PCR e o Perfil Microbiolgico das Infeces Endodnticas: Realidade ou Utopia? Artigo de Reviso / Review Article Beatrice, L.C.S.

, et al

PCR e o Perfil Microbiolgico das Infeces Endodnticas: Realidade ou Utopia? PCR and the Microbiological Profile of Endodontic Infections: Reality or Utopy?
Lcia Carneiro de Souza Beatrice*, Carlos Menezes Aguiar**, Cludio Heliomar Vicente da Silva**, Andreza Lira Correia***, Raquel Braz Cavalcanti***, * Prof Associado do Depto de Prtese e Cirurgia Buco Facial - UFPE ** Prof. Adjunto do Depto de Prtese e Cirurgia Buco Facial - UFPE *** Aluna do Mestrado em Odontologia - UFPE - rea de Concentrao Clnica Integrada Descritores Resumo A influncia dos microrganismos nos processos patolgicos, principalmente, infecciosos que envolvem a polpa e o peripice, est bem estabelecida nas falhas dos tratamentos endodnticos; entretanto, o real papel que cada microorganismo exerce dentro do processo infeccioso ainda capaz de levantar discusses. Dentro desse contexto, o uso de novas tcnicas moleculares, mais sensveis e de maior especificidade na identificao desses patgenos abre novas perspectivas no campo da pesquisa, diagnstico, tratamento e desenvolvimento de novos materiais endodnticos. O objetivo desse trabalho o de discutir, luz da literatura, as reais abrangncias e possibilidades de uma dessas tcnicas a PCR (poliymerase chain reaction) dentro do mbito do conhecimento e identificao dos patgenos responsveis pelas infeces endodnticas. Abstract The influence of microorganisms in pathological processes is well established in the flaws of endodontic treatment, especially infectious processes involving the pulp and periapex. However, the actual role that each microorganism exercises within the infectious process remains open for discussion. Thus, the use of new molecular methods with greater sensitivity and specificity in the identification of these pathogens broadens perspectives in the fields of research, diagnosis, treatment and the development of new endodontic materials. The aim of the present study was to discuss the scope and possibilities of one such method PCR (polymerase chain reaction) regarding knowledge and the identification of pathogens that cause endodontic infection.

Endodontia, PCR, Microbiologia oral.

Key-words Endodonty, PCR, Oral microbiology

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Correspondncia para / Correspondence to: Profa. Dra. Lcia Carneiro de Souza Beatrice Av. Parnamirim, 327 apto 901 - Parnamirim Recife PE CEP: 52060-000 / E-mail: luciabeatrice@uol.com.br

INTRODUO
de conhecimento geral que as infeces de origem endodntica so produzidas por microorganismos que tm acesso aos tecidos pulpares e periapicais 7. Mecanismos de defesa do hospedeiro, predisposio gentica, fatores ambientais, tabagismo, estresse, hbitos e freqncia dos cuidados odontolgicos, doenas infecciosas, entre outras condies, so capazes de exercer influncia na composio da microbiota oral24. Entretanto, na maioria das vezes, as infeces endodnticas apresentam caracteristicamente um carter polimicrobiano, com predomnio de bactrias anaerbias 1. Algumas dessas espcies bacterianas so de difcil cultivo e identificao dentro das tcnicas de diagnstico convencionais o que pode dificultar ou mesmo impossibilitar sua deteco, podendo conduzir a uma estimativa errnea referente ao papel de determinadas espcies bacterianas envolvidas na infeco do sistema de canais radiculares 10. Dentre esses microorganismos, os patgenos anaerbios so difceis de identificar atravs dos mtodos diagnsticos tradicionais, levando muitas vezes ao tratamento emprico com conseqente incremento de

custos, complicaes iatrognicas potenciais e aumento no padro de resistncia bacteriana 22. A identificao convencional de microorganismos anaerbicos tecnicamente complicada, cara, consome tempo e no considerada segura 22. So procedimentos baseados no crescimento do agente infeccioso em meio de cultura ou na deteco da presena de anticorpos. Incluem ainda como limitao, pobre sensibilidade, a possibilidade de falso negativo, reaes cruzadas e no especficas 9, 16. Mtodos de deteco molecular representam um poderoso meio de identificao de patgenos, estudo do relacionamento parasita hospedeiro e esclarecimento de posies taxonmicas de patgenos j conhecidos. Agregam incrvel sensibilidade, especificidade e rapidez, com relativo baixo custo, em comparao aos mtodos tradicionais 22. Nesta conjuntura, surge a PCR como um inovador mtodo baseado nos cidos nuclicos, com uma maior sensibilidade que qualquer tcnica microbiolgica para deteco de bactrias j existente 2.

REVISAO DA LITERATURA

Odontologia. Cln.-Cientf., Recife, 7 (4): 295-298, out/dez., 2008

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A maioria dos estudos da microbiota de canais radiculares de dentes com tratamento endodntico prvio associados a leses periapicais tem sido realizada atravs da coleta microbiolgica dos canais radiculares e identificao bacteriana pelo mtodo da cultura 21. Os procedimentos de cultura so tradicionalmente utilizados como padro ouro na identificao bacteriana, no entanto, alm dos problemas referentes grande diluio da amostra, h uma notvel dificuldade em simular as circunstncias ambientais requeridas para a maioria dos microorganismos 14. Para Tyrone e Nicholas 23, os meios de cultura tradicionais podem ser facilmente alterados em virtude da simulao de condies ambientais, a insuficincia de diluio, os traos fenotpicos do microorganismo e outros. Para superar as dificuldades inerentes ao mtodo da cultura, pesquisadores tm utilizado mtodos genticos moleculares, em especial a PCR, na identificao de bactrias presentes no sistema de canais radiculares12,21,10,4. Esses mtodos se baseiam na deteco do DNA das espcies bacterianas sendo, portanto, mais sensveis do que o mtodo da cultura, alm de poder identificar cepas de cultivo difcil ou at mesmo impossvel 21. A PCR foi descrita primariamente em 1985 e a partir de ento, tem se transformado em valioso instrumento de pesquisa na odontologia. Este mtodo permite uma amplificao exponencial de fragmentos especficos de DNA, resultando em milhes de cpias que servem de matrizes para diferentes tipos de anlises. Esta tcnica tem se mostrado como importante instrumento dentro da pesquisa odontolgica, mostrando um potencial para ser utilizado como instrumento na preveno, diagnstico e tratamento de vrias doenas, entre elas a crie, doena periodontal, infeces endodnticas e cncer 15. Atravs dessa tcnica possvel conseguir expressiva amplificao do fragmento de DNA originrio de uma nica clula. Este procedimento consiste em repetidos ciclos de sntese de DNA, por meio de dois oligonucleotdeos sintticos (primers) com orientaes opostas, com seqncias complementares s extremidades do fragmento alvo. Essa reao ocorre mediante ao de uma DNA polimerase, usualmente a Taq polimerase, capaz de atuar em elevadas temperaturas. Cada ciclo de reao de amplificao constitudo pr trs fases distintas: desnaturao (separao das hlices do DNA a ser amplificado), pareamento (ligao complementar entre os primers). e o DNA a ser amplificado) e extenso (sntese do DNA pela Taq polimerase) 13. A orientao dos primers faz com que a sntese de DNA ocorra na regio interna entre eles. Assim, o produto da extenso de um primer utilizado como substrato para o outro, o que resulta, em cada ciclo, na duplicao da quantidade de DNA sintetizada na fase precedente. Portanto, o nmero de cpias do fragmento alvo tem um aumento exponencial (2n), facultando, no final de 30 ciclos, um acrscimo da ordem de 106 cpias, valendo-se de uma nica clula 13. Devido sua alta especificidade, o mtodo da PCR apresenta um potencial significativo a ser explorado no diagnstico microbiolgico e identificao de patgenos envolvidos no desenvolvimento e perpetuao de leses perirradiculares. Este mtodo permite identificar rapidamente microrganismos de cultivo difcil ou impossvel, mesmo que presentes em baixo nmero na amostra coletada 11. O objetivo do estudo feito por Ras et al. 10 foi o de relatar, pela primeira vez, a deteco da bactria T.

A Prevotella tannerae foi detectada nos canais radiculares infectados pela primeira vez em alta prevalncia atravs da PCR. A Porphyromonas endodontalis, uma bactria pigmentada gram - negativa anaerbia foi isolada em amostras de canais radiculares infectados (principalmente nos casos sintomticos), por meio de cultura. Contudo, a sua relevncia muito mais pronunciada quando avaliada pela PCR. Utilizando PCR, P.Gingivalis foi identificada com uma alta prevalncia em infeces de origem endodntica 23. O estudo de Hashimura e Hoshino5 foi criado para desenvolver um protocolo para deteco de Enterococcus faecalis e o Enterococcus faecium no sistema de canais radiculares atravs da utilizao da PCR, demonstrando uma alta especificidade na deteco dessas espcies bacterianas. Rolph et al. 12estudaram a microbiota de canais radiculares com polpas necrosadas e com tratamento endodntico prvio utilizando mtodos moleculares e de cultura. Os autores relataram que houve um maior nmero de resultados positivos pelo mtodo da PCR do que pela cultura, especialmente em casos de retratamento. As anlises moleculares de 5 casos de infeces refratrias revelaram espcies dos gneros Capnocytophaga, Cytophaga,Dialister, Eubacterium, Fusobacterium, Gemella, Mogibacterium, Peptostreptococcus, Prevotella, Propionibacterium, Selenomonas, Solobacterium, Streptococcus e Veillonella. O trabalho realizado por Ras et al. 11 teve como objetivo relatar dez casos de infeco endodntica onde foi detectada a ocorrncia da espcie bacteriana Bacteroides forsythus. Aps coleta do material, a identificao desta espcie foi realizada atravs do mtodo da PCR. Os resultados indicaram que o B. forsythus pode ser um componente da microbiota presente em canais radiculares infectados, podendo estar associado etiologia de leses perirradiculares. O objetivo do estudo de Siqueira Jr. e Ras19 foi descrever um mtodo de nested PCR baseado na frao 16S do rDNA para investigar a ocorrncia de Campylobacter gracilis em infeces orais. Amostras foram coletadas de dez casos de canais radiculares infectados, dez casos de abscesso perirradicular agudo e oito casos de periodontite do adulto. O C. gracilis foi detectado nos trs tipos de infeces orais investigadas em 4 dos 10 canais radiculares infectados. Siqueira e Ras20 investigaram a ocorrncia de Propionibacterium propionicum e Actinomyces radicidentis em infeces endodnticas primrias e persistentes pelo mtodo da PCR. P. propionicum estava presente em 36% das amostras de infeces primrias, e 58% das amostras de dentes tratados endodonticamente associados a leses periapicais. Por sua vez, A. radicidentis estava presente, respectivamente, em 4% e 8% das infeces endodnticas primrias e persistentes. No estudo realizado por Jacobovitz6 foi monitorada a microbiota do canal radicular de 30 dentes de humanos portadores de leso periapical crnica atravs da utilizao da PCR. As seguintes espcies bacterianas foram encontradas: Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens e Bacteroides forsythus, microrganismos marcantes na patologia de processos infecciosos dos tecidos pulpoperiapicais.

denticola em casos de abscessos perirradiculares agudos, pelo mtodo da PCR. O T. denticola tem sido considerado um importante patgeno periodontal. Todavia, sua presena associada a infeces endodnticas ainda no havia sido relatada.
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Siqueira e Ras 21 investigaram a ocorrncia de 19 espcies microbianas, pela anlise da PCR, em 22 amostras de canais radiculares de dentes com insucesso do tratamento endodntico. Todas as amostras foram positivas a pelo menos uma das seguintes bactrias Gram-positivas: Enterococcus faecalis, Pseudoramibacter alactolyticus ou Propionibacterium propionicum. Enterococcus faecalis foi a espcie mais prevalente, detectada em 77% dos casos. As outras espcies mais detectadas foram: Pseudoramibacter alactolyticus (52%), Propionibacterium propionicum (52%), Dialister pneumosintes (48%) e Filifactor alocis (48%). Gomes et al. 4 investigaram a ocorrncia de Enterococcus faecalis em canais com polpas necrosadas e em canais de dentes com insucesso do tratamento endodntico, utilizando a cultura e a PCR. Nos 50 casos de insucesso endodntico, Enterococcus faecalis estava presente em 21 (42%) casos pela cultura, e em 38 (76%) casos pela anlise da PCR das mesmas amostras. Por outro lado, nos 50 casos de infeces primrias, Enterococcus faecalis estava presente em 2 (4%) e 41 (82%) canais, respectivamente, pela cultura e PCR. Esses resultados mostraram que Enterococcus faecalis est presente em canais com polpas necrosadas, porm em quantidades bem pequenas, no detectveis pelo mtodo da cultura.

A tcnica da PCR, alm de rpida, apresenta a vantagem de requerer quantidades muito pequenas de material para identificao, podendo ser eficaz at se realizada a partir de uma molcula de DNA proveniente de uma nica clula, o que traz grandes vantagens no diagnstico das diversas patologias. Devido sua grande especificidade, representa um grande potencial no auxlio do diagnstico das infeces endodnticas.

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DISCUSSO
Estudos recentes, utilizando mtodos moleculares de identificao bacteriana, tm revelado a presena de microrganismos em casos de insucesso endodntico. Os estudos feitos por Siqueira e Ras 21; Gomes et al.4 comprovam que os insucessos dos tratamentos endodnticos so, em sua maioria, de origem infecciosa, mesmo que o mtodo da cultura seja incapaz de identificar bactrias. Da a importncia do desenvolvimento de tcnicas mais precisas para o reconhecimento das cepas bacterianas mais prevalentes nas infeces endodnticas. O mtodo da PCR empregado em experimentos por Ras et al. 10 ; Ras et al.11 ; Siqueira Jr. e Ras19 e Siqueira e Ras20 permitiu a deteco de novas bactrias associadas as infeces endodnticas como a T. denticola em casos de abscessos perirradiculares agudos, a espcie Bacteroides forsythus e a presena do Campylobacter gracilis em infeces orais. H ocorrncia tambm da Propionibacterium propionicum e Actinomyces radicidentis em infeces endodnticas primrias e persistentes pelo mtodo do PCR e a presena de um organismo relacionado com o gnero Olsenella, que no tinha sido descrito anteriormente nas infeces endodnticas10,23,11,19. Outros estudos ainda ratificam ou associam algumas bactrias tambm relacionadas a infeces endodnticas como o de Hashimura e Hoshino5 no qual demonstrou o potencial de utilizao da PCR para a deteco de E. faecalis e E. faecium presentes no sistema de canais radiculares como tambm Gomes et al.4 que no seu estudo nos 50 casos de insucesso endodntico, o Enterococcus faecalis foi identificado em 42% casos pela tcnica da cultura, e em 76% atravs da anlise da PCR. Por outro lado, nos 50 casos do estudo onde observaramse infeces primrias, Enterococcus faecalis foi identificado em 4% e em 82% dos casos, respectivamente, pela cultura e pela PCR. Esses resultados mostraram que Enterococcus faecalis est presente em canais com polpas necrosadas, porm em quantidades no

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detectveis pelo mtodo da cultura o que prova o grande potencial da utilizao da PCR como mtodo eficaz de identificao.

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Recebido para publicao em 10/04/2008 Aceito para publicao em 03/06/2008

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