ESCUELA SUPERIOR POLIETCNICA DE CHIMBORAZO INGENIERIA BIOTECCNOLOGIA AMBIENTAL MICROBIOLOGIA NOMBRE: Lucely Valdivieso CODIGO: 21-04 CURSO: tercero

A FECHA: 2012-06-08 TEMA:

Nutricin microbiana y Medios de Cultivo

OBJETIVO GENERAL Conocer los nutrientes que necesita la clula microbiana y la composicin qumica de los medios de cultivo para poder cultivar microorganismos en el laboratorio

OBJETIVOS ESPECIFICOS Determinar por qu el nitrgeno siendo un macronutriente importante de los microorganismos tambin es importante en los procesos oxidantes de materia biodegradable. Conocer qu tipo de bacterias en general requieren de medios de cultivo compuestas por lquidos orgnicos del cuerpo humano y por qu lo hacen.

NUTRICIN MICROBIANA

Una caracterstica muy importante de estas clulas es la capacidad para llevar a cabo sus reacciones qumicas y organizar sus molculas para formar sus estructuras especficas. La nutricin microbiana consiste en el suministro de las sustancias qumicas importantes o los nutrientes para que ella elabore sus monmeros. Los nutrientes se requieren para procesos energticos y biosntesis adems de otras actividades propias de estos microorganismos. Las clulas estn compuestas de: 1. Macromolculas: polisacridos, lpidos, cidos nucleicos y protenas. 2. Agua.- Que es el solvente ideal para los organismos vivos debido a su polaridad y a su cohesin Los nutrientes se pueden clasificar esto segn las cantidades en que son requeridos y estas son: Macronutrientes o elementos traza .- aqu estn presentes elementos como : Carbono Nitrgeno Fsforo

 Azufre Potasio Magnesio Sodio Calcio Hierro Micronutrientes .- Elementos tales como : Cromo Cobalto Cobre Manganeso Molibdeno Niquel Selenio Vanadio Zinc

En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte de sustancias orgnicas o inorgnicas. Algunos de los nutrientes sern incorporados para construir macromolculas y estructuras celulares; otros solo sirven para la produccin de energa, y no se incorporan directamente como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles. Agua Desde el punto de vista de sus posibles papeles, el agua es: El principal componente del protoplasma bacteriano, constituyndose el medio donde suceden las reacciones qumicas. El agua es un producto resultante de algunas reacciones bioqumicas como reactante en exceso. Los microorganismos necesitan grandes cantidades de agua y la mayora de las veces requieren cierto grado de humedad para crecer y por lo tanto dems funciones importantes. La disponibilidad se mide por un parmetro denominado: actividad de agua (aw) o potencial de agua donde sus valores normales entre 0.90- 0.99. Carbono Elemento ms abundante en las macromolculas se encuentra formando el 50% del peso seco de las clulas lo que indica que su cantidad es importante, es un elemento primario que desde los orgenes de la vida existe y forma parte de la evolucin de ella que se crea que de

elementos como este se origin la vida en los procariotas que son las clulas ms antiguas.. La mayora de los procariotas son hetertrofos es decir que necesitan algn tipo de compuesto orgnico como fuente de carbono para hacer nuevo material celular. Los aminocidos, los cidos grasos, los cidos orgnicos, los azcares, las bases nitrogenadas, los compuestos aromticos y otros, pueden ser utilizados por las bacterias. Algunos procariotas son auttrofos y son capaces de construir todas sus estructuras orgnicas a partir del CO2 con la energa obtenida de la luz o de compuestos inorgnicos. Despus del carbono el elemento ms abundante en la clula es el Nitrgeno En una bacteria tpica el nitrgeno constituye el 12% de su peso seco. En la naturaleza este se encuentra en forma de nitrgeno inorgnico y orgnico. El amoniaco es una forma inorgnica donde las bacterias son capaces de captar esta forma de nitrgeno. El Nitrgeno es importante ya que es un macronutriente que da la estabilidad a la clula y as como el carbono este elemento primario constituyo en los primeros orgenes de la vida formando parte de las primeras formas existentes de clulas procariotas adems intervienen en procesos oxidantes en la degradacin bacteriana de la biomasa produciendo ion amonio y amoniaco. Fsforo El fsforo se usa para la sntesis de los cidos nucleicos y los fosfolpidos, pero aparece tambin en coenzimas y en protenas. Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgnico o inorgnico. Las bacterias que pueden usar los fosfatos orgnicos (poseen fosfatasas) no dependen absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgnicos. Los fosfatos orgnicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gram-negativas) periplsmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina. El Azufre se requiere porque es un componente estructural de los aminocidos como la cistena y metionina. El potasio es necesario en todos los organismos. Una gran diversidad de enzimas requieren especficamente como por ejemplo en la sntesis proteica. El Magnesio funciona como estabilizador de los ribosomas, membranas celulares y cidos nucleicos as como regulador de muchas actividades de las enzimas.

Algunos elementos no son esenciales uno de ellos es el calcio pero, ayuda a estabilizar la pared celular microbiana y tiene una funcin muy importante en la termorrestistencia de las endoesporas. El sodio es requerido por algunos microorganismos aunque es reflejo de su habitad, la cantidad que requieren dentro de esta. El hierro es importante para su respiracin celular y tambin cable de los citocromos; muchas protenas que estn presentes en el transporte de electrones tambin requieren hierro y azufre y en muchos casos es considerado como un micronutriente. LOS MICRONUTRIENTES. Los micronutrientes o elementos traza son aquellos que el microorganismo lo requiere en cantidades pequeas, estos son metales, muchos de los cuales tienen una funcin estructural en varias enzimas: Cromo Cobalto Cobre. Manganeso Molibdeno Nquel Selenio Tungsteno. Vanadio y Zinc. Factores de crecimiento Los factores de crecimiento son molculas orgnicas especficas que, en muy pequea cantidad, algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen funcin plstica (no son sillares de macromolculas) ni sirven como fuente de energa. Suelen ser coenzimas o sus precursores, vitaminas principalmente adems de Aminocidos , Purinas, pirimidinas, que determinadas bacterias no pueden fabricar por s mismas, al carecer de parte o toda una ruta biosinttica. Ejemplos: las bacterias del gnero Brucella requieren como factores de crecimiento en sus medios de cultivo la biotina, niacina, tiamina y cido pantotnico. Haemophilus necesita suplementos de grupos hemo y piridn-nucletidos. En la siguiente tabla se muestran algunas de las vitaminas y cofactores requeridos por algunas bacterias:

MEDIOS DE CULTIVO

En microbiologa, un cultivo es un mtodo para la multiplicacin de microorganismos, tales como bacterias , hongos y parsitos, en el que se prepara un medio ptimo para favorecer el proceso deseado. Un cultivo es empleado como un mtodo fundamental para el estudio de las bacterias y otros microorganismos que causan enfermedades en medicina humana y veterinaria. Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc)

CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los elementos citados a continuacin, son los ms frecuentemente usados en la preparacin delos medios de cultivo, aunque pueden no ser los nicos e incluso alguno de ellos puede estar ausente de la preparacin.

Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento.

Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacrido, al que acompaan algunas impurezas yque se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullicin (funde hacia los 98C) y al enfriarse forma un gel inodoro e inspido (se gelifica alrededor de los 42C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser slido a la temperatura de incubacin. Con la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para preparar un medio slido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega agar al 3 %. Extractos. Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne, hgado, semillas, etc.) son extrados con agua y calor, y posteriormente concentrado hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confeccin de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitgeno y carbono.

Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y sales minerales que carecen de identidad qumica definida; se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, casena, etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos y aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteosas, peptonas, polipptidos y aminocidos.

Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son frecuentemente aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones aspticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino tambin con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Los microorganismos ms comunes son neutrfilos (el pH ptimo para su crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisdicos o bipotsicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviacin del pH. Indicadores de pH. Indicadores cido- base se aaden a menudo a los medios de cultivo cono objeto de detectar variaciones del pH. Agentes reductores. Cistena, tioglicolato y otros son agentes reductores que se aaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Agentes selectivos. La adicin de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo (ver ms adelante, clasificacin de los medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, cida sdica, telurito potsico, antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios, pero los ms importantes son aquellos que se basan en: SEGN SU ESTADO FSICO (CONSISTENCIA). 1) Medios lquidos: Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada concentracin. Ejemplo: como el agua de peptona 2) Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la tempera

ptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar: Es un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molcula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solucin al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39C y no se funde por debajo de 85C. Funde a 90C y solidifica una vez fundido alrededor de los 45C. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgnicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacridos, Araki, en 1937, los dividi en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de cido pirvico, y- agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporcin de agarosa a agaropectina en el agar vara segn el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los ms importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriolgico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo que es importante la ausencia de metales txicos. Ejemplo: llevan un agente solidificante (Agar) que es un polisacrido acdico
producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45 C. Se usa a una concentracin del 1,5%. ,

3) Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias. Ejemplo agar a una concentracin
del 0,7%. Y tambin Agar de Hugh-Leiffson

ATENDIENDO A SU COMPOSICIN. Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los medios de cultivo pueden ser clasificados en: 1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados. Ejemplo: extracto de carne 3 g/L. 2) Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida. Ejemplo: cido ctrico cantidad 0.006 g/L. 3) Medios semisintticos: El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un

extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc. SEGN SU UTILIZACIN. 1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar triplicase de soja, el agar Columbia, etc. 2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc) El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate). 3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una poblacin polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito. 4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos. 5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.

6) Medios de identificacin: Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificacin. Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios especficos de identificacin para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificacin. Son ejemplos de esto ltimos los medios CPS ID3 o Uriline ID (Biomerieux), utilizados para identificar los grmenes urinarios ms importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilizacin de sustratos cromognicos especficos. 7) Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios. 8) Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en el Laboratorio de Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas: a) haciendo pases peridicos de placa a placa, b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%. 9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los medios de Stuart-Amies, Cary-Blair, etc. Segn su origen: a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactamente. b) SINTTICOS: son los medios que contienen una composicin qumica definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.

c) SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura. 1) Medios complejos o indefinidos: su composicin qumica exacta se desconoce, ya que son el producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos:Ejemplos: Digeridos crudos de extracto de carne Digeridos de extracto de levadura Digeridos de peptona de carne o de soja Digeridos de casena (de la leche). Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido qumicamente. Si lo que pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento bacteriano, este tipo de medios es ideal, ya que su confeccin es fcil y rpida (basta pesar una cierta cantidad del extracto desecado, suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e incubar la bacteria con la que queramos trabajar). Estos medios contienen fuentes variadas de C y N orgnicos, sales minerales y micronutrientes. Sin embargo, con ellos no podemos tener un control nutricional preciso, ya que desconocemos la composicin qumica y proporcin exacta de los distintos nutrientes. 2) Medios sintticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades concretas de distintas sustancias qumicas puras, orgnicas y/o inorgnicas. La composicin concreta de un medio sinttico depender de la bacteria que queramos cultivar: lgicamente, un medio definido para una bacteria con grandes capacidades biosintticas ser ms sencillo que el medio definido de otra bacteria con menores posibilidades biosintticas. En la tabla siguiente se dan las composiciones de sendos medios sintticos para dos bacterias diferentes. Ejemplos:

MEDIOS VIVIENTES: Los medios vivos estn constituidos por animales o capas de tejidos que son utilizados para el cultivo de virus y rickettsias, que no se desarrollan en los medios simples o sintticos por requerir de la presencia de clulas vivas para reproducirse en su interior (parsitos intracelulares obligados). Estos medios no tienen utilidad prctica para el cultivo de las bacterias y los hongos. Ejemplos: hmster (curieles jvenes), ratones blancos lactantes, huevos frtiles de gallina de 7 a 10 das, cultivo de tejidos, etc. Ejemplos : Medios de cultivos vivos: a) Hamster; b) Huevo de gallina con embrin de pollo de 7 a 10 dias; c) Cultivo de tejidos

CONCLUSIONES: Se determina que el nitrgeno es un macronutriente de los microorganismos que representa el segundo elemento de mayor abundancia en ellos despus del carbono es importante porque da la estabilidad a la clula, es la caractersticas propia de aquellas bacterias nitrificantes que intervienen en los procesos de oxidacin y degradacin de la biomasa produciendo amoniaco y amonio que ser absorbido por las plantas como nutrientes para luego completar el ciclo del nitrgeno. Se conoce que muchas bacterias en general estas son de carcter patgeno requieren de medios de cultivo lquidos orgnicos del cuerpo humano ya que les sirve como nutrientes ricos en carbono y nitrgenos principalmente lo cual es el medio ptimo para que se

desarrollen es as que en un laboratorio utilizan medios de cultivo como una infusin de

extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes.

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-MICROBIOLOGIA EN CIENCIAS DE LA SALUD Conceptos y Aplicaciones, Tercera Edicin de Manuel de la Rosa, Jos Prieto, Jos Mara Navarro ARTICULO Medios de Cultivo. www.estudentconsult.es LIBROS SACADOS POR: Jenny Verrones 9:30 a 10:30

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