao), com aplicao de campo eltrico vertical segundo LAEMMLI (1970), seguida de colorao com Coomassie Brilliant Blue (doravante abreviado por CBB). O procedimento foi repetido com volumes maiores de plasma estocado (ver III.2.1.1) com a razo molar de 1:2 ([EDTA] [Mg++]), para obteno de VTGp (imungeno) utilizado em III.2.2.1 (ver linha 6 da figura 6).

75
III.2.2 ANTICORPOS POLICLONAIS PARA A IMUNO-DETECO

Foram adquiridos comercialmente (Laboratrios Biosense, Oslo, Noruega) trs tipos de anti-soro (anticorpos policlonais) contra a VTG de 3 diferentes espcies de peixes, a saber: Salvelinus alpinus (anti-soro doravante abreviado por SALP), Sparus aurata (SPAU) e Salmo salar (SALA). Todos os 3 tipos de antisoro foram produzidos em coelhos pelo laboratrio supracitado. Os anticorpos foram testados para constatao de reao imuno-qumica cruzada com a VTG de Hoplias malabaricus.

III.2.2.1 Produo de Anti-Soro contra VTG de Hoplias malabaricus (HOPL)

O plasma excedente (estocado a 75oC), das traras induzidas como descrito em III.2.1.1 e adiante, em III.2.3 (controles de induo), serviu como fonte de VTG. Esta foi precipitada (VTGp) de acordo com o mtodo de SILVERSAND, HYLLNER e HAUX (1993), seguido da separao das protenas da amostra de VTGp por sua massa molecular (SDS-PAGE) como descrito em III.2.1.2. As amostras de VTGp aplicadas ao gel de poliacrilamida tiveram seu teor protico previamente quantificado pelo mtodo de BRADFORD (1976) e serviram como imungeno, aps a macerao (grau e pistilo) da banda de gel congelada com N2 lquido e correspondente a frao protica de 180200 kDa (ver figura 6). A poliacrilamida serviu como adjuvante. Dois coelhos da raa New Zealand, mantidos no biotrio do SCB (UFPR), foram injetados, cada qual com cerca de 0,5 mg da VTGp, distribudos por duas vias (mesma seringa para cada animal): intramuscular e subcutnea. Aps 30 dias a mesma dose foi administrada como descrito acima. Depois disso, com intervalos alternados de 15 dias (HOLBECH et al., 2001), foram realizadas coletas de sangue a partir da veia marginal auricular, ou a administrao de 0,25 mg de VTGp. Dez dias aps a 4.a inoculao os animais sofreram puno cardaca, de acordo com procedimento de rotina do Biotrio do SCB (UFPR).

76
O sangue obtido foi deixado a 4oC por 24 h e ento centrifugado por 10 minutos a 3000g para obteno do anti-soro contra VTG de Hoplias malabaricus, este aliquotado e mantido a 4oC. O anti-soro obtido aps a 4.a inoculao (doravante abreviado por HOPL) serviu para a imuno-deteco da VTG de Hoplias malabaricus. No houve diferena em especificidade da reao imuno-qumica obtida com HOPL proveniente dos dois coelhos.

III.2.2.2 Imuno-Deteco por Western Blot

Reaes imuno-qumicas entre os anti-soros SALP, SPAU, SALA ou HOPL, e a VTG de Hoplias malabaricus foram realizadas com amostras de plasma, meio de cultivo celular e clulas (hepatcitos) cultivados in vitro, aps separao das protenas dessas amostras por SDS-PAGE, seguida da transferncia das protenas para uma membrana de nitrocelulose (BioRad: poro de 0,45 m), com aplicao de um campo eltrico ortogonal ao plano da membrana (1 h, 95 V, 200 mA, 0oC), na tcnica conhecida como Western Blot (doravante abreviada por WB). Marcadores de massa molecular pr-corados em azul (BioRad) foram empregados para o monitoramento da transferncia. Foi utilizado para SDSPAGE e WB o aparato Mini Protean System da BioRad. As membranas de nitrocelulose contendo as protenas transferidas do gel foram incubadas com os anti-soros supracitados e tratadas sob diferentes condies de estringncia (ver resultados). Um kit de reagentes obtido comercialmente da BioRad (Amplified Alkaline Phosphatase Immun-Blot Assay Kit) foi utilizado para a imuno-deteco. Esse kit dispe da amplificao do sinal (cor prpura) da fosfatase alcalina conjugada com a biotina, sendo esta incubada com a streptoavidina; o passo intermedirio consiste da incubao com o anti-soro secundrio (produzido em cabras contra a IgG de coelhos), que tambm tem suas molculas de IgG conjugadas com a biotina. Entre as incubaes houveram trs lavagens das membranas (sob forte agitao orbital), cada qual de 710 minutos com salina tamponada com Tris, pH 7,5 (TBS), contendo 0,1% (v/v) do detergente bioqumico Tween 20 (TTBS). O

77
TTBS serviu para a diluio dos componentes integrantes das incubaes, no volume final de 0,5 ml.cm-2 de membrana de nitrocelulose. Os policlonais primrios foram adicionados sobre a soluo de bloqueio membrana (leite em p desnatado sem ferro a 5%, m/v, em TTBS), aps o bloqueio de 12 horas (ocupao de stios no especficos), temperatura ambiente e com agitao orbital constante. As reaes de cor da fosfatase alcalina, com a adio dos substratos, ocorreram sobre a bancada, a temperatura ambiente e no escuro, por tempos variados de acordo com a imuno-reatividade do policlonal primrio empregado. Variaes do mtodo proposto pelo fabricante do kit esto expressas nos resultados e o apndice 3 compila numa planilha todos os procedimentos do mtodo empregado para SDS-PAGE-WB, bem como as concentraes e volumes utilizados aps padronizao.

III.2.3 EFEITO DO CHUMBO SOBRE A EXPRESSO DA VTG IN VIVO

Dezoito exemplares jovens de Hoplias malabaricus, machos e fmeas, foram obtidos comercialmente de um piscicultor de Araucria (PR). Os animais foram aclimatados nas condies experimentais por 4 meses, de acordo com III.2.1.1. Sua massa mdia foi de 80,84 g (DP = 34,67 g), somando 1616,83 g de biomassa total. Foi realizado um bioensaio de exposio aguda (96 h) ao Pb(NO3)2, diludo em soluo aquosa neutra e administrado por via intraperitoneal (iip), aps 15 dias de induo da expresso da VTG com 17-estradiol (E2: C18H24O2), este diludo em leo de amendoim (aps prvia diluio com etanol) e administrado por iip em 4 doses distintas. Seis triplicatas constituram os grupos que seguem: a) controles: iip de leo de amendoim; b) controles de induo: iip de 10 mg E2.kg-1; c) iip de 7 g Pb++.g-1 depois de 15 dias da iip 10 mg E2.kg-1; d) iip de 21 g Pb++.g-1 depois de 15 dias da iip 10 mg E2.kg-1; e) iip de 63 g Pb++.g-1 depois de 15 dias da iip 10 mg E2.kg-1;

78
f) iip de 100 g Pb++.g-1 depois de 15 dias da iip 10 mg E2.kg-1; As pesagens e injees ocorreram aps anestesia, como descrito em III.2.1.1, bem como a coleta de amostras de sangue e obteno do plasma com anti-proteoltico PMSF. As amostras de plasma dos animais foram analisadas por SDS-PAGE (empilhamento a 5% e separao a 7-9%), segundo LAEMMLI (1970), seguida de colorao com CBB, ou sujeitas a imuno-deteco da VTG por WB. Ver apndice 3.

III.2.4 CULTIVO PRIMRIO DE HEPATCITOS E INDUO IN VITRO

III.2.4.1 Isolamento e Cultivo Primrio de Hepatcitos

Dois exemplares de Hoplias malabaricus adultos e em idade reprodutiva, um macho ( 980 g) e uma fmea em vitelognese ( 240 g) foram capturados no Parque Ecolgico Costa, Curitiba (PR). Os dois foram utilizados, aps anestesia descrita em III.2.1.1, para obteno de hepatcitos. Foi utilizado o mtodo padronizado por FILIPAK NETO et al. (2006) para cultivo primrio de hepatcitos de traras. Os animais foram mortos com uma inciso na coluna vertebral, separando a primeira vrtebra do crnio, e logo em seguida desinfetados com cloro-hexidina alcolica a 2%, aplicado com gaze. As escamas da linha mediano-ventral foram retiradas e o animal levado sob fluxo laminar. Todos os procedimentos seguintes ocorreram com assepsia, sob o fluxo. Aps a abertura ventral, o lobo fusiforme direito do fgado foi excisado e perfundido com EDTA a 2 mM em salina tamponada com fosfato (PBS) por 1 h, com fluxo de aproximadamente 4 ml.min-1. O rgo foi cortado e comprimido contra uma tela metlica com poro de 1 mm, os pedaos foram lavados com meio de cultivo (MC descrito abaixo) e a suspenso de clulas foi colhida em um recipiente disposto abaixo da tela. As clulas foram centrifugadas por 1 minuto, em baixa rotao e ressuspensas (lavadas) em novo volume, com MC. Aps nova centrifugao as clulas foram ressuspensas em MC: RPMI 1640 (pH 7.8),

79
contendo HEPES (15 mM); NaHCO3 (6 mM); sulfato de gentamicina (40 mg.l-1); insulina bovina-suna (0,2 U.ml-1); e aprotinina a 2 mg.l-1, como antiproteoltico. A uma alquota da suspenso final de clulas de cada animal foi separada para citometria de fluxo no FACSCalibur, do SCB (UFPR). Aps centrifugao as clulas foram ressuspensas em PBS para contagem no aparelho. A suspenso de hepatcitos do macho (doravante denominados apenas de HPs) apresentou densidade de 0,6.106 clulas.ml-1, e a suspenso de hepatcitos da fmea (HPs), densidade de 0,7.106 clulas.ml-1. As clulas foram semeadas em microplacas CORNING de 96 poos (fundo plano, poliestireno, pr-tratamento com carga eltrica para adeso celular). Cada poo recebeu 250 l da suspenso de HPs, ou de HPs, com uma quantidade mdia de 15.104 clulas por poo. A adeso ocorreu por 72 horas a 22oC.

III.2.4.2 Induo Experimental da VTG in vitro

Aps a pr-incubao para adeso (72 horas), dois experimentos foram realizados, um com HPs e outro com HPs. Para HPs houve troca do MC nos tempos 0, 2, 4, 7 e 10 dias, quando o MC foi substitudo em todos os poos e preservado para a anlise de VTG. Ao trmino de 10 dias as clulas (pool de 8 poos por tratamento ou grupo) foram desagregadas a temperatura ambiente por 20 minutos, com EDTA a 0,02% e tripsina a 0,05% em PBS, suspensas, centrifugadas e ressuspensas em PBS para contagem por citometria de fluxo. Uma alquota das amostras serviu para o ensaio de viabilidade com azul de tripano, realizado em cmara citomtrica de Neubauer por microscopia de luz visvel. A viabilidade mdia nos tratamentos foi sempre superior a 80%. Para a induo da expresso da VTG por HPs usou-se o 17-estradiol (E2) diludo em etanol; e como substncia antagonista ao efeito estrognico, usou-se o citrato de tamoxifeno (TMX: C26H29NO.C6H8O7), tambm diludo em etanol. Os seguintes tratamentos foram empregados (concentraes de E2 e TMX segundo SMEETS et al., 1999) a cada 16 poos de microplaca por grupo e em estufa a 22oC:

80
a) CTRL: grupo controle, sem nenhum tratamento; b) Et-OH: grupo controle de etanol a 0,15% (v/v) no MC; c) E2: grupo induzido com E2 a 1 M; d) TMX: grupo controle de citotoxicidade ao TMX a 6 M; e) E2+TMX: grupo controle de ao anti-estrognica (E2 a 1 M e TMX a 6 M). Para os HPs houve a incluso de soro bovino fetal a 10% (v/v) no MC, este foi trocado nos tempos 0, 2 e 4 dias, quando o MC foi substitudo em todos os poos e preservado para a anlise de VTG. Ao trmino de 4 dias as clulas foram desagregadas como descrito acima, centrifugadas e ressuspensas em PBS para contagem por citometria de fluxo (pool de 8 poos por tratamento). Uma alquota das amostras serviu para o ensaio de viabilidade descrito acima. A viabilidade mdia nos tratamentos foi sempre superior a 80%. Para a induo da expresso da VTG por HPs usou-se o 17-etinil-estradiol (EE2: C20H24O2) diludo em etanol; e como substncia antagonista ao efeito estrognico, usou-se o citrato de tamoxifeno (TMX), tambm diludo em etanol. Os seguintes tratamentos foram empregados, a cada 16 poos de microplaca por grupo e em estufa a 22oC: a) CTRL: grupo controle, sem nenhum tratamento; b) Et-OH: grupo controle de etanol a 0,15% (v/v) no MC; c) EE2: grupo induzido com EE2 a 9 M; d) TMX: grupo controle de citotoxicidade ao TMX a 9 M; e) EE2+TMX: grupo controle de ao anti-estrognica (E2 e TMX a 9 M). As amostras de MC foram analisadas por SDS-PAGE (empilhamento a 5% e separao a 79%), segundo LAEMMLI (1970), seguida de colorao com CBB, ou sujeitas a imuno-deteco da VTG por WB. Ver apndice 3. Algumas das amostras de MC coletadas do experimento com HPs tiveram seus teores proticos concentrados atravs da precipitao com cido tricloroactico (TCA) a 8% (m/v) em soluo aquosa, na razo de 1:2 (v/v). As protenas precipitadas em suspenso foram centrifugadas e ressuspensas em PBS. Esse procedimento permitiu que fossem aplicadas ao gel de eletroforese, quantidades

81
de protena relativas a um volume de MC maior (25125 l) do que a capacidade limite (20 l) do aparato utilizado. Tambm foi testada, para as amostras de MC, uma variante do tampo de desnaturao da amostra (TDA) concentrado 4 e sem o -mercapto-etanol como agente redutor. A VTG liberada no sangue pelos hepatcitos in vivo, por exocitose. Pressupe-se portanto sua presena no MC de experimentos in vitro. Contudo no foi possvel precipitar com TCA nenhuma protena do MC oriundo do experimento com HPs. Tambm no foi possvel a precipitao seletiva da VTG com EDTA e MgCl2 (descrita em III.2.1.2) a partir das amostras de MC de ambos os ensaios in vitro. Devido a esse fato, foram adicionados 20 l de TDA 1 sobre os HPs preservados a 75oC, procedimento repetido em 8 poos (pool) por tratamento. Cada pool foi submetido a 100oC por 10 minutos e em seguida passado por uma agulha fina (133,8) para a quebra de DNA. Vinte microlitros de amostra de cada pool foram aplicados por linha de gel de eletroforese, correspondendo aproximadamente mdia de clulas contidas em 1 poo. A VTG do MC do experimento com HPs, aps SDS-PAGE-WB, foi quantificada por anlise de imagem (quantificao relativa) pelo programa de distribuio gratuita, Image Tool da UTHSCSA (desenvolvido pela University of Texas Health Science Center at San Antonio). A imagem da membrana de nitrocelulose foi digitalizada em alta definio (1200 dpi), convertida para tons de cinza (graduao de 0256) e o parmetro aferido pelo Image Tool foi a densidade integrada das bandas (intensidade total), que correspondente ao produto da mdia da intensidade (mdia de tons de cinza, em cada pixel integrante da banda de VTG), pelo nmero de pixels da banda. Os valores obtidos dessa anlise e os dados de citometria de fluxo (contagem de clulas) serviram aplicao do ndice Vitelognico para ensaios in vitro de estrogenicidade (IVTGh), com emprego da equao (11). Ver III.1.2.4.

82

III.3 RESULTADOS

III.3.1 INDUO DA EXPRESSO DA VTG IN VIVO

O hexa-hidrobenzoato de estradiol, administrado por via intraperitoneal (iip) na dose de 20 mg.kg-1, induziu a expresso da VTG em Hoplias malabaricus, 15 dias aps a iip (dose nica), como demonstrado com a VTG plasmtica analisada por SDS-PAGE, seguida de colorao com CBB. Ver figura 6. O mtodo de isolamento da VTG plasmtica atravs da precipitao com EDTA e MgCl2 (SILVERSAND; HYLLNER; HAUX, 1993) eliminou grande parte das protenas plasmticas de Hoplias malabaricus, quando de uma anlise subjetiva e pelo mtodo empregado (SDS-PAGE-CBB, fig. 6). O plasma de macho jovem de Hoplias malabaricus, analisado por SDSPAGE-CBB, no apresentou a banda correspondente VTG ( 200 kDa), como ilustrado na figura 6. O plasma de fmea jovem de Hoplias malabaricus, analisado por SDSPAGE-CBB, apresentou a banda correspondente VTG, mas com fraca intensidade, indicando que o animal estava em estgios iniciais de vitelognese, fato confirmado pela anlise macroscpica das gnadas. provvel, devido ao tamanho da fmea (26,1 g) que ela estivesse entrando no seu primeiro perodo de vitelognese, no incio de sua maturao sexual. Ver figura 6.

III.3.2 EFEITO DO CHUMBO SOBRE A EXPRESSO DA VTG IN VIVO

O 17-estradiol (E2) administrado por iip na dose de 10 mg.kg-1 induziu a expresso da VTG em Hoplias malabaricus (15 dias aps dose nica), como demonstrado com a VTG plasmtica analisada por SDS-PAGE-CBB e em comparao ao plasma de um macho jovem no induzido. Ver figura 7a.

83
FIGURA 6 ELETROFORESE DESNATURANTE EM GEL DE POLIACRILAMIDA PARA ANLISE DA VITELOGENINA PLASMTICA DE HOPLIAS MALABARICUS
1 2 3 4 5 6 7 8
MWM

205 kDa 116 kDa 97,4 kDa 66 kDa 45 kDa 29 kDa

LEGENDA: Empilhamento com acrilamida a 4% e separao a 9%. Colorao por Coomassie Brilliant Blue. Desnaturao em TRIS-HCl a 62,5 mM (pH 6,8), com glicerol a 10% (v/v), dodecilsulfato de sdio (SDS) a 2% (m/v), -mercapto-etanol a 5% (v/v), e azul de bromofenol a 0,001% (m/v); 1 minuto a 100oC. O plasma do macho adulto foi coletado aps 15 dias de induo por 20 mg.kg-1 de hexa-hidrobenzoato de estradiol, administrado intraperitonealmente e no foi congelado antes da anlise aqui ilustrada. A linha 6 ilustra o imungeno administrado em coelhos para produo do anti-soro homlogo HOPL (policlonais primrios para a imuno-deteco). MWM: marcador de massa molecular Linha 1: 200 nl de plasma de macho jovem (25,8 g); Linha 2: 200 nl de plasma de fmea jovem (26,1 g); Linha 3: 50 nl de plasma de macho adulto (494,3 g); Linha 4: repetio com 200 nl de plasma de macho adulto (494,3 g); Linhas 5 a 8: 50 nl de precipitado protico redissolvido em NaCl a 1 M, aps precipitao do plasma de macho adulto em soluo de Na2EDTA.2H2O adicionada de MgCl2, gerando as seguintes razes molares finais: Linha 5: [EDTA] [Mg++] = 1,0 2,5 Linha 6: [EDTA] [Mg++] = 1,0 2,0 Linha 7: [EDTA] [Mg++] = 1,0 1,5 Linha 8: [EDTA] [Mg++] = 1,0 1,0

84
FIGURA 7 EFEITO AGUDO DO Pb++ IN VIVO (96 HORAS) SOBRE A PRODUO DE VITELOGENINA PLASMTICA DE HOPLIAS MALABARICUS, APS 15 DIAS DE INDUO COM 17-ESTRADIOL (E2) (a)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

250 kDa 150 kDa

100 kDa 75 kDa

(b)
250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa
2 3 4 5

(c)
250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa
2 3 4 5

50 kDa

50 kDa

37 kDa

37 kDa

25 kDa

25 kDa

LEGENDA: (a) empilhamento com acrilamida a 5% e separao a 79%. Colorao por Coomassie Brilliant Blue. Tampo de desnaturao da amostra (TDA) 1: TRIS-HCl a 62,5 mM (pH 6,8), com glicerol a 10% (v/v), dodecil-sulfato de sdio (SDS) a 2% (m/v), -mercapto-etanol a 5% (v/v), e azul de bromofenol a 0,001% (m/v); 2 minutos a 100oC. Volume de plasma aplicado por linha: 100 nl. Linha 1: marcador de massa molecular recombinante e pr-corado (BioRad); Linha 2: pool de plasma dos 3 machos do grupo controle; Linha 3: pool de plasma dos 3 machos do grupo controle de induo injeo (ip) nica de 10 mg E2.kg-1 (15 dias de induo); Linhas 4 a 10: todos os animais injetados com 10 mg E2.kg-1 e aps 15 dias de induo, injetados com as seguintes doses de chumbo (96 h de exposio): Linha 4: pool de plasma dos 3 machos do grupo de 7 g Pb++.g-1; Linha 5: pool de plasma dos 2 machos do grupo de 21 g Pb++.g-1; Linha 6: plasma da fmea do grupo de 21 g Pb++.g-1; Linha 7: plasma da fmea do grupo de 63 g Pb++.g-1; Linha 8: pool de plasma dos 2 machos do grupo de 63 g Pb++.g-1; Linha 9: plasma de 1 macho do grupo de 100 g Pb++.g-1; Linha 10: plasma de 1 macho do grupo de 100 g Pb++.g-1. (b) e (c): Imuno-deteco por Western Blot: incubaes com policlonal primrio realizadas em salina tamponada com Tris, pH 7,5 (TBS) contendo 0,1% (v/v) de Tween 20 (TTBS) e 5% de leite (m/v), com oscilao orbital, por 2 horas e a temperatura ambiente.

85
Linha 1: marcador de massa molecular recombinante e pr-corado (BioRad); Linha 2: plasma de 1 macho do grupo controle de induo injeo (ip) nica de 10 mg E2.kg-1 (15 dias de induo); Linha 3: plasma da fmea do grupo de 21 g Pb++.g-1; Linha 4: plasma de 1 macho do grupo de 63 g Pb++.g-1; Linha 5: plasma de 1 macho do grupo de 100 g Pb++.g-1; (b) anti-soro HOPL (1:3000): 20 segundos de reao da fosfatase alcalina (c) anti-soro SALA (1:3000): 15 minutos de reao da fosfatase alcalina

Nenhuma das quatro doses de Pb++ administradas simultaneamente ao E2, 15 dias aps a induo, produziu efeito anti-estrognico aps 96 horas de exposio via iip. Isso quando da anlise subjetiva das amostras de plasma por SDS-PAGE-CBB (fig. 7a), ou por SDS-PAGE-WB, atravs da reao imunoqumica entre a VTG e os anti-soros HOPL (fig. 7b) e SALA (fig. 7c). H um aparente efeito estrognico causado pelas doses iip de 21 e 63 g Pb++.g-1 (linhas 6 e 7 da fig. 7a, respectivamente, e linha 3 da fig. 7b), contudo isso foi atribudo ao fato dessas amostras de plasma serem de fmeas. Os 18 animais foram analisados em separado por SDS-PAGE (no ilustrado), antes de comporem os pools de plasma (mistura de volumes iguais) dos machos da fig. 7a. O anti-soro HOPL mostrou-se mais imuno-reativo que o SALA, nas mesmas condies de incubao (2 h a temperatura ambiente, com oscilao orbital), pois a reao da fosfatase alcalina para o HOPL produziu um sinal forte em 20 segundos, enquanto que para o SALA, um sinal bem mais fraco em 15 minutos, ambas no escuro. Em outra condio de incubao (no ilustrado) e em relao maior intensidade de sinal e especificidade VTG plasmtica de Hoplias malabaricus, os 4 anti-soros testados puderam ser classificados, do mais eficiente para o menos, como SALP > SPAU > SALA > HOPL: 16 horas a 4oC com agitao orbital constante. O aumento da estringncia na imuno-reatividade, com a

permanncia do leite (do bloqueio), a adio de Tween 20 a 0,1% (v/v), o aumento da temperatura (de 4oC para temperatura ambiente) e a diminuio do tempo de incubao (para 2 h), aumentou a especificidade antgeno-anticorpo por alteraes na afinidade qumica, o que tornou o anti-soro homlogo mais eficiente que os outros trs. Nessas condies a imuno-reao cruzada perdeu especificidade e intensidade de sinal.

86
III.3.3 ESTROGENICIDADE IN VITRO

III.3.3.1 Anlises das Amostras de Meio de Cultivo

Os HPs produziram e liberaram a VTG no MC em todos os tratamentos (CTRL, Et-OH, EE2, TMX, EE2+TMX, ver III.2.4.2), j a partir do primeiro dia (T0) aps a adeso das clulas (72 h). Aps 4 dias o EE2 induziu a expresso da VTG, quando essa foi comparada a do grupo controle no T0 (no ilustrado) e com a de todos os grupos no T4 (aps 96 horas), como ilustrado na figura 8. Os HPs aps 10 dias, no produziram nenhuma VTG detectvel no MC, pela imuno-reao cruzada com o anti-soro SALP (linhas 9 e 10 da fig. 9) e o mesmo foi observado com o anti-soro HOPL ou por SDS-PAGE-CBB (no ilustrado). Tambm no foi possvel a obteno de nenhum precipitado protico com TCA ou EDTA-MgCl2, das amostras de MC preservadas do experimento com HPs. Os anti-soros SALP (fig. 9) e SPAU (fig. 10) mostraram-se pouco imunoreativos contra a VTG contida no MC (HPs). O SPAU produziu um sinal mais forte para a VTG, com menos tempo de reao da fosfatase alcalina (40 segundos), quando comparado ao SALP (15 minutos). Contudo as condies de incubao foram distintas: 16 h a 810oC para o SPAU e 2 h a temperatura ambiente para o SALP, ambos com oscilao orbital constante. Nenhum dos dois demonstrou um bom grau de especificidade contra a VTG, j que reagiram com protenas do soro bovino fetal empregado no experimento com HPs. Um controle desse soro a 10% no MC, que no entrou em contato com nenhum hepatcito demonstra esse fato (ver linha 2, fig. 9). A precipitao das amostras de MC com TCA provocou quebra nas protenas do soro bovino, aumentando sua mobilidade eletrofortica (fig. 9). A variante do tampo de desnaturao da amostra (TDA 4) sem o agente redutor (-mercapto-etanol) restringiu a mobilidade eletrofortica das protenas aplicadas ao gel (ver linha 8, fig. 9), produzindo uma corrida excessivamente arrastada para essa linha, sem a devida separao das bandas.

87
FIGURA 8 IMUNO-DETECO DA VITELOGENINA PRODUZIDA EM CULTIVO PRIMRIO DE HEPATCITOS DE HOPLIAS MALABARICUS: (ANTI)ESTROGENICIDADE IN VITRO (a)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

(b)
250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa

250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa

50 kDa 37 kDa

50 kDa 37 kDa 25 kDa

25 kDa

(c)
gel_LINHA amostra MM CTRL EE2 TMX+EE2 TMX CTRL Et-OH E2 TMX+E2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 VOLUMES em l TDA 250, 150, 100, 50,0 50,0 50,0 50,0 20 x 8 20 x 8 20 x 8 20 x 8 20 x 8 2X 2X 2X 2X 1X 1X 1X 1X 1X AMOSTRA 75, 50, 50,0 50,0 50,0 50,0 8 poos 8 poos 8 poos 8 poos 8 poos VAMOSTRA aplicado ( (l) VTOTAL aplicado amostra MM recombinante 10 10 10 10 20 20 20 20 20 grupo controle grupo induzido: EE2 a 9 M EE2 a 9 M + TMX a 9 M tamoxifeno (TMX) a 9 M grupo controle controle de etanol a 0,15% grupo induzido: E2 a 1 M E2 a 1 M + TMX a 6 M tamoxifeno (TMX) a 6 M cultivo primrio de hepatcito de trara: FMEA APS 4 DIAS MACHO APS 10 DIAS MACHO DESNATURAO

37, <=25 (20, 15, 10) 5,0 5,0 5,0 5,0 1 poo 1 poo 1 poo 1 poo 1 poo

MEIO DE CULTIVO: MC concentrado 5X com TCA 1 minuto a 100oC TDA 1X aplicado sobre as CLULAS do cultivo 10 minutos a 100oC

TMX 10

E2: 17-estradiol (C18H24O2)

EE2: 17-etinil-estradiol: (C20H24O2)

TMX: citrato de tamoxifeno (C26H29NO.C6H

LEGENDA: (a) empilhamento com acrilamida a 5% e separao a 79%. Colorao por Coomassie Brilliant Blue. Tampo de desnaturao da amostra (TDA) 1: TRIS-HCl a 62,5 mM (pH 6,8), com glicerol a 10% (v/v), dodecil-sulfato de sdio (SDS) a 2% (m/v), -mercapto-etanol a 5% (v/v), e azul de bromofenol a 0,001% (m/v); (b) imuno-deteco da VTG (150 kDa) por Western Blot do padro eletrofortico obtido em (a): incubao com policlonal primrio (anti-soro HOPL) 1:3000 em TTBS, com 5% de leite (m/v), com oscilao orbital, por 2 horas e a temperatura ambiente; 20 segundos de reao da fosfatase alcalina; (c) planilha esquemtica utilizada na montagem da eletroforese.

88
FIGURA 9 ANLISE DO MEIO DE CULTIVO PRIMRIO DE HEPATCITOS DE HOPLIAS MALABARICUS
8 1 2 3 4 5 6 7 9

(a)
gel_LINHA VOLUMES em l TDA 1 2 3 4 5 6 7 250, 150, 100, 50 25 25 50 25 2X 2X 2X 2X 2X AMOSTRA 75, 50, 50 25 25 50 25 VAMOSTRA aplicado l VTOTAL AMOSTRA DE

(b)
amostra MM MC + S10 aplicado MEIO DE CULTIVO (MC) MM recombinante 10,00 7,00 7,00 10,00 7,00 CTRL de SBF CTRL concentrado 10X - TCA CTRL concentrado 10X - TCA EE2 EE2 - concentrado 10X - TCA 37, <=25 (20, 15, 10) 5,000 3,500 3,500 5,000 3,500

10

250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa

CTRL - F CTRL - F EE2 EE2

50 kDa 37 kDa

EE2 CTRL - M E2

8 9 10

10 50 50

4X 2X 2X

30 50 50

3,500 10,000 10,000

4,67 20,00 20,00

EE2 - concentrado 10X - TCA CTRL E2

LEGENDA: empilhamento com acrilamida a 5% e separao a 79%; tampo de desnaturao da amostra (TDA) 1: TRIS-HCl a 62,5 mM (pH 6,8), com 25 kDa glicerol a 10% (v/v), dodecil-sulfato de sdio (SDS) a 2% (m/v), -mercaptoetanol a 5% (exceto linhas 7 e 8), e azul de bromofenol a 0,001% (m/v); (a) Western Blot do padro eletrofortico obtido com amostras de meio de cultivo (MC): incubao com policlonal primrio (anti-soro SALP) 1:3000 em TTBS, com 5% de leite (m/v), com oscilao orbital, por 2 horas e a temperatura ambiente (TA); 15 minutos de reao da fosfatase alcalina; (b) planilha esquemtica utilizada na montagem da eletroforese, onde: MM: marcador de massa molecular recombinante e pr-corado; MC + S10: controle de SORO BOVINO FETAL a 10% (v/v) em MC recm preparado; CTRLF: MC do grupo controle (sem tratamento) de hepatcitos de FMEA no T4 (4 dias), aps adeso das clulas por 72 horas; EE2: MC do grupo induzido (hepatcitos de FMEA) com 17-etinil-estradiol a 9 M, aps 4 dias; CTRLM: MC do grupo controle (sem tratamento) de hepatcitos de MACHO, aps 10 dias; E2: MC do grupo induzido (hepatcitos de MACHO) com 17-estradiol a 1 M, aps 10 dias. FIGURA 10 ANLISE PILOTO DO MEIO DE CULTIVO PRIMRIO DE HEPATCITOS DE HOPLIAS MALABARICUS FMEA
miosina: 207 kDa -galactosidase: 117 kDa albumina de soro bovino: 95 kDa

ovalbumina: 45 kDa

LEGENDA: empilhamento com acrilamida a 5% e separao a 79%; tampo de desnaturao da amostra (TDA) 1: TRIS-HCl a 62,5 mM (pH 6,8), com glicerol a 10% (v/v), dodecil-sulfato de sdio (SDS) a 2% (m/v), -mercapto-etanol a 5%, e azul de bromofenol a 0,001%; Western Blot do padro eletrofortico obtido com amostras de meio de cultivo (MC): incubao com policlonal primrio (anti-soro SPAU) 1:3000 em TTBS, com 5% de leite (m/v), com oscilao orbital, por 16 horas a 810oC; 40 segundos de reao da fosfatase alcalina; As duas linhas so MC de um grupo sem tratamento (ensaio piloto) de hepatcitos de FMEA.

89
III.3.3.2 Anlises das Amostras de Hepatcitos do Macho (HPs)

A anlise das protenas dos HPs aplicados ao gel, aps intensa desnaturao (10 minutos a 100oC com TDA 1) revelaram duas fortes bandas, detectadas pela reao imuno-qumica com os anti-soros HOPL (fig. 8) e SALP (fig. 11): uma banda entre 150 e 100 kDa e outra com 75 kDa. Presume-se que essas duas bandas correspondam maior parte da VTG intracelular dos hepatcitos. Os dois padres de mobilidade eletrofortica distintos podem ser explicados pela desnaturao, que provavelmente quebrou a VTG em 2 partes de menor massa molecular. No houve diferena para a intensidade do sinal, obtido nessas 2 bandas, entre os tratamentos do experimento com HPs. A imuno-reao do anti-soro HOPL (fig. 8) detectou tambm outras duas bandas com forte sinal, e com massa molecular aproximada de 45 e 30 kDa. Essa reao considerada aqui como no especfica para a VTG. J o SALP no reagiu com tais protenas celulares (fig. 11). As condies de incubao foram distintas: 16 horas a 810oC para o SALP e 2 h a temperatura ambiente para o HOPL, ambos com oscilao orbital constante. O tempo de reao da fosfatase alcalina foi igual para ambos (20 segundos). O SALP produziu um sinal bem mais limpo que o HOPL, que gerou bastante colorao de fundo (background) e marcao no especfica.

90
FIGURA 11 ANLISE DAS CLULAS DO CULTIVO PRIMRIO DE HEPATCITOS DE HOPLIAS MALABARICUS MACHO, APS DEZ DIAS DE CULTIVO (a)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa

50 kDa

37 kDa

(b)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa

LEGENDA: (a) empilhamento com acrilamida a 5% e separao a 79%. Colorao por Coomassie Brilliant Blue. Tampo de desnaturao da amostra (TDA) 1: TRIS-HCl a 62,5 mM (pH 6,8), com glicerol a 10% (v/v), dodecil-sulfato de sdio (SDS) a 2% (m/v), -mercapto-etanol a 5% (v/v), e azul de bromofenol a 0,001% (m/v); TDA 1 aplicado sobre as clulas, na microplaca; desnaturao intensa de 10 minutos a 100oC. Volume de amostra aplicado por linha corresponde quantidade de clulas de 1 poo de microplaca. (b) imuno-deteco da VTG ( 75 e 100150 kDa) por Western Blot do padro eletrofortico obtido em (a): incubao com policlonal primrio (anti-soro SALP) 1:3000 em TTBS, sem o leite do bloqueio, com oscilao orbital por 16 horas a 810oC; 20 segundos de reao da fosfatase alcalina. Para (a) e (b): Linha 1: marcador de massa molecular recombinante e pr-corado (BioRad); Linhas 2 e 3: clulas do grupo controle (sem tratamento); Linha 4: clulas do grupo controle de etanol a 0,15% (v/v); Linhas 5 e 6: clulas do grupo induzido com 17-estradiol (E2) a 1 M; Linhas 7 e 8: clulas do grupo tratado com tamoxifeno (TMX) a 6 M; Linhas 9 e 10: clulas do grupo tratado com E2 a 1 M e TMX a 6 M.

91
III.3.4 APLICAO DO IVTG PARA ESTROGENICIDADE IN VITRO

A anlise subjetiva (SDS-PAGE-WB) da induo por EE2 (HPs) pde revelar a expresso diferenciada da VTG, entre os tratamentos (ver III.2.4.2): TMX < CTRL Et-OH EE2+TMX < EE2 (no ilustrado). Contudo o mtodo de imuno-deteco com o anti-soro HOPL no se mostrou sensvel o suficiente para uma quantificao acurada e precisa dos teores de VTG no MC. Isso ocorreu por dois motivos: a) o emprego do anti-soro HOPL invariavelmente produziu uma colorao de fundo ou background excessivo (a melhor condio est ilustrada na figura 8b); b) as protenas do soro bovino fetal empregado no MC (HPs) restringiram a anlise de volumes satisfatrios de MC (com maiores quantidades de VTG), por limitaes impostas pela tcnica;

quantidades de protenas obtidas com TCA e correspondentes a volumes maiores que 35 l produziram corridas arrastadas como padres de eletroforese. Por outro lado na equao (11), do ndice Vitelognico para ensaios in vitro de estrogenicidade (IVTGh), os valores para quantidades de VTG sofrem uma correo que permite que at mtodos pouco acurados sejam empregados na comparao entre grupos, eliminando o carter subjetivo da anlise. Com a banda correspondente VTG das linhas 2, 3, 4 e 5 da figura 8b (respectivamente os tratamentos CTRL, EE2, EE2+TMX e TMX) foi realizada por anlise de imagem (densidade integrada descrita em III.2.4.2) uma quantificao relativa da intensidade das bandas de VTG. Como o nmero de clulas ao final do experimento foi sempre menor que a densidade da suspenso semeada nas placas, pde-se observar diferentes padres de citotoxicidade, entre os dois experimentos e entre os tratamentos. O grfico 8 demonstra os resultados da citometria de fluxo (contagem das clulas desagregadas com EDTA / Tripsina) ao final dos experimentos com HPs (10 dias, grf. 8a) e com HPs (4 dias, grf. 8b).

92
Foi ento aplicado o IVTGh (figura 12), como concebido pela equao (11) em III.1.2.4, com os dados da intensidade das bandas de VTG e do grfico 8b.

93
GRFICO 8 CITOMETRIA DE FLUXO APS EXPERIMENTOS IN VITRO (a)
16 14 10.000 CLULAS por POO de microplaca 12 10 8 6 4 2 0
H 2 X R L E TM C T TM tO X

(b)
16 14 10.000 CLULAS por POO de microplaca 12 10 8 6 4 2 0
T R L X H E 2 T M tO C T M E X

FONTE: O autor NOTAS: Clulas do fgado de Hoplias malabaricus cultivadas a partir do animal macho (a), aps 3 dias para adeso, seguidos de 10 dias de exposio; ou fmea (b), aps 3 dias para adeso e 4 dias de exposio. Clulas desagregadas na microplaca com EDTA e tripsina, compondo grupos (pools) de 8 poos (com o fundo totalmente coberto de clulas) para cada tratamento. O resultado final expresso a mdia (realizada com a pipeta) do nmero de clulas em 1 poo, por tratamento: CTRL: clulas do grupo controle (sem tratamento); EtOH: clulas do grupo controle de etanol a 0,15% (v/v); E2: clulas do grupo induzido com 17-estradiol a 1 M; TMX: clulas do grupo tratado com tamoxifeno a 6 M em (a) e a 9 M em (b); EE2: clulas do grupo tratado com 17-etinil-estradiol a 9 M.

E 2

94
FIGURA 12 NDICE VITELOGNICO PARA ENSAIOS IN VITRO DE ESTROGENICIDADE (IVTGh): APLICAO DA EQUAO (11) (a)
TRATAMENTO NMERO DE CLULAS POR POO DE MICROPLACA CLULAS VTG (+) POR POO DE MICROPLACA CONCENTRAO RELATIVA (intensidade) de VTG maior valor individual de VTG intensidade de VTG no grupo CONTROLE N n VTG VTGmax VTGC ctrl 129.471 129.471 3.320.517 4.839.472 3.320.517 0,000000 145.807 145.807 473764 11,77 0,27 1,00 1,27 0,00 0,00 11,89 1,31 15,55 0,00 EE 145.807 145.807 4.839.472 4.839.472 3.320.517 0,313868 145.807 145.807 473764 11,89 0,31 1,00 1,31 0,31 4,88 11,89 1,31 15,55 31,39 92.357 92.357 3.434.054 4.839.472 3.320.517 0,023461 145.807 145.807 473764 11,43 0,19 1,00 1,19 0,02 0,32 11,89 1,31 15,55 2,06 106.128 106.128 1.856.669 4.839.472 3.320.517 -0,302481 145.807 145.807 473764 11,57 0,22 1,00 1,22 -0,30 -4,28 11,89 1,31 15,55 -27,55
ENTRA VALOR ENTRA VALOR

ESTROGENICIDADE no grupo = VTG - VTGC / VTGmax NMERO DE CLULAS no grupo controle induzido ( EE2 ) NMERO DE CLULAS VTG (+) no grupo EE2 NE2 nE2

somatrio de n (Sn)

ln n IVTGh = ln NE2

[( n n ) + 1] [( NE2 n ) + 1]

ln N

(VTG VTGC) VTGmax

100

n / Sn n/N

(n / Sn)+(n / N) VTG - VTGC / VTGmax numerador ln NE2 (NE2 / Sn)+1 denominador

IVTGh =
16 14 10.000 CLULAS por POO de microplaca 12 10

(b)
40 30 ndice Vitelognico 20 10
CTRL 0 TMX EE2 EE2 + TMX

8 6 4 2 0

-10 -20 -30

R L

E E 2

t-O

E E 2

(c)

-40

(d)

LEGENDA: (a) decomposio da equao (11), descrita em III.1.2.4 e que figura inserida na planilha; a figura 8b e o grfico 8b provm os valores de entrada na planilha; (b) rea da figura 8b utilizada na anlise de imagem para determinao da intensidade da banda correspondente a VTG ( 150 kDa: barras horizontais cingindo a figura) de hepatcitos de trara fmea cultivados por 4 dias. (c) grfico 8b descrito na pgina anterior; (d) ndice Vitelognico para ensaios in vitro de estrogenicidade (IVTGh) aplicado ao cultivo primrio de hepatcitos de Hoplias malabaricus.

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III.4 DISCUSSO Como esperado, tanto o 17-estradiol (E2), quanto o hexa-hidrobenzoato de estradiol (6HB-E2) induziram a sntese da VTG de Hoplias malabaricus in vivo, nas respectivas doses de 10 e 20 mg.kg-1 (iip), inclusive em animais machos (1 adulto e 3 jovens). WERNER et al. (2003) revisam que estaes de tratamento de esgoto j foram relatadas contendo em seus efluentes concentraes de at 0,021 mg.l-1 de E2 (Brasil); 7 ng.l-1 de 17-etinil-estradiol (EE2, Reino Unido); 17 ng.l-1 de EE2 (Alemanha); 8 ng.l-1 de E2 e 9 ng.l-1 de 17-estradiol (Canad). No caso particular brasileiro, onde muito do esgoto domstico ainda vai para corpos de gua e sistemas de drenagem de bacias, populaes naturais de peixes podem estar sujeitas a concentraes muito superiores s supracitadas, de compostos que desregulam o sistema neuro-endcrino-reprodutor de peixes, este facilmente susceptvel a variveis abiticas como intervenientes fsico-qumicos (KIME, 1999). O fato de os exemplares de Hoplias malabaricus aqui analisados, da exposio intraperitoneal ao Pb++, no apresentarem efeito estrognico, identifica esses animais como resistentes a condies adversas, no que diz respeito a viabilidade populacional dependente desse fator (produo de vitelo). Contudo estudos mais completos do efeito do chumbo em Hoplias malabaricus devem ainda ser conduzidos para tal afirmao. A ao estrognica aqui observada no plasma de fmeas expostas ao chumbo, e comparadas aos machos, um resultado contraditrio pois os machos no podem incorporar a VTG em suas gnadas. Esperava-se que os machos apresentassem menores teores de VTG plasmtica que as fmeas. Contudo alteraes causadas pelo Pb++ na regulao fisiolgica determinada pelo eixo crebro-hipotlamo-hipfise-gnada podem ter produzido tal efeito diferencial. Outrossim, a demonstrao de que essa incongruncia no relativa a fatores aleatrios (erro amostral) deve ser suportada com grupos de tamanho satisfatrio e mtodos acurados de quantificao da VTG.

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A trara no apresenta dimorfismo sexual e portanto grandes grupos devem compor bioensaios, para que variaes significativas nas quantidades de VTG possam demonstrar a situao reprodutiva de ambos os sexos, frente a contaminantes. Embora traras grandes (> 1 kg), em estgio avanado de vitelognese possam ser determinadas como fmeas, da interveno com otoscpio e visualizao do ovrio, apenas este grupo no representa a populao total em condies naturais e a tcnica pode ainda gerar leses e causa estresse, no recomendados em bioensaios. Fatos como esses conduziram o Laboratrio de Toxicologia Celular implementao de testes que empregam o cultivo primrio de hepatcitos. Em adio estudos in vitro com hepatcitos de truta revelam ao antiestrognica (supresso da sntese de VTG) causada pelo cdmio e pelo alumnio, como descrito por MUGIYA e TANAHASHI (1998) e HWANG, NAGAWA e MUGIYA (2000). O 17-etinil-estradiol (EE2) induziu a sntese e a liberao da VTG por hepatcitos de fmeas de Hoplias malabaricus, no meio de cultivo primrio (MC). O EE2 um estrgeno sinttico que est entre os mais potentes xenoestrgenos encontrados em esgotos tratados (LABADIE e BUDZINSKI, 2006). O relato da induo da expresso de VTG por xenoestrgenos em peixes, ou clulas de peixes, amplo: SMEETS et al. (1999); LANTONNELLE et al. (2002); KORDES, RIEBER e GUTZEIT (2002); WERNER et al. (2003); RADICE et al. (2004); BERG, WESTERLUND e OLSSON (2004); ZHONG et al. (2005); GORDON et al. (2006). Em biomonitoramentos recentes, concentraes de VTG plasmtica em peixes machos tm sido utilizadas como resposta indicadora de efeitos estrognicos em reas impactadas, como por HINCK et al. (2006) e REMPEL et al. (2006). Frente ao volume da pesquisa internacional dirigida a esse objeto de estudo, torna-se urgente o desenvolvimento de mtodos de monitoramento da (anti)estrogenicidade de substncias, para as espcies de peixes que ocorram em territrio nacional. Condies fisico-qumicas de ambientes aquticos distintos

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influenciam diferencialmente a reproduo em peixes (KIME, 1999). Populaes aloptricas de uma mesma espcie de peixe respondem e se adaptam fisiologicamente de forma distinta a contaminantes. O uso de sistemas biolgicos que sejam comuns a tais organismos de ambientes distintos pretendido para se poder comparar, predizer e sanear. Assim o operar da clula eucaritica foco principal de estudos atuais com biomarcadores, a despeito dos j observados polimorfismos moleculares (estruturais) que intervm numa resposta fisiolgica (diferenas de padres de organizao sistmica). MIKAWA et al. (2006) clonaram o DNAc da VTG de uma espcie de enguia japonesa (Conger myriaster) e encontraram 4555%, 3234% e 2729% de similaridade entre a seqncia de aminocidos da enguia, deduzida a partir do seqenciamento do DNA, com a seqncia da VTG de outros peixes, anfbios e aves, respectivamente. O mtodo de SILVERSAND, HYLLNER e HAUX (1993) de purificao parcial da VTG, aqui utilizado para obteno do imungeno inoculado nos coelhos, mostrou-se simples e eficaz. Tal mtodo consiste da precipitao da protena on bath, dispensando procedimentos cromatogrficos e tem como princpio algumas propriedades moleculares da VTG, determinadas pelo ortofosfato em interaes eletroflicas com o magnsio adicionado, permitindo assim o isolamento por centrifugao. Os autores utilizaram o mtodo com xito para o isolamento da VTG de 4 espcies de telesteos, variando a razo molar final entre EDTA e Mg++ na precipitao. Foram realizados estudos cromatogrficos e deteco imuno-qumica, indicando que possvel precipitar seletivamente a VTG de peixes com tal mtodo, obtendo altos graus de pureza. Por outro lado os autores citam trabalhos em que, com outras espcies de peixes, no foi possvel a precipitao da VTG. A variao supracitada para a razo molar final foi aqui repetida e produziu o mesmo resultado para a VTG induzida in vivo (hexa-hidrobenzoato de estradiol: 6HB-E2) em todas as razes finais analisadas por SDS-PAGE. (ver figura 6). PETERS et al. (2001) tambm conseguiram o isolamento da VTG de enguias atravs do mtodo descrito acima.

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Para a trara aqui induzida com 6HB-E2, foi possvel a precipitao acidental da VTG apenas com adio de gua de torneira sobre um volume remanescente de plasma, nos microtubos usados. O mesmo ocorreu para outras traras induzidas com E2, e de localidade diferente daquela exposta ao 6HB-E2. Contudo o mesmo padro de massa molecular das protenas do plasma no foi obtido, contendo o novo padro, outras protenas de menor massa molecular, identificadas eletroforeticamente aps a precipitao com Mg++. Essas protenas no foram inoculadas nos coelhos para a produo do anti-soro homlogo e podem constituir parte das protenas do envelope vitelnico, segundo SILVERSAND, HYLLNER e HAUX (1993), induzidas pelo E2. Contudo outras protenas, tambm de menor massa molecular que a VTG, foram identificadas com o anti-soro homlogo por imuno-deteco (Western Blot). A degradao da VTG em condies redutoras de desnaturao pode ter gerado tal deteco, bem como a marcao no especfica resultante de epitopos polissacardicos da VTG (glicoprotena). A VTG de Hoplias malabaricus demonstrou a instabilidade estrutural reportada por SILVERSAND, HYLLNER e HAUX (1993) com estudos cromatogrficos, sendo susceptvel a degradao por sua alta massa molecular. O padro eletrofortico da figura 6 no pde ser repetido e atribui-se a isso o congelamento do plasma que, mesmo sendo realizado s uma vez, degradou a VTG. Teores distintos de fosforilao determinam se a VTG pode ou no ser precipitada pelo mtodo de SILVERSAND, HYLLNER e HAUX (1993). Polimorfismos moleculares determinados por distintos teores de serina, treonina e tirosina da VTG devem ser considerados, pois estes so os aminocidos passveis de sofrerem a adio ps-transcricional de fosfato inorgnico. A VTG de tilpia (Oreochromis sp) tem 13,26% de serina na sua composio total (195 kDa), muitas delas em repeties seqenciais de mais de trs aminocidos, podendo chegar at vinte (NCBI, 2006). Essa regio de seqncias repetidas foi visualizada pelo programa BioEdit v.5.0.9 (HALL, 2001) e uma suposta quebra no local foi admitida, gerando dois fragmentos polipeptdicos com 75 e 120 kDa. Duas protenas com esses valores de massa aproximados foram identificadas por imuno-deteco da VTG de Hoplias malabaricus com o anti-soro

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homlogo produzido, a partir do perfil eletrofortico das protenas dos hepatcitos do macho. Contudo nenhuma VTG pde ser detectada no meio de cultivo usado com os hepatcitos do macho adulto, sugerindo que quando a espcie atinge a maturidade sexual, alguns processos celulares podem ser diferenciados entre machos e fmeas. Embora se tenha utilizado dois agentes indutores diferentes para a estrogenicidade, nos dois experimentos in vitro (macho e fmea), a condio controle no tempo zero (72 horas aps adeso) sugere que traras macho, quando atingem a maturidade sexual, tenham o transporte subcelular de molculas ou a exocitose, interrompidos em algum momento da seqncia: retculo endoplasmtico rugoso >> Golgi CIS >> Golgi TRANS >> vescula secretora. A VTG detectada nas clulas do macho aqui caracterizada como resultado de uma produo basal (ou transcrio constitutiva), que durante o ensaio no integrava nenhum dos dois processos conhecidos de secreo celular: exocitose constitutiva ou mediada por sinal qumico. Por outro lado, no experimento in vitro com clulas do macho no foi utilizado soro bovino fetal no meio de cultivo e uma decorrente deficincia de zinco ou de fatores de crescimento celular pode ter interrompido a seqncia de eventos supracitada. O constatao da produo in vivo de VTG plasmtica em machos de Hoplias malabaricus suporta o fato de que uma possvel carncia de elementos moleculares no pde ser controlada in vitro causando a interrupo da secreo de VTG pelas clulas. Sugere-se o uso soro obtido em peixes para futuros estudos in vitro. O zinco requerido como cofator essencial na produo de VTG e de outras protenas, pois mantm a estabilidade dos polirribossomos e de outros componentes envolvidos com mecanismos de sntese protica. Ao final da vitelognese o zinco mobilizado a partir de protenas de alta massa molecular para as metalotionena (MTs) de hepatcitos. Durante a vitelognese os teores hepticos de MTs declinam, possibilitando a transferncia de zinco para componentes essenciais sntese de VTG. A relao entre a induo da sntese de VTG por EE2 (via hdrica) e a expresso de MTs foi estudada por WERNER et al. (2003), que demonstraram (para ambos os sexos de Salvelinus namaycush) um

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decrscimo em teores hepticos de MTs, mas tambm a induo sua expresso nos rins. THOMPSON et al. (2003) reportam que a prpria VTG responsvel pelo transporte de zinco no plasma. O zinco tambm essencial na maturao dos ocitos (KIME, 1999) estando envolvido com a produo de hormnios sexuais esterides nas gnadas. O ndice vitelognico para ensaios in vitro de induo experimental da VTG (IVTGh) relacionou a resposta biolgica obtida por cultivo celular primrio de hepatcitos (produo de VTG) com o tamanho da amostra experimental (nmero mdio de clulas, por poo de microplaca), e com a estrogenicidade estabelecida como padro, induzida no grupo de referncia por EE2, essa estrogenicidade tambm relativa ao tamanho do grupo de referncia. A citotoxicidade diferencial entre as clulas do macho e da fmea, frente aos tratamentos e aos tempos de manuteno, foi determinada pela contagem de clulas no final dos ensaios. O grupo controle das clulas da fmea (aps 7 dias) demonstrou maior citotoxicidade quando comparado ao grupo controle das clulas do macho (aps 13 dias). Para um mesmo sexo no houve diferena entre os controles e o controle de etanol. O tamoxifeno ou sua mistura com o agente indutor (E2 ou EE2) produziram um efeito equivalente entre as clulas do machos e da fmea. J o E2 foi bem mais citotxico para as clulas do macho que o EE2 para as da fmea, e esse por sua vez, menos citotxico que a condio controle, sugerindo um efeito de proteo para os hepatcitos de fmeas, caso inverso ao obtido com a exposio hepatcitos do macho ao E2. A principal vantagem do emprego do IVTGh concebido pela equao (11), que visa complementar os parmetros clssicos de farmacocintica, est no fato de que substncias que tm efeito citotxico associado ao efeito anti-estrognico, este podendo inclusive ser indiretamente decorrente daquele, podem produzir resultados falso-positivos ou subestimados, j que uma frao do decrscimo em quantidade de VTG produzida pode ser devida a um menor nmero de clulas expressando a protena. O IVTGh corrige em parte a fonte de tal erro experimental, por considerar o nmero de clulas na anlise. Assim mesmo substncias que promovam uma baixa viabilidade em cultivos podem ser testadas.

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Outra vantagem que substncias (ou misturas) com efeito estrognico produzem valores de IVTGh positivos, e aquelas com efeito anti-estrognico, valores negativos, o que torna fcil a comparao de grupos experimentais. O soro bovino fetal contm molculas esterides com possvel ao estrognica, mas a equao do IVTGh suprime a produo do grupo controle da anlise, apresentando o valor nulo para qualquer produo de VTG das clulas controle, e permitindo assim que se use o soro como fonte de componentes moleculares essenciais clula. Embora o emprego dos outros ndices vitelognicos aqui propostos no tenha sido demonstrado, considera-se importante o estabelecimento de

metodologias que visem avaliar e quantificar a (anti)estrogenicidade in vivo e a reproduo vivel de populaes de peixes, pois estes so eficientes

biomarcadores de toxicidade ambiental. Assim estudos que envolvam a reproduo de indivduos, associada com emprego de modelos ecolgicos, podem revelar condies importantes de ambientes impactados, bem como elevar uma resposta biolgica individual para um status determinante da viabilidade de populaes naturais. Outrossim, estudos in vivo permitem a abordagem de vrios efeitos biolgicos associados, decorrentes de uma nica causa (xenobitico), o que leva a asseres mais realsticas do comprometimento fisiolgico de uma espcie em risco. Somado a isso tem-se que em ambientes impactados geralmente se encontra mais de uma substncia txica. Nesse mbito os estudos in vitro so essenciais para se entender os mecanismos moleculares de toxicidade envolvidos com a resposta in vivo.

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CONCLUSES GERAIS

A possibilidade do emprego de condies fisico-qumicas de ambientes tropicais, da exposio via alimento por longos perodos (subcrnica) e da busca de respostas biolgicas subletais, detectveis e consistentes, caracterizam a espcie Hoplias malabaricus como um excelente modelo experimental in vivo, na padronizao de metodologias para o

estabelecimento de biomarcadores de efeito ou de exposio. A determinao da atividade da -ALAd acompanhada do monitoramento de parmetros hematolgicos so mtodos eficientes para o uso de respostas biolgicas individuais (fisiolgicas) como biomarcadores de contaminao de peixes in vivo. O mtodo aqui empregado para a determinao de alteraes nos teores teciduais de metalotionena, induzidas experimentalmente in vivo, no pde ser efetivado para o emprego dessa resposta como biomarcadora. Sugere-se a utilizao de mtodos mais acurados, com a quantificao direta (absoluta) da metalotionena. A produo de vitelogenina plasmtica pelo fgado in vivo (expresso em hepatcitos) pde ser induzida experimentalmente com substncias estrognicas (via intraperitoneal) em Hoplias malabaricus de ambos os sexos em idade reprodutiva, ou em indivduos sexualmente imaturos. O anti-soro homlogo produzido em coelhos contra a vitelogenina de Hoplias malabaricus mostrou-se eficiente para a imuno-deteco. Os anti-soros heterlogos obtidos comercialmente demonstraram diferentes graus de especificidade e de intensidade de sinal (fosfatase alcalina) relacionados com diferentes condies de estringncia da reao imunoqumica cruzada com a vitelogenina de Hoplias malabaricus. O chumbo inorgnico divalente no produziu nenhum efeito antiestrognico detectvel pelo mtodo empregado (imuno-deteco), aps bioensaio (administrao via intraperitoneal).

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O emprego de um modelo matemtico da ecologia, aplicvel em nvel populacional e associado com respostas biolgicas individuais frente a condies adversas possvel a priori dispondo-se do ndice Vitelognico. Este considerado como um biomarcador para substncias que comprometem a reproduo de espcies de peixes, apresentando efeitos (anti)estrognicos mensurados pela produo de vitelogenina in vivo. Contudo a demonstrao emprica se faz necessria para o uso do ndice. Os ensaios in vitro com cultivo primrio de hepatcitos de Hoplias malabaricus revelaram aspectos importantes dos mecanismos moleculares de citotoxicidade, obtidos com a exposio das clulas a substncias com reconhecida ao (anti)estrognica. O aplicao do ndice Vitelognico para Ensaios in vitro de Estrogenicidade (IVTGh) permitiu padronizar a comparao de grupos controlados em condies laboratoriais (tratamentos in vitro). Isso porque o IVTGh representa a produo molecular de vitelogenina em cada tratamento in vitro, onde a resposta a ao (anti)estrognica e est relacionada com a quantidade de clulas que expressam a protena em cada unidade de cultivo e com a magnitude amostral dos grupos analisados (tratamentos) e de referncia (controle induzido com substncia de reconhecida ao estrognica).

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QUADRO 1 INTERAES RECPROCAS ENTRE DUAS RESPOSTAS BIOLGICAS OBTIDAS COMO BIOMARCADORES BioT-I (P450) (anti)ESTRG

NeuEndRep

HEMO-prots

prc-HEME

HmtpErtp

VTGinput

(anti)OXI

pr-OXI

-ALAd -ALAd [HEME] prc-HEME

HEMO-prots

BioT-II

[HEME] 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

AdHoc

ESxH

VTG

MTs 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0

ZnP 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0

Zn

0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0

1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0

1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0

1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0

1 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0

1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0

0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1

0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1

0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1

0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0

HmtpErtp (anti)OXI pr-OXI MTs Zn ZnP BioT-I (P450) BioT-II NeuEndRep ESxH (anti)ESTRG VTG VTGinput AdHoc

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LEGENDA: as interaes referidas dizem respeito possibilidade de uma resposta obtida intervir em outra, duas a duas e para um mesmo sistema biolgico considerado, a saber, clula, tecido, rgo ou organismo, sem considerar a ascendncia de organizao sistmica, ou seja, o que afeta uma clula pode, direta ou indiretamente afetar o organismo e vice-versa. (1) interao possvel ou observada; (0) ausncia de interao ou a resposta comparada com ela mesma (em verde). As interaes marcadas em vermelho foram constatadas empiricamente ou inferidas pela investigao cientfica realizada pelo Laboratrio de Toxicologia Celular SCB, UFPR. As outras foram constatadas por outros grupos de pesquisa com biomarcadores, ou inferidas e deduzidas do contexto terico pertinente, determinado por publicaes cientficas nessa rea de estudo. O dados do quadro 1 esto sujeitos a modificaes, principalmente no que diz respeito a mudana da condio (0) para (1). -ALAd: alteraes na atividade da -aminolevulinato desidratase; [HEME]: alteraes nos teores celulares de grupamentos HEME; prc-HEME: acmulo de precursores do grupo HEME, na clula ou tecidos; HEMO-prots: alteraes estruturais de componentes proticos que tm o HEME integrante: hemoprotenas como hemoglobina, citocromos e catalases; HmtpErtp: alteraes na taxa de renovao do estoque de eritrcitos (eritropoiese) e do sangue (hematopoiese); (anti)OXI: alteraes no balano REDOX de clulas de rgos ou tecidos-alvo como sangue, brnquias, fgado e rim; pr-OXI: quebra de macromolculas (p.ex.: DNA ou citoesqueleto) como efeito da ao oxidante de espcies reativas de oxignio; MTs: alteraes de teores teciduais de metalotionenas; Zn: alteraes na estocagem, distribuio e disponibilizao de zinco em processos celulares; ZnP: alteraes sistmicas no transporte de zinco por componentes do plasma sanguneo; BioT-I (p450): biotransformao de fase I em hepatcitos, com ao do complexo citocromo oxidase P450 e monoxigenases associadas, com utilizao de O2 como substrato; BioT-II: biotransformao de fase II em hepatcitos, com uso da glutationa reduzida (GSH) como substrato; NeuEndRep: alteraes no operar do sistema integrado neuro-endcrino-reprodutor (eixo crebro-hipotlamo-hipfise-gnada); ESxH: alteraes na produo, metabolismo e excreo de hormnios sexuais esterides; (anti)ESTRG: ao estrognica ou anti-estrognica em tecidos-alvo que respondem a estrgenos; VTG: ao (anti)estrognica determinada pela quantificao da expresso de vitelogenina no hepatcito ou sua produo in vivo ou in vitro; VTGinput: incorporao da vitelogenina no ocito, diferenciao do gameta e maturao sexual: vitelognese; AdHoc: influncia de condies fisico-qumicas do meio externo (fatores abiticos), como temperatura, dureza da gua e fotoperodo; no inclui a biodisponibilidade e a exposio de xenobitico(s) considerado(s) como causa da resposta biolgica monitorada.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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117

APNDICE 1

PROTOCOLO EMPREGADO PARA QUANTIFICAO DA ATIVIDADE DA -ALAd ERITROCITRIA

118

APNDICE 2

PROTOCOLO EMPREGADO PARA QUANTIFICAO INDIRETA DA METALOTIONENA EM BRNQUIAS E FGADO DE PEIXES

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APNDICE 3

PROTOCOLO EMPREGADO PARA O ISOLAMENTO DA VTG PLASMTICA POR PRECIPITAO

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APNDICE 4

PROTOCOLO EMPREGADO PARA SDS-PAGE, WESTERN BLOTTING E IMUNO-DETECO

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ANEXO 1

ESTUDOS COM A -ALAd DE PEIXES