ISSN 0301-732x ISSN 0717-6201

Archivos de Medicina Veterinaria

VOL. 43, N 1, 2011

Comit Editor Presidente: Gustavo Monti, M.V., Mg.Sc., Ph.D. Enrique Paredes H., M.V., Dr. med.vet. Rubn Pulido F., M.V., Mg.Sc., Ph.D. Jorge Toro Y., M.V., M.Sc., Ph.D. Asistente Editorial: Claudia Crdenas A., Ing. Agr.

Comit Editor Asesor Arturo Ferreira, M.V., Ph.D. - Universidad de Chile, Chile Carmen Fuentealba, M.V., M.Sc., Ph.D. - University of Calgary, Canada Carlos Hermosilla, M.V., Dr. med.vet., DipEVPC, Dr. habil. - University of London, UK Oscar Illanes, M.V., Ph.D. - University of Calgary, Canada Ral Mainar, M.V., M.Sc., Dr. Vet., DipECVPH - Centro de Invest. y Tec. Agroalimentaria, Espaa Claudia Muoz-Zanzi, M.V., MPVM, Ph.D. - University of Minnesota, USA Manuel Quezada, M.V., Dr. med.vet. - Universidad de Concepcin, Chile Sergio Recabarren, Lic. Biologa, M.Sc. - Universidad de Concepcin, Chile Gerhardt Schurig, M.V., Ph.D. - Virginia Tech, USA Pedro Smith, M.V., M.Sc.- Universidad de Chile, Chile Francisco Uzal, M.V., M.Sc., Ph.D., Dipl. ACVP - University of California Davis, USA Gerdien van Schaik, M.Sc., Dipl Anim Sci, Ph.D. - Gezondheidsdienst voor Dieren, The Netherlands

Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Veterinarias Casilla 567 - Valdivia, Chile

VOLUMEN 43, N 1, 2011

CONTENIDO EDITORIAL ....................................................................................................................................................................... REVISIONES BIBLIOGRFICAS

Uso de concentrados autlogos de plaquetas como terapia regenerativa de enfermedades crnicas del aparato musculoesqueltico equino. JU Carmona, C Lpez, CE Giraldo ...................................................................................................................................... Atresia folicular en peces telesteos: una revisin. I Valdebenito, L Paiva, M Berland ........................................................................................................................................ V

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ARTCULOS ORIGINALES
Evaluacin de la respuesta clnico-patolgica e inmune humoral en cras de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente con el virus de la Necrosis Pancretica Infecciosa (IPNV). LF Vega, B Valladares, S Martnez-Castaeda, U Alonso, R Enrquez, R Montes de Oca, C Ortega .................................. Anlisis de las concentraciones de azufre en agua, alimento y gas sulfrico ruminal de rebaos bovinos de carne de las regiones de La Araucana, Los Ros y Los Lagos de Chile. M Gmez, B Gonzlez, D Pinochet, P Aburto ...................................................................................................................... Comparacin de mtodos basados en los requerimientos nutricionales y disponibilidad de biomasa para estimar la capacidad de carga para venado cola blanca. FX Plata, GD Mendoza, JA Viccon, R Brcena, F Clemente ............................................................................................... Evaluacin a travs de tomografa computarizada del efecto de una infusin endovenosa de ketamina en el desarrollo de atelectasia inducida por anestesia general en perros. CA Henrquez, LM Mieres, HA Bustamante, DE Herzberg, CE Campillo, MP Cabrera, MA Gmez ............................... Utilizacin de fascia lata alognica para la herniorrafia perineal canina: comunicacin de 7 casos clnicos. GG Semiglia, DF Izquierdo, JH Zunino ...............................................................................................................................

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COMUNICACIONES
Suplementacin de vacas en periodo de transicin con propionato-propilen glicol o minerales traza orgnicos: implicancias para la eficiencia reproductiva y la lactancia. OA Peralta, D Monardes, M Duchens, L Moraga, RL Nebel ............................................................................................... Eficacia de un desinfectante sobre Vibrio ordalii, Vibrio anguillarum, Francisella sp. y Virus de la Necrosis Pancretica Infecciosa (IPNV), patgenos de salmn del Atlntico (Salmo salar) cultivado en Chile. M Muller, P Ilardi, R Avendao-Herrera .............................................................................................................................. Insectos asociados a fecas de pollo en una avcola de Chile Central. J Retamales, F Vivallo, J Robeson ........................................................................................................................................ Uso de bacterifagos en gallinas de postura infectadas con Salmonella enterica serotipo enteritidis: prevencin de la colonizacin intestinal y reproductiva. C Borie, C Hauva, J Quiroga, V Bravo, ML Snchez, MA Morales, P Retamal, J Retamales, J Robeson .......................... Carcinoma folicular de tiroides en perros. Reporte de casos. AB De Nardi, CR Daleck, MCV Silva, JC Canola, LGGG Dias, SG Calazans, SC Fernandes, D Eurides, LAF Silva, RR Huppes ............................................................................................................................................................................ Evaluacin del mtodo del tubo para concentrar plaquetas caninas: estudio celular. RF Silva, CMF Rezende, FO Paes-Leme, JU Carmona .......................................................................................................

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VOLUME 43, N 1, 2011

CONTENTS EDITORIAL ....................................................................................................................................................................... REVIEW ARTICLES

Use of autologous platelet concentrates as regenerative therapy for chronic diseases of the equine musculoskeletal system. JU Carmona, C Lpez, CE Giraldo ...................................................................................................................................... Follicular atresia in teleost fish: a review. I Valdebenito, L Paiva, M Berland ........................................................................................................................................ V

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ORIGINAL ARTICLES
Evaluation of the clinical - pathological and humoral immune response in rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) infected experimentally with the infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). LF Vega, B Valladares, S Martnez-Castaeda, U Alonso, R Enrquez, R Montes de Oca, C Ortega .................................. Determination of sulphur contents in water, forage and ruminal hydrogen sulphide concentrations in beef cattle herds from La Araucana, Los Ros and Los Lagos regions of Chile. M Gmez, B Gonzlez, D Pinochet, P Aburto ...................................................................................................................... Comparison of methods based on the nutritional requirements and availability of biomass to estimate carrying capacity for white tailed deer. FX Plata, GD Mendoza, JA Viccon, R Brcena, F Clemente ............................................................................................... Evaluation of an endovenous ketamine infusion through computed tomography on the development of pulmonary atelectasis due to general anesthesia in dogs. CA Henrquez, LM Mieres, HA Bustamante, DE Herzberg, CE Campillo, MP Cabrera, MA Gmez ............................... Use of allogenic fascia lata in perineal herniorrhaphy in dogs: communication of 7 clinical cases. GG Semiglia, DF Izquierdo, JH Zunino ...............................................................................................................................

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COMMUNICATIONS
Supplementing transition cows with calcium propionate-propylene glycol drenching or organic trace minerals: implications on reproductive and lactation performances. OA Peralta, D Monardes, M Duchens, L Moraga, RL Nebel ............................................................................................... Efficacy of a commercial disinfectant against Vibrio ordalii, Vibrio anguillarum, Francisella sp and Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV) pathogens of Atlantic salmon (Salmo salar) farmed in Chile. M Muller, P Ilardi, R Avendao-Herrera .............................................................................................................................. Insects associated with chicken manure in a breeder poultry farm of Central Chile. J Retamales, F Vivallo, J Robeson ........................................................................................................................................ Bacteriophage use in laying hens infected with Salmonella enterica serovar Enteritidis: prevention of intestinal and reproductive colonization. C Borie, C Hauva, J Quiroga, V Bravo, ML Snchez, MA Morales, P Retamal, J Retamales, J Robeson .......................... Follicular thyroid carcinoma in dogs. Report of cases. AB De Nardi, CR Daleck, MCV Silva, JC Canola, LGGG Dias, SG Calazans, SC Fernandes, D Eurides, LAF Silva, RR Huppes ............................................................................................................................................................................ Evaluation of the tube method for concentrating canine platelets: cellular study. RF Silva, CMF Rezende, FO Paes-Leme, JU Carmona .......................................................................................................

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Arch Med Vet 43, V (2011)

Editorial

En marzo de 2011 se pone fin al perodo de marcha blanca en la implementacin de la plataforma electrnica eQuipu, como parte de una red de revistas ISI chilenas. El objetivo de dicha plataforma es apoyar el trabajo de los editores y mejorar la calidad de las revistas cientficas chilenas mediante el fortalecimiento de una red de editores profesionales, la adopcin de los ms altos estndares de la industria editorial y la consolidacin de una plataforma comn de envo de trabajos, y que permite una marcada modernizacin de todo el proceso editorial, y en el caso de los autores realizar un seguimiento on-line del estado en que se encuentran sus trabajos. Durante los ltimos meses el Comit Editor ha realizado los ajustes necesarios para la adecuada implementacin de este nuevo sistema, tales como la capacitacin de sus integrantes en el manejo del software, y la adquisicin de una moderna red computacional para el trabajo del Comit Editorial. Pensamos que esto agilizar y dar mayor dinamismo al proceso, no slo de envo sino tambin al sistema de arbitraje, todo lo cual debera redundar en una mayor calidad y agilidad del proceso editorial, acortando los tiempos entre recepcin y aceptacin de un artculo. Paralelamente a lo anterior, se pretende a la brevedad que los artculos aceptados en Archivos de Medicina Veterinaria, al igual que en otras revistas cientficas, se encuentren disponibles (en su versin pdf) en la pgina web de la revista (www.veterinaria.uach.cl) con antelacin a la publicacin de la revista impresa. De este modo se lograr acceder a las publicaciones en forma temprana, permitiendo citarlas si es pertinente. Finalmente, hemos decidido aceptar solamente artculos de Revisin en ingls a partir de enero del presente ao. Todo esto es un esfuerzo por contribuir a mantener el sostenido aumento del ndice de Impacto que hemos logrado en los ltimos aos.

Arch Med Vet 43, 1-10 (2011) REVISIN BIBLIOGRFICA

Uso de concentrados autlogos de plaquetas como terapia regenerativa de enfermedades crnicas del aparato musculoesqueltico equino
Use of autologous platelet concentrates as regenerative therapy for chronic diseases of the equine musculoskeletal system
JU Carmona, C Lpez, CE Giraldo
Grupo de Investigacin Terapia Regenerativa, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Manizales, Caldas, Colombia

SUMMARY Platelets are of pivotal importance for wound healing since they release growth factors that in turns produce chemotaxis, both cellular proliferation and differentiation, angiogenesis, and extracellular matrix deposition. The use of autologous platelet concentrates (APCs) has been proposed for accelerating wound healing, decreasing inflammation, to stimulate the regenerative capability of the injured tissues, to decrease the fibroblastic activity and to avoid the production of non functional scarring tissue. APCs could be obtained by several methods. Each method produces APCs of different both cellular and molecular quality. Recently, some basic and clinical information that justifies the usage of APCs for the treatment of degenerative musculoskeletal diseases in horses, such as osteoarthritis, tendinopathies and desmopathies has been published. Palabras clave: equino, enfermedades musculoesquelticas, plasma rico en plaquetas, factores de crecimiento. Key words: equine, musculoskeletal diseases, platelet rich plasma, growth factors.

INTRODUCCIN La cicatrizacin de heridas est dirigida por una sucesin de complejos mecanismos celulares y moleculares. Muchas clulas estn involucradas en este proceso. Estas producen y son sensibles a una infinidad de molculas (por ejemplo: citocinas, factores de crecimiento (GFs) y eicosanoides, entre otros) que permiten, en condiciones fisiolgicas, la reparacin o incluso la regeneracin de los tejidos lesionados (Theoret 2005). Las plaquetas (PLTs) desempean un papel primordial en la cicatrizacin de las heridas, ya que estos fragmentos citoplsmicos adems de poseer propiedades hemostticas (Hartwig e Italiano 2003) tambin poseen propiedades proinflamatorias, reguladoras (Mannaioni y col 1997) y acciones regenerativas, las cuales estn mediadas por la interaccin con clulas (neutrfilos y clulas endoteliales) y por la liberacin de GFs, quimiocinas y otras molculas (Anitua y col 2004). Se ha propuesto el uso de concentrados autlogos de plaquetas (APCs) en seres humanos para estimular la cicatrizacin de heridas en ciruga oral y maxilofacial (Marx y col 1998, Anitua 1999, Carlson y Roach 2002), en ciruga plstica (Powell y col 2001, Bhanot y Alex 2002)

y ortopdica (Lowery y col 1999, Snchez y col 2003). En medicina equina los APCs han sido empleados para el tratamiento de heridas en las extremidades (Carter y col 2003) y enfermedades musculoesquelticas crnicas (Carmona y col, 2009a, b, Waselau y col 2008, Abellanet 2009). Los objetivos de esta revisin son describir la razones biolgicas (fisiolgicas), experimentales y clnicas que sustentan el uso de APCs en caballos con enfermedades crnicas del aparato musculoesqueltico, tales como la osteoartritis, tendinopatias y desmopatas.
GNESIS, FISIOLOGA Y BIOQUMICA DE LAS PLAQUETAS

Aceptado: 24.03.2010. Calle 65 N 26-10, Manizales, Caldas, Colombia; carmona@ucaldas. edu.co

Los megacariocitos (MKs) son los precursores de las PLTs. Estas clulas se desarrollan a partir de clulas progenitoras mieloides multipotenciales CD34+ que residen en el tejido hemopoytico y el torrente sanguneo. Los MKs representan aproximadamente el 0,1-0,5% de las clulas nucleadas de la mdula sea. Estas clulas se encuentran en la regin ms profunda de los sinuosidades capilares de la mdula sea y emiten prolongaciones citoplasmticas (proplaquetas) que estn en contacto con la sangre. Estas prolongaciones son seccionadas y las PLTs son liberadas al torrente sanguneo (Hartwig e Italiano 2003). Las plaquetas equinas son fragmentos citoplasmticos discoides de 5-7 m de largo y 1-3 m de ancho (Leven 2000, Paes-Leme y col 2006); aunque es frecuente observar PLTs grandes (>20 m) en el torrente sanguneo (Argelles y col 2006). 1

JU CARMONA Y COL

MEMBRANA DE LAS PLAQUETAS Y SUS RECEPTORES

La membrana de las plaquetas se compone de tres capas: glicocalix, capa fosfolipdica y submembranosa (Tablin 2000). El glicocalix es la capa exterior que contiene receptores glicoproteicos implicados en la activacin y adhesin de las PLTs. Estas glicoprotenas constituyen los antgenos de membrana de las PLTs, que se dividen en tres familias: integrinas, protenas ricas en leucina y selectinas. Una bicapa fosfolipdica asimtrica con propiedades anticoagulantes constituye la capa central. La estructura de esta capa es idntica a la de otras clulas con dominios de protenas perifricas y transmembranales que actan como receptores de membrana (Tablin 2000). La capa submembranosa contiene los microtbulos de actina y acta como el esqueleto que da la forma discal a la plaqueta en reposo. Esta capa interviene activamente en los procesos de sealizacin plaquetaria (Spencer y Becker 1997). Las integrinas producen agregacin y adhesin plaquetaria (Gentry 2000, Tablin 2000, Pelagalli y col 2003). Las integrinas estn constituidas por dos subunidades, y , las cuales no estn ligadas covalentemente. Las integrinas estn conectadas de forma interna con el citoplasma de las PLTs por una sola cola y externamente con el medio por varias subunidades con dominios extracelulares. En la parte interior las integrinas estn asociadas con las protenas de sealizacin (protenas G, tirosina-quinasas) y fosfoinositoles. La P-selectina es la principal molcula de adhesin de las PLTs y MKs. Esta glicoprotena est presente en la superficie de los grnulos que interactan con fibringeno, factor von Willebrand (vWF), fibronectina y vitronectina (Mannaioni y col 1997, Gentry 2000, Pelagalli y col 2003). La externalizacin de la integrina P-selectina est relacionada con la activacin de las PLTs equinas (Segura y col 2006).
CITOPLASMA Y GRNULOS DE LAS PLAQUETAS

Figura 1. Micrografas obtenidas mediante microscopa electrnica de transmisin (MET) de una plaqueta equina normal (A) y de una plaqueta equina activada. MP: membrana plasmtica. G: glicgeno. : grnulos alfa. P: pseudpodo. MT: mitocondria. T: microtbulos. La barra representa 1 m (Cortesa de la Pfra. Fabiola Paes Leme).
Micrographies obtained by transmission electron microscopy (TEM) of a normal equine platelet (A) and an activated equine platelet (B). MP: plasmatic membrane. G: glycogen. : alpha granules. P: pseudopodium. MT: mitocondria. T microtubules. The bar represents 1 m (Courtesy by Pfr. Fabiola Paes Leme).

La red citoplsmica de las PLTs est constituida por dos tipos de actina (globular y filamentosa). La actina filamentosa acta como soporte estructural para diferentes grnulos plaquetarios y mitocondrias. La respuesta plaquetaria se produce por una actividad contrctil mediada por la polimerizacin del complejo actina-miosina. Los microtbulos citoplasmticos mantienen la forma discoide de las PLTs y dirigen los movimientos generados por actina-miosina (Gentry 2000, Hartwig e Italiano 2003). Las PLTs de los mamferos contienen tres tipos de grnulos: lisosomales, densos y alfa () (Mannaioni y col 1997, Pelagalli y col 2002). Los grnulos lisosomales contienen hidrolasas cidas, guanina, fosfolipasas y quinasas, que actan como enzimas proteolticas e hidrolticas (Tablin 2000). Los grnulos densos almacenan ATP, ADP, calcio, fsforo y serotonina (figura 1A). El ADP induce la 2

migracin plaquetaria y en combinacin con la serotonina produce la contraccin de las arterias lesionadas. El ATP antagoniza la accin del ADP (Pelagalli y col 2002). Los grnulos contienen varias molculas (citocinas, quimiocinas, GFs, entre otras), algunas especficas para las PLTs (por ejemplo: factor plaquetario 4 y -tromboglobulina) y otras que no son especficas para ellas, tales como la albmina, condroitn 4-sulfato, fibringeno, fibronectina, trombospondina, factor V, factor Va y factor von Willebrand (Mannaioni y col 1997, Anitua y col 2004). Estas protenas son importantes para todas las funciones plaquetarias, tales como la formacin y crecimiento de trombos, modulacin inflamatoria y la sntesis de matriz extracelular (ECM) durante la cicatrizacin de heridas (Gentry 2000). Los grnulos almacenan principalmente siete GFs directamente implicados en la cicatrizacin de las heridas, entre ellos: factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-1), TGF-2, factor de crecimiento epidrmico (EGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento insulnico tipo 1 (IGF-I) y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (Anitua y col 2005, Weibrich y col 2005). El cuadro 1 muestra un resumen que describe las principales caractersticas y la accin biolgica de estas protenas durante la cicatrizacin de heridas. RESPUESTA PLAQUETARIA Cuando se produce lesin tisular, se dispara una fuerte interaccin celular. Se producen respuestas plaquetarias independientes, tales como el cambio de forma, transformacin interna, secrecin de grnulos (figura 1B) (Paes-Leme y col 2006), formacin del tapn hemosttico

EQUINO, ENFERMEDADES MUSCULOESQUELTICAS, PLASMA RICO EN PLAQUETAS, FACTORES DE CRECIMIENTO

Cuadro 1. Algunos factores de crecimiento y quimiocinas contenidas en los grnulos de las plaquetas
Some growth factors and chemokines contained in platelet -granules

Factor de crecimiento/Quimiocinas y sus formas biolgicas y receptores Factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF). PDGF-AA, -BB, -AB, -CC y -DD. Dos receptores (PDGFRs): y

Efectos biolgicos durante la cicatrizacin de las heridas Este es un quimiotctico e inductor de proliferacin celular. Estimula la angiognesis y promueve la expresin de las metaloprotenas de matriz (MMP)-1 y su inhibidor tisular (TIMP-1) en la ltima fase de la remodelacin. Los productos de la proliferacin de fibroblastos, migracin epitelial, vascularizacin extensiva y la infiltracin de neutrfilos. Regula la expresin de colgenos y fibronectina. Restringe la degradacin de la matriz extracelular (ECM). Disminuye la expresin de las MMPs, promueve la sntesis de TIMPs y del factor de crecimiento de fibroblastos y la produccin de angiogensis. TGF-3 tiene efectos antifibrticos. Interaccin con TRI produce proliferacin celular y con TRII sntesis de ECM. Induce la proliferacin celular, diferenciacin y motilidad. Es altamente expresado en el margen de las heridas, promueve la reepitelizacin. EGF induce la expresin de MMP-1 y regula el cambio de colgeno tipo I. Promueve la vascularizacin de los tejidos lesionados y facilita el arribo de clulas inflamatorias y reparadoras. Tiene efectos sobre la proliferacin de clulas del endotelio vascular. FGF-1 (FGF bsico) es una potente protena angiognica y controla los depsitos de ECM, puesto que inhibe la sntesis del colgeno tipo I. IGF es un pptido anablico. Produce proliferacin celular y depsito de ECM. Este pptido tiene efectos angiognicos, puesto que incrementa la expresin de VEGF. Produce quimiotaxis de leucocitos y la adhesin de neutrfilos a las clulas endoteliales. Es un pptido antiangiognico, puesto que interacta directamente con FGF o VEGF mediante el bloqueo de sus receptores de superficie celular. Inhibe la apoptosis de monocitos e induce la diferenciacin de estas clulas a macrfagos. Estas quimiocinas producen quimiotaxis de neutrfilos y degranulacin plaquetaria. En el ltimo estado de inflamacin, -TGs desensibilizan la degranulacin de neutrfilos y actan como protenas antiinflamatorias.

Referencias Nimmi 1997, Reigstad y col 2005, Theoret 2005

Factor de crecimiento transformante beta (TGF-). TGF-1, -2, -3. Cinco receptores (TRs). TRI y TRII son los ms importantes

Braun y col 2002, Todorovic y col 2005, Huang y Huang 2005

Factor de crecimiento epidrmico (EGF). Un receptor EGF (EGFR)

Nimmi 1997, Calvin 1998

Factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF). VEGF-B, -C, -D y dos protenas VEGF. Dos receptores: VEGFR-1 y R-2

Nimmi 1997, Ferrara 2001, Braun y col 2002, Theoret 2005

Factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). FGF-1, -2, -4, -7, -9, -10 y -19. Factor de crecimiento insulnico (IGF). IGF-I y IGF II. Dos receptores: IGF-I-R y - II-R Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). Protena de unin HGF (HGF-BP) Factor plaquetario 4 (PF-4). Condroitin sulfato (receptor)

Nimmi 1997, Braun y col 2002, Theoret 2005 Harridge 2003, Frisbie y col 2000 Catlow 2003, Anitua y col 2005 Mannaioni y col 1997, Boehlen y Clemetson 2001

Betatromboglobulina (-TG). Tres pptidos relacionados

Mannaioni y col 1997, Boehlen y Clemetson 2001

primario y retraccin del cogulo (Gentry 2000, Tablin 2000). Molculas de la superficie plaquetaria, como las integrinas, regulan la capacidad de comunicacin intercelular durante la formacin del tapn hemosttico, la respuesta inflamatoria y los procesos de reparacin de tejidos (Mannaioni y col 1997). La expresin cintica es

diferente para cada tipo de grnulo plaquetario. Primero, los grnulos liberan sus contenidos como consecuencia de estmulos de baja intensidad. Luego, los grnulos densos son activados y, finalmente, los grnulos lisosomales liberan sus productos proteolticos (Gentry 2000, Pelagalli y col 2002). Esta cadena de eventos se conoce 3

JU CARMONA Y COL

como reaccin de liberacin plaquetaria (Pelagalli y col 2003). Las plaquetas equinas son especialmente sensibles al ADP, colgeno y factor activador de plaquetas (Pelagalli 2003). Las plaquetas y sus protenas secretadas, principalmente GFs y quimiocinas, disparan el inicio del proceso inflamatorio y secuencialmente coordinan el incremento o la disminucin del efecto de muchas clulas y molculas implicadas en la cicatrizacin de las heridas (cuadro 2). Estos procesos an no son bien comprendidos. Marx (2004) seal que la clave del efecto regenerativo de los APCs (acuado por l como plasma rico en plaquetas PRP) est asociada con el uso de plaquetas

vivas. En ese sentido, las plaquetas deberan ser manipuladas con delicadeza durante la extraccin venosa y subsecuentemente durante la preparacin e inyeccin del APC. La inyeccin de una dosis superior a lo normal de plaquetas vivas en tejidos lesionados podra dar lugar a una respuesta similar a la inducida por estos fragmentos citoplasmticos cuando ocurre una lesin tisular. Aunque Marx (2004) declar que el nmero de PLTs concentradas en un PRP debera ser mayor que 1 milln de fragmentos citoplasmticos por L, los autores de esta revisin y otros como Anitua y col (2004) han observado que concentraciones hasta de 300.000 PLTs por L pueden inducir un efecto teraputico similar.

Cuadro 2. Patobiologa de la cicatrizacin de heridas: clulas, citocinas, factores de crecimiento y otras molculas implicadas en este proceso.
Pathobiology of wound healing: cells, cytokines, growth factors and other molecules implicated in this process.

Fases de la cicatrizacin de heridas* Inflamatoria

Principales caractersticas y clulas implicadas Diseada para proteger el cuerpo contra la prdida excesiva de sangre y la invasin de sustancias extraas. Clulas implicadas: plaquetas, clulas endoteliales, neutrfilos y monocitos. Comienza la formacin de tejido de granulacin necesario para la migracin celular y la deposicin de colgeno. Clulas implicadas: macrfagos, fibroblastos y queratinocitos. Este proceso se superpone con fibroplasia. Es necesario para transportar el oxgeno y nutrientes al tejido de granulacin. Comienza con la ruptura de la membrana basal por la accin de colagenasas y plasmingeno activador secretado por las clulas endoteliales. Clulas implicadas: las clulas endoteliales y pericitos. Es la fase ms lenta del proceso de cicatrizacin de heridas. Comienza 1 a 2 das despus de producidas las heridas y hay una reconstitucin de las clulas de la epidermis y otros epitelios. Se produce una migracin de los queratinocitos desde el borde del corte de la epidermis y a travs del defecto, posiblemente gracias a la disolucin temporal de desmosomas y hemidesmosomas. La migracin se produce gracias a la formacin de pseudpodos. La contraccin de la herida determina la velocidad de cicatrizacin por segunda intencin. El da 7 despus de producida la herida, los defectos de la piel se reducen gracias al movimiento centrpeto de la piel intacta circundante. La fase de maduracin se caracteriza por la disminucin del nmero de fibroblastos y alcanzar el equilibrio entre la produccin de colgeno y su lisis. El equilibrio entre la sntesis de colgeno y la degradacin durante la fase de remodelacin depende de la presencia simultnea de metaloproteinasas de matriz (MMPs) y sus inhibidores naturales especficos de tejidos (TIMPs).

Factores de crecimiento implicados y otras molculas Factores de coagulacin, fibrina, fibronectina, trombospondina, bradiquinina, C3a/C5a, histamina, leucotrienos, P-selectina, IL-1, TNF-, PDGF, TGF-, TGF-, EGF, IGF, VEGF, HGF, PF-4, -TG. EGF, TGF-, TGF-, FGF-1, HB-EGF, PDGF, IL-6, VEGF, IL-4, C5a, colgeno tipo I y III fragmentos y fibronectina. FGF, TNF-, IL-8, cido lctico, aminas biognicas, TGF-, VEGF y PDGF

Proliferativa (fibroplasia)

Angiogensis

Epitelizacin

EGF, factor de crecimiento de los queratinocitos (KGF), TGF-

Contraccin

Fibronectina y receptores de integrina 1, PDGF y interfern gamma (IFN-)

Depsito y remodelacin de matriz

MMPs

Esta es una clasificacin arbitraria. De hecho, cada fase del proceso de cicatrizacin se ha superpuesto. Il-1: Interleucina 1 beta. TNF-: Factor de Necrosis Tumoral alfa. C: Complemento. Otras abreviaturas, tal como en el cuadro 1.

EQUINO, ENFERMEDADES MUSCULOESQUELTICAS, PLASMA RICO EN PLAQUETAS, FACTORES DE CRECIMIENTO

MTODOS UTILIZADOS PARA LA PREPARACIN DE CONCENTRADOS AUTLOGOS DE PLAQUETAS Whitman y col (1997) introdujeron el uso de APCs (gel autlogo de plaquetas) en ciruga maxilofacial humana para aumentar el piso de los senos maxilares como un sustitutivo del pegamento de fibrina autloga (Matras 1982). Despus de esto, muchos dispositivos automatizados, semiautomatizados y mtodos manuales se han desarrollado para la concentracin de plaquetas en seres humanos (Zimmermann y col 2001, 2003, Appel y col 2002, Weibrich y col 2002b, 2003a, b, Eppley y col 2004). Estos dispositivos concentran ms PLTs, leucocitos y GFs, que algunos procedimientos de afresis (Marx y col 1998) y el mtodo del tubo (Weibrich y col 2005, Tamimi y col 2007). Todas las tcnicas utilizadas para preparar APCs presentan ventajas e inconvenientes. An no se ha desarrollado un mtodo o dispositivo ideal para concentrar plaquetas y factores de crecimiento. El sistema de afresis requiere alta tecnologa y personal experimentado y un gran volumen de sangre (> 450 mL) (Marx y col 1998, Weibrich y col 2002a). Sin embargo, se presenta un bajo riesgo de contaminacin bacteriana durante la preparacin de los APCs (Vasconcelos y col 2003). Los sistemas semiatomatizados (buffy coat) permiten concentrar un elevado nmero de PLTs y GFs en comparacin con las otras dos tcnicas (Zimmermann y col 2001, Appel y col 2002, Weibrich y col 2002b, 2003a, b, Zimmermann y col 2003, Eppley y col 2004) y, adems, el riesgo de contaminacin bacteriana es

menor (Vasconcelos y col 2003) que con el mtodo manual (tubo) (Weibrich y col 2005). Sin embargo, estos dispositivos tambin concentran un elevado nmero de leucocitos y son costosos. Es importante sealar que la funcin exacta de los leucocitos en los APCs no se ha establecido. Sin embargo, se cree que la concentracin de un gran nmero de glbulos blancos en los APCs podra ser perjudicial para los tejidos tratados (Zimmermann y col 2003). Los mtodos manuales (tubo) son sencillos y baratos; sin embargo, requieren de un estricto manejo asptico para evitar la contaminacin bacteriana (Weibrich y col 2005, Tamimi y col 2007, lvarez y col 2010). Las ventajas del mtodo del tubo incluyen su simplicidad y bajo costo, mientras que los mtodos semiautomatizados son costo-limitantes, ya que requieren kits y centrfugas especializadas. Los tres mtodos generales utilizados para la obtencin de APCs en seres humanos han sido validados en caballos. Se ha evaluado la capacidad para concentrar PLTs, leucocitos, algunos GFs (Carter y col 2003, Sutter y col 2004, Argelles y col 2006, Schnabel y col 2007, Carmona y col 2008) y xido ntrico (Carmona y col 2008) (cuadro 3). INVESTIGACIN BSICA QUE SUSTENTA EL USO CLNICO DE CONCENTRADOS AUTLOGOS DE PLAQUETAS EN CABALLOS Las plaquetas contienen GFs que han sido evaluados individualmente en cartlago y tendn equino. De estos, el PDGF-BB e IGF-I han demostrado efectos positivos

Cuadro 3. Tcnicas utilizadas para la preparacin de concentrados de plaquetas autlogos equinos. Comparacin de algunos aspectos celulares y moleculares.
Techniques used for preparing equine autologous platelet concentrates. Comparison of some cellular and molecular aspects.

Mtodos Secquire PRP System Smart PReP 2 system Afresis Afresis ms filtracin Mtodo del tubo Sangre entera

Plaquetas WBCs TGF1 TGF2 TGF3 PDGF-AB PDGF-BB IGF-I Oxido ntrico x103/l x103/l ng/ml ng/ml pg/ml ng/ml ng/ml ng/ml (M) 1.472 395 32,5 4,48 15,3 ~9,5 7 ,4-23,6 57,9 10,5 5,58,3 1 ~8,5 107,4 ~200

Referencias Sutter y col 2004 Schnabel y col 2007 Carter y col 2003, Sutter y col 2004 Sutter y col 2004 Argelles y col 2006, Carmona y col 2008 Sutter y col 2004, Argelles y col 2006, Carmona y col 2008

490-55 2.172 272 158-165

33,7 61,2 8,4 6,371

4,3 1,2

30.772 <30.774

7,4

~3

183,4 171,5

35 33

WBCs: Leucocitos. Otras abreviaturas, tal como en el cuadro 1.

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en tendn equino in vitro (Haupt y col 2006) e in vivo (Dahlgren y col 2002). Lo mismo ha sido documentado en condrocitos equinos in vitro, especialmente con IGF-I (Frisbie y col 2000) y TGF-1 (Fortier y col 1997). Estos GFs incrementan la sntesis de ECM del cartlago articular y producen proliferacin de condrocitos. La investigacin bsica del efecto de los APCs en caballos se ha centrado en estudios en sistemas in vitro (Smith y col 2006, Schnabel y col 2007, 2008, McCarrel y Fortier 2009) y en modelos de tendinitis (Maia y col 2009, Bosch y col 2010). Se ha dado gran preponderancia al efecto de los APCs sobre el metabolismo de tenocitos y/o miofibroblastos y la matriz extracelular de tendn y/o ligamento suspensorio de caballos. Sin embargo, hasta el momento (segn lo revisado por los autores), no se ha descrito el efecto in vitro de los APCs sobre cartlago, menisco o membrana sinovial de equinos. Los APCs aumentan la capacidad metablica y proliferativa de tenocitos y fibroblastos, la cual se hace evidente al incrementar la expresin de colgeno tipo I y la sntesis de protena oligomrica de matriz del cartlago (COMP) (Smith y col 2006, Schnabel y col 2007, 2008). Por otra parte, Anitua y col (2005) demostraron in vitro, en explantes de tendn humano, que estas sustancias promovan la angiognesis mediante el incremento de la expresin del factor de crecimiento vsculo-endotelial (VEGF) y el factor de crecimiento hepatocitario (HGF). Recientemente, se ha publicado una investigacin sobre el efecto de un APC (obtenido mediante el mtodo del tubo) en un modelo equino de tendinitis inducida por colagenasa (Maia y col 2009) y otra sobre el efecto de un APC (obtenido mediante un mtodo semiautomatizado) sobre la calidad de la reparacin de lesiones tendinosas centrales (core lesion) inducidas mecnicamente en caballos. En el primer estudio se observ que a los 36 das los caballos tratados con APC tenan una mejor disposicin histolgica de las fibras de colgeno y fibroblastos sobre la matriz de sus tendones en comparacin con los caballos del grupo control. Sin embargo, el nmero de fibroblastos y vasos sanguneos no fue diferente entre ambos grupos (Maia y col 2009). En el segundo estudio se observ que a los 6 meses el grupo de caballos tratados con APC present una mejor arquitectura histolgica, mayor contenido de colgeno, glicosaminoglicanos, DNA y mayor resistencia tnsil que el grupo control (Bosch y col 2010). Se puede apreciar que ambos mtodos para concentrar plaquetas produjeron resultados biolgicos similares en esos estudios experimentales. En cuanto al efecto in vitro de los APCs sobre el metabolismo de tejidos articulares, en porcinos se ha observado que producen proliferacin de condrocitos y aumento de la sntesis de su matriz extracelular (Akeda y col 2006) y en sinoviocitos de personas con osteoartritis promueven la sntesis de cido hialurnico y la expresin de VEGF (Anitua y col 2007). 6

USO CLNICO DE CONCENTRADOS AUTLOGOS DE PLAQUETAS COMO TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES DEGENERATIVAS DEL APARATO LOCOMOTOR EQUINO La historia del uso clnico de los APCs como tratamiento de enfermedades degenerativas del aparato musculoesqueltico de caballos, tales como tendinopata (principalmente) del tendn flexor digital, desmopata del ligamento suspensor y osteoartritis es muy reciente. En Estados Unidos existe predileccin por el uso de dispositivos semiautomatizados, tales como el Secquire (PPAI Medical, Fort Myers, FL, USA) (Waselau y col 2008) y el SmartPReP2 system (Harvest Technologies, Plymouth, MA, USA), para preparar APCs equinos con finalidades teraputicas (Schnabel y col 2007). Entretanto, en Europa continental y en algunos pases de Latinoamrica se emplea el mtodo manual del tubo (Argelles y col 2006, Carmona y col 2008). Un aspecto importante que se debe considerar es que independientemente del mtodo empleado (tal como se ha observado recientemente en estudios experimentales (Maia y col 2009, Bosch y col 2010)), se han obtenido buenos resultados en caballos con diferentes enfermedades locomotoras. Sin embargo, el mtodo del tubo tiene la ventaja de ser muy barato y efectivo en comparacin con los mtodos semiautomatizados (Monteiro y col 2009).
TRATAMIENTO DE LESIONES DEGENERATIVAS DE TENDONES Y LIGAMENTOS

Se ha descrito el uso de APCs en casos de tendinopata (Abellanet 2009, Carmona y col 2009a) y desmopata del ligamento suspensorio (Waselau y col 2008, Abellanet 2009, Carmona y col 2009a). Los APCs (obtenidos mediante el mtodo del tubo) fueron utilizados inicialmente en un pequeo nmero de caballos con afecciones tendinosas y ligamentosas (Carmona y col 2009a). Los pacientes de ese estudio presentaron una mejora clnica y ecogrfica, pero esa investigacin incluy un bajo nmero de pacientes (n = 5) y no haba un grupo control. Sin embargo, el tratamiento fue seguro, ya que las inyecciones de APCs no indujeron reacciones adversas en los caballos tratados. Waselau y col (2008) describieron los resultados de una inyeccin de un APC (obtenido mediante mtodo semiautomatizado) seguido de un programa de ejercicio controlado como tratamiento de desmitis moderada o severa del cuerpo del ligamento suspensorio en 9 caballos de carreras. Los pacientes alcanzaron su nivel atltico entre 6, 5-17 meses poslesin y corrieron consecutivamente durante dos aos. Sin embargo, en ese estudio no haba grupo control. Recientemente, Abellanet (2009) describi los resultados de un estudio clnico controlado en el que se evalu el uso de APCs (obtenidos mediante el mtodo del tubo (Argelles y col 2006, Carmona y col 2008, 2009)) en 72

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caballos con tendinopata del tendn flexor digital superficial, 10 con tendinopata del flexor digital profundo y 16 con lesiones del ligamento suspensorio. Los caballos con tendinopata del tendn flexor digital superficial presentaron una mejora clnica del 80% vs 45% para el grupo control (n = 9). De los caballos que fueron tratados con APCs presentaron recidiva el 22% en comparacin con el 80% del grupo control. Los caballos con tendinopata del flexor digital profundo que recibieron tratamiento con APCs presentaron mejora del 100% en comparacin con el 0% del grupo control (n = 4) y una recidiva del 17% en los caballos tratados. Los caballos con desmopata del ligamento suspensor presentaron mejora clnica el 90% vs 0% del grupo control (n = 16). De los caballos que fueron tratados con APCs recay el 10%. En general todos los caballos tratados con APCs se recuperaron en un periodo de 6 meses.
TRATAMIENTO DE OSTEOARTRITIS

leucocitos perifricos (Nimmi 1997). Existe alguna desconfianza entre veterinarios para inyectar APCs va intraarticular en caballos con OA, pues se piensa en la posibilidad de desarrollar una artritis sptica posinyeccin. Recientemente, lvarez y col (2010) demostraron que los APCs obtenidos mediante el mtodo del tubo no sufren contaminacin bacteriana, siempre y cuando se realice un adecuado protocolo de desinfeccin de la piel del sitio de la venopuncin y que estos sean preparados en un cuarto cerrado y sin corrientes de aire. Por otra parte, es necesario considerar que los APCs tienen una potente accin antimicrobiana contra las bacterias de la piel de los caballos (lvarez y col, datos sin publicar), tales como Staphylococcus aureus (Bielecki y col 2007). NMERO Y VIABILIDAD DE PLAQUETAS, NMERO DE DOSIS, INTERVALO POSOLGICO, MOMENTO IDEAL DE APLICACIN VERSUS EFECTIVIDAD CLNICA DE LOS CONCENTRADOS AUTLOGOS DE PLAQUETAS Segn la literatura revisada y particularmente por los resultados obtenidos in vivo en modelos experimentales (Maia y col 2009, Bosch y col 2010) y en estudios clnicos (Waselaw y col 2008, Abellanet 2009, Carmona y col 2009a, b) existe una buena respuesta teraputica de los APCs a partir de dosis de plaquetas tan bajas como 300.000/L (Maia y col 2008, Carmona y col 2009a, b, Abellanet 2009) y tan altas como ms de un milln/L (Waselaw y col 2008). Para los autores de esta revisin la fraccin celular extraplaquetaria y la viabilidad plaquetaria son aspectos ms importantes que concentrar una gran cantidad de plaquetas no viables y de factores de crecimiento (McCarrel y Fortier 2009). Aunque existe una corriente norteamericana que recomienda congelar APCs para un posterior uso en el paciente, nuestro equipo cree que estos concentrados se deben activar y aplicar inmediatamente. Esto porque es posible que la viabilidad celular del APC y su actividad metablica produzcan una reaccin de liberacin ms adecuada y temporalmente sostenida de los grnulos alfa y una mejor interaccin celular (Anitua y col 2004). Los resultados de Abellanet (2009) confirman, especialmente para lesiones de tejidos blandos, que entre mayor sea el nmero de aplicaciones de APC/lesin, se presentar una mejor respuesta clnica y un menor nmero de recadas. Los autores consideran que tres e incluso cuatro aplicacin de APCs, con un intervalo de 10-15 das entre aplicacin, es un esquema posolgico adecuado. Este esquema teraputico se ha basado en la impresin clnica de los autores y, por otra parte, los estudios de Abellanet (2009) indican que algunos biomarcadores anablicos declinan 15 das despus de la aplicacin intraarticular o intrasinovial de APCs en caballos. Los autores consideran que los APCs pueden ser aplicados en cualquier momento de evolucin de las lesiones. No se debe olvidar que 7

Carmona y col (2009b) describieron el tratamiento con APCs de 4 caballos con OA de diferentes articulaciones. Los resultados obtenidos fueron favorables ya que los APCs disminuyeron el grado de cojera y efusin sinovial por ms de 8 meses. Sin embargo, en ese estudio no haba un grupo control, por lo que los autores slo pudieron concluir que la inyeccin intraarticular de APCs en caballos con OA era segura. Sin embargo, recientemente Abellanet (2009) evalu el efecto clnico de la inyeccin intraarticular de APCs en 30 caballos con OA. En ese trabajo se observ mejora clnica en el 75% de los caballos tratados contra 0% en el grupo de 12 caballos con OA que no recibi tratamiento. El porcentaje de recidiva en esa investigacin fue del 30%. Los caballos que recayeron presentaban alteraciones radiolgicas severas, principalmente fragmentos seos libres mayores de 4 mm (Abellanet 2009). EFECTOS ADVERSOS ASOCIADOS CON LA INYECCIN DE CONCENTRADOS AUTLOGOS DE PLAQUETAS Hasta la fecha no hay informes sobre efectos adversos secundarios derivados del uso de APCs en pacientes equinos. Los autores han realizado ms de 1.000 inyecciones de APCs, obtenidos mediante el mtodo del tubo (Argelles y col 2006, Carmona y col 2008), sin ningn tipo de complicacin, aunque algunos caballos afectados por enfermedad articular desarrollaron un ligero derrame sinovial durante las primeras 48 horas despus de la inyeccin de APCs (Carmona y col 2009b). Es posible que estas efusiones sinoviales transitorias estn relacionadas con la presencia de leucocitos en los APCs. Sin embargo, el PDGF liberado durante la activacin plaquetaria tambin podra contribuir con este problema, ya que es un poderoso factor de crecimiento quimiotctico para

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la mayora de las enfermedades del aparato locomotor equino son crnicas por naturaleza y que los episodios agudos son solamente agravamientos momentneos de las mismas patologas (Carmona y Prades 2009). Los APCs constituyen un excelente tratamiento analgsico y antiinflamatorio para las lesiones en fase aguda de tendones, ligamentos y articulaciones y slo existen limitaciones tericas, que sugieren su aplicacin nicamente en la fase proliferativa de la lesin, especialmente tendinosa (Schnabel y col 2007). CONCLUSIN Los APCs constituyen una opcin teraputica real para el manejo de las enfermedades crnicas musculoesquelticas del caballo. Segn los resultados obtenidos en modelos experimentales y en pacientes con enfermedad natural, existe una buena respuesta teraputica de los APCs a partir de dosis de plaquetas tan bajas como 300.000/L. Los APCs deberan ser aplicados al menos tres veces con un intervalo de 2 semanas entre aplicacin. El mtodo del tubo representa una opcin simple y econmica para preparar concentrados autlogos de plaquetas viables. Es necesario ampliar el conocimiento sobre los efectos moleculares de los APCs sobre el cartlago articular equino y realizar ms estudios clnicos doble ciego que incluyan un gran nmero de pacientes equinos con diferentes enfermedades musculoesquelticas y hacer estudios sobre el comportamiento de biomarcadores anablicos y catablicos a largo tiempo (3 aos). Los resultados de estudios de tal magnitud no slo seran de beneficio para los caballos, sino que tendran una importante aplicacin traslacional en seres humanos. RESUMEN
Las plaquetas son fundamentales para la reparacin tisular de las heridas, ya que secretan factores de crecimiento, los cuales inducen quimiotaxis, proliferacin y diferenciacin celular, neovascularizacin y produccin de la matriz extracelular. Se ha propuesto el uso de concentrados autlogos de plaquetas (APCs) para acelerar la cicatrizacin de heridas, disminuir la inflamacin, estimular la capacidad regenerativa de los tejidos lesionados, disminuir la actividad fibroblstica y la produccin de tejido cicatricial nofuncional. Los APCs pueden ser preparados mediante diferentes mtodos. Cada mtodo produce APCs de diferente calidad celular y molecular. Recientemente, se ha generado informacin bsica y clnica que justifica el uso de APCs en caballos con enfermedades degenerativas del aparato musculoesqueltico equino como la osteoartritis, tendinopatas y desmopatas.

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AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Profesora Fabiola de Oliveira Paes Leme, MV, MSc, PhD (Universidad Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil), por el aporte de las fotografas ultraestructurales de las plaquetas equinas presentadas en este trabajo.

EQUINO, ENFERMEDADES MUSCULOESQUELTICAS, PLASMA RICO EN PLAQUETAS, FACTORES DE CRECIMIENTO

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Arch Med Vet 43, 11-25 (2011) REVISIN BIBLIOGRFICA

Atresia folicular en peces telesteos: una revisin

Follicular atresia in teleost fish: a review
I Valdebenitoa*, L Paivaa, M Berlandb
a*Escuela bEscuela

de Acuicultura, Universidad Catlica de Temuco, Temuco, Chile. de Medicina Veterinaria, Universidad Catlica de Temuco, Temuco, Chile.
SUMMARY

Many fish species with economic importance have been heavily exploited, causing the collapse of their fisheries. For this reason, there have been attempts to cultivate fish species for commercial purposes, resulting in varying success. It has been observed that when some species are kept in captivity or under intensive exploitation in its natural environment, they present reproductive dysfunctions that leads to the appearance of follicular atresia. This process is scarcely studied in fish and the characterization by several authors shows differences in nomenclature and criteria that make even more difficult its understanding. The objective of this work is to present a literature review of follicular atresia in fish that will contribute to its understanding and study. The follicular atresia is a degenerative process observed in some oocytes that can occur at any time of its development. The presence of follicular atresia has been associated with normal degenerative conditions due to seasonal changes in the gonadal activity, health disorders or inadequate management conditions in fish culture. It has been suggested that this process is a mechanism that allows the recycling of components and energy. However, in certain species such as puye (Galaxias maculatus) and cutthroat trout (Salmo clarki), among others, it has been noted the presence of follicular atresia with pathological characteristics, in which the yolk reabsorption does not occur causing the hardening of the more developed follicles that leads finally to the female death. Palabras claves: reproduccin de peces, oognesis, folculo ovrico, atresia folicular. Key words: fish reproduction, oogenesis, ovarian follicle, follicular atresia.

INTRODUCCIN La creciente demanda de alimentos ha provocado que muchas especies de peces con importancia econmica sean intensamente explotadas, con el consecuente colapso de sus pesqueras y su tendencia a desaparecer de aquellos hbitats donde histricamente se les ha encontrado (Rutaisire y Booth 2004). Sin embargo, en algunas especies se han hecho intentos por lograr cultivar individuos con fines comerciales, obtenindose relativo xito. Estas poblaciones cuando son mantenidas en confinamiento o sometidas a intensa presin de explotacin presentan alteraciones gonadales que pueden disminuir su desempeo reproductivo, lo que se refleja especialmente en la reduccin de parmetros como la tasa de fertilidad y sobrevivencia en incubacin (Leonardo y col 2006). Una de las ms serias limitantes para el cultivo comercial de una nueva especie es el conocimiento y control de la biologa reproductiva y los problemas o disfunciones que en ella acontecen, ya que sta es la base de sustentacin para los futuros programas productivos (Zohar y Mylonas 2001). El manejo de las pesqueras a menudo requiere de la valoracin de parmetros de madurez sexual, desove y

fecundidad, los que necesitan de la comprensin cabal de la microestructura y funcin gonadal (Rutaisire y Booth 2004). Dicha informacin est disponible slo para una pequea cantidad de especies comercialmente importantes y en muchos casos slo de forma parcial (Tyler y Sumpter 1996). Los estudios histolgicos proveen de informacin precisa del desarrollo oocitario, pero son lentos y costosos debido a que involucran complejas tcnicas de laboratorio (West 1990). Sin embargo, actualmente se ha incrementado el inters en el estudio de las alteraciones histolgicas (histopatologa), debido a que los cambios estructurales a nivel gonadal son el resultado de la integracin de un gran nmero de procesos fisiolgicos que interactan entre s (van der Oost y col 2003). La presente revisin realiza una breve descripcin de las alteraciones reproductivas de hembras de peces enfocada en el proceso de atresia folicular, basndose en disfunciones analizadas en literatura con diferentes especies de peces telesteos. ESTRUCTURA GONADAL EN PECES
ORGANIZACIN HISTOLGICA

Aceptado: 19.05.2010. * Casilla 15-D, Temuco, Chile; ivisler@uct.cl

La microestructura del ovario de los peces telesteos revela que ste se encuentra envuelto por una delgada tnica albugnea de tejido conectivo laxo, la cual presenta engrosamientos donde existen vasos sanguneos que 11

I VALDEBENITO Y COL

irrigan la gnada. En el interior del ovario se observan laminillas ovgeras que se desprenden de la albugnea, proyectndose hacia el lumen del rgano. El cuerpo de la laminilla est formado por tejido conectivo y escasas fibras musculares lisas, recubiertas por el epitelio germinal ovrico. El folculo ovrico se encuentra embebido dentro de un heterogneo tejido de sostn, el que en su conjunto constituye el ovario (Nagahama 1983, Peredo y Sobarzo 1993). Microscpicamente el folculo ovrico de los peces es relativamente simple, siendo su organizacin similar en todos los telesteos. El oocito de ubicacin central est rodeado por una envoltura acelular denominada corion, zona radiata (Leonardo y col 2006) o envoltura vitelina (Leino y col 2005). Esta envoltura se encuentra cubierta externamente por clulas foliculares, las cuales a medida que crece el oocito incrementan su nmero, distribuyndose en una envoltura continua de una monocapa de clulas (llamada granulosa) y una capa externa de clulas tecales o envoltura folicular externa (figura 1). Ambas capas celulares se encuentran separadas por la membrana basal (Takashima e Hibiya 1995). Histolgicamente, la evidencia actual sugiere que la capa de clulas de la granulosa est compuesta por una poblacin celular homognea. Sin embargo, esta capa celular tambin contiene clulas micropilares, las cuales son fcilmente distinguibles de las clulas granulosas por sus caractersticas morfolgicas, como son su forma triangular y su ubicacin en el canal micropilar. Por el contrario, la capa de clulas tecales presenta mayor heterogeneidad, ya que est compuesta de capilares, fibroblastos, fibras de colgeno y en muchos casos de clulas especiales de la teca (Nagahama 1983, Takashima e Hibiya 1995, Linares-Casenave y col 2002).

OOGNESIS Se han empleado muchos criterios para caracterizar el proceso de oognesis, entre ellos se encuentran: el tamao, la cantidad y distribucin de varias inclusiones celulares, especialmente grnulos de vitelo y morfologa de los cromosomas. El proceso de oognesis se ha dividido en cinco, seis u ocho etapas en la mayora de los telesteos (nver y nver Saraydin 2004). Sin embargo, la mayora de los autores coinciden en una clasificacin de seis estados de desarrollo oocitario (figura 2), los cuales se describen a continuacin. Oogonias: El primer paso en la oognesis es similar al desarrollo encontrado en la espermatognesis, ya que las oogonias experimentan proliferacin por divisiones mitticas. Estas oogonias se presentan distribuidas de una manera no uniforme, aisladas o formando cistos (Peredo y Sobarzo 1993), con caractersticas citolgicas que presentan poca variacin entre las especies. En la carpita cabezona (Pimephales promelas Rafinesque, 1820) las oogonias poseen un gran ncleo con algunos nuclolos de tamao variable y en algunos casos un pequeo aro de citoplasma (Leino y col 2005). Cromatina nucleolar: Esta etapa comprende desde leptoteno a paquiteno durante la profase I. Las principales caractersticas al microscopio ptico son la redistribucin de los cromosomas por todo el ncleo adoptando variadas figuras cromosomales, adems de una redistribucin de organelos citoplasmticos. Durante esta etapa en la mayora de las especies, una estructura citoplasmtica conocida como el cuerpo vitelino de Balbiani o ncleo vitelino

Figura 1. Estructura de un folculo ovrico de puye (Galaxias maculatus). (A) VG vescula germinal; C citoplasma vitelnico; PF pared folicular. Barra = 30 m (40x). (B) CR corion; G monocapa granulosa; T capa tecal. Barra = 10 m (100x).
Structure of puye (Galaxias maculatus) ovary follicle. (A) VG germinal vesicle; C vitellinic cytoplasm; PF follicular wall. Scale Bar = 30 m (40x). (B) CR chorion; G monolayer of granulosa cells; T thecal layer. Scale bar = 10 m (100x).

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REPRODUCCIN DE PECES, OOGNESIS, FOLCULO OVRICO, ATRESIA FOLICULAR

Cuerpo de Balbiani Alvolo cortical

I, IIa IIb III VI

definido en una posicin yuxtanuclear. Posteriormente, este cuerpo sufre una desintegracin gradual y migra hacia la superficie oocitaria (Takashima e Hibiya 1995). Alvolo cortical (Vescula vitelina): Esta fase se caracteriza por la formacin de vesculas vitelinas alrededor de la vescula germinal y en algunos peces por la formacin de gotas lipdicas en el citoplasma, como en la carpita cabezona (P. promelas) (Leino y col 2005, Honji y col 2006). La formacin de estas vesculas vitelinas se inicia en la periferia del ooplasma en algunas especies, pudiendo observarse slo escasas vesculas durante una fase temprana. Sin embargo, a medida que el desarrollo progresa van llenando y distribuyndose por todo el citoplasma contribuyendo a un incremento de tamao por parte del oocito (Ravaglia y Maggese 2002, Leino y col 2005). Otra caracterstica de importancia es la aparicin de microvellosidades y corion (Takashima e Hibiya 1995, Honji y col 2006), la cual en el caso de la carpita cabezona es claramente visible hasta en los oocitos ms pequeos de esta fase. Las clulas foliculares son de apariencia escamosa en la fase temprana, transformndose en cuboidales en la fase tarda (Leino y col 2005). En la mayora de los telesteos el inicio de la fase de alvolo cortical precede el inicio de la fase vitelina, pero en algunas especies como el pez cebra (Branchydanio rerio Hamilton, 1822), estas fases pueden iniciarse conjuntamente (Nagahama 1983, Takashima e Hibiya 1995). Algunos autores separan esta etapa en tres: Vescula de Vitelo I, Vescula de Vitelo II, Vescula de Vitelo III (Rutaisire y Booth 2004). Vitelognesis: En peces, antes de que la vitelognesis se inicie, tiene lugar una serie de transformaciones nucleares, nucleolares y citoplasmticas que hacen que el aspecto de los oocitos vare de manera considerable (Zanuy y Carrillo 1987, Zanuy y col 2009, Mylonas y col 2010). Esta primera etapa corresponde al crecimiento primario o fase de crecimiento citoplasmtico, donde se produce un incremento de los organelos citoplasmticos, como son las mitocondrias, cuerpos multivesiculares, retculo endoplasmtico y los elementos del Golgi. La segunda etapa corresponde a la vitelognesis propiamente tal, fase donde el oocito experimenta un aumento de tamao prolongado y sostenido. En los meses anteriores a la puesta, se produce un crecimiento drstico del ovario de la mayora de los telesteos (desde menos del 1% hasta un 20% o ms de ndice Gonadosomtico (IGS), dependiendo de la especie). Este crecimiento es debido al cmulo de grandes reservas nutritivas o vitelo por parte de los oocitos (Zanuy y Carrillo 1987). Por ejemplo, en la trucha arco iris el oocito joven posee un promedio de 20 m de dimetro y al trmino de su desarrollo es de alrededor de 4 mm (Nagahama 1983). La sntesis de vitelo recibe el nombre de vitelognesis, la cual ocurre fuera del oocito (vitelognesis exgena) (Zanuy y Carrillo 1987, Le Menn y col 2000, Zanuy y col 2009, Mylonas y col 2010). 13

Lpidos

IV

Vesculas Vitelinas

Lpidos Figura 2. Esquema de un corte transversal de ovario de pez con distintas etapas de crecimiento folicular. I oogonia; IIa cromatina nucleolar; IIb oocitos perinucleolares; III alvolo cortical; IV vitelognesis; V oocito maduro; VI oocito ovulado (Extrado de Takashima e Hibiya 1995).
Scheme of cross section of fish ovary with different stages of follicular growth. I oogonia; IIa chromatin nucleolar; IIb perinucleolar stage; III cortical alveoli; IV vitellogenesis; V mature oocyte; VI spawned egg (Extracted from Takashima and Hibiya 1995).

inicia su desarrollo (Nagahama 1983, Takashima e Hibiya 1995), el cual ha sido caracterizado como una estructura altamente basoflica. A travs de microscopa electrnica se ha revelado que sta no es una estructura homognea, ya que est compuesta por diversos organelos como retculo endoplsmico liso, aparato de Golgi, mitocondrias, grnulos lipdicos y cuerpos multivesiculares (Wallace y Selman 1981). Fase perinucleolar: El inicio de esta fase se caracteriza por la aparicin e inicio de la migracin de mltiples nuclolos hacia el nucleoplasma perifrico. Desde este momento el gran ncleo del oocito ser llamado vescula germinal (Nagahama 1983, Begovac y Wallace 1988, Takashima e Hibiya 1995). A pesar de que la meiosis se encuentra detenida en diploteno, el crecimiento oocitario y la diferenciacin de la pared folicular contina. Desde un punto de vista prctico, la organizacin bsica del folculo ovrico puede ser observada mediante microscopa ptica por primera vez durante la fase perinucleolar, cuando el oocito se encuentra rodeado dentro de una capa continua de clulas foliculares (Takashima e Hibiya 1995) y tecales, las cuales poseen un ncleo aplanado con una capa muy delgada de citoplasma, difcil de observar. A nivel ultraestructural, tanto la capa de la granulosa y de clulas tecales se hacen distinguibles y rudimentos del corion pueden aparecer (Ravaglia y Maggese 2002). Adems, en muchas especies el cuerpo de Balbiani es claramente

I VALDEBENITO Y COL

El oocito empieza a incorporar material por micropinocitosis formando grnulos de vitelo, los cuales inicialmente son ms pequeos que los alvolos corticales, encontrndose dispersos en el citoplasma perifrico. Sin embargo, a medida que el oocito crece los grnulos de vitelo son de mayor tamao y ms numerosos, emigrando hacia el interior del ooplasma y desplazando a los alvolos corticales hacia la periferia (Nagahama 1983, Leino y col 2005). Durante esta fase se han caracterizado tres tipos distintos de material vitelino: gotas lipdicas, vesculas vitelinas y grnulos vitelinos, la secuencia de aparicin de este material vitelino vara segn la especie (Nagahama 1983). En estados avanzados de vitelognesis, las inclusiones lipdicas (generalmente triglicridos) coalescen entre s para formar una sola o varias gotas de grasa, dependiendo de la especie (Zanuy y Carrillo 1987, Zanuy y col 2009, Mylonas y col 2010). La arquitectura de la pared folicular aumenta su complejidad durante esta fase. A nivel estructural el corion en algunas especies como los scianidos, puede ser reconocido por la presencia de tres capas, denominadas: Z1, Z2, Z3 (Nagahama 1983). Esta ltima es de apariencia reticular o estriada durante gran parte de la vitelognesis, debido al gran nmero de canales o poros (Leino y col 2005). No obstante, durante el final de la vitelognesis, puede perder su apariencia debido a la compactacin (Takashima e Hibiya 1995). Maduracin: Morfolgicamente esta fase es caracterizada por el inicio o reanudacin de la migracin de la vescula germinal hacia el polo animal y la posterior ruptura de sta (proceso llamado breakdown en ingls), adems se produce una clarificacin del vitelo y un marcado incremento de tamao debido a la hidratacin (Nagahama 1983, Zanuy y Carrillo 1987, Takashima e Hibiya 1995, nver y nver Saraydin 2004, Honji y col 2006). Cabe sealar que en algunas especies, como los salmondeos y la carpita cabezona (P. promelas), la vescula germinal inicia su migracin hacia el polo animal antes de la maduracin durante las ltimas etapas de la vitelognesis, pero en otras como los scianidos la vescula germinal permanece en el centro del oocito hasta el inicio de la maduracin final (Takashima e Hibiya 1995, Leino y col 2005). En esta etapa concluye la primera divisin meitica con la expulsin del primer cuerpo polar, para nuevamente volver a detenerse, esta vez en metafase de la segunda divisin (Takashima e Hibiya 1995), para luego ser ovulado y eventualmente desovado (o puesto). Wallace y Selman (1980) observaron que durante la maduracin final en Fundulus heteroclitus (Linnaeus 1766), clulas de la granulosa experimentaron algunas alteraciones citolgicas especficas, tales como un enorme aumento del aparato de Golgi con presencia de material secretorio e incremento de las cisternas glandulares de retculo endoplsmico rugoso y ribosomas libres. 14

Los oocitos ya maduros son llamados huevos u ovas, los cuales durante la ovulacin (con la meiosis detenida en metafase II) son expelidos en la cavidad peritoneal en especies con ovarios gimnovrico (Nagahama 1983) o en la cavidad ovrica en especies con ovario cistovrico. En muchas especies de peces marinos y de estuario se produce un marcado aumento del volumen oocitario debido al ingreso de agua dentro del oocito, proceso llamado hidratacin. El reinicio y finalizacin de la segunda divisin meitica ocurre posterior a la fecundacin del oocito II. La ovulacin en los telesteos involucra una serie de pasos preparatorios. Primero la capa folicular debe separarse del oocito, el mecanismo que comanda la interrupcin en la comunicacin folculo-oocito previo a la ovulacin es desconocido, pero se ha sugerido la intervencin de enzimas proteolticas en la disrupcin de la conexin. Se ha demostrado la presencia de algunos elementos contrctiles como microfilamentos en las clulas tecales, as como la presencia de fibras musculares lisas. A travs de experimentos con inhibidores de estos sistemas contrctiles como Citocalasina B, se ha sugerido que este sistema de microfilamentos es necesario para la ovulacin de los telesteos (Nagahama 1983). Posterior a la ovulacin y desove, el ovario contiene folculos postovulatorios (POFs), ovas no desovadas, oocitos adultos inmaduros, oogonias y en peces con estaciones de desove continua o prolongada, oocitos en varias etapas de desarrollo (Takashima e Hibiya 1995, nver y nver Saraydin 2004). Los folculos postovulatorios estn constituidos por capas foliculares que permanecen en el ovario despus de liberado el oocito. Inicialmente los POFs son una estructura definida, pero rpidamente se deterioran tornndose indetectables dentro de algunos das (Macchi y col 2003, Honji y col 2006, Ganias y col 2007).
CONTROL ENDOCRINO DE LA REPRODUCCIN EN PECES

Similar a lo ocurrido en vertebrados superiores el desarrollo y crecimiento oocitario est gobernado por el sistema neuroendocrino, el cual estimula a los tejidos ovricos para el desarrollo folicular y la produccin de esteroides (Hafez 2002). En peces, al igual que en otros vertebrados no mamferos, la gran sensibilidad al medio ambiente ejerce un importante control sobre la reproduccin, modulando a travs de la integracin de los sistemas sensoriales la secrecin de hormonas liberadoras hipotalmicas. El mecanismo de secrecin de esteroides es un complejo sistema que involucra la percepcin de estmulos ambientales, conexiones neuronales y rganos endocrinos, el cual de manera general est compuesto por rganos de los sentidos, glndula pineal, hipotlamo e hipfisis, esta ltima es la encargada de secretar hormonas estimuladoras de tejidos sintetizadores de esteroides (Nagahama 1983, Zanuy y Carrillo 1987, Zanuy y col 2009).

REPRODUCCIN DE PECES, OOGNESIS, FOLCULO OVRICO, ATRESIA FOLICULAR

Las gonadotrofinas (GtHs) se han purificado en especies como el salmn, la carpa y la trucha, separndose dos fracciones denominadas GtH I (FSH) y GtH II (LH) (Zanuy y Carrillo 1987, Arantes y col 2010). La GtH I induce la captura de vitelogenina (Zanuy y Carrillo 1987, Luckenbach y col 2010) y, dependiendo de la especie, puede estimular la esteroidognesis y liberacin de AMPc, por lo cual se la denomina hormona vitelognica. Por otra parte, la GtH II induce la maduracin de los oocitos, la ovulacin, adems de estimular la formacin de AMPc, denominndose hormona madurativa (Zanuy y Carrillo 1987, Zanuy y col 2009). Ambos tipos de GtH son liberadas desde la hipfisis y vertidas al torrente sanguneo, donde al llegar a las gnadas, estimulan a los tejidos ovricos para realizar la sntesis esteroidognica a nivel folicular en las clulas de la granulosa, clulas tecales, cuerpos atrsicos y folculos postovulatorios (corpora lutea) (Nagahama 1983, Valdebenito 2008, Mylonas y col 2010) (figura 3). La sntesis de esteroides gonadales es llevada a cabo por clulas de la granulosa y de la teca en forma

conjunta, produciendo 17-estradiol y esteroide inductor de la maduracin (17-20-dihidroxi-4-pregnen-3ona), respectivamente (Nagahama 1983). La accin fisiolgica del 17-estradiol es inducir la biosntesis y secrecin heptica de vitelogenina, la cual es liberada en la sangre y transportada hasta el ovario, en donde cumple un rol primordial durante la etapa de vitelognesis. La hormona 17, 20-dihidroxi-4-pregnen-3-ona, es altamente efectiva en la induccin de la maduracin in vitro. Este esteroide es sintetizado por el folculo en respuesta a la gonadotrofina, encontrndose en elevadas concentraciones en el plasma de hembras que experimentan maduracin final oocitaria (FOM) (Nagahama 1983), pero no slo el folculo ovrico es el nico secretor de esteroides gonadales, estructuras postovulatorias tambin participan en su secrecin. Los folculos postovulatorios recientes han sido caracterizados por un alto grado de vascularizacin de la capa tecal e hipertrofia de las clulas de la granulosa y al igual que en la granulosa de los folculos en crecimiento, existe evidencia de la actividad de enzimas involucradas en la produccin de hormonas

Cuadro 1. Factores involucrados en disfunciones reproductivas causantes de atresia folicular en peces.

Factors involved in reproductive dysfunctions causatives of follicular atresia in fish.

Factor Agonistas estrognicos y andrognicos Estrs ambiental Temperatura elevada previo a la maduracin Fotoperiodo largo Temperatura elevada del medio Melatonina Ondas de luz largas Presencia de mercurio en el medio Altos niveles de zinc o cobre en el medio Pesticidas (organoclorados) Temp. elevada constante durante madurez mxima Falta de fotoperiodo decreciente Carencia de fotoperiodo largo o temperatura elevada Fotoperodo alterado

Efecto o Alteracin Probable interferencia de la maduracin final oocitaria Desequilibrio hormonal Detencin del desarrollo ovrico Inhibe regresin gonadal Ausencia de recrudescencia gonadal Regresin o bloqueo del desarrollo gonadal Inhibicin de la maduracin Regresin gonadal e inhibicin de la ovulacin Bajo nmero de oocitos ovulados. Inhibicin hormona luteinizante (LH) Bajo porcentaje de oocitos ovulados Inhibicin de la maduracin Ausencia de maduracin Probable interferencia de la maduracin final oocitaria

Especie(s) o Genero(s) Pimephales promelas Chalcalburnus chalcoides Acipenser transmontanus Bairdiella spp. y Rhodeus spp. Gillichthys mirabilis Oryzias latipes Plecoglossus sp. Oryzias latipes Pimephales promelas Oryzias latipes Salmo clarki Salmondeos Notemigonus crysoleucas Galaxias maculatus

Autor(es) Leino y col 2005. nver y nver Saraydin 2004. Linares-Casenave y col 2002. Zanuy y Carrillo 1987. Zanuy y Carrillo 1987. Urasaki 1972. Lam 1983. Lam 1983. Lam 1983. Lam 1983. Smith y col 1983. Billard y col 1978. de Vlaming 1975. Datos sin publicar.

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I VALDEBENITO Y COL

Figura 3. Esquema del mecanismo de control endocrino e interaccin folicular en peces telesteos. PDR pars distalis rostralis; PDP pars distalis proximalis; PI pars intermedia (modificado de Zanuy y Carrillo 1987).
Model of endocrine control mechanism and follicular interaction in teleosts fish. PDR pars distalis rostralis; PDP pars distalis proximalis; PI pars intermedia (modified from Zanuy and Carrillo 1987).

esteroidales, lo que sugiere una similitud de los folculos postovulatorios con el cuerpo lteo de los mamferos, ya que en stos existe biosntesis de esteroides (Kagawa y col 1981, Nagahama y Kagawa 1982, Nagahama 1983, Takashima e Hibiya 1995).
ATRESIA FOLICULAR

dos poblaciones silvestres en ros distintos, determinndose distintos tipos de atresia para cada una de las poblaciones y una tasa de atresia mayor para la poblacin con mayor presin de explotacin. DISFUNCIONES REPRODUCTIVAS INVOLUCRADAS
ASPECTOS GENERALES

La atresia folicular se ha caracterizado como un proceso de degeneracin que pueden sufrir algunos oocitos durante su desarrollo (Nagahama 1983, 1994), el cual se incrementa en poblaciones de cultivo o silvestres sometidas a altos grados de explotacin o captura, pudiendo ser generado por distintas disfunciones o alteraciones reproductivas. Por ejemplo, en la especie Labeo victorianus (Boulenger, 1901), los investigadores Rutaisire y Booth (2004) examinaron 16

Varias especies de peces exhiben disfunciones reproductivas cuando son criadas en cautiverio. Comnmente, son fallas en hembras cerca de la maduracin final del oocito (FOM), ovulacin o desove (Zohar 1988,1989a, b, Peter y col 1993). Estas disfunciones probablemente resultan de la combinacin del estrs inducido por la cautividad (Sumpter

REPRODUCCIN DE PECES, OOGNESIS, FOLCULO OVRICO, ATRESIA FOLICULAR

y col 1994, Pankhurst y van der Kraak 1997) y la falta de un ambiente adecuado para el desove natural (Zohar 1989a, b, Yaron 1995, Battaglene y Selosse 1996, Ohta y col 1997). Los peces criados en cautividad generalmente exhiben un acelerado crecimiento y maduracin. Sin embargo, este ambiente puede fallar en proveer los cambios cclicos requeridos para completar el ciclo reproductivo (Linares-Casenave y col 2002). Los problemas reproductivos pueden ser clasificados en tres tipos: El primero y ms severo es ejemplificado por la anguila de agua dulce (Anguilla spp.), la cual experimenta una falla de la vitelognesis cuando es mantenida en cautiverio, lo que tambin ha sido observado en grupos de lisas (Mugil cephalus Linnaeus, 1758) mantenidas exclusivamente en agua salada en las cuales la vitelognesis se detiene en etapas muy tempranas (de Monbrison y col 1997). En el segundo tipo, la vitelognesis progresa normalmente, pero al principio de la temporada de desove los oocitos postvitelognicos fallan en la maduracin oocitaria final y ovulacin, convirtindose en atrsicos (Zanuy y Carrillo 1987, Tucker 1994, Berlinsky y col 1997, Larsson y col 1997, Mylonas y col 1997a, b). Este tipo de disfuncin es el problema reproductivo ms comn encontrado en pisciculturas (Mylonas y col 2010). Como lo observado en la especies Galaxias maculatus (Jenyns, 1842) y P. promelas. El tercer tipo corresponde a la ausencia de desove (puesta) al final del ciclo reproductivo. En especies que exhiben este problema, el oocito experimenta una vitelognesis, FOM y ovulacin normal en respuesta a los estmulos fisiolgicos y ambientales, pero los oocitos ovulados no son liberados (Zanuy y Carrillo 1987, Zohar y Mylonas 2001). Este tercer tipo es presentado en todas las especies salmondeas mantenidas en cultivo. Las disfunciones o alteraciones reproductivas pueden producirse debido a una serie de factores extrnsecos e intrnsecos (cuadro 1) alterados, conllevando as a la aparicin de atresia folicular: FACTORES EXTRNSECOS Factores externos como la temperatura, luz, salinidad y confinamiento juegan un papel preponderante en la maduracin, ovulacin y puesta, debido a su profunda influencia sobre la sensibilidad folicular, ya que se requieren seales ambientales precisas para su sincronizacin (Ekcstein 1975, Daettlaff y Davydova 1979, Sower y col 1982, Arantes y col 2010). La temperatura afecta el desarrollo gonadal a travs de la accin directa sobre la gametognesis, la secrecin de hormonas hipofisiarias, la tasa de depuracin hormonal, la respuesta del hgado a los estrgenos y, finalmente, sobre la respuesta de las gnadas a la estimulacin (Zanuy y Carrillo 1987), lo cual ha sido demostrado en estudios de atresia folicular inducida por temperatura en el esturin blanco (Acipenser transmontanus

Richardson, 1836), un actinopterigio no telesteo, donde hembras sometidas a medios con temperaturas mayores a las normales previo a la adquisicin de competencia maduracional han detenido su desarrollo ovrico con la consecuente aparicin posterior de atresia folicular (Linares-Casenave y col 2002). De manera similar, en la especie Gillichthys mirabilis (Cooper, 1864) la regresin gonadal es inducida en individuos sometidos a un rgimen trmico elevado por un periodo prolongado. En muchas especies, adems de temperaturas elevadas se requiere de fotoperodos de das cortos. Sin embargo, en especies de los gneros Bairdiella y Rhodeus basta un fotoperodo de das cortos para inducir la regresin gonadal (Zanuy y Carrillo 1987). Como se mencion anteriormente, la calidad espectral e intensidad luminosa tambin puede modificar la puesta. Se ha observado especies con un amplio espectro de respuesta y otras ms selectivas donde longitudes de ondas cortas estimulan la maduracin y ondas largas la inhiben (Lam 1983). La coincidencia existente entre niveles elevados de esteroides sexuales durante la recrudescencia gonadal y fotoperodos decrecientes posteriores al solsticio de verano ha dado lugar a la hiptesis que en los salmondeos los fotoperodos decrecientes disparan la maduracin gonadal (Billard y col 1978). Al contrario, en Notemigonus crysoleucas (Mitchill, 1814) la maduracin final de los oocitos y ovulacin slo se presenta en peces expuestos a regmenes de fotoperiodos largos y temperaturas elevadas. Cabe sealar que ambos factores por separado no fueron capaces de inducir la maduracin y ovulacin en dicha especie (de Vlaming 1975). En algunas especies se ha advertido que la melatonina induce la regresin o bloquea el desarrollo gonadal en peces que estn en las ltimas etapas de recrudescencia gonadal durante la primavera a fotoperodos cortos. Cabe sealar que la melatonina puede tener efectos anti o pro gonadotropos segn la hora del da en que es administrada. Adems, se conoce la existencia de influencia lunar sobre la estacin de puestas con la fase de vitelognesis iniciada, por lo que es previsible que dicha influencia est involucrada slo en las etapas finales del ciclo reproductor, como son la maduracin final, ovulacin y puesta (Zanuy y Carrillo 1987). En la shemaya (Chalcalburnus chalcoides Gldenstdt, 1772) se ha descrito la aparicin de atresia folicular posterior al desove y ocasionalmente durante la etapa de maduracin, presentndose en oocitos en cualquier etapa de desarrollo. Aparentemente, el estrs ambiental sera la principal causa de la atresia en esta especie (nver y nver Saraydin 2004). Otros factores que pueden afectar la gametognesis y puesta son la nutricin, el ambiente social tales como las feromonas, estmulos visuales y tctiles, corrientes de agua, oxgeno disuelto, presin baromtrica, contaminacin, radiacin, entre otros (Zanuy y Carrillo 1987, Leino y col 2005). 17

I VALDEBENITO Y COL

FACTORES INTRNSECOS Del mismo modo, se han investigado factores internos que pueden alterar el proceso de oognesis. Se ha observado que la presencia de la hormona madurativa en salmondeos presenta niveles ms elevados durante el periodo periovulatorio, mientras que durante la incorporacin activa de vitelo los niveles de esta hormona son ms bajos (Fostier y col 1982, Ng e Idler 1983). Experimentalmente, se ha visto la imposibilidad de inducir la maduracin en oocitos de la lubina (Dicentrarchus labrax Linnaeus, 1758) con ovarios en estado avanzado de vitelognesis, a pesar de ser inyectada con hCG (gonadotrofina corinica humana), demostrndose de esta forma que las hormonas de tipo madurativas son indispensables para que la maduracin y ovulacin se lleve a cabo. En peces tratados con un anticuerpo contra la gonadotrofina vitelognica (FSH) se observ la detencin de la vitelognesis con posterior aparicin de atresia folicular. Sin embargo, cuando se administraron anticuerpos contra la hormona madurativa no se observaron los efectos anteriores. Aparentemente, la seal que dispara irreversiblemente todo el proceso de maduracin y ovulacin en salmondeos es la cada de los niveles plasmticos de 17-estradiol, debido a una merma en la actividad de la aromatasa de la granulosa y por consiguiente la prdida de la retroalimentacin negativa de los esteroides sobre la secrecin de gonadotrofina, la que alcanzara niveles mximos (Zanuy y Carrillo 1987, Zeilinger y col 2009). En la carpita cabezona (P. promelas) se estudiaron las disrupciones endocrinas y cambios gonadales inducidos por qumicos. Los agonistas de receptores de estrgenos provocaron un aumento en la incidencia de atresia folicular, probablemente debido a que altos niveles de vitelogenina interfieren con la maduracin final. Sin embargo, agonistas ms dbiles como el Methoxychlor incrementaron la incidencia de atresia, pero slo en algunas hembras. En el caso de los agonistas de receptores de andrgenos, estos incrementaron la atresia en folculos preovulatorios, muchos de los cuales adquirieron una apariencia inusual en su deposicin de vitelo, la cual se vio disminuida en relacin al tamao del oocito. Los antagonistas de andrgenos como Flutamine aumentaron la incidencia de folculos en desarrollo temprano y folculos atrsicos. Observaciones similares se describieron para inhibidores del metabolismo esteroide (Leino y col 2005).
CARACTERSTICAS DE LA ATRESIA FOLICULAR

Figura 4. Folculo atrsico de puye (Galaxias maculatus). CE cpsula externa; CR corion; VR vitelo en reabsorcin. Barra = 50 m (40x). Atretic follicle of puye (Galaxias maculatus). CE external capsule; CR chorion; VR yolk in reabsorption. Scale bar = 50 m (40x).

Morfolgicamente la atresia folicular comienza con la ruptura y vacuolizacin del corion (Santos y col 2008), adems de la disolucin de la membrana nuclear. Segn el grado de desarrollo alcanzado por el oocito, su contenido de vitelo tambin ser reabsorbido por fagocitosis desde las clulas de la granulosa (figura 4). La atresia folicular involucra la hipertrofia de las clulas de la 18

granulosa y posiblemente las clulas tecales (Nagahama 1983, Linares-Casenave y col 2002). Durante la atresia temprana las clulas de la granulosa remueven la cubierta del huevo y los contenidos oocitarios por digestin lisosomal y las clulas tecales son infiltradas por linfocitos (Linares-Casenave y col 2002). Esta puede presentarse en cualquier momento del desarrollo oocitario (Leonardo y col 2006, Ganias y col 2008), aunque lo ms comn es que aparezca en las fases de vitelognesis y preovulatoria (Bromage y Cumaranatunga 1988). Desafortunadamente, los mecanismos que regulan la atresia folicular no estn debidamente entendidos (Santos y col 2008), as como sus cambios estructurales, ultraestructurales y su correlacin con cambios bioqumicos a nivel plasmtico (LinaresCasenave y col 2002, Rutaisire y Booth 2004). La atresia folicular y en algunos casos la aparicin de necrosis estn relacionadas con cambios patolgicos debidos a afecciones sanitarias o condiciones degenerativas normales acompaados de cambios estacionales en la actividad gonadal (Takashima e Hibiya 1995). Los oocitos atrsicos (corpora atretica preovulatoria) son una caracterstica muy comn del ovario de los telesteos (Ball 1960, Saidapur 1978), los cuales pueden presentarse tanto en peces de vida silvestre como en cautiverio (Leonardo y col 2006). Este proceso de degeneracin se puede presentar particularmente bajo situaciones de estrs (Santos y col 2008) y condiciones ambientales adversas, especialmente en peces en cautiverio (Ball 1960, Linares-Casenave y col 2002). Como se mencion, la presencia de ciertos contaminantes en el agua se han relacionado con la aparicin de atresia folicular (Takashima e Hibiya 1995, Leino y col 2005), as como con alteraciones macroscpicas anormales en la morfologa gonadal e inhibicin de la oognesis, adems de tumores ovricos espontneos o qumicamente

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inducidos, tales como cistadenomas, fibromas, adenomas y linfosarcomas (Takashima e Hibiya 1995). Los folculos atrsicos han sido descritos como un sitio de biosntesis de esteroides en los telesteos debido a su apariencia glandular (Ball 1960, Hoar 1969, Browning 1973). Sin embargo, en especies como el esturin blanco (A. transmontanus) se ha concluido que no existe evidencia morfolgica de sntesis de hormonas en stos (LinaresCasenave y col 2002, Leonardo y col 2006). Pruebas histoqumicas han fallado en demostrar cualquier actividad enzimtica esteroidognica, as como en la deteccin de progesterona, testosterona y 17-estradiol en folculos atrsicos incubados con gonadotrofinas. Actualmente, diversos autores postulan que los folculos atrsicos estn asociados slo con degeneracin y reabsorcin de vitelo (Nagahama 1983). Sin importar la razn por la cual los oocitos son reabsorbidos por el organismo, las especies en que se describe atresia folicular comparten un patrn comn a nivel ultraestrutural, ya que todos los elementos constitutivos del folculo ovrico son reabsorbidos (teca externa, teca interna, clulas foliculares, corion y oocitos). Los grnulos de vitelo, en el caso de estar presentes, pierden su individualidad, constituyendo una masa amorfa acidfila. La apariencia de los folculos atrsicos se caracteriza por la carencia de una forma definida, presentando vacuolas y pequeas escamas u hojuelas amarillentas (Honji y col 2006). CLASIFICACIN DE LA ATRESIA FOLICULAR Diversos autores han caracterizado y dividido el proceso de atresia folicular en distintas etapas segn la especie estudiada, no existiendo unificacin en su nomenclatura (Rutaisire y Booth 2004). Sin embargo, algunos investigadores han dividido la atresia folicular de los telesteos en cuatro etapas consecutivas de acuerdo a la descripcin al microscopio ptico de Bretschneider y Duyvene de Wit (1947) en Rhodeus amarus (Bloch 1782). Otros autores como Vizziano y Beroi (1990) clasifican los folculos atrsicos como hipertrficos y no hipertrficos, correspondiendo a las fases de proliferacin de clulas foliculares y reduccin del tamao del oocito, respectivamente (Uribe y col 2006). Khoo (1975) entrega una descripcin detallada de los cambios histolgicos de la atresia folicular en el goldfish despus de realizada su hipofisectoma, clasificndola en cinco etapas consecutivas: alfa (), beta (), gamma (), delta () y psilon (). Para mayores detalles, se recomienda revisar el trabajo de este autor. La atresia observada por Tricas e Hiramoto (1989) en Chaetodon multicinctus (Garrett 1863) es cualitativamente similar a la descrita en otras especies, los oocitos vitelognicos que presentan su desarrollo detenido, muestran distintas etapas degenerativas de atresia:

Alfa: Caracterizada por ondulaciones del corion, disrupcin nuclear, quiebre temprano de glbulos de vitelo e hipertrofia de clulas de la granulosa. Beta: Las clulas de la granulosa migran y fagocitan el vitelo. Las clulas de la teca no son observadas invadiendo el interior del oocito. El final de la atresia beta es caracterizada por la completa desintegracin del corion. Gamma: La reabsorcin del contenido oocitario contina durante esta etapa, hasta la reabsorcin completa del contenido. Se presentan folculos pequeos y de aspecto irregular (posibles clulas luteales) de coloracin amarillonaranjo con tincin HyE. Las clulas tecales del folculo todava rodean el oocito remanente. Delta: Es caracterizada por la presencia de componentes residuales despus de la reabsorcin de vitelo y citoplasma. psilon: Algunos autores han postulado que en esta etapa clulas del cuerpo lteo se podran diferenciar en nuevas clulas oogoniales (Khoo 1975). En estudios del ningu (L. victorianus), los autores Rutaisire y Booth (2004) clasifican la atresia folicular en tres tipos, segn las caractersticas histolgicas observadas: a) Caracterizada por la rpida fragmentacin del corion y disolucin del contenido citoplasmtico, observndose oocitos liquefactos adems de una disminucin de stos. Este tipo de atresia es ms comn en oocitos terciarios de ovarios desovados exitosamente. b) Fue observada en oocitos en estado de vescula de vitelo II, estando determinada por el quiebre de los glbulos vitelinos en grnulos ms pequeos, acompaado de degeneracin vacuolar del citoplasma con un corion intacto, no se observaron signos de fagocitosis. La presencia de atresia tipo II, generalmente est relacionada con una falla o interrupcin en el desove, teniendo esta una alta prevalencia en el estudio conducido por Rutaisire y Booth (2004). Sin embargo, en este tipo de atresia el ovario reabsorbi activamente los oocitos maduros para facilitar la recrudescencia gonadal. c) Fue encontrada en baja frecuencia y slo en oocitos previtelognicos, caracterizndose por una degeneracin de los oocitos debido a una tumefaccin celular poco ntida al microscopio ptico, no se observ la invasin y fagocitosis de los folculos a diferencia de lo descrito para otras especies.
DESCRIPCIONES DE LA ATRESIA FOLICULAR EN PECES

En el esturin blanco (A. transmontanus) en una primera etapa se inicia la degeneracin del corion, lo que 19

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se manifiesta por la desaparicin de sus estriaciones. A diferencia de otras especies se observan agregaciones de material nuclear en el citoplasma de folculos atrsicos tempranos. La corteza citoplasmtica aparece desorganizada con agregaciones densas de grnulos de glicgeno y algunos glbulos de lpidos se fusionan incrementando su tamao. La lmina basal permanece intacta a pesar de la fagocitosis sufrida por el corion. En una etapa intermedia se produce la digestin del corion y la capa tecal aparece vascularizada e incrementada en su espesor con una lmina basal an intacta. A medida que la etapa intermedia progresa, la lmina basal se degenera y las plaquetas de vitelo y gotas lipdicas son fagocitadas. Este cuerpo atrsico permanece encapsulado por una capa celular vascularizada. Posteriormente, en una etapa avanzada de la atresia las clulas fagocticas compartimentalizan el citoplasma. Durante esta fase las plaquetas de vitelo desaparecen, aunque los lpidos e inclusiones de pigmentos permanecen por un tiempo prolongado. Los cuerpos atrsicos multicelulares formados en esta ltima etapa persisten en el ovario por muchos meses, exhibiendo una reduccin gradual en el tamao celular y concomitantemente una acumulacin de pigmento oscuro. Las observaciones indican que la sensibilidad a la temperatura ocurrira en la oognesis tarda, durante el periodo de sntesis de protenas requeridas para que el oocito adquiera su competencia maduracional. Las etapas tempranas e intermedias de la atresia transcurren bastante rpido, la ltima etapa puede durar hasta ms de cinco meses a temperaturas elevadas en esta especie (Linares-Casenave y col 2002). Se postula que las clulas foliculares poseen la habilidad de adquirir caractersticas fagocitarias, lo que ha sido observado durante la fagocitosis de folculos atrsicos en algunos peces. Histolgicamente se ha caracterizado por reas de tincin color marrn con HyE (Rutaisire y Booth 2004). Sin embargo, en el esturin blanco (A. transmontanus) las clulas transformadas de la granulosa slo aparecen en la fase inicial de digestin del oocito. En este mismo estudio las clulas tecales aparecen involucradas en los principales cambios fibrticos del folculo, los que resultan en la formacin de una densa cpsula alrededor del cuerpo atrsico sin participar en la fagocitosis. El destino del pigmento de melanina del oocito y el origen del pigmento oscuro en folculos atrsicos no est claro. Estas observaciones han sido descritas en muchos estudios de telesteos y anfibios. Pareciera ser que estos pigmentos estn asociados a fagocitosis del oocito y degeneracin de clulas fagocticas en cuerpos atrsicos avanzados (Linares-Casenave y col 2002). En algunas especies como la trucha arco iris se ha observado atresia vinculada a apoptosis en folculos preovulatorios (Wood y van der Kraak 2001), pero no ha sido descrito en el esturin blanco. Cabe sealar que en las ltimas etapas de atresia los cuerpos atrsicos compuestos de masas de 20

clulas experimentan una reduccin en su tamao debido a una baja en el nmero de clulas, sugiriendo la apoptosis de clulas transformadas de la granulosa, lo que podra jugar un rol durante las ltimas etapas de la atresia folicular en el esturin blanco (Linares-Casenave y col 2002). En la sardina ibrica (Sardina pilchardus Walbaum 1792) se ha descrito la separacin de los folculos atrsicos preovulatorios tardos del epitelio, los cuales se concentran en la parte central de las laminillas ovgeras (Ganias y col 2007). Este patrn tambin ha sido observado en otros peces como la lisa (M. cephalus) por los autores McDonough y col (2005). Los folculos atrsicos tardos permanecen en el ovario por largos periodos, extendindose incluso hasta la prxima temporada de desove. Esta separacin del epitelio laminar constituye un mecanismo para administrar el espacio disponible para los nuevos oocitos de la prxima temporada de desove (Ganias y col 2007). A nivel histolgico la atresia folicular tarda puede ser confundida con los folculos postovulatorios (POFs) de ms de 24 horas (Macchi y col 2003, Ganias y col 2007). La duracin de la degeneracin de los folculos postovulatorios vara segn la especie, desde menos de un da hasta ms de una semana. Histolgicamente estas pueden diferenciarse debido a que durante todas las etapas de la atresia folicular, el folculo est cercado dentro de estructuras celulares. Por el contrario, los POFs siempre conservan una abertura hacia el lumen ovrico y no son separados del epitelio de las laminillas, mantenindose en el epitelio hasta completar su reabsorcin (Ganias y col 2007). En la carpita cabezona (P. promelas) el inicio de la atresia folicular est dada por el quiebre o aberturas del corion, posteriormente el ncleo y el material vitelino inician su degeneracin, provocando la reabsorcin del vitelo, lo que se distingue por una dbil tincin del folculo. Leino y col (2005) reportaron la aparicin de altos niveles de atresia folicular en tres gnadas de un total de veintisiete, la cual se present principalmente en folculos maduros, lo que indicara que estas hembras perdieron su oportunidad para desovar. En cultivos experimentales de carpita cabezona (P. promelas) la incidencia de atresia es relativamente baja (Jensen y col 2001, Leino y col 2005), oscilando entre 1,6% a 4,6% en algunos experimentos (Leino y col 2005). En el bagre rayado (Pseudoplatystoma fasciatum Linnaeus 1766), un pez migrador de los ros sudamericanos, se observ la aparicin de procesos de degeneracin ovricos cuando stos fueron mantenidos en confinamiento y no se indujo su reproduccin durante un experimento controlado, en el cual se dividi la poblacin en grupos que fueron muestreados histolgicamente a lo largo de un periodo de tiempo. En el primer grupo se encontraron oocitos en diferentes etapas de desarrollo. La atresia observada se caracteriz de forma similar a la encontrada en otras especies por hipertrofia de las clulas foliculares,

reproduccin de peces, oognesis, folculo ovrico, atresia folicular

corrugacin del corion y algunas vacuolas en el ooplasma perifrico. en el segundo grupo los ovarios presentaban gran cantidad de oocitos alterados, alrededor de un 10% ms que en la etapa previa. Microscpicamente estos presentaban la prdida de su forma redondeada, mostrando desorganizacin nuclear y citoplasmtica. su ncleo se present ligeramente excntrico y a nivel citoplasmtico se observaron grandes cantidades de grnulos de diferentes tamaos. las clulas foliculares presentaban una hipertrofia severa, penetrando los alrededores del interior oocitario y grnulos de vitelo emergan entre las clulas foliculares. el corion estaba altamente corrugado y roto. en el tercer y cuarto grupo los ovarios contenan gran cantidad de oocitos perinucleares y pocos oocitos atrsicos, los cuales posean un corion corrugado y en muchos casos completamente desintegrado. la mayor parte de los grnulos de vitelo estaban desintegrados y slo una pequea cantidad de vitelo permaneca en el centro del oocito. esta etapa final marc la completa degeneracin oocitaria, con presencia de fagocitosis y vasos sanguneos. los eventos morfolgicos observados son similares a los descritos en otras especies de peces de agua dulce nativas del Brasil. los primeros signos de atresia ovrica y folicular aparecieron a finales de enero, coincidiendo con la cada en los valores de la temperatura del agua, das ms cortos y disminucin en las lluvias, lo que supondra que el estrs ambiental induce la atresia folicular en el caso de esta especie (leonardo y col 2006). por otra parte, en la lubina (D. labrax) Zanuy y col (1995) observaron un mayor nmero de oocitos atrsicos en individuos mantenidos en un fotoperiodo de das largos constantes y un rgimen trmico alterado respecto al grupo control bajo condiciones naturales de luz y temperatura. en la anguila de pantano (Synbranchus marmoratus Bloch 1795) el inicio de la atresia puede ser detectado por cambios en las clulas foliculares, las cuales modifican su apariencia de planas o cuboidales a una apariencia cilndrica y vacuolada. estas ltimas participaran de forma activa en el proceso de fagocitosis agrupndose en masas epitelioides en etapas avanzadas de fagocitosis. estas estructuras atrsicas muestran una intensa fluorescencia bajo luz ultravioleta (uv). al final del proceso, las clulas fagocticas, granulocitos degenerativos y remanentes foliculares permanecen juntos formando una estructura heterognea compacta (ravaglia y Maggese 2002). en el huaiquil (Micropogonias furnieri desmarest, 1823) se han registrado incrementos en los porcentajes de atresia folicular, en poblaciones del estuario del ro de la plata, en las cuales se observ un incremento en la atresia folicular, variando desde un 20% durante la primera temporada reproductiva hasta un 60% en la segunda temporada (Macchi y col 2003). adems, se observ un aumento en la presencia de oocitos atrsicos a medida que la temporada de desove progresaba, lo que

coincide con lo descrito por valdebenito y col (1995) en poblaciones de esta especie del lago Budi en el sur de chile. los altos niveles de atresia han sido usados para establecer el final del desove en esta especie (Macchi y col 2003). en poblaciones silvestres de sardina monterrey (sardina espaola) (Sardinops sagax Jenyns 1842) se estimaron los porcentajes de atresia folicular, concluyndose que un 2% puede ser considerado normal. sin embargo, al final de la temporada este porcentaje se eleva a un 5%, lo que indica el final del mximo de puesta, aunque se ha descrito la reabsorcin generalizada de los oocitos. cuando sobre el 50% de los oocitos es afectado se denomina atresia mayor, lo que generalmente coincide con el final de la temporada de desove. una vez alcanzado este nivel de reabsorcin, se reduce la probabilidad que estas hembras desoven nuevamente. el proceso de atresia mayor es una problemtica poco estudiada en poblaciones silvestres. en la sardina monterrey la atresia puede presentarse en oocitos durante los primeros estadios de desarrollo hasta en oocitos previos al desove. las posibles causas de atresia mayor se han vinculado con condiciones de baja temperatura, problemas nutricionales, hacinamiento y contaminantes. establecer las causas de la interrupcin del desarrollo ovrico es difcil. sin embargo, se ha relacionado la atresia de folculos con vitelo en sardinas adultas con condiciones o cambios ambientales que puedan interrumpir la puesta (torres-villegas y col 2007). en el caso de la lubina (D. labrax) Zanuy y col (1995) demostraron que una manipulacin inadecuada del fotoperiodo y la temperatura para alterar la poca de puestas, indujo una atresia generalizada dando lugar a una drstica disminucin de la fecundidad. en la sardina monterrey (S. sagax) la aparicin de atresia en oocitos sin vitelo se asocia a factores de condicin corporal subptimos, lo que sugiere un efecto ambiental a largo plazo e inanicin prolongada, ya que esta atresia se present principalmente en peces pequeos. el anlisis histolgico de la atresia folicular revel una alta incidencia en el porcentaje de atresia de oocitos en estado de alvolo cortical desde el inicio de la temporada reproductiva, observndose tambin atresia alfa y beta sin vitelo. Hacia finales de invierno e inicio de primavera se observ la presencia de atresia mayor en el 90% de las hembras, coincidiendo con el mximo de puesta de la temporada reproductiva, adems de observarse atresia en oocitos en vitelognesis avanzada (torres-villegas y col 2007). en algunos peces pelgicos la frecuencia de atresia es alta de forma normal, alcanzando valores cercanos al 20% en especies como Trachurus trachurus (linnaeus 1758) (torres-villegas y col 2007). lee y Yang (2002) observaron la aparicin de atresia folicular en alrededor de un 60% en la especie Lateolabrax maculatus (Mcclelland, 1844), la cual fue capturada desde un ambiente silvestre y posteriormente mantenida a una temperatura y horas de 21

i valdeBenito Y col

luz constantes, la atresia fue vinculada a una disminucin de la temperatura. se ha postulado a la atresia como un mecanismo de reciclaje que permite recuperar componentes y energa de oocitos que no alcanzaron su desarrollo (uribe y col 2006). sin embargo, algunos autores postulan que la atresia slo se tratara de un proceso de apoptosis (torres-villegas y col 2007). aparentemente, el proceso de atresia se presenta como una va alternativa dentro del desarrollo del ciclo ovrico en peces, permitiendo la creacin de un ambiente tisular ptimo a nivel gonadal para las futuras temporadas reproductivas. sin embargo, este proceso se puede presentar de dos formas: Normal, con reabsorcin activa de todos los constituyentes foliculares por parte de clulas especializadas del folculo y estructuras ovricas adyacentes, la que se puede presentar en cualquier etapa del desarrollo oocitario, con vacuolizacin y licuefaccin del vitelo en estados ms avanzados. Patolgica donde no ocurre reabsorcin del contenido oocitario, la que de forma general se presenta en oocitos durante etapas de desarrollo avanzado posteriores a la vitelognesis, produciendo un endurecimiento irreversible del vitelo que puede hipertrofiar el ovario y causar finalmente la muerte de la hembra. esta atresia patolgica se ha presentado con frecuencia en especies como el puye (G. maculatus) en poblaciones sometidas al estrs estando bajo condiciones de cultivo experimental. en dicha especie, los ovarios presentan un gran aumento de volumen, rompiendo incluso la pared abdominal en casos extremos, mostrndose duros al corte, lo que

indicara una alta presencia de minerales. las causas de la atresia patolgica en esta especie son an desconocidas. sin embargo, su incidencia es mayor en grupos mantenidos con fotoperiodos alterados, presentndose como un proceso crnico, donde aparentemente estaran involucrados procesos fisiolgicos alterados del pez, tales como alteraciones inmunolgicas o del balance mineral, dadas las caractersticas gonadales observadas (cuadro 2). este tipo de atresia ha sido descrita por Mitchell (1989) para poblaciones neozelandesas de la misma especie bajo cultivo experimental y en especies no telesteas como el esturin (ruban y col 2006). conclusiones la atresia folicular es un proceso multifuncional, donde los estmulos ambientales aparecen como los ms relevantes y ms especficamente los que hacen referencia al fotoperiodo y la temperatura. los cambios histolgicos de la atresia a nivel folicular son muy similares entre las distintas especies estudiadas, por lo que la descripcin de los caracteres antomo-histolgicos de la atresia folicular realizados por diferentes autores no presenta grandes variaciones. a pesar de esto, no existe una nomenclatura clara para la descripcin del proceso de atresia folicular. la atresia folicular normal se presenta como un proceso estratgico establecido dentro del ciclo de desarrollo gonadal de diversas especies, el cual permite un reciclaje energtico bajo condiciones adversas. sin embargo, este proceso puede verse alterado en algunas especies.

Cuadro 2. caractersticas generales de los tipos de atresia folicular en peces.

general characteristics of atresia types in fish.

parmetro evaluado etapa del desarrollo folicular ovulacin tamao ovrico consistencia ovrica condiciones ambientales ocurrencia prevalencia estado del vitelo reabsorcin factores causantes comprometidos

atresia normal cualquier etapa del desarrollo folicular presente, aunque puede variar (atresia mayor) normal tejido normal, relativa laxitud tanto en vida silvestre, como en condiciones de cultivo generalmente al final del ciclo reproductivo variable, segn etapa de la estacin reproductiva licuefacto con presencia de vacuolas activa por fagocitosis y/o apoptosis extrnsecos, relacionados con estmulos ambientales

atresia patolgica etapas avanzadas (vitelognesis en adelante) ausente, todos los folculos comprometidos aumentado de volumen duro, firme al corte, probablemente mineralizado condiciones de cultivo controlado cualquier momento del ciclo reproductivo alta en algunas cohortes endurecido ausente extrnsecos e intrnsecos

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REPRODUCCIN DE PECES, OOGNESIS, FOLCULO OVRICO, ATRESIA FOLICULAR

La atresia folicular patolgica afecta a individuos con alto nivel de estrs, en los cuales debido a factores internos no pueden mantener una adecuada homeostasis de sus procesos fisiolgicos, lo que altera la ovognesis en cualquiera de sus etapas, pudiendo llevar a la muerte de la hembra si el proceso se detiene durante la etapa final de desarrollo del oocito. RESUMEN
Muchas especies de peces de importancia econmica han sido intensamente explotadas, provocando el colapso de sus pesqueras. Por este motivo, en algunas de estas especies se han hecho intentos por lograr cultivar individuos con fines comerciales, obteniendo relativo xito. Se ha observado que cuando algunas especies son mantenidas en cautiverio o bajo intensa presin de explotacin en su medio natural presentan disfunciones reproductivas que conducen a la aparicin de atresia folicular. Este es un proceso poco estudiado en peces y la caracterizacin realizada por varios autores, arroja diferencias de criterios y nomenclatura que dificultan an ms su comprensin. El objetivo de la presente investigacin es realizar una revisin bibliogrfica de la atresia folicular en peces y contribuir a su comprensin y estudio. La atresia folicular es un proceso degenerativo observado en algunos oocitos en cualquier momento de su desarrollo. La aparicin de atresia folicular se ha relacionado con condiciones degenerativas normales debido a cambios estacionales en la actividad gonadal, afecciones sanitarias, o bien, a condiciones de manejo inadecuadas en peces mantenidos en cultivo. Este proceso se ha postulado como un mecanismo que permite reciclar componentes y energa. Sin embargo, en especies como el puye (Galaxias maculatus), la trucha garganta cortada (Salmo clarki), entre otras, se ha observado la presencia de una atresia folicular con caractersticas patolgicas, en la cual la reabsorcin del vitelo no ocurre, causando el endurecimiento de los folculos ms desarrollados, lo que puede conducir finalmente a la muerte de la hembra.

AGRADECIMIENTOS
Se agradece el apoyo del proyecto FONDEF D06I1020 y a la Direccin de Investigacin de la Universidad Catlica de Temuco a travs del proyecto DGIUCTemuco N 2007-DGI-CDA-05. Adems, al Dr. Manuel Carrillo por la revisin y observaciones al manuscrito, y al Dr. Adrin Hernndez en la correccin del resumen en ingls.

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Arch Med Vet 43, 27-34 (2011) ARTCULO ORIGINAL

Evaluacin de la respuesta clnico-patolgica e inmune humoral en cras de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente con el virus de la Necrosis Pancretica Infecciosa (IPNV)
Evaluation of the clinical-pathological and humoral immune response in rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) experimentally infected with Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV)
LF Vegaa, R Montes de Ocaa, B Valladaresa, S Martnez-Castaedaa, U Alonsoa, R Enrquezb, C Ortegaa*
aCentro

de Investigacin y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autnoma del Estado de Mxico, Mxico. bLaboratorio de Biotecnologa Acutica, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Chile.

SUMMARY The aim of this study was to assess the relationship between the clinical-pathologic process in rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) infected with infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) and the immunoglobulin M (IgM) levels in blood serum. Parameters were evaluated up to 45 days post infection (dpi) in fish intraperitoneally inoculated (IP) with 1X104 TCDI of IPNV, with minimal essential medium (MEM) and in the control group. Infected fish showed classical signs of infectious pancreatic necrosis (IPN) disease since day 19 pi, reaching 70% of accumulated mortality, and the survivor fish showed emaciation and IgM blood serum levels which progressively increased up to its maximum peak at day 31 pi; the most significant histopathological changes were the increase in melanomacrophage centers in the kidney, pancreatic necrosis and catarrhal enteritis. Viral isolation was possible only in the infected fish starting at day 3 pi up to day 45 (P > 0.5). The results suggest that even though the fish infected with IPNV can develop a humoral immune response characterized by the increase in IgM levels, this is insufficient to develop protection because while IgM levels are increasing, so does the viral title accompanied by clinical signs and histopathological injuries that are typical of the disease. Palabras clave: IPNV, IgM, virus, respuesta inmune. Key words: IPNV, IgM, virus, immune response.

INTRODUCCIN El virus de la Necrosis Pancretica Infecciosa (IPNV), virus prototipo de la familia Birnaviridae, ocasiona una enfermedad sistmica aguda altamente contagiosa, usualmente letal para salmnidos jvenes menores a 1.500 grados/da. Los animales que sobreviven a brotes de enfermedad o que se infectan de forma subclnica se convierten en portadores, perpetuando el riesgo de infeccin (Wolf 1988, Rodrguez y col 2001). En Mxico, la presencia de IPNV fue confirmada en cras de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) importadas como ovas ojo desde Norteamrica, creando una situacin de emergencia para la produccin de trucha en el pas (Ortega y col 2002). El cuadro clnico patolgico tpico de la enfermedad se presenta en cras de primera alimentacin, caracterizado por mortalidad sbita y elevada, natacin lenta y errtica, hiperpigmentacin cutnea, severa distensin abdominal, presencia de pseudofecas, exoftalmia y branquias plidas

Aceptado: 20.10.2010. * cortegas@uaemex.mx

(McKnight y Roberts 1976, Wolf 1998). A la necropsia, la cavidad celmica suele presentar ascitis, pncreas y grasa abdominal presentan petequias multifocales, y en general los rganos internos muestran coloracin plida (Roberts y Pearson 2005, Smail y col 2006). El desarrollo de una respuesta inmune especfica contra IPNV a travs de la produccin de anticuerpos neutralizantes especficos de tipo IgM contra las protenas virales VP2 y VP3 ha sido demostrada en peces inmunizados con virus inactivo y durante la infeccin con virus activo (Jarp y col 1996). Imajoh y col (2005) observaron nivel mximo de anticuerpos neutralizantes a 21 dpi, en aparente asociacin con la disminucin del ttulo viral; sin embargo, un ttulo alto de anticuerpos no siempre garantiza disminucin de la carga viral, y en peces que actan como portadores se ha observado que el virus contina replicndose ante la incapacidad de los anticuerpos para controlar la infeccin (Yamamoto 1975). Esta situacin aparentemente est influida por factores como la edad de los peces, temperatura, forma de presentacin y el tipo de antgeno (Ogut 2004, Park y Reno 2005, Ortega y Enrquez 2007). No obstante, poco se conoce sobre la relacin existente entre la manifestacin clnico-patolgica y el nivel de respuesta inmunitaria ocasionada por la infeccin. Este trabajo tiene por objetivo determinar el nivel de anticuerpos 27

LF VEGA Y COL

especficos (IgM) y describir el cuadro clnico y lesiones histopatolgicas desarrolladas por cras de trucha arco iris sometidas a una infeccin experimental. MATERIALES Y MTODOS Virus. Para el estudio se utiliz el virus obtenido en Mxico el ao 2000, tipificado como VR-299 (Ortega y col 2002); el virus fue replicado a 15 C en botella de 25 cm3 conteniendo clulas CHSE-214 (Chinook salmon embryo) propagadas en minimal essential Medium (MEM) suplementado con 2% de suero fetal bovino (SFB), adicionado con 10.000 UI/mL de penicilina G sdica y 100 L de sulfato de estreptomicina por mL (Gibco, USA). Despus de expresar efecto citoptico (CPE), la botella se congel y descongel en dos ocasiones, el contenido se cosech y centrifug a 559 x g durante 10 min a 4 C. El ttulo viral se determin por el mtodo de Reed y Muench (1938), y finalmente se calcul la dosis infectiva en cultivo de tejido a un ttulo de 1x104 TCID50/mL. Peces. Cras de trucha arco iris de 500 unidades trmicas acumuladas (UTA), 4,5 cm de longitud y 1,5 g de peso obtenidas de una piscicultura libre de IPNV fueron mantenidas en adaptacin en estanques de fibra de vidrio de 200 L de agua en recirculacin con los siguientes parmetros fisicoqumicos: temperatura 17 C, dureza 200 mg/L, alcalinidad 120 mg/L, oxgeno 8,0 ppm, amonio 0,1 ppm, nitratos 0,01 ppm y pH 7,5. Previo al experimento, se realiz un estudio sanitario para descartar que los peces fuesen portadores de agentes infecciosos, particularmente confirmar su condicin sanitaria de libres de IPNV (OIE 2005). Grupos experimentales. Los peces fueron distribuidos en tres grupos de 300 individuos cada uno y luego de ser anestesiados con 100 mg/L de p-aminobenzoate ([BZ20] Veterqumica, Santiago de Chile), el grupo I (GI) fue inoculado por va intraperitoneal (IP) con 0,2 mL de solucin viral a concentracin de 1x104 TCDI50/mL. El grupo II (GII) fue nicamente inoculado con MEM con 2% de SFB; mientras que el grupo III (GIII) no fue inoculado. Los peces fueron sometidos a las mismas condiciones de manejo, mantenidos en constante aireacin y alimentados con dieta comercial en proporcin de 1% de biomasa (Pedregal Toluca, Mxico); los signos clnicos y mortalidad se registraron diariamente; el agua de los estanques sufri una tasa de recambio de 25% por semana. Recuperacin de muestras. A los 0, 3, 5, 7, 10, 15, 31 y 45 dpi quince peces de cada grupo fueron sacrificados por sobredosis de anestesia con 100 mg/L de p-aminobenzoate (Veterqumica, Santiago de Chile). Luego de su decapitacin, la sangre fue colectada en viales de 0,5 mL y centrifugada a 358 x g a 4 C durante 30 min; el suero obtenido se congel a -70 C hasta su uso. Para el reaislamiento 28

viral, aproximadamente 1 mL de pool de tejido renal, esplnico y ciegos pilricos se deposit en tubo Falcon, conteniendo 9 mL de MEM con 2% de SFB (proporcin 1:9 peso/volumen). La muestra se macer y centrifug a 559xg por 15 min a 10 C y el sobrenadante obtenido fue conservado a 4 C hasta su uso. Aislamiento e identificacin de IPNV. Clulas CHSE-214 en MEM con 10% de SFB fueron sembradas en placas de poliestireno de 24 pocillos (NunClon) y al tener un 90% de confluencia se inocularon con 100 L del sobrenadante diluido 1:10 y 1:100. Despus de permitir la adsorcin por una hora a 15 C, las clulas recibieron un mL de MEM con 2% de SFB y se incubaron a 15 C durante 7 das; las clulas que manifestaron efecto citoptico (CPE) fueron sometidas a inmunofluorescencia indirecta (IFAT) especfica para IPNV mediante el Kit IPNV-FluoroTest Indirecto (Bios Chile, Ingeniera Gentica S.A. Chile). Para el anlisis histopatolgico, peces decapitados se colocaron en formol al 10% tamponado a pH 7,0 y posteriormente se procesaron para tincin de hematoxilina y eosina (H-E). Para evaluar las lesiones en rin, hgado, intestino y pncreas se utiliz la escala: 0 = ausencia de lesin, 1 = lesin leve, 2 = lesin moderada y 3 = lesin severa. Deteccin de IgM. Placas de ELISA fondo plano de 96 pocillos (NunClon) fueron cubiertas con 100 L de una solucin viral con 1X104 UPF en solucin amortiguadora de carbonato y bicarbonato de sodio pH 9,6. La placa se incub durante 12 h a 4 C y se lav con solucin amortiguadora Trisma base, cloruro de sodio y Tween 20 pH 7,3; posteriormente, se bloquearon los sitios de unin inespecficos mediante incubacin en una solucin de albmina srica bovina (Sigma) al 1% (p/v) por 2 h a 22 C; la placa se lav en tres ocasiones y finalmente se adicionaron 100 L de diluciones del suero y se incub por 12 h a 4 C. Se retir el excedente y la placa se lav cinco veces antes de agregar en cada pozo 100 L de IgM antisalmn elaborada en ratn (Donada por la Dra. Alexandra Adams del Institute of Aquaculture, University of Stirling, Escocia), se incub por 60 min a 22 C, despus de lo cual el excedente se retir y nuevamente la placa fue lavada para finalmente adicionar el anticuerpo secundario IgG antirratn marcado con peroxidasa a una dilucin de 1:10.000, incubndose nuevamente durante 60 min a 22 C. Despus de cinco lavados, a cada pocillo se agregaron 100L del cromgeno en una solucin amortiguadora Trizma base (Sigma-Aldrich; Mxico), cloruro de Sodio (J.T. Baker, Estado de Mxico, Mxico), timerosal (Merck, Naucalpan, Estado de Mxico, Mxico), tween 20 (Merck, Naucalpan, Estado de Mxico, Mxico), albmina srica bovina al 1%, pH de 7,3, y se incub por 10 min a 22 C. La reaccin fue detenida por adicin de solucin de cido sulfhdrico (Merck, Naucalpan, Estado de Mxico, Mxico) 2M y se efectu la lectura en lector de ELISA modelo 680 (Bio-Rad Laboratorios, California, USA) a 450 nm.

IPNV, IgM, VIRUS, RESPUESTA INMUNE

Anlisis de datos. Los valores de datos correspondientes a los signos clnicos, mortalidad, lesiones histopatolgicas y aislamiento viral fueron analizados por medio de frecuencias presentadas en tablas y grficas. El nivel de IgM (DO) se evalu a travs de anlisis de varianza y comparacin de medias utilizando el software estadstico GraphPad Prism 5. RESULTADOS
SIGNOS CLNICOS

La signologa clnica tpicamente asociada a la infeccin por IPNV nicamente estuvo presente en peces del grupo GI (figuras 1a-d), en los que el oscurecimiento de piel se manifest inicialmente en el 25% de la poblacin a los 2 dpi, disminuyendo paulatinamente hasta los 9 das; sin embargo, el oscurecimiento afect al 100% entre 20 a

27 dpi, slo observndose en 5% a 32 dpi. Por su parte, en el GII el obscurecimiento slo se manifest en 5% de los peces entre los das 1 a 5; peces de GIII no manifestaron cambio de color. El abultamiento abdominal en peces infectados (GI) se inici a 5 dpi en el 10% de la poblacin y luego de alcanzar un ligero incremento a los 6 dpi se mantuvo en 5% hasta los 20 dpi en que notablemente se increment hasta alcanzar el 50% entre 25 y 30 dpi. La presencia de pseudofecas se detect en los peces infectados a 6 dpi en el 10% de la poblacin, con gradual incremento hasta alcanzar un pico mximo de 50% entre los 25 a 29 dpi; por su parte, la descoordinacin comenz a los 19 dpi en el 5% de la poblacin, con punto mximo de 50% a 25 dpi, siendo nicamente evidente en el 3% de la poblacin a 32 dpi. En los primeros dos dpi en los tres grupos de peces se observ una mortalidad baja que no present diferencias entre grupos (P > 0,05). Sin embargo, los peces infectados

Figura 1a. Porcentaje de cras de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) que mostr cambio de coloracin durante la infeccin con IPNV.
Percentage of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) showing colour change when infected with IPNV.

Figura 1b. Porcentaje de cras de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) con manifestacin de abultamiento abdominal durante la infeccin con IPNV.
Percentage of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) showing abdominal bulging when infected with IPNV.

Figura 1c. Porcentaje de cras de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) con presencia de falsas heces durante la infeccin con IPNV.
Percentage of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) showing pseudofaeces when infected with IPNV.

Figura 1d. Porcentaje de cras de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) que mostraron incoordinacin durante la infeccin con IPNV.
Percentage of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) showing incoordination when infected with IPNV.

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LF VEGA Y COL

ligera infiltracin de clulas mononucleares y alrededor de los 15 dpi se present necrosis de pncreas exocrino, con remanentes de estructura de sostn, tejido adiposo y endocrino (figuras 3c y 3d).
NIVEL DE INMUNOGLOBULINA M (IgM)

Figura 2. Mortalidad de cras de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente con IPNV.
Mortality of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) when infected with IPNV.

Los peces del grupo GI presentaron un promedio de 0,132 densidad ptica (DO) de IgM al da 3 pi, nivel que se increment a 0,255 DO a los 5 dpi y disminuy a 0,176 a los 7 dpi; sin embargo, a partir de este tiempo el nivel se increment en forma gradual, alcanzando un punto mximo de 0,573 DO a 31 dpi con tendencia descendente posterior. Por su parte, los grupos GII y GIII no mostraron presencia de IgM en ningn tiempo de la fase experimental (figura 4), indicando desarrollo de una respuesta especfica en los peces infectados. DISCUSIN En peces la coloracin oscura de la piel es inducida por hormonas estimuladoras de melanforos y generalmente se considera un signo de estado de salud deficiente por acompaarse de baja tasa de crecimiento y mortalidad, sumado al incremento de cortisol en el suero sanguneo como indicador de estrs (Ruane y Komen 2003). En el presente estudio, el oscurecimiento descrito previamente en peces infectados por IPNV (McKnight y Roberts 1976) estuvo nicamente presente en los grupos de peces inoculados, siendo la primera manifestacin clnica de IPN en peces de GI, en los que el estrs acumulado por la infeccin indujo hasta un 100% de manifestacin en el periodo que tambin mostr mayor mortalidad; mientras que en peces de GII el proceso nicamente se manifest durante la primera semana postinoculacin con MEM, relacionado al estrs provocado por el manejo e inoculacin (Swanson y col 1982), a diferencia del grupo GIII que nicamente fue sometido a anestesia por inmersin. El abultamiento abdominal, una caracterstica comn en casos clnicos de IPN que es atribuida a necrosis del pncreas exocrino, intestino anterior e hgado, dilatacin de estmago y ascitis (Roberts y Pearson 2005, Smail y col 2006), slo se manifest en los peces infectados, en mayor porcentaje a partir de los 20 dpi, coincidiendo con la mxima manifestacin de otros signos clnicos de la enfermedad y mayor mortalidad; no obstante, al inicio de la infeccin el abultamiento tambin se present en un bajo porcentaje de la poblacin como supuesto signo agudo de la enfermedad (Roberts y Pearson 2005). Sin embargo, esta ltima condicin tambin podra encontrar relacin con lo referido por Swanson y col (1982), quienes observaron que la dilatacin abdominal por el acumulo de fluido proteico tambin puede ocurrir en peces que nicamente han sido inoculados con MEM, lo cual podra estar influido por la preparacin del medio utilizado. Tomando en cuenta que en el estudio los peces de GII no

con IPNV presentaron una mortalidad acumulada de 70% con un pico mximo de 51,02% a los 25 dpi, mientras que en GII la mortalidad fue de 20% y de 13,33% en peces del grupo control (P < 0,01) (figura 2).
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE IPNV

IPNV no fue identificado en muestras obtenidas de peces de los grupos GII y GIII; en cambio, en peces infectados (GI) el aislamiento fue posible en todos los tiempos de muestreo, a excepcin de muestras correspondientes a 0 dpi (datos no mostrados). Pese a que el ttulo viral no fue calculado, el virus se multiplic en los peces inoculados; las muestras obtenidas a 3 dpi expresaron CPE en clulas a 7 dpi; por su parte, las muestras correspondientes a 5 y 7 dpi manifestaron CPE 5 das despus de su inoculacin en lnea celular. La manifestacin fue ms rpida en las muestras de peces obtenidas a los 10 dpi, donde el CPE se present 3 das despus de su inoculacin, mientras que en clulas inoculadas con las muestras obtenidas a 15 y 31 dpi el CPE ocurri a 2 das postinoculacin. Por su parte, las muestras obtenidas a los 45 dpi produjeron CPE hasta el da 6 postinoculacin.
HALLAZGOS HISTOPATOLGICOS

Durante el periodo experimental los rganos internos de peces de los grupos GII y GIII no presentaron cambios patolgicos, situacin similar a muestras correspondientes al da 0 en peces de GI; sin embargo, a partir de 3 dpi el nmero de centros de melanomacrfagos en rin de GI manifest un incremento gradual en muestreos posteriores (figura 3a), mientras que la principal lesin en hgado fue necrosis multifocal leve a moderada. El intestino anterior y ciegos pilricos presentaron severa infiltracin de clulas mononucleares con engrosamiento de vellosidades y enteritis catarral (figura 3b), de mayor severidad a partir del da 25 pi. En pncreas se observ 30

IPNV, IgM, VIRUS, RESPUESTA INMUNE

Figura 3a. Izquierda, rin de cra de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectada experimentalmente con el virus de la necrosis pancretica infecciosa de 31 das postinfeccin. Se observa moderado aumento de clulas melanomacrofgicas (flecha). Derecha, control. 400X.
Left, kidney of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) infected with IPNV. At 31 dpi an important number of melanomacrophage cells are noticed (arrow). Right control.

Figura 3b. Izquierda, ciego pilrico de cra de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectada experimentalmente con el virus de la necrosis pancretica infecciosa a 15 das postinfeccin. Se observa severa infiltracin de clulas mononucleares y necrosis de tejido pancretico aledao. Derecha, control. 400X.
Left, pyloric ceacal of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) infected with IPNV. At 15 dpi a moderate caliciform cell hyperplasia is observed (arrow) with mononuclear cell infiltration (asterisk). Right, control. 400X.

Figura 3c. Izquierda, pncreas de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectada experimentalmente con el virus de la necrosis pancretica infecciosa a 15 das postinfeccin. Se observa severa destruccin de clulas pancreticas e infiltracin de clulas mononucleares tanto en pncreas como en ciego pilrico aledao. Derecha, control. 400X.
Left, pancreas of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) infected with IPNV. At 15 dpi an important destruction of pancreatic tissue is observed, besides mononuclear cells infiltration in pancreas and pyloric cecal is observed too. Right, control. 400X.

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LF VEGA Y COL

Figura 3d. Pncreas de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectada experimentalmente con el virus de la necrosis pancretica infecciosa a 15 das postinfeccin. Se observa severa necrosis del tejido pancretico y adiposo distribuido entre ciegos pilricos.
Pancreas of rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) infected with IPNV. At 45 dpi a severe pancreatic and adipose necrosis is observed between pyloric cecals.

Figura 4. Nivel promedio de inmunoglobulina M (IgM) en cras de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectadas con IPNV.
IgM average level in rainbow trout fry (Oncorhynchus mykiss) when infected with IPNV.

manifestaron abultamiento abdominal, su ocurrencia en los peces infectados indicara efecto viral. La presencia de pseudofecas, nicamente evidente en el grupo GI, es atribuida directamente a la enteritis catarral aguda derivada de necrosis y desprendimiento del epitelio intestinal, provocados por la replicacin de IPNV en clulas epiteliales (Roberts y Pearson 2005, Smail y col 2006). Al respecto, McKnight y Roberts (1976) mencionan que peces que sufren descamacin de mucosa intestinal severa mueren ms rpido que los que padecen un proceso patolgico menos grave al que pueden sobrevivir durante perodos ms largos; basado en lo anterior, la enteritis catarral podra ser la principal causa de muerte en los peces infectados. Por otra parte, la descoordinacin 32

natatoria o natacin errtica, que es una manifestacin tarda del cuadro clnico de IPN, asociada a daos del sistema nervioso central (Frantsi y Savan 1971) fue evidente justo antes de la muerte de los peces infectados. Los signos clnicos descritos en este trabajo presentan relacin con la mortalidad obtenida en los peces infectados; sin embargo, la mortalidad ante casos de infeccin natural y experimental con IPNV es muy variable, pudiendo ser desde una infeccin subclnica hasta cuadros de 90% de mortalidad (Wolf 1988, Ortega y Enrquez 2007). En el presente estudio, los signos clnicos propios de IPNV y su confirmacin por aislamiento viral indican que 70% de la mortalidad observada en GI correspondi a efectos directos del virus inoculado; resultados similares han sido descritos por Frantsi y Savan (1971), en truchas de arroyo (Salvelinus fontinalis), y por Jorgensen y col (2003) en smolts de salmn del Atlntico (Salmo salar) infectados con IPNV serotipo Sp (105 TCID50), donde la mortalidad se inici a 7 dpi alcanzando un 75% a los 33 dpi. En el presente trabajo, usando un inculo de 104 TCID50, se obtuvo mxima mortalidad alrededor de los 25 dpi asociada a ttulo alto de virus replicante, ya que clulas inoculadas con estas muestras mostraron CPE a 2 dpi; en este sentido, adems de la dosis infectiva y las cepas utilizadas, las diferencias reportadas pueden estar asociadas a factores como el estado de inmunidad de los peces y condiciones ambientales (Ortega y Enrquez 2007). Los melanomacrfagos son clulas pigmentarias presentes en tejido hematopoytico de bazo, rin y reas periportales del hgado que contienen inclusiones de melanina, hemosiderina y lipofucsina, capaces de ingerir agentes microbianos o desechos metablicos (Press y Evensen 1999); su proliferacin acompaada de restos de desechos celulares es evidente en peces infectados con IPNV (Swanson y col 1982), por lo que en el presente estudio su incremento progresivo en rin de peces inoculados podra relacionarse a la infeccin viral (Lerner y Thomas 2002) y estrs prolongado. Asimismo, las lesiones pancreticas caractersticas de la enfermedad se iniciaron a partir de los 3 dpi con moderada disociacin de acinos pancreticos; sin embargo, durante el periodo de mayor mortalidad tambin se observaron lesiones pancreticas ms graves y extensas, manifestando vacuolizacin y necrosis difusa de pncreas exocrino. Datos similares se han descrito previamente por Swanson y col (1982) en truchas de arroyo inoculadas o en brotes naturales de IPN en la misma especie. IPNV pudo ser aislado e identificado nicamente de rganos de peces del grupo GI a partir de los 3 dpi, donde el CPE fue manifiesto a los 7 dpi en lnea celular asociado a poca carga viral; en cambio, las muestras obtenidas de peces de entre 5 y 31 dpi presentaron multiplicacin ms rpida en la lnea celular, siendo nuevamente ms lenta en rganos de peces de 45 dpi, donde el CPE se manifest a los 6 dpi. Estos resultados concuerdan con lo informado

IPNV, IgM, VIRUS, RESPUESTA INMUNE

por Swanson y col (1982) en trucha de arroyo, que entre 5 y 25 dpi presentaron mayor concentracin viral en ciegos pilricos y tejido renal. Considerando que el ciclo de replicacin de IPNV se cumple en aproximadamente 20 h, es poco probable que el aislamiento realizado a los 3 dpi corresponda al virus inoculado, mientras que el CPE tardo obtenido a los 45 dpi podra deberse a una disminucin del ttulo viral en los rganos de los peces para entrar al estado de portador (Imajoh y col 2005). IPNV o sus productos pueden inducir la produccin de anticuerpos especficos de tipo IgM; sin embargo, el nivel de la respuesta es variable y su participacin en el control de la infeccin tambin es incierta al ser procesos influidos por la temperatura del agua, forma de presentacin del antgeno o tipo de vacuna (Ortega y Enrquez 2007). Imajoh y col (2005) reportan que despus de la infeccin la presencia de anticuerpos especficos contra IPNV puede detectarse a los 6 dpi, mientras que en otros casos aparecen despus de 12 semanas pi (Frost y Ness 1997). En el presente estudio nicamente los peces inoculados con IPNV desarrollaron una repuesta humoral especfica, mxima a los 31 dpi; el resultado muestra relacin con observaciones de Imajoh y col (2005) en truchas arco iris que generaron mximo nivel de anticuerpos neutralizantes a 21 dpi y descenso paulatino hasta 90 dpi. Sin embargo, en este estudio, el incremento de IgM se registr en forma ms temprana a lo reportado por otros autores, lo cual podra estar asociado a activacin de algunas clulas productoras de anticuerpos para inducir una pronta respuesta humoral (Frost y Ness 1997); en este sentido Lockhart y col (2004) evidenciaron que los peces ms susceptibles a infeccin viral desarrollan una respuesta de defensa ms rpida que los animales menos susceptibles. Asimismo, es poco probable que la respuesta se deba a previa estimulacin para generar anticuerpos contra el virus, ya que previo al estudio los peces fueron analizados para descartarlos como portadores, y adems la misma respuesta tambin habra sido manifiesta en los grupos GII y GIII. Los resultados obtenidos indican que junto con la replicacin de IPNV y la manifestacin de signos clnicos propios de la infeccin, tambin se present un incremento del nivel de IgM como desarrollo de una respuesta inmune especfica, aparentemente incapaz de ejercer un estado de proteccin. Al respecto, Ogut (2004) report coexistencia de alto ttulo viral y de anticuerpos, como aparentemente ha ocurrido en el presente estudio; sin embargo, no se inform la respuesta clnico-patolgica en los animales infectados; en este sentido, quedan por determinarse los mecanismos por los cuales el virus puede coexistir con los anticuerpos y con el sistema inmune en general para permitir o impedir el desarrollo del cuadro clnico asociado a la infeccin (Ortega y Enrquez 2007), o si bien esto ltimo es una condicin influida por las caractersticas del agente.

Considerando que la respuesta inmune inespecfica acta como la primera barrera de proteccin contra la infeccin viral poco influida por la temperatura, los resultados encaminan tambin a proponer estudios para determinar la relacin existente entre el nivel de anticuerpos y la expresin de molculas de actividad antiviral inespecfica inducida por interfern tipo I (IFN-I) y con el desarrollo de la infeccin inducida por cepas de IPNV de caractersticas distintas. RESUMEN
Se realiz un estudio para obtener informacin acerca de la relacin existente entre el cuadro clnico-patolgico desarrollado en cras de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectadas con el virus de la necrosis pancretica infecciosa (IPNV) y el nivel de inmunoglobulina M (IgM) en suero sanguneo. Los parmetros fueron determinados hasta 45 das postinfeccin (dpi) en peces inoculados por va intraperitoneal (IP) con 1X104 TCDI de IPNV o nicamente inoculados con Medio Mnimo Esencial (MEM) y en un grupo control no inoculado. Los peces infectados presentaron los signos caractersticos de necrosis pancretica (IPN) a partir de 19 dpi, alcanzando una mortalidad acumulada de 70%, con evidente emaciacin de animales sobrevivientes; asimismo, el nivel de IgM en suero sanguneo se increment progresivamente hasta alcanzar su punto mximo a 31 dpi; los hallazgos histopatolgicos ms significativos fueron: incremento de centros de melanomacrfagos en rin, necrosis pancretica y enteritis catarral. El aislamiento viral fue posible nicamente en peces infectados a partir del da 3 y hasta los 45 dpi (P > 0,5). Los resultados observados sugieren que aunque los animales infectados con IPNV pueden desarrollar una respuesta inmune humoral caracterizada por incremento de IgM, sta es insuficiente para desarrollar proteccin, ya que al mismo tiempo que se incrementa el nivel de IgM, tambin aumenta el ttulo viral, acompaado de signos clnicos y lesiones histopatolgicas tpicas de la enfermedad.

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Arch Med Vet 43, 35-40 (2011) ARTCULO ORIGINAL

Anlisis de las concentraciones de azufre en agua, alimento y gas sulfrico ruminal de rebaos bovinos de carne de las regiones de La Araucana, Los Ros y Los Lagos de Chile#
Determination of sulphur contents in water, forage and ruminal hydrogen sulphide concentrations in beef cattle herds from La Araucana, Los Ros y Los Lagos regions of Chile
M Gmez*a, B Gonzlez a, D Pinochetb, A Gutirreza, P Aburtoa
de Farmacologa y Morfofisiologa Veterinaria, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. bInstituto de Ingeniera Agraria, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
aInstituto

SUMMARY Sulphur is an essential element for the metabolism of ruminant animals. However, high dietary concentrations of sulphur are potentially harmful. The purpose of this study was to measure the forage and water sulphur content in samples from 45 beef herds from the La Araucana, Los Ros y Los Lagos regions of Chile. Additionally, ruminal gas hydrogen sulphide (H2S) concentrations were obtained from 5 animals on each farm. Samples were collected during the spring 2008 and summer 2009. Pasture sulphur content was 1,482 592 ppm in the spring and 1,471 448 ppm in the summer. Water sulphur concentrations in all farms was < 1.5 ppm each season. Ruminal gas H2S concentrations in animals was 273 187.5 ppm and 245.4 173 ppm in spring and summer, respectively. Positive and significant correlations were found between pasture sulphur content and ruminal H2S concentration for both periods. Estimated total sulphur intake considering pastures and water was < 0.2% sulfur on a dry matter basis. The results of this study suggest that forage and water sulphur concentrations in Southern Chile do not represent a potential risk of intoxication in grazing beef cattle. Palabras clave: azufre, bovinos, pradera, agua. Key words: sulphur, bovine, pastures, water.

INTRODUCCIN El azufre es un macroelemento esencial en rumiantes para la formacin de aminocidos como la cistina, cistena, metionina, taurina y ciertas vitaminas como biotina y tiamina (Whitehead 2000). Este mineral est presente en aproximadamente un 0,15% del peso corporal en bovinos (NRC 2001). La absorcin del azufre por parte de los rumiantes se realiza mayoritariamente en la forma de sulfato o como ion sulfuro (NRC 1996). Estos compuestos pueden ser utilizados por los microorganismos del rumen ms eficientemente que el azufre elemental para la formacin de biomasa microbiana (Whitehead 2000). La flora ruminal transforma el exceso de azufre en gas, el sulfuro de hidrgeno (H2S), que se acumula en el rumen y traspasa al torrente sanguneo (Galyean y Rivera 2003). Niveles elevados de azufre y sulfatos, consumidos por los rumiantes a travs de las plantas, agua y otros alimentos, pueden afectar a los animales de variadas formas (Gould

Aceptado: 15.09.2010. # Proyecto FONDECYT N 11070053, Proyecto DID S-2006-14 * Casilla 567, Valdivia, Chile; marcelogomez@uach.cl

y col 2002). Niveles altos de azufre en el agua y forraje se han asociado a una forma de polioencefalomalacia (PEM) en rumiantes (Gibson y col 1988, McAllister 1991, Gould 2000). Adicionalmente, niveles altos de sulfuros pueden intervenir en la absorcin y disponibilidad de otros metales trazas importantes como el cobre y selenio (NRC 2001). Gooneratne (1989) postula que esta deficiencia en cobre interferira indirectamente en el metabolismo de la tiamina contribuyendo a la presentacin de la PEM. Adems, esta deficiencia secundaria de cobre producira efectos negativos en la reproduccin, niveles productivos del ganado y caractersticas de la canal (Suttle 1993, Loneragan y col 1998, Gould y col 2002). Los requerimientos diarios de azufre en la dieta para bovinos de carne adultos y en crecimiento de acuerdo al NRC (1996) son de 1.500 a 2.000 partes por milln (ppm). Esto equivale a un 0,15% del alimento base materia seca (BMS). Niveles de azufre en la racin de hasta 0,4% BMS son considerados el mximo tolerable en bovinos de carne y de leche (NRC 1996, 2001). Sin embargo, la tolerancia de rumiantes para dietas azufradas vara inversamente con la proporcin de concentrado en la dieta (Klasing y col 2005). Bovinos y otros rumiantes con dietas menores a un 15% de forraje poseen riesgo de PEM cuando el azufre dietario es de 0,35% BMS (Klasing y col 2005). 35

M GMEZ Y COL

Por otro lado, dietas con niveles de forraje sobre el 40% necesitan niveles de azufre dietario sobre 0,5% para producir riesgo de PEM (Klasing y col 2005). Sulfuros y sulfatos pueden encontrarse en altas concentraciones en el agua, forrajes de ciertas crucferas y granos, malezas, suplementos o aditivos minerales y fertilizantes (Hill y Ebbert 1997, Gould 2000, Kul y col 2006, McKenzie y col 2009). En nuestro pas no existen recomendaciones de niveles mximos tolerables de compuestos azufrados en la dieta. Los objetivos de este trabajo fueron determinar la concentracin de azufre presente en el agua de bebida y praderas de predios bovinos de carne de las regiones de La Araucana, Los Ros y Los Lagos, y evaluar si existen diferencias entre predios localizados en la zona costera, la depresin intermedia y precordillera. MATERIAL Y MTODOS

por 3 para obtener la cantidad de azufre aportada por el agua (S mg/L).

ANLISIS DE AZUFRE EN EL FORRAJE

De cada predio, y en ambos perodos, se obtuvieron 3 muestras de pradera. Para estimar la concentracin de azufre proveniente del forraje se determin la concentracin de sulfuro en la pradera o de los componentes individuales de la dieta de los predios muestreados. Estas muestras fueron analizadas en el laboratorio de Suelos del Instituto de Ingeniera Agraria y Suelos de la UACh. Las concentraciones de azufre se obtuvieron por la tcnica de calcinacin y determinacin por tcnica de turbidimetra. Estos valores se expresaron como porcentaje de sulfuro en la materia seca, los que se convirtieron posteriormente a ppm.
CONCENTRACIN TOTAL DE AZUFRE EN LA DIETA

MUESTREO Y SELECCIN DE PREDIOS

Se analizaron 45 predios productores de carne bovina con ms de 50 animales por predio, pertenecientes a las regiones de La Araucana, Los Ros y Los Lagos durante los meses de octubre 2008 (primavera) y enero (verano) del 2009. Para cada Regin en estudio se seleccionaron por muestreo dirigido 5 predios correspondientes a la zona costera, 5 a la zona de depresin intermedia y los 5 restantes a la zona de precordillera. De cada predio y para cada perodo (primavera y verano) se obtuvieron 3 muestras de pradera y 3 muestras de agua. Adems, de cada predio se obtuvieron muestras de gas ruminal de 5 animales seleccionados de forma aleatoria simple para anlisis de cido sulfhdrico (H2S) ruminal, analizndose un total de 225 animales por perodo. Para cada predio, los muestreos de agua, alimento y gas ruminal fueron obtenidos en un mismo da.
ANLISIS DE AZUFRE EN EL AGUA

La concentracin total de azufre (CTS) en la dieta se estim mediante la suma de la concentracin de azufre en el agua (% SH2O) ms la concentracin de azufre en el forraje (%SF) (Gould 2000). La ingesta diaria total de forraje por animal se calcul estimando un consumo promedio de materia seca equivalente al 2,5% del peso vivo del animal (Ruiz 1996).
CONCENTRACIN DE CIDO SULFHDRICO EN GAS RUMINAL

En cada uno de los predios seleccionados se obtuvieron 3 muestras seriadas de agua de aproximadamente 100 mL cada una, las cuales fueron recolectadas de los bebederos para animales o de las fuentes de agua disponibles en cada predio. Los muestreos se realizaron una vez por predio en ambos perodos. Posteriormente las muestras de agua fueron identificadas y refrigeradas para su posterior anlisis. Estas muestras fueron analizadas en el laboratorio de Suelos del Instituto de Ingeniera Agraria y Suelos de la Universidad Austral de Chile (UACh) para medicin de la concentracin de azufre, utilizando para ello pruebas turbidimtricas. La concentracin de azufre fue expresada en partes por milln (ppm). Para el caso del agua los valores entregados por el Laboratorio son expresados en sulfato (SO4 mg/L), lo que es equivalente a ppm (1 mg/L = 1 ppm). Dado que un tercio del contenido de sulfato es azufre, los resultados del anlisis de Laboratorio fueron divididos 36

De cada predio analizado, se obtuvieron 5 muestras de gas ruminal de 5 animales seleccionados aleatoriamente por muestreo simple con el objeto de medir la concentracin de H2S. La determinacin de H2S en gas ruminal se realiz mediante tubos detectores, utilizando la tcnica paralumbar descrita previamente (Gould y col 1997). Esta tcnica provee una adecuada estimacin en terreno de las concentraciones de sulfato ruminal y es comparable a tcnicas de laboratorio como la cromatografa (Gould 2000). En esta tcnica se prepara aspticamente la fosa paralumbar izquierda y bajo anestesia local se introduce una aguja espinal estril (8,9 cm, 18G) hacia el saco dorsal del rumen. Luego el estilete de la aguja es removido y la base de sta es unida a un circuito conectado a un tubo calibrado para deteccin de H2S (Sensibilidad de 50 a 1000 ppm). Posteriormente, 100 mL de gas ruminal son extrados hacia el tubo para realizar la medicin de H2S, utilizando para ello un sistema colector de gas a precisin (Gastec gas precision sampler and hydrogen sulfide analyzer tube, Sensidyne, Clearwater, Fl, USA).
ANLISIS ESTADSTICO

Los datos obtenidos fueron evaluados para establecer normalidad en su distribucin. Se utiliz el test de anlisis de Varianza (ANDEVA) para evaluar las diferencias entre

AZUFRE, BOVINOS, PRADERA, AGUA

grupos (ubicacin geogrfica y regin), utilizando un valor de significancia de 0,05 para establecer la presencia de diferencias estadsticas entre promedios. Se realiz la prueba de T student en los casos de comparacin de variables entre perodos (primavera y verano). Adicionalmente, se realiz un anlisis de correlacin entre las variables en estudio para ambos perodos. Para el anlisis estadstico de los datos se utiliz el Software JMP8 Statistics (SAS Institute, Cary, NC, USA). RESULTADOS En la totalidad de los predios muestreados la principal fuente de alimentacin durante el perodo en estudio fue la pradera. La concentracin de azufre en la pradera para ambos perodos vari entre 900 a 3.000 ppm (0,09 y 0,3% de azufre BMS). Los niveles de azufre en agua tuvieron una concentracin promedio, para ambos perodos, de 1,13 0,1 ppm y los valores no superaron los 1,5 ppm considerndose baja su concentracin. Los anlisis por regiones no mostraron diferencias significativas (P > 0,05) entre las variables estudiadas (cuadro 1). Los niveles de azufre en agua y alimento no presentaron diferencias significativas (P > 0,05) al considerar la zona geogrfica de los predios (figura 1). El anlisis de 12 muestras de 4 tipos de concentrado de uso nacional (inicial, crecimiento y adulto) indic concentraciones de azufre entre 3.000 a 6.000 ppm (0,3 a 0,6% de azufre BMS) (cuadro 2). Los niveles de H2S ruminal obtenidos tanto en primavera como en verano variaron desde valores menores a 50 ppm hasta 800 ppm. No se observaron diferencias significativas en los resultados de H2S ruminal al considerar la regin de origen, la estacin o zona geogrfica de los predios de origen (figura 2). La comparacin entre los promedios de las concentraciones de H2S ruminal en primavera (273,1 187,5 ppm) y verano (245,4 173,1 ppm) no evidenci diferencias significativas (P > 0,05). Los niveles de H2S a nivel ruminal presentaron una correlacin positiva y estadsticamente significativa (P < 0,05) con los niveles de azufre en alimento tanto en la poca de primavera (r = 0,59) como en verano (r = 0,77).

El consumo promedio total de azufre estimado considerando las fuentes de pradera y agua en 45 predios de la regiones en ambos perodos fue de 25,8 g/da, lo que constituye un 0,21% de azufre en la dieta. DISCUSIN Los niveles de azufre en la pradera variaron entre un 0,03% a 0,2% BMS. No se observaron diferencias significativas en las concentraciones de azufre en ambos perodos ni tampoco entre las diferentes zonas geogrficas analizadas. Los niveles observados en la pradera son coincidentes con los informados en otros estudios con rangos de azufre no superiores a 0,3% BMS (Gould 2000). Se considera que en general, las praderas tienden a tener niveles bajos de azufre debido a su bajo contenido proteico (NRC 2001). Sin embargo, los niveles de azufre en la pradera pueden estar aumentados si existe la presencia de malezas con alto contenido de este mineral (Loneragan y col 1998). En la zona sur de Chile, uno de los factores importantes que afectan la disponibilidad de azufre en el suelo para las plantas es la cantidad de sulfato que se pierde en la zona radicular por lixiviacin (Rhue y Kamprath 1973, Vidal 2003). Otro factor que influye en la disponibilidad de azufre en las plantas es el tipo de suelo. Anlisis de suelos trumaos y rojo del sur de Chile han mostrado niveles bajos de azufre (Teuber 1996). El NRC (1996), en dietas para bovinos de carne, recomienda niveles de azufre dietario de aproximadamente 0,15% BMS con un mximo tolerable de 0,4% BMS. Plantas de la familia Brassicaceae son conocidas por sus altos contenidos de azufre (Loneragan y col 2001, Mackenzie y col 2009). Suplementos como la col forrajera (Brassica napus) pueden tener niveles de azufre de 0,6% hasta un 1% BMS y por tanto no debieran exceder el 30% de la racin (Soto 1996). El azufre presente en las plantas forma parte de azufre elemental, sulfuro de hidrgeno, glutatin, fitoquelatinas, glucosinolatos y protenas ricas en azufre, todos componentes esenciales ante situaciones de estrs bitico y abitico, los cuales median resistencia a agentes fngicos e insectos

Cuadro 1. Concentracin de azufre en pradera y en agua de 45 predios de produccin de carne bovina pertenecientes a las regiones de La Araucana, Los Ros y Los Lagos de Chile muestreados durante la poca de Primavera 2008 y Verano 2009.
Sulphur content of pasture and water of 45 beef farms during spring 2008 and summer 2009 in La Araucana, Los Ros y Los Lagos regions of southern Chile.

Concentraciones de Azufre (ppm) Regin Pradera La Araucana Los Lagos Los Ros Total 1566,6 519,1 1246,6 277,7 1633,3 622,9 1482,2 592,6 Primavera 2008 Agua 1,09 0,11 1,16 0,09 1,12 0,10 1,12 0,10 Pradera 1456,0 483,3 1506,6 475,7 1453,3 412,0 1471,1 448,0 Verano 2009 Agua 1,14 0,08 1,12 0,09 1,17 0,11 1,14 0,09

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M GMEZ Y COL

(Booth y col 1991). La capacidad de generar H2S de los microorganismos ruminales aumenta bajo condiciones de dietas altas en azufre (Cummings y col 1995, Gould 1998). Los resultados del anlisis de concentracin de azufre en la pradera de predios bovinos de las regiones de La Araucana, Los Ros y Los Lagos indican que las concentraciones de azufre en la pradera no sobrepasaron
Cuadro 2. Concentracin de azufre (ppm) en algunos suplementos utilizados en los predios bovinos de carne del sur de Chile.
Sulphur content (ppm) in some food supplements used in beef farms of southern Chile.

Suplemento Heno Ballica (n = 7) Ensilaje Ballica (n = 6) Nabo Forrajero (n = 3) Concentrado 1 (n = 3) Concentrado 2 (n = 4) Concentrado 3 (n = 4) Concentrado 4 (n = 4)

Concentracin de Azufre (ppm) 2.300 1.400 5.000 3.500 5.900 4.000 4.100

Concentrado 1: Concentrado Inicial Suralim, Biomaster S.A., Chile. Concentrado 2: Cosetan, Biomaster-IANSA, Chile. Concentrado 3: Concentrado vaca 14 Suralim, Biomaster S.A., Chile. Concentrado 4: Concentrado crecimiento Suralim, Biomaster S.A., Chile.

los riesgos de exposicin a niveles txicos de azufre. Estudios previos en Nebraska (USA) indican que en predios con niveles de 0,4% BMS de azufre en la dieta presentaron una incidencia de PEM de 0,14% (Vanness y col 2009a). Cuando los niveles de azufre en la dieta superaron los 0,56% BMS, la incidencia de PEM fue de un 6,06% BMS (Vanness y col 2009a). Los suplementos analizados indicaron niveles altos de azufre de 0,4% y 0,5% BMS en nabos y algunos concentrados respectivamente. Estos niveles altos de azufre en plantas crucferas ya han sido mencionados por otros autores (Soto 1996, Kul y col 2006, McKenzie y col 2009). Sin embargo, se desconoce la proporcin en la dieta en que estos suplementos alimentarios fueron utilizados en los predios en estudio. El contenido de azufre en el agua puede representar una proporcin importante del total de azufre ingerido por bovinos (Gould y col 2002). En nuestro pas, los niveles mximos permitidos de sulfato en agua de bebida segn la norma oficial para calidad del agua no debieran exceder las 250 ppm (Norma Chilena Oficial 1984). Los niveles de azufre en agua obtenidos en nuestro estudio no sobrepasaron las 1,2 ppm (1,12 0,1 ppm en primavera y 1,14 0,09 en verano). Un estudio en Estados Unidos, que incluy el anlisis de azufre en agua de 498 predios bovinos provenientes de 23 diferentes Estados indic rangos de azufre en el agua desde < 200 ppm hasta 7.600 ppm (Gould y col 2002). Se ha indicado que concentraciones de azufre en agua sobre 583 ppm pueden disminuir la

Figura 1. Concentraciones promedio (ppm) de azufre en pradera (A) y agua (B) segn zona geogrfica (costa: Costa, depresin intermedia: Depr y precordillera: Prec) en 45 predios bovinos de carne en los periodos de primavera 2008 y verano 2009. Cada barra de error est construida utilizando 1 desviacin estndar del promedio.
Mean concentration (ppm) of sulphur content in pasture (A) and water (B) according to geographic area (coastal, central and pre-Andean areas) of 45 beef farms during spring 2008 and summer 2009.

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AZUFRE, BOVINOS, PRADERA, AGUA

Figura 2. Concentraciones promedio (ppm) de H2S en gas ruminal obtenidas de 225 bovinos durante la poca de primavera y verano en las regiones de La Araucana, Los Ros y Los Lagos de Chile (A) y en tres reas geogrficas (costa: Costa, depresin intermedia: Depr, precordillera: Prec) de cada regin (B). En cada regin se analizaron 75 animales. Cada barra de error est construida utilizando 1 desviacin estndar del promedio.
Mean concentrations of H2S ruminal gas concentrations obtained from 225 bovines during spring and summer in La Araucana, Los Ros and Los Lagos regions of southern Chile (A) and from three geographic regions (B) . On each region 75 animals were analyzed.

productividad en el ganado bovino y las caractersticas de la canal, incluyendo disminucin del peso caliente de sta y de la proporcin de grasa a nivel de la 12a costilla (Loneragan y col 2001). Zinn y col (1997) sealaron que ingestas moderadamente altas de azufre en la dieta de bovinos de carne (0,25% BMS) producen una disminucin del peso de la canal y del rea del msculo longissimus. Adicionalmente, se ha estimado que concentraciones de azufre en el agua sobre las 2.000 ppm, en ambientes de temperatura moderada, pueden resultar en una ingesta total de azufre en la dieta de hasta 0,53% con presentacin de casos clnicos de PEM (Gould 2000). Esta concentracin total de azufre ingerido puede incluso aumentar en altas temperaturas ambientales, debido al mayor consumo de agua (Gould 2000). Los niveles de H2S en gas ruminal de nuestro estudio indicaron valores no significativos entre los perodos de primavera (273,1 ppm) y verano (245,4 ppm). Valores similares (264 ppm) han sido informados por McAllister y col (1997) en bovinos de carne sin signos de PEM en el perodo de verano de USA. Niveles de H2S en gas ruminal sobre 1.000 ppm son sugerentes de toxicosis. Los mximos niveles de encontrados en nuestro estudio no sobrepasaron las 800 ppm. Por otra parte, se encontr una alta correlacin entre los niveles de H2S en gas ruminal con la concentracin de azufre en la pradera. En un estudio, que utiliz subproductos de maz en la dieta con concentraciones de azufre en la dieta de 0,42% a 0,47% se encontraron niveles de H2S en gas ruminal de

1.700 ppm a 7.500 ppm en bovinos de carne (Vanness y col 2009b). Otro estudio que midi niveles de H2S 12 horas postalimentacin indic niveles de H2S de 1.100 ppm a concentraciones dietarias de azufre de 0,53% y niveles de 825 ppm cuando las mismas fueron de 0,34% BMS (Vanness y col 2009a). Al parecer, los niveles de H2S ruminal tienden a correlacionarse positivamente con los niveles dietarios de azufre al comparar dietas similares en cuanto a los alimentos utilizados. Sin embargo, esta relacin no es tan clara cuando se comparan niveles de azufre provenientes de dietas de diferente composicin (Vanness y col 2009a). Factores como los cambios del pH ruminal, inducidos por el cambio de dieta, se han correlacionado negativamente con los niveles de H2S ruminal (Gould y col 2002). El consumo promedio total de azufre estimado por Unidad Animal (animal de 500 kg) fue de 25,8 g/da, lo que se traduce en un 0,21% en BMS. El consumo de este mineral no presenta riesgos de intoxicacin para los animales, ya que de acuerdo al NRC (1996) lo recomendado como requerimiento diario para ganado de carne es de un 0,15 a 0,20% de azufre en BMS, siendo la concentracin mxima tolerable de azufre en la dieta un 0,4% en BMS. En conclusin, los resultados indican que las concentraciones de azufre encontradas en los predios ganaderos de las regiones de La Araucana, Los Ros y Los Lagos de Chile no representan un riesgo potencial para el consumo de azufre en bovinos. Adicionalmente, no se encontraron diferencias significativas entre las concentraciones de 39

M GMEZ Y COL

azufre del agua y pradera provenientes de las zonas costera, intermedia y precordillerana en ambos perodos en estudio. Las concentraciones de azufre en la pradera es un factor que influye en la concentracin ruminal de H2S. RESUMEN
El azufre es un macroelemento esencial en rumiantes. Niveles elevados de azufre y sulfatos consumidos por rumiantes a travs de las plantas, agua y otros alimentos pueden reducir el apetito y la tasa de crecimiento en los animales, afectar la absorcin de otros elementos y causar afecciones respiratorias y/o neurolgicas. El propsito de este estudio fue medir los niveles de azufre en la dieta, analizando las praderas (3 muestras por predio) y el agua (1 muestra por predio) en 45 predios dedicados a la produccin de carne, de las regiones de La Araucana, Los Ros y Los Lagos de Chile durante los perodos de primavera 2008 y verano 2009. Adicionalmente, se obtuvieron muestras de gas ruminal de 5 animales por predio, muestrendose un total de 225 animales por perodo. Posteriormente, se analizaron las diferencias en las concentraciones de azufre en agua y pradera y H2S en gas ruminal de los predios provenientes de las zonas de la costa, depresin intermedia y precordillera. Los resultados obtenidos indican que las concentraciones promedios de azufre en la pradera fueron de 1.482 592 ppm y de 1.472,1 448 ppm en el periodo primavera y verano respectivamente, no evidencindose diferencias significativas. La concentracin de azufre en agua fue de 1,12 0,1 y 1,14 0,09 ppm durante el perodo de primavera y de verano, respectivamente. Los resultados de los anlisis por regin y zona geogrfica (costa, depresin intermedia y precordillera) no mostraron diferencias significativas. La concentracin de H2S en gas ruminal en los animales en estudio fueron de 273,1 187,5 y de 245,4 180 ppm en primavera y en verano, respectivamente. El anlisis de correlacin entre variables indic una asociacin positiva entre los niveles de azufre en alimento y H2S en gas ruminal para el perodo de primavera y verano. El consumo promedio total de azufre estimado considerando las fuentes de pradera y agua en 45 predios durante ambos perodos fue < 0,2% de azufre en la dieta. En conclusin, los resultados indican que las concentraciones de azufre encontradas en los predios ganaderos de las regiones de La Araucana, Los Ros y Los Lagos de Chile no representan riesgo para el consumo en bovinos.

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Arch Med Vet 43, 41-50 (2011) ARTCULO ORIGINAL

Comparacin de mtodos basados en los requerimientos nutricionales y disponibilidad de biomasa para estimar la capacidad de carga para venado cola blanca
Comparison of methods based on the nutritional requirements and availability of biomass to estimate carrying capacity for white tailed deer
FX Plataa*, GD Mendozaa, JA Viccona, R Brcenab, F Clementeb
aUniversidad Autnoma bColegio

Metropolitana, Doctorado en Ciencias Biolgicas, Mxico D.F. de Postgraduados, Campus Montecillo, Mxico.

SUMMARY Due to the importance of the estimation of carrying capacity (K animals/ha) in white tailed deer, the objectives of this study were: 1) To compare the estimation of K with five methods, three of them based on nutrient availability (dry matter (DM), digestible energy (DE) and nitrogen (N)), one based on pressure of pasture and one based on the requirement of metabolizable energy (ME) based on the ecological metabolism of the deer, and; 2) To compare the K estimated when using the total biomass or vegetation groups consumed by the deer (grasses, herbs, shrubs and trees). The information about diet composition and biomass was collected at a hunting ranch in Aguascalientes, Mexico. The results were analyzed as a factorial arrangement (5 x 4), with the factors being the estimation method and the vegetal group factors. The estimated K (deer/ha) with total biomass was the highest (1.043), followed by grass (0.707) and herbs (0.325), whereas the estimates with trees and shrubs were the lowest ones (0.228 and 0.032 deer/ha). The K estimated, based in shrubs availability gives the value most similar to the population density than with the other methods, independently of selected method (DM, DE or N availability, pressure of pasture or ecological metabolism). It is concluded that carrying capacity should be estimated based on shrubs availability when considering the population density (0.02 - 0.04 deer/ha) as the appropriate indicator to evaluate the carrying capacity. Palabras clave: capacidad de carga, Odocoileus virginianus, requerimientos nutricionales, vegetacin. Key words: carrying capacity, Odocoileus virginianus, nutritional requirements, vegetation.

INTRODUCCIN La estimacin del nmero de animales que un hbitat puede mantener en una condicin vigorosa y saludable es un problema que tiene sus orgenes a comienzos del siglo pasado. Por tal razn y a lo largo de todo este tiempo se han generado y discutido diversos tipos de modelos que permiten su determinacin (McLeod 1997). Dependiendo de la especie y funcin para la que sea utilizada, la capacidad de carga ha sido definida de diversas maneras (Miller y Wentworth 2000). En general, la capacidad de carga ecolgica (K) es definida como el nmero mximo de animales que puede crecer dentro de una poblacin de acuerdo al modelo logstico, mientras que las restricciones a dicho crecimiento incluyen la disponibilidad de espacio, agua y biomasa comestible, de tal forma que la tasa de crecimiento (r) es igual a cero cuando una poblacin alcanza K (Gotelli 2008). Esta K es afectada por la presencia de enfermedades que afectan a la poblacin, la disponibilidad de agua, la presencia de competidores naturales y depredadores (Gallina 1990, Mandujano 2007). Por otro lado, la capacidad de carga econmica se refiere

Aceptado: 15.09.2010. * Calz. Del hueso 1100, Mxico D.F. 04960, Mxico; ppfx221@ correo.xoc.uam.mx

al valor que permite maximizar el nmero de individuos a condicin de no generar cambios en la composicin botnica del sitio (Beck y col 2006). Mientras que para los productores de ganado domstico y los manejadores de pastizales, la estimacin de la carga animal representa al nmero mximo de animales en un pastizal que permite el mantenimiento o mejoramiento de la vegetacin o de los recursos utilizados, y se utiliza como sinnimo de K (Jacoby 1989, Young 1998, Galt 2000). En todos los casos, la K de una regin, es dependiente del tipo y disponibilidad de vegetacin presente, de los hbitos de consumo de la especie y la poca del ao (Stuth y Sheffield 2001). Se han evaluado diferentes mtodos para determinar la capacidad de carga; Mandujano (2007) evalu la capacidad de carga de un rea del estado de Jalisco (Mxico) utilizando el concepto ecolgico y considerando que K es igual a la densidad estimada de animales ms los animales muertos en el rea. En bovinos, Paladines y Lazcano (1983) disearon una tcnica para estimarla incorporando el concepto de presin de pastoreo (PP), el cual en lugar de estimar el consumo del animal asigna un porcentaje de su peso vivo como requerimiento de forraje. En venados, Hobbs y Swift (1985), McCall y col (1997) y Stuth y Sheffield (2001), han evaluado mtodos que utilizan la materia seca o los nutrientes disponibles en el rea y los dividen entre los requerimientos nutritivos. Sin embargo, dichos requerimientos 41

FX PLATA Y COL

son definidos en forma fija (Robbins 1973, McCall y col 1997, Galbraith y col 1998), lo que fisiolgicamente no ocurre en los animales. Debido a que los requerimientos nutricionales cambian con la poca del ao, el gnero y el estado fisiolgico del animal, Moen (1978) desarroll un modelo para estimar el gasto energtico de un venado cola blanca en funcin de estos factores y defini a este requerimiento de energa como metabolismo ecolgico del venado (MEV); este modelo fue modificado por Clemente (1984), para estimar el MEV como requerimiento de energa metabolizable (EM) en funcin del peso vivo. La estimacin adecuada de K es fundamental para garantizar tanto el mantenimiento de la poblacin de venados como el de la comunidad vegetal. Sin embargo, uno de los problemas que se tienen al determinar la K de hbitats para venado cola blanca en vida libre es que algunos mtodos de estimacin utilizan procedimientos similares a los usados con bovinos domsticos sin considerar su selectividad (McCall y col 1997, Stuth y Sheffield 2001). Los hbitos alimenticios del venado son de ramoneo y el tipo de vegetales que consumen son casi totalmente diferentes a los consumidos por los bovinos. Se ha demostrado que aun bajo condiciones de excelente pastizal, slo consumen alrededor de un 8% de gramneas del total de su dieta (Hansen y col 1977, Stuth y Winward 1977, Bryant y col 1979). Otros autores han mostrado que la palatabilidad de las arbustivas y las herbceas es un factor determinante en la seleccin de la dieta de venados y que pueden incluso minimizar el consumo de leguminosas o gramneas si este tipo de arbustivas estn presentes (Augustine y Jordan 1998, Sauv y Ct 2007, Plata y col 2009). Tambin se ha demostrado que el uso de hbitat por esta especie es dependiente del tipo de especies vegetales que lo conforman, de tal manera que aunque un rea ofrezca mayor biomasa vegetal comestible los venados pueden localizarse en mayor densidad en otras reas con menor densidad relativa de alimento (Mandujano y col 2004). Considerando que el metabolismo energtico del venado cola blanca se modifica en una forma dinmica y que el modelo de presin de pastoreo utilizado en bovinos no ha sido evaluado en venado cola blanca, los objetivos de este trabajo fueron: 1) Comparar la estimacin de K por cinco mtodos, tres basados en disponibilidad de componentes nutritivos: materia seca (MS), energa digestible (ED), nitrgeno (N), otro basado en la presin de pastoreo y un ltimo en el requerimiento de EM estimado con base al MEV, y 2) Estimar los cambios en la K al sustituir en los modelos evaluados la biomasa total por los grupos de vegetacin consumidos por el venado (arbreas, herbceas, arbustivas y gramneas) comparando los resultados de las estimaciones de capacidad de carga versus la densidad poblacional de venados reportada de la zona. 42

MATERIAL Y MTODOS
SITIO DE MUESTREO

Se us la informacin del muestreo de vegetacin realizado por Clemente (1984) en un rancho cinegtico (El Antrialgo) localizado en el municipio de San Jos de Gracia, Aguascalientes, Mxico, entre los paralelos 2205 y 2210 latitud N y los 10235 y 10240 latitud W, dentro de la zona sujeta a conservacin ecolgica denominada Sierra Fra. El rancho tiene una extensin de 260 ha, con una altura sobre el nivel del mar de 2.350 msnm. La precipitacin anual de la regin fue de 600 mm distribuidos principalmente de junio a octubre, la evaporacin media anual es de 1.500 mm, y el clima corresponde al tipo BSwh de acuerdo a la clasificacin de Koppen, modificada por Garca (1981). El tipo de suelo del rea de estudio va de suelo complejo de montaa podzlico a suelo de depsito abanico aluvial y lacustre. La relacin de especies que componen la cubierta vegetal del lugar se observa en el cuadro 1. Este rancho se caracteriz por tener actividad ganadera cuatro aos antes de convertirse en rancho cinegtico.
MUESTREO DE VEGETACIN

El muestreo de vegetacin se realiz en los meses de julio (antes de la lluvia), octubre (poca de lluvias) y diciembre (despus de las lluvias) de 1983. Dichos muestreos corresponden a los momentos ms importantes de cambios vegetativos (Beauchamp y Stromberg 2008, Rogers y col 2004) y no se muestre al inicio del ao por considerar que al no haber precipitacin pluvial los cambios en crecimiento eran nulos (Otto y col 2002). Tomando como criterio la dominancia de especies arbreas y arbustivas, se determinaron tres tipos de hbitats. El primero dominado por Quercus-Arctostaphylus, el segundo dominado por Quercus-Arctostaphylus-Juniperus, mientras que el tercero por Quercus-Juniperus. Todos los muestreos se realizaron en el ao de 1984. Para el muestreo de julio se localizaron tres reas representativas de cada hbitat y para los muestreos de octubre y diciembre se localizaron tres reas representativas del primero y un rea representativa del segundo y el tercero. En total se tuvieron 19 sitios de muestreo de 400 m2 (20 x 20 m) cada uno.
ESTIMACIN DE BIOMASA

Para las especies arbreas de cada rbol dentro del rea de muestreo se recolect el material vegetativo disponible a 1,60 m de altura (Jordan 1967). Para las arbustivas menores a esa altura se colect la biomasa total separando las hojas tiernas, rebrotes y frutos. Para las determinaciones de la disponibilidad de forraje (herbceas y gramneas) dentro de cada rea de muestreo se distribuyeron al azar 2 cuadrantes de 1 m2 y se recolect todo el material herbceo y

CAPACIDAD DE CARGA, ODOCOILEuS VIRGINIANuS, REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES, VEGETACIN

Cuadro 1. Especies que componen la cubierta vegetal del rancho El Antrialgo.

Vegetal species at the soil cover at the Antrialgo Ranch.

Arctostaphylos pungens Aristida orcuttiana Borreria densiflora Carex coulteri Calea spp Castilleja tenuiflora Cologania angustifolia Cologania obovata Conyza gnaphalioides Cyperus seslerioides Evolvulus prostratus Geranium spp Allium glomeratum Hypericum silenoides Ipomoea capillacea Juniperus deppeana Lycurus phleoides Muhlenbergia emersleyi Muhlenbergia pungens Muhlenbergia rigida Odontotrichum amplum Oxalis latifolia Perymenium buphthalmoides Polygala alba Quercus rugosa Quercus microphylla Stevia pilosa Stevia serrata Stipa virescens Viola barroetana

Ericaceae Poaceae Rubiaceae Cyperaceae Asteraceae Scrophulariaceae Fabaceae Fabaceae Asteraceae Cyperaceae Convolvulaceae Geraniaceae Liliaceae Clusiaceae Convolvulaceae Cupressaceae Poaceae Poaceae Poaceae Poaceae Asteraceae Oxalidaceae Asteraceae Polygalaceae Fagaceae Fagaceae Asteraceae Asteraceae Poaceae Violaceae

Arbustiva Gramnea Herbcea Herbcea Herbcea Arbustiva Herbcea Herbcea Herbcea Herbcea Herbcea Arbustiva Herbcea Herbcea Herbcea Arbrea Gramnea Gramnea Gramnea Gramnea Herbcea Herbcea Arbustiva Herbcea Arbustiva Arbustiva Herbcea Herbcea Gramnea Herbcea

gramneo presente en el suelo (Bullock 1996). La biomasa vegetal de cada estrato se estim como el producto del rea total por el promedio de los kg de MS del mismo en ese periodo, mientras que la biomasa total fue el resultado de la sumatoria de las biomasas de todos los estratos en el mismo periodo.
COMPOSICIN QUMICA DE LA BIOMASA VEGETAL

los diferentes grupos vegetales en cada poca del ao y la relacin de energa metabolizable se estim con la ecuacin EM = 0,82 ED (Gonzlez y Everitt 1982).
REQUERIMIENTOS NUTRITIVOS DEL ANIMAL

Tanto las especies analizadas como las caractersticas nutritivas, la composicin qumica y la digestibilidad in vitro de la dieta de acuerdo a cada poca fueron reportadas previamente (Clemente y col 2005). La concentracin de energa bruta del alimento se determin de acuerdo a los mtodos oficiales de AOAC (1995). La concentracin de energa digestible (ED) de cada estrato vegetal se estim con el producto de la relacin EDMS Mcal/kg = (DIVMS/100) EB utilizando la digestibilidad in vitro de

Para la estimacin del consumo de materia seca (CMS) y los requerimientos de ED y N, se consider un venado de 60 kg de peso vivo (PV). El CMS en estos modelos se estim con el valor obtenido por Galbraith y col (1998) de 46 g de MS por kilogramo de peso metablico (CMS kg/ da = 0,046*PV0,75). La estimacin del requerimiento de ED (RED) para mantenimiento fue de 158 kcal por kilogramo de peso metablico (RED = 158* PV0,75; Ullrey y col 1970). El requerimiento de nitrgeno (RN) se estim en 710 mg por kilogramo de peso metablico (RN g/da = 0,710* PV0,75; Robbins 1973). El metabolismo ecolgico del venado (MEV, kcal/da) se calcul utilizando una hoja de clculo del programa 43

FX PLATA Y COL

Excel de Microsoft Office y se encuentra disponible en la plataforma de Bioeficiencia1 que corresponde al modelo de Moen (1978) modificado por Clemente (1984), con el cual se estim el requerimiento energtico considerando los das julianos 31, 59, 90, 120, 151, 181, 212, 243, 273, 304, 330 y 365 que corresponden al da ltimo de cada mes, respectivamente, y se multiplic por el nmero de das de cada mes.
DENSIDAD ANIMAL

(2) Donde:

Bi Fj K = 0, 35 RD

La densidad poblacional de venado en el ao durante el cual se hizo el muestreo de vegetacin en la zona fue reportada por Romo (1987), quien estim la densidad de venados en la zona aplicando dos tcnicas diferentes: un muestreo por transectos de observacin directa y un muestreo por conteo indirecto basado en indicios (huellas). Tambin se consideraron los antecedentes publicados por Villalobos (1998), quien report estimados de la poblacin de venados en Sierra Fra desde 1975 hasta 1996. Estas estimaciones fueron realizadas a partir de 24 muestreos realizados en un rea de 2.975 ha. Ambas densidades junto con las de Kobelkowsky y col (2000) fueron tomadas como indicadores de referencia para discutir la estimacin de la capacidad de carga (Mandujano 2007).
ESTIMACIN DE CAPACIDAD DE CARGA

K = Carga del rea de estudio (venados/ha). Bi = Biomasa del estrato vegetal i (gramneas, herbceas, arbustivas y arbreas; kg/ha). Fj = Contenido de los componentes nutritivos del estrato vegetal j (MS kg, N kg/kg o ED Mcal/kg). R = Requerimiento de los componentes nutritivos de un venado de 60 kg (kg o kcal). D = Tiempo de utilizacin (das). 0,35 = Eficiencia de utilizacin del forraje.
MTODO BASADO EN LA PRESIN DE PASTOREO

Para estimar la capacidad de carga con el mtodo basado en la presin de pastoreo (Paladines y Lazcano 1983) se estim la disponibilidad (D) de MS total o de cada estrato vegetal por ha y se aplic la siguiente ecuacin: D 0, 35 A 100 T PP K = 60

(3)

Se estim la K del rea muestreada utilizando los modelos descritos a continuacin. En todos los mtodos la eficiencia de utilizacin fue del 35%, ya que en el modelo logstico de crecimiento dicha asignacin garantiza que el crecimiento de una poblacin no se limita (Gotelli 1998). La estimacin se realiz para cada periodo de muestreo considerando su duracin (91 das el verano, 61 das el otoo y 213 das el perodo de invierno). MODELOS EVALUADOS
MODELOS DE DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES

Donde: K = Capacidad de carga (venado/ha) D = Disponibilidad de MS total o por estrato vegetal (kg/ha) 0,35 = Eficiencia de utilizacin del forraje A = rea (ha) T = Tiempo (das) PP = Presin de pastoreo (% de PV) 60 = Peso vivo del venado (kg) La presin de pastoreo asignada fue igual al factor de consumo proporcional al peso vivo (PV) propuesto por Stuth y Sheffield (2001) de 3,5% del PV, el tiempo (T) cambi de acuerdo a la poca del ao. Para determinar el nmero de animales por ha (K) que se pueden sostener con los diversos estratos vegetales se dividi el nmero de kg de animal entre 60. En las metodologas basadas en la disponibilidad de MS, ED y N y en la presin de pastoreo, el consumo y los requerimientos fueron mantenidos constantes a lo largo del ao.
MTODO BASADO EN EL METABOLISMO ECOLGICO

Se seleccionaron tres de los mtodos publicados por McCall y col (1997) basados en la disponibilidad de MS, ED y N. Para estimar la K con la biomasa total se us el algoritmo de Hobbs y Swift (1985), utilizando la ecuacin 1. Para la estimacin de la K por grupo vegetal se consider la concentracin del nutriente evaluado (MS, ED o N) en cada uno de los estratos vegetales presentes en el rea, utilizando la ecuacin 2. n Bi Fj K = 0, 35 i =1 RD

(1)

Modelacin sobre eficiencia animal. http://bioeficiencia.avanzavet. com/ consultada el 12 de febrero de 2008.

Este mtodo se bas en una estimacin del requerimiento energtico del venado en vida libre, por una serie de ecuaciones que conforman el metabolismo ecolgico (ME, kcal/da), el cual se calcul utilizando la secuencia

44

CAPACIDAD DE CARGA, ODOCOILEuS VIRGINIANuS, REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES, VEGETACIN

descrita por Moen (1978) modificada por Clemente (1984). A diferencia de los mtodos anteriores, el modelo de metabolismo ecolgico es un mtodo dinmico que cambia el requerimiento energtico de acuerdo a la poca del ao junto con los cambios de actividad del venado. Para estimar la capacidad de carga en este modelo se dividi la energa metabolizable disponible de la biomasa total o de los diversos estratos vegetales entre la sumatoria del requerimiento energtico del animal de los meses que corresponden a cada periodo, utilizando la siguiente frmula: K=

por cinco), donde los factores fueron los mtodos y los estratos vegetales consumidos por el venado (MS total, gramneas, herbceas, arbustivas y arbreas). Por esto tambin se realizaron contrastes de inters, para comparar algunos efectos especficos tanto entre grupos vegetales como entre mtodos (Herrera y Barreras 2005). RESULTADOS En el cuadro 1 se presenta la relacin de las especies que componan la cubierta vegetal y que fueron muestreadas para la estimacin de biomasa total, disponible y nutrientes aportados para la estimacin de K. El anlisis estadstico mostr que existieron diferencias estadsticas (P < 0,05) tanto entre la biomasa vegetal total y disponible por grupo vegetal como en la concentracin de energa digestible y metabolizable de los mismos (cuadro 3). Las gramneas fueron el grupo que aport la mayor cantidad de biomasa, energa digestible y metabolizable, mientras que las arbreas y herbceas aportaron cantidades intermedias y las arbustivas fueron las que menor cantidad de compuestos nutritivos aportaron. Sin embargo, la cantidad de N disponible por grupo vegetal no mostr cambios importantes (P > 0,05). La poca del ao no modific ni la biomasa total ni la disponibilidad de MS en cada estrato vegetal, ni tampoco tuvo efecto en los compuestos nutritivos disponibles. Debido a que no se encontraron efectos de la poca del ao, en el cuadro 3 se presentan las medias y el error estndar de la biomasa disponible y los compuestos nutritivos contenidos en cada estrato. Adems, se presenta como referencia la biomasa total, biomasa disponible y compuestos nutritivos resultantes de la sumatoria de los grupos vegetales y los requerimientos de MS, ED, N y EM de un animal de 60 kg de peso vivo. En el anlisis estadstico de K (cuadro 4) se encontraron diferencias significativas tanto entre los mtodos de estimacin (P < 0,003) como entre la K estimada a partir de los diversos grupos vegetales (P < 0,0001); sin embargo, la interaccin entre los mismos no fue significativa (P = 0,20), por lo que slo se presentan los efectos principales de mtodo de estimacin y grupo vegetal, los cuales se contrastan con la densidad poblacional

(4) Donde:

1- n Emf A 0, 35 1- m MEVd

K = Capacidad de carga (venados de 60 kg/ha) Emf = Energa metabolizable del forraje de la especie vegetal 1 hasta n (kcal /ha) A = rea total del predio (ha) n = Estrato m = Da juliano MEVd = Metabolismo ecolgico diario de un venado de 60 kg (kcal/da). El clculo de esta variable se observa en el cuadro 2. 0,35 = Eficiencia de utilizacin del forraje
ANLISIS ESTADSTICO

Tanto el anlisis estadstico de la biomasa de los diferentes grupos vegetales como de la capacidad de carga se realizaron utilizando un diseo en bloques al azar considerando a la poca del ao como factor de heterogeneidad y se realiz una prueba de Tukey para comparar las medias de los tratamientos, para lo cual se utiliz el procedimiento GLM del SAS (1994, SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA). La biomasa total no se incluy en dicho anlisis por ser el resultado de la sumatoria de los grupos vegetales; en consecuencia, es mayor a cada uno de los mismos. Los estimados de capacidad de carga se analizaron con un diseo de tratamientos con arreglo factorial (cinco

Cuadro 2. Modelos para estimar el metabolismo ecolgico de los venados de cola blanca1.
Models for estimation of ecological metabolism of white-tailed deer.

Machos MEm = [{1,02850 sin [(Dj) (0,09863) + 239] + 0,0281} + 2,67] 70 {[(e1,617 + 0,3810 In edias) {sin [Dj) (0,9863) + 90] 0 Hembras MEH = 2,56894e0,19602 (c) ({[1,0285 sin [(dj + 170,0536e0,15488(c)) 0,9863] + 0,0281] [0,19 + 0,05 (c)]} + [0,81 - 0,05 (c)]) * 70 {[(e1,617+0,3810 In edias) {sin [(Dj) (0,98)
1

La solucin a la ecuacin est disponible en Bioeficiencia. Modelacin sobre eficiencia animal. http://bioeficiencia.avanzavet.com/ consultada el 12 de febrero de 2008.

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Cuadro 3. Biomasa, compuestos nutritivos disponibles por grupo vegetal y requerimientos del venado de cola blanca utilizados para estimar capacidad de carga con diferentes mtodos.
Biomass, nutrient availability by vegetative group and white-tailed deer requirements used to estimate carrying capacity with different methods.

Biomasa disponible por grupo vegetal Aportes nutritivos Gramneas Materia seca disponible (kg/ha) Proporcin de la biomasa aportada (%) ED1 (Mcal/ha) Proporcin de la ED aportada (%) EM2 (kcal/ha) Proporcin de la EM aportada (%) Nitrgeno (kg/ha) Proporcin del N aportado (%) Requerimientos anuales del venado de cola blanca3 MS, kg/ao 334,15
ab 1 2 3 4

Herbceas 49,5ab 22,4 113,4ab 36,4 93,0ab 36,3 0,64a 35,0

Arbreas 38,3ab 17,3 54,0ab 17,3 44,3ab 17,3 0,38a 20,6

Arbustivas 5,8b 2,6 a9,6b 3,1 7,9b 3,1 0,05a 2,9

Total 221,1 100 312,4 256,2 1,83

EEM 24,2 26,9 22,0 1,0

127,4a 57,3 135,4a 43,3 111,0a 43,3 0,76a 22,7

ED, Mcal/ao 1.154,896

N, kg/ao 5,184

MS asignada4/ao 766,5

EM, Mcal/ao 880, 62

Literales diferentes en el mismo rengln son diferentes (P < 0,05). ED: Energa digestible. EM: Energa metabolizable. Considerando un venado con un PV de 60 kg, por lo que el peso metablico3 (Peso vivo),75 es de 19,90 kg. Es la cantidad de MS asignada de acuerdo a la presin de pastoreo. Kg de forraje por 3,5% PV.

Cuadro 4. Capacidad de carga de venados de cola blanca (venados/ha) estimada por diferentes mtodos y grupos vegetales.
Carrying capacity of white-tailed deer (deer/ha) estimated using different methods and vegetal groups.

Mtodo de estimacin Disponibilidad de compuestos nutritivos MS1 1,043a Nitrgeno 0,604ab ED2 0,451b Presin de pastoreo 0,387b Grupo vegetal Pastos 0,707b Herbceas 0,325bc Arbreas 0,228c Arbustivas 0,033c Total 1,449a EEM 0,118 Metabolismo ecolgico 0,256b EEM 0,118

Densidad animal, venados /ha Autor, (ao) Romo, (1987) Villalobos, (1998) Kobelkowsky y col (2000)
1 2 abc

1975 0,0065

1978 0,0159

1984 0,02-0,04 0,0241

1991 0,0181

1996 0,027

2000

0,0231

Materia seca. Energa digestible. Literales distintos son diferentes estadsticamente, Tukey (P < 0,05).

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CAPACIDAD DE CARGA, ODOCOILEuS VIRGINIANuS, REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES, VEGETACIN

(DP) del venado cola blanca en los aos del muestreo y subsecuentes publicados por Romo (1987), Villalobos (1998) y Kobelkowsky y col (2000). Dentro de mtodos, la estimacin de K utilizando la MS gener el valor ms alto, mientras que la estimacin por PC produjo valores intermedios y el uso de ED, PP y EM generaron los valores ms bajos. Dentro de grupos vegetales, la estimacin ms alta de K se obtuvo con la sumatoria de la biomasa de los diferentes grupos, mientras que las gramneas y las herbceas generaron valores intermedios y tanto las arbreas como las arbustivas tuvieron los valores menores; sin embargo, slo estas ltimas tuvieron un valor de K menor a la DP. El anlisis de los contrastes mostr que dentro de los mtodos evaluados tanto la suma de las herbceas con las arbustivas versus los pastos y las arbreas como la de las arbustivas con las arbreas versus los pastos y las herbceas tuvieron una menor K (0,15 vs. 0,33 P < 0,01 y 0,10 vs. 0,38 P < 0,002). DISCUSIN Las diferencias en la biomasa vegetal y en la cantidad de componentes nutritivos disponibles aportados por cada grupo vegetal pueden ser explicadas parcialmente en base a la ausencia de actividad ganadera que tena el rancho antes de convertirse en coto de caza. Holecheck y col (2006) han revisado y discutido en forma abundante los efectos del pastoreo en la vegetacin; sus datos muestran que dicha actividad incrementa la cantidad de gramneas y reduce el nmero de arbustivas presentes en un sitio. Sin embargo, cuando dicha actividad desaparece por efecto de exclusin del ganado la sustitucin de gramneas por herbceas y arbustivas es mnima si no se realiza una prctica cultural que estimule el crecimiento de las mismas (Adler y col 2004). Tambin, trabajos publicados por Bates (2005) y Bates y col (2005) muestran que la produccin de herbceas y arbustivas se deprime por la ausencia de prcticas de corte o pastoreo de tal forma que se ocasiona una reduccin en la biomasa de las mismas despus de 4 aos. Tobler y col (2003) mostraron que el pastoreo de bovinos modifica la proporcin de especies gramneas en un clima de sabana, por lo que bajo las condiciones de este trabajo, no es sorprendente que la biomasa aportada por los pastos sea mayor que la aportada por los otros grupos vegetales. Por otro lado, la ausencia del efecto de poca del ao ha sido similar a la de otros estudios, que muestran que bajo un estado de equilibrio, la biomasa producida en una comunidad vegetal permanece relativamente constante a lo largo de las diferentes pocas del ao, lo cual se explica como el resultado del incremento de la MS de algunas especies vegetales cuando otras tienden a disminuir su produccin en el mismo momento (Buttolph y Coppock 2004). La estimacin de la capacidad de carga es un problema que ha sido tratado de resolver desde hace mucho tiempo

utilizando diversas metodologas que incluyen la disponibilidad de la MS (McCall y col 1999), del hbitat de la zona (Warren y Krysl 1983), as como la concentracin de protena y ED de la dieta (McCall y col 1997), usando como referencia el requerimiento de MS, protena o energa de un venado cola blanca estndar. Sin embargo, dentro de la literatura revisada, slo el estudio de Mandujano (2007) ha contrastado la capacidad de carga estimada con la densidad poblacional, lo cual sera el criterio de comparacin ms cercano para la evaluacin del parmetro estimado. La comparacin de la K con la DP es importante, dado que de acuerdo con Mandujano (2007), cuando un rea no tiene disturbios, la K es igual a la DP ms los animales muertos por los predadores y, en consecuencia, las K estimadas correctamente son aquellas que se acercan ms a la DP. En ese sentido, nuestros resultados indican que tanto los mtodos como los componentes nutritivos seleccionados para determinar el requerimiento del animal tienen un impacto en la estimacin de la capacidad de carga. A menor exigencia en el requerimiento de forraje o de nutrientes, mayor K estimada. Por ejemplo, si se compara la capacidad de carga estimada a partir de la concentracin de ED de los grupos vegetales (0,451) con la estimada en base al metabolismo ecolgico (0,256), se puede apreciar que, al no considerar el gasto energtico adicional al metabolismo basal lleva a una sobrestimacin de la misma. El clculo original de Moen (1978) para estimar el metabolismo ecolgico del venado es laborioso; sin embargo, el uso de programas disponibles en plataformas permite determinar el requerimiento en forma sencilla considerando otros factores (poca del ao, sexo, estado fisiolgico) y mejora la estimacin del requerimiento energtico evitando la subestimacin del mismo. La metodologa basada en presin de pastoreo tiene la ventaja de ser ms sencilla en su uso para los manejadores de fauna silvestre, pues no requiere el clculo del requerimiento energtico del venado en vida libre. Los resultados de esta estimacin muestran que el uso de biomasa total, as como el de gramneas, arbreas y herbceas, resulta en valores ms altos que la DP, lo cual sobrestima el nmero de animales que puede soportar el rea; en contraste, la estimacin de K con arbustivas resulta en valores que indican que podra estar cercana a la DP (0,04 venados/ha), dicha DP se mantiene a lo largo del tiempo durante al menos 15 aos despus del estudio (cuadro 2), lo que corrobora entonces que la estimacin de capacidad de carga a partir de las arbustivas es un mtodo que permite obtener valores cercanos a la misma. Aunque diversos investigadores han mostrado que el venado cola blanca tiene una dieta basada predominantemente en especies arbustivas y arbreas (85%), las herbceas y gramneas forman parte de su dieta (Gallina 1993, Plata y col 2009). Tambin se ha demostrado la tendencia de dicha especie a migrar a reas con una menor biomasa vegetal si esta es de mayor calidad nutritiva (Mandujano y col 2004). 47

FX PLATA Y COL

La estimacin de la K a partir de la sumatoria de todas las especies vegetales est fundamentada en las preferencias de los rumiantes por las especies vegetales y el hecho de que los venados tienen una dieta diversa, por lo que se puede utilizar la sumatoria de la biomasa de los diversos grupos vegetales que el animal consume (Stuth y Sheffield 2001). Sin embargo, nuestros resultados sugieren que el uso de biomasa total no es viable para estimar la K porque la proporcin de grupos vegetales consumidos no es homognea, por lo que se requerira identificar la preferencia del grupo vegetativo consumido por cada tipo de rumiante y as corregir los aportes. La estimacin de K con base a las gramneas resulta en valores mayores que la DP; adems, su uso como estimador para venados puede ser biolgicamente cuestionado. Estudios de composicin de dieta del venado cola blanca en Mxico indican que los pastos pueden estar del 0 al 6% (Martnez y col 1997, Clemente y col 2005, Plata y col 2009). La baja capacidad de los selectores de concentrados para incluir gramneas en su dieta (< 25%) ha sido establecida claramente por Janis y col (2000) y est asociada al tamao y requerimiento metablico del animal, pues se ha establecido que las especies con menor tamao tienen un mayor gasto energtico y una mayor velocidad de trnsito intestinal que las especies grandes, por lo que estn obligados a buscar tanto las especies vegetales como las partes ms nutritivas de la planta que garanticen su supervivencia (McNaughton y Georgiadis 1986). La estimacin de K basada en herbceas y arbreas produce valores mayores a la DP. En el caso de las herbceas se ha detectado que bajo condiciones de pastoreo tanto de animales domsticos como silvestres uno de los impactos ms comunes es la modificacin de la composicin de tal forma que aumenta el nmero de plantas indeseables por dichas especies (Gonzales y Clements 2010), esta proliferacin de especies no consumidas puede explicar el aumento de K y la baja DP del sitio. Por su parte, el uso de arbustivas estimara una capacidad de carga muy similar a la DP, lo cual se puede explicar por el hecho de que este grupo constituye uno de los principales alimentos consumidos por el venado. En la zona de estudio, este grupo se ha encontrado como componente de la dieta del venado cola blanca desde el 39% (Kobelkowsky 2000) hasta el 49% (Clemente y col 2005). Tambin, los trabajos de Stewart y col (2000) muestran la predileccin que tienen los venados hacia los arbustos. Sus datos muestran que independientemente de la cobertura los venados prefieren reas con ms presencia de arbustivas que de herbceas. Paton y col (1999) utilizaron la EM de este grupo vegetal para estimar la K en reas naturales de Espaa con buenos resultados, por lo que en trminos prcticos lo ms sencillo sera estimar la K a partir de la disponibilidad de MS de arbustivas utilizando el modelo con la presin de pastoreo, mientras que lo ms complicado es estimar dicha variable a partir de la EM y el metabolismo ecolgico del venado.

Se concluye que la determinacin de la capacidad de carga en venado cola blanca debe considerar sus preferencias alimenticias, la seleccin del mtodo y el impacto que tienen los requerimientos de nutrientes en la estimacin del parmetro. Los mtodos en base a energa y PP producen mejores estimaciones que los mtodos basados en N o MS, dado que los resultados son ms cercanos a la densidad poblacional y se esperara que no pusiesen en riesgo a largo plazo el uso sustentable del recurso vegetal. Tanto el uso de biomasa total como de pastos, herbceas y arbreas producen una sobrestimacin de la capacidad de carga, por lo no se recomiendan para estimar K. Bajo las condiciones de este trabajo la estimacin de K a partir de la biomasa disponible de las arbustivas produce la mejor aproximacin a la DP del rea. RESUMEN
Debido a la importancia que tiene la metodologa en la estimacin de la capacidad de carga (K animales/ha) en venado cola blanca, los objetivos de este trabajo fueron: 1) Comparar la estimacin de la K por cinco mtodos; tres basados en disponibilidad de compuestos nutritivos (materia seca (MS), energa digestible (ED) y nitrgeno (N)), otro basado en la presin de pastoreo y un ltimo en el requerimiento de energa metabolizable (EM) estimado con base al metabolismo ecolgico del venado, y 2) Comparar la K estimada al usar la biomasa total o por los grupos de vegetales consumidos por el venado (gramneas, herbceas, arbustivas y arbreas). Se utiliz la informacin de composicin de la dieta y de biomasa de un rancho cinegtico localizado en Aguascalientes, Mxico. Los resultados fueron analizados de acuerdo a un modelo con arreglo factorial (5 x 5), donde los factores fueron el mtodo de estimacin y el grupo vegetal. Los valores de K estimados con biomasa total fueron los mayores (1,449), seguidos por los pastos (0,707), luego por las herbceas (0,325), mientras que los estimados con arbreas y arbustivas dieron los menores valores (0,228 y 0,03). La estimacin de K por medio de plantas arbustivas (0,033 venados/ha) proporciona un valor ms similar al de la densidad poblacional (0,02-0,04 venados/ha) que el estimado con otros grupos vegetativos, independientemente del mtodo seleccionado (disponibilidad de MS, ED, N, metabolismo ecolgico y la presin de pastoreo). Considerando la densidad poblacional (0,02-0,04 venados/ha) como el indicador apropiado para evaluar la capacidad de carga, se concluye que debe estimarse con base a la disponibilidad de arbustivas.

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Arch Med Vet 43, 51-58 (2011) ARTCULO ORIGINAL

Evaluacin a travs de tomografa computarizada del efecto de una infusin endovenosa de ketamina en el desarrollo de atelectasia inducida por anestesia general en perros
Evaluation of an endovenous ketamine infusion through computed tomography on the development of pulmonary atelectasis due to general anesthesia in dogs
CA Henrqueza, LM Mieresb*, HA Bustamanteb, DE Herzbergb, CE Campilloa, MP Cabrerab, MA Gmezc
aPrograma

bInstituto

de Doctorado en Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. de Medicina Preventiva Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. cInstituto de Farmacologa y Morfofisiologa, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
SUMMARY

The aim of this study was to assess through computed tomography the presence of pulmonary atelectasis in dogs under inhalatory anesthesia and evaluate the effect of an endovenous ketamine infusion upon it. For this purpose 12 dogs separated in two groups (A and B) of 6 dogs each were used. Both groups were subjected to the same anesthetic protocol. The protocol consisted in premedication with xilacine IM, induction with propofol IV and maintenance with inhalatory anesthesia for a period of two hours. The group B received also a ketamine infusion. Computed tomographic images were taken at 0, 60 and 120 minutes, with the purpose of monitoring developments of atelectasis. In 58% of the dogs it was possible to determine the presence of some degree of atelectasis. In these animals atelectasis was observed in all the cases, but only in one lung. Atelectasis was found in 5 animals in the group without infusion of ketamine and in 2 animals in the group with infusion. The collapsed lung zones ranged between 0.13 and 8.03 cm2 in group A, and 0.07 and 2.10 cm2 in group B. Results indicated that ketamina infusion did not influence the presentation of pulmonary atelectasis. With regard to the evolution of the atelectasis through time, slight changes were observed in both groups, not being statistically significant (P > 0.05). Palabras clave: atelectasia, anestesia, tomografa computarizada, perro. Key words: atelectasis, anesthesia, computed tomography, dog.

INTRODUCCIN El intercambio gaseoso ptimo requiere el transporte conjunto de aire y de la sangre hasta el alvolo (ventilacin y flujo sanguneo), por lo que la relacin de ventilacin y perfusin (V/Q) es vital. De forma ideal el pulmn debiera recibir volmenes equilibrados tanto de ventilacin como de perfusin. En condiciones reales, existe un cierto desequilibrio V/Q en parte como resultado de la accin de las fuerzas de gravedad sobre el pulmn, como se aprecia en animales de gran tamao (como por ejemplo equinos) en decbito, sobre todo supino y lateral (Robinson 2003). La anestesia general y enfermedades pulmonares acentan el desequilibrio V/Q y por lo tanto perjudican el intercambio de gases (Robinson 2003). En humanos se puede encontrar aproximadamente entre 16 a 20% del parnquima pulmonar hipoventilado o colapsado durante la anestesia, generando zonas de baja relacin V/Q y shunt pulmonar (Hedenstierna y col 1986). El colapso ocurre con regularidad durante el periodo de induccin anestsica, pero puede persistir an despus

Aceptado: 06.10.2010. * Casilla N 567, Valdivia, Chile; mmieres@uach.cl

de finalizado el proceso anestsico y contribuye significativamente a aumentar los gastos de atencin de salud, la convalecencia e incluso aumenta la probabilidad de enfermedad y muerte (Magnusson y Spahn 2003). En la dcada de los ochenta fue diagnosticado en humanos por primera vez el colapso alveolar producido por anestesia. Esto fue observado tanto en pacientes neonatos como adultos gracias a la introduccin de nuevas tcnicas de rayos X como la tomografa computarizada (TC) (Magnusson y Spahn 2003). Este colapso alveolar se denomin atelectasia pulmonar, la cual era producida por la anestesia (Tusman y col 2002). En 1985, Brismar y col mostraron que 5 minutos posterior a la induccin de la anestesia aparecan picos de densidad en ciertas reas de ambos pulmones. Luego Hedenstierna y col (1989) tambin encontraron estos aumentos de densidad en ovejas anestesiadas, demostrando a travs de microscopa que estas densidades se trataban de regiones pulmonares atelectsicas (Pedersen y col 1992). La cantidad de tejido atelectsico est determinada por la magnitud del shunt producido por la anestesia (Warner y col 1996). La atelectasia pulmonar aparece en el 90% de los pacientes humanos sometidos a un procedimiento de anestesia general (Gunnarsson y col 1991). Esto convierte a la atelectasia en una de las complicaciones ms frecuentes en pacientes quirrgicos. Se puede presentar de forma 51

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subclnica y resolverse espontneamente en 24 a 48 horas o persistir por mayor tiempo (Brooks-Brunn 1995). En general se describen distintos factores que influyen en la presentacin y severidad de la atelectasia pulmonar durante un proceso anestsico. Dentro de estos factores destaca el posicionamiento, siendo ms severa cuando los pacientes mantienen un decbito supino, presentndose de manera ms pronunciada cercana al diafragma, disminuyendo hacia el pex pulmonar (Reber y col 1996). Adems se ve asociada con la edad, siendo mucho ms severa en pacientes peditricos. Condicin corporal, Strandberg y col (1987), utilizando imgenes de tomografa, observaron una alta correlacin entre el porcentaje de atelectasia y la masa corporal, explicando la mayor presentacin de sta en pacientes con obesidad. Otro factor es el porcentaje de oxgeno inspirado, siendo este punto en el que se ha puesto mayor atencin en el ltimo tiempo, ya que se ha descubierto que a una menor concentracin de oxgeno inspirado el porcentaje de atelectasia presentado es menor y se presenta luego de un tiempo mayor de anestesia (Staffieri y col 2007). Por ltimo se destaca el tipo de anestsico utilizado, ya que por ejemplo la ketamina no produce atelectasia. La ketamina es un anestsico inyectable, que pertenece junto a la fenciclidina y la tiletamina al grupo de los anestsicos disociativos (Sumano y Ocampo 1997). En pacientes con ventilacin espontnea la administracin de la mayora de los anestsicos causa una inmediata baja de la Capacidad Residual Funcional (CRF), lo cual resulta en un aumento de la diferencia entre la oxigenacin arterial y alveolar (Gooding y col 1977). El uso de anestsicos que mantengan el tono muscular pulmonar previene la aparicin de atelectasia. La ketamina aparece como el nico anestsico con la capacidad de mantener la CRF y por ende prevenir la presentacin de atelectasia, reduciendo as la capacidad de presentar hipoxemia intraoperatoria (Tweed y col 1972, Gooding y col 1977, Tokics y col 1987, Hedenstierna 2003). Durante la anestesia con ketamina en pacientes con ventilacin espontnea el volumen total puede ser mantenido al mismo nivel que en estado consciente (Tokics y col 1987). Adems, hay cambios mnimos en el intercambio gaseoso y ausencia de atelectasia y shunt. Al parecer esto sera debido a la mantencin del tono del msculo esqueltico y a la mantencin de la presin vascular (Hass y Harper 1992). Ketamina administrada en perros en infusiones de 10 ug/kg/min otorga analgesia adecuada en pacientes sometidos a intervenciones quirrgicas (Wagner y col 2002) y es capaz de reducir la concentracin alveolar mnima de isoflurano en un 25% (Muir y col 2003). Adicionalmente, en el estudio de Muir y col (2003), el efecto analgsico de ketamina se asoci a un incremento significativo de la presin arterial media (PAM) en comparacin a la PAM de perros mantenidos anestsicamente slo con isoflurano. Previamente otros autores han sealado el efecto analgsico de dosis bajas de ketamina en perros sin reportar efectos adversos asociados (Ko y col 2001, Slingsby y 52

Waterman-Pearson 2000), sin embargo, no se ha reportado si ketamina administrada en la dosis mencionada anteriormente puede reducir el porcentaje de atelectasia pulmonar en perros sometidos a anestesia general inhalatoria. La TC ha emergido como el mtodo imagenolgico preferido para el pulmn, debido a la amplitud de niveles de atenuacin entre las estructuras, gran resolucin y velocidad. A partir de las imgenes pulmonares obtenidas mediante tomografa computarizada es posible medir el volumen, distribucin y comportamiento de la ventilacin bajo varias condiciones clnicas (Duggan y Kavanagh 2005). En contexto de lo anterior se plante como hiptesis que la administracin de una infusin endovenosa de ketamina en perros bajo anestesia general inhalatoria previene el desarrollo de atelectasia pulmonar. Para ello se establecieron como objetivos: determinar el porcentaje de atelectasia pulmonar en caninos sometidos a anestesia inhalatoria y el efecto de una infusin endovenosa de ketamina sobre la presentacin de atelectasia pulmonar en caninos bajo anestesia inhalatoria. MATERIAL Y MTODOS El estudio se realiz en el Hospital Clnico Veterinario de la Universidad Austral de Chile. Se utilizaron 12 caninos (Canis lupus familiaris), entre 2 y 6 aos de edad, con un peso entre 25 y 45 kilogramos, sin distincin de sexo y raza, clnicamente sanos y con una condicin corporal de 3 (escala de 1-5). Tanto el mantenimiento como el procedimiento realizado en ellos estuvieron de acuerdo con las directrices de la gua para el cuidado y uso de animales de laboratorio. A los animales se les retiraron los alimentos slidos y lquidos doce y seis horas, respectivamente, antes del inicio del estudio. Cada animal fue premedicado con xilacina a una dosis de 1 mg/kg por va intramuscular. Posterior a la premedicacin se realiz la induccin anestsica administrando propofol a una dosis de 4,4 mg/kg. Luego los animales fueron intubados y la anestesia fue mantenida con isoflurano en O2 a una concentracin continua durante todo el estudio (1% a 2% vol.). Los animales fueron separados en dos grupos: un grupo A, el cual est comprendido por seis animales a los cuales se les mantuvo nicamente bajo anestesia inhalatoria con isoflurano y un grupo B, comprendido por los otros seis animales, el cual fue mantenido mediante anestesia inhalatoria con isoflurano, ms la administracin de una infusin endovenosa de 10 g/kg/min de ketamina (Muir y col 2003). Para esto 60 mg de ketamina fueron diluidos en un litro de cristaloide (NaCl 0,9%), el cual se administr a una razn de 10mL/kg/h, utilizando un equipo de infusin BRAUN, Infusomat fmS. Ambos grupos de animales se mantuvieron anestesiados durante un periodo de dos horas, tiempo durante el cual se monitorizaron sus frecuencias y constantes (frecuencia respiratoria, frecuencia cardiaca, presin arterial, saturacin de oxgeno).

ATELECTASIA, ANESTESIA, TOMOGRAFA COMPUTARIZADA, PERRO

Una vez anestesiados los animales, se procedi a la toma de dos radiografas por individuo, una en decbito lateral derecho y otra en decbito lateral izquierdo, con el fin de descartar la presencia de alguna enfermedad pulmonar preexistente. Los animales fueron posicionados en la mesa de tomografa en decbito prono con las cuatro extremidades en extensin. El examen tomogrfico de la cavidad torcica fue realizado con un equipo TC de 4 generacin Picker JQ/ PQ 4,25 Diagnostic, utilizndose los parmetros tcnicos de 130 kV y 85 mA con un tiempo de adquisicin de 2 segundos. Se realiz una primera tomografa 5 minutos posteriores a la induccin tiempo que dur el posicionamiento de los animales, en la cual se realizaron 3 cortes transversales de trax en la zona entre el pex cardiaco y el diafragma, a intervalos de 2 mm y de un grosor de 5 mm. Posteriormente se realizaron dos tomografas a los 60 y 120 minutos posteriores a la induccin anestsica con los mismos parmetros utilizados en la primera. stas se realizaron con el fin de determinar las variaciones en la cantidad de tejido atelectsico a travs de un procedimiento anestsico prolongado.
VARIABLES A ANALIZAR

utilizada fue W: 1.100 UH; L: -450 UH y en la cual se consideraron como rea pulmonar todos los valores entre +100 y -1.000 HU (figura 1). rea Atelectsica: Las reas con valores de atenuacin entre -100 y +100 HU encontradas en cada corte transversal fueron contorneadas utilizando un recurso del tomgrafo denominado regin de inters, siendo su atenuacin promedio expresada en HU y entregando el rea en mm (figura 2). Para este propsito se utiliz una ventana de W: 200 HU; L: 0 HU. Porcentaje de Atelectasia: Se calcul en base a los resultados de rea pulmonar atelectsica en relacin al rea pulmonar de ambos pulmones por separado y al rea pulmonar total. ANLISIS ESTADSTICO Los resultados de los tres cortes tomogrficos de cada sesin fueron promediados e ingresados a una planilla MS EXCEL y se analizaron mediante el uso de estadstica descriptiva en base a media aritmtica. Se realiz una prueba de normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk y para determinar si existieron diferencias significativas entre las mediciones entre grupos se realiz una prueba para muestras independientes no paramtricas Test de Kruskal-Wallis y para determinar las diferencias entre tiempos se efectu un Test exacto de Friedman. Ambos test con un nivel de significancia de P < 0,05. El programa computacional utilizado fue el Statistix versin 8.0 para Windows (Statistix 8, Copyright 19852003, Analytical Software, USA).

Se realiz la medicin de las distintas variables en los tres cortes en cada tiempo y se promediaron los resultados obteniendo un solo valor para cada variable. rea Pulmonar: Para la medicin de esta rea pulmonar se contorne toda el rea torcica comprendida por cada pulmn exceptuando las reas correspondientes al mediastino, corazn, diafragma y vasos importantes. La ventana

Figura 1. Imagen tomogrfica torcica tomada entre el pex del corazn y el diafragma (izquierda). Imagen en la que se explica el sistema de medicin del rea pulmonar (derecha). C: corazn; PD: pulmn derecho; PI: pulmn izquierdo; VC: vena cava caudal.
Transverse CT image of the thorax taken between the apex of the heart and the diaphragm (left). CT image showing the system for measuring lung area (right). C: heart; PD: right lung; PI: left lung; VC: caudal vena cava.

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Figura 2. Imagen tomogrfica torcica tomada entre el pex del corazn y el diafragma (izquierda). Imagen en la que se explica el sistema de medicin del rea pulmonar atelectsica (derecha). C: corazn; D: diafragma; PD: pulmn derecho; PI: pulmn izquierdo; VC: vena cava caudal.
Transverse CT image of the thorax taken between the apex of the heart and the diaphragm (left) (left). CT image showingthe measurement system for atelectatic lung area determination (right). C: heart; D: diaphragm; PD: right lung; PI: left lung; VC: caudal vena cava.

RESULTADOS Las imgenes obtenidas mediante TC permitieron diferenciar claramente las zonas atelectsicas y determinar por zonas de alta densidad. Adems fue posible diferenciar claramente los distintos mrgenes de las estructuras y los cambios en sus densidades, lo que permite realizar mediciones y comparaciones claras y precisas entre distintos cortes o individuos, por lo que se puede indicar a la TC como un mtodo de gran valor diagnstico en patologas torcicas de pequeos animales. En el cuadro 1 se presenta el grupo sin infusin de ketamina (grupo A) y el grupo con infusin de ketamina (grupo B), indicando con una cruz a aquellos perros en los que se present algn grado de atelectasia (58%) y el pulmn afectado, pudindose observar que un 86% de los individuos que presentaron atelectasia independientemente del grupo, sta se present slo en el pulmn izquierdo. Las frecuencias y constantes no presentaron variaciones apreciables, a pesar de lo largo del periodo de anestesia al cual fueron sometidos los animales. Las mediciones de las reas pulmonares atelectsicas por perro del grupo A y del grupo B, en los cortes 1, 2 y 3, tomadas en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la induccin se presentan en los cuadros 2 y 3. De la misma manera, los registros de los porcentajes de atelectasia del grupo A y del grupo B en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la induccin se presentan en los cuadros 4 y 5. 54

Cuadro 1. Presentacin de atelectasia en pulmones derecho e izquierdo en dos grupos de perros bajo anestesia general (n = 6).
Presentation of atelectasis in the right and left lungs in both groups of dogs under general anesthesia (n = 6).

Grupo A Perro D 1 2 3 4 5 6 + I + + + +

Grupo B D I + +

No presenta atelectasia; + Presenta atelectasia; Grupo A, perros sin infusin de ketamina; Grupo B, perros con infusin de ketamina; D, pulmn derecho; I, pulmn izquierdo.

En los cuadros 2 y 3 se presentan en detalle las reas atelectsicas observadas en los animales del grupo A y B respectivamente, observndose en el caso del grupo A que dos de los animales (perros 1 y 2) presentaron una mayor cantidad de tejido afectado, mientras que los otros tres presentaron cantidades menores. Del mismo modo, en el grupo B se puede observar que solamente uno de los animales (perro 3) present un grado mayor de tejido atelectsico, mientras que el otro animal, present una cantidad muy pequea.

ATELECTASIA, ANESTESIA, TOMOGRAFA COMPUTARIZADA, PERRO

Cuadro 2. reas atelectsicas de los pulmones derecho e izquierdo en los perros sin infusin de ketamina (grupo A), expresadas en mm2 y medidas en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la induccin (n = 6).
Atelectatic areas of the right and left lungs in dogs without infusion of ketamine (group A), expressed in mm2 in minutes 0, 60 and 120 post-induction (n = 6).

Cuadro 3. reas atelectsicas de los pulmones derecho e izquierdo en los perros con infusin de ketamina (grupo B), expresadas en mm2 y medidas en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la induccin (n = 6).
Atelectatic areas of the right and left lungs in dogs with infusion of ketamine (group B), expressed in mm2 in minutes 0,60 and 120 post-induction (n = 6).

Minuto 0 Perro D 1 2 3 4 5 6 0,0 58,7 0,0 0,0 0,0 0,0 I 33,3 0,0 0,0 0,0 5,7 2,3

Minuto 60 D 0,0 68,7 0,0 0,0 0,0 0,0 I 40,0 0,0 0,0 3,3 2,7 3,0

Minuto 120 Perro D 0,0 80,3 0,0 0,0 0,0 0,0 I 54,0 0,0 0,0 10,0 6,7 1,3 1 2 3 4 5 6

Minuto 0 D 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 I 0,0 0,0 21,0 0,7 0,0 0,0

Minuto 60 D 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 I 0,0 0,0 20,3 4,3 0,0 0,0

Minuto 120 D 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 I 0,0 0,0 1,7 3,3 0,0 0,0

D: pulmn derecho; I: pulmn izquierdo.

D, pulmn derecho; I, pulmn izquierdo.

En los cuadros 4 y 5 se observa el porcentaje de atelectasia pulmonar presente en los perros de ambos grupos en estudio. Fue posible determinar que existieron diferencias estadsticamente significativas entre el grupo sin infusin de ketamina y el grupo con infusin (P < 0,05). En cuanto al comportamiento de la atelectasia a travs del tiempo, en el caso del grupo A, a pesar de observarse en algunos animales (perros 1 y 2) una leve tendencia al aumento en los porcentajes de atelectasia pulmonar, sta no fue estadsticamente significativa (P > 0,05). Por otra parte, en los animales del grupo B se aprecia una leve tendencia a la disminucin, particularmente en uno de los perros (perro 3); sin embargo, sta, al igual que en grupo anterior, no fue estadsticamente significativa (P > 0,05). DISCUSIN En este estudio el porcentaje de perros que presentaron atelectasia pulmonar fue del 58%, resultado que no coincide con los presentados por el trabajo realizado por Lundquist y col (1988), quienes estudiaron la presentacin de densidades pulmonares en 28 perros anestesiados con barbitricos y donde se plantea la presentacin de atelectasia en el 7% de los perros anestesiados. Esta diferencia entre los resultados del presente estudio con los de los expuestos por Lundquist y col (1988) puede explicarse debido es que este ltimo no administr oxgeno adicional, por lo que los animales slo fueron ventilados con la concentracin de oxgeno atmosfrico; en cambio, en nuestro estudio y en el realizado por Aneli (2005) se administr una concentracin inspiratoria de oxgeno de un 100%, lo cual, como ya se ha explicado, disminuye el tiempo de aparicin y aumenta el porcentaje de tejido pulmonar atelectsico. Otra razn que puede explicar

Cuadro 4. Porcentaje de atelectasia pulmonar en relacin al rea pulmonar total, presentada en los perros sin infusin de ketamina (grupo A), en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la induccin (n = 6).
Percentage of lung atelectasis in relation to the total lung area in dogs without ketamine infusion (group A), in minutes 0, 60 and 120 post-induction (n = 6).

Perro 1 2 3 4 5 6

Minuto 0 0,26% 0,37% 0,00% 0,00% 0,04% 0,02%

Minuto 60 0,31% 0,44% 0,00% 0,00% 0,02% 0,02%

Minuto 120 0,44% 0,52% 0,00% 0,09% 0,05% 0,01%

Cuadro 5. Porcentaje de atelectasia pulmonar en relacin al rea pulmonar total, presentada en los perros con infusin de ketamina (grupo B), en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la induccin (n = 6).
Percentage of lung atelectasis in relation to the total lung area in dogs without ketamine infusion (group B), in minutes 0, 60 and 120 post-induction (n = 6).

Perro 1 2 3 4 5 6

Minuto 0 0,00% 0,00% 0,18% 0,01% 0,00% 0,00%

Minuto 60 0,00% 0,00% 0,17% 0,04% 0,00% 0,00%

Minuto 120 0,00% 0,00% 0,02% 0,03% 0,00% 0,00%

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los distintos resultados entre los estudios es la diferencia de pesos entre los perros en estudio, ya que Lundquist y col (1988) utilizaron perros mestizos con un promedio de peso de 18,7 kg, mientras que en este estudio se utilizaron perros con un peso superior a los 25 kg, situacin que se asemeja a lo realizado por Aneli (2005), quien utiliz 16 perros adultos de raza Rottweiller, encontrando en ellos un porcentaje de presentacin de atelectasia de un 43,75%, similar a los resultados de esta investigacin. Destaca el hecho que en el 86% de los perros, en los que se present algn grado de atelectasia pulmonar, sta se ubic en el pulmn izquierdo, hecho que no aparece mencionado en la literatura y que pudiese deberse a un factor anatmico particular de esta especie, como lo pudiese ser la marcada diferencia en la lobulacin y que predisponga a la mayor ocurrencia de colapso en ese pulmn. Es posible adems encontrar diferencias con estudios realizados en pacientes humanos, como los realizados por Rothen y col (1999), Sargent y col (1999), Hedenstierna y col (2000), Benit y col (2002), los cuales registraron que entre un 85% y 90% de ellos presentaban atelectasia pulmonar. Segn Aneli (2005), algn factor fisiolgico relevante no determinado an puede estar relacionado con la diferencia notable entre las especies. Nyman y col (1990) realizaron un estudio del deterioro del intercambio gaseoso en caballos, y Hedenstierna y col (1989) trabajaron en un modelo ovino en el cual se pudo apreciar la presencia de opacidades en los pulmones que al ser estudiadas histolgicamente se determin que eran zonas atelectsicas, acompaadas de edema y una leve congestin vascular. Ambos estudios determinaron que en las distintas especies animales se presentan opacidades pulmonares dependientes de la gravedad, pero con algunas diferencias histolgicas. El rea pulmonar atelectsica vari entre 0,7 y 80,3 mm2, similar a lo presentado por el trabajo de Rothen y col (1996), quienes obtuvieron reas con atelectasia que variaron entre 2 y 80 mm2. Ellos estudiaron el volumen de atelectasia presentado por sus pacientes con una distinta concentracin inspiratoria de oxgeno. Distintos autores, entre los que destacan Rothen y col (1995), Reber y col (1996) y Edmark y col (2003), plantean que una concentracin elevada de oxgeno promueve la formacin de atelectasia. En el presente estudio los resultados obtenidos demostraron una pequea cantidad de sta, lo que hace concordar con lo planteado por Aneli (2005), quien sugiere que no est contraindicado el uso de una elevada concentracin de oxgeno en la especie canina. Por otro lado, Staffieri y col (2007) describen que la diferencia de presentacin de atelectasia dada por los cambios en la concentracin de oxgeno, s existe en caninos anestesiados y sometidos a una ciruga abdominal, especficamente a una ovariohisterectoma, obteniendo como resultados mayor cantidad de tejido atelectsico y una diferencia marcada entre concentraciones de 100% (12,8 3,7 cm2) y 40% (2,5 0,9 cm2) de oxgeno, lo 56

cual hace pensar que un factor principal en cuanto a la cantidad de tejido atelectsico presente durante la anestesia, ms que la anestesia misma, es la incapacidad del diafragma de mantener la diferencia de presin durante la ciruga abdominal. Los porcentajes totales de atelectasia pulmonar variaron entre un 0,01% y 0,52%, similares a los resultados presentado por Aneli (2005), los que variaron entre 0,05% y 1,20% y Lundquist y col (1988) en el cual el porcentaje fue de un 1%. Por otra parte es distinto a los resultados del trabajo de Bletz y col (2004), el que fue realizado con 8 cerdos y en el cual se registraron las diferencias de mediciones de atelectasia entre la tomografa helicoidal y de corte dinmico donde obtuvieron resultados de 19,0% y 28,4%, respectivamente. Tambin difieren con los resultados presentados por Hedenstierna y col (1989), cuyos autores encontraron porcentajes entre un 3% y 4%; estudio realizado en humanos. El grupo tratado con ketamina present diferencias estadsticamente significativas con respecto al grupo sin ella. Esto concuerda con los resultados descritos por Tokics y col (1987), segn los cuales slo hubo presencia de atelectasia en uno de ocho pacientes durante la anestesia con ketamina, concluyendo que al no producirse la relajacin de la pared diafragmtica, as como tampoco una disminucin significativa de la presin vascular pulmonar, esto impedira que disminuya de manera importante la CRF, permaneciendo sta mayor a la capacidad de cierre, evitando as el colapso y la presentacin de atelectasia. La diferencia presentada entre los estudios puede deberse a que Tokics y colaboradores realizaron su estudio con humanos, quienes, como se ha planteado anteriormente, presentan una mayor cantidad de tejido atelectsico en comparacin a los perros. Adems, la ketamina fue administrada en bolo como anestsico principal, lo cual difiere al presente estudio donde se administr como infusin a una dosis de 10 g/kg/min, lo cual pudo resultar insuficiente para causar el efecto de mantencin del tono muscular pero que tiene un efecto en la presin vascular pulmonar, lo cual pudiese producir una disminucin en la susceptibilidad a producir atelectasia. En relacin al tiempo de aparicin de atelectasia, sta se present en la primera tomografa, la que se denomina en el presente estudio como la tomada en el minuto 0, la cual en realidad era tomada aproximadamente 5 minutos luego de la induccin, tiempo que se ocupaba para el posicionamiento del animal en el tomgrafo. Esto es similar a lo expuesto por Brismar y col (1985) y Rothen y col (1995), a quienes utilizando una concentracin de oxgeno de un 100%, que fue la misma utilizada en el presente estudio, la atelectasia se present de igual manera a los 5 minutos posteriores a la induccin. Asimismo difiere de lo presentado por Rothen y col (1995) que al utilizar una concentracin de oxgeno de un 40% la atelectasia se present a los 40 minutos luego de la induccin, lo cual se explica por lo planteado anteriormente.

ATELECTASIA, ANESTESIA, TOMOGRAFA COMPUTARIZADA, PERRO

En cuanto a la influencia del tiempo de anestesia sobre la atelectasia, no hubo diferencias estadsticamente significativas entre los minutos 0, 60 y 120 postinduccin. Esto es explicado por Duggan y Kavanagh (2005), quienes describen el impacto del tiempo sobre la atelectasia. Ellos plantean que la mxima disminucin del CRF se produce unos pocos minutos luego de la induccin anestsica y que ste no est influenciado por la profundidad ni el tiempo de anestesia. Es de esta manera que podemos concluir que fue posible determinar que un 58% del total de perros en estudio present algn grado de atelectasia pulmonar. La infusin de ketamina influy significativamente en la presentacin de atelectasia pulmonar, debido a que no hubo diferencias estadsticamente significativas en los porcentajes de atelectasia presentados entre el grupo de perros con infusin y el grupo sin infusin. No existi diferencia estadsticamente significativa entre los porcentajes de atelectasia presentados en ambos grupos a los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la induccin, y por ltimo que en el 86% de los perros que presentaron atelectasia sta se present en el pulmn izquierdo, sugiriendo que existe algn factor posiblemente anatmico que predispone a la mayor presentacin en ese pulmn. RESUMEN
El objetivo del estudio fue evaluar, a travs de tomografa computarizada, el efecto de una infusin endovenosa de ketamina sobre la atelectasia pulmonar en perros sometidos a anestesia inhalatoria. Para esto se utilizaron 12 perros separados en dos grupos (A y B) de 6 perros cada uno. Ambos fueron sometidos al mismo protocolo anestsico que consisti en premedicacin con xilacina, induccin con propofol y mantencin con anestesia inhalatoria por un periodo de dos horas. Al grupo B se le administr adems una infusin de ketamina. Se realizaron cortes tomogrficos 1 cm craneal al diafragma, en los minutos 0, 60 y 120 posteriores a la induccin, con el fin de monitorear la evolucin en el caso de presentarse atelectasia. La totalidad del estudio fue realizado en las dependencias del Hospital Clnico Veterinario de la Universidad Austral de Chile. Se determin la presencia de atelectasia en diferentes grados en el 58% de los perros, observndose en la totalidad de los animales en slo uno de los pulmones. Adems se present en 5 perros en el grupo sin infusin de ketamina y slo 2 en el grupo con infusin. Asimismo, las reas atelectsicas variaron entre 0,13 y 8,03 cm2 en el grupo A y 0,07 y 2,10 cm2 en el grupo B. La infusin de ketamina no influy en la presentacin de atelectasia pulmonar. Con respecto a la evolucin de la atelectasia a travs del tiempo, se apreciaron leves cambios en ambos grupos, los cuales no fueron estadsticamente significativos (P > 0,05).

REFERENCIAS
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CA HENRQUEZ Y COL

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Arch Med Vet 43, 59-64 (2011) ARTCULO ORIGINAL

Utilizacin de fascia lata alognica para la herniorrafia perineal canina: comunicacin de 7 casos clnicos
Use of allogenic fascia lata in perineal herniorrhaphy in dogs: communication of 7 clinical cases
GG Semigliaa*, DF Izquierdoa, JH Zuninob
aUniversidad de la Repblica Oriental del Uruguay, Departamento de Pequeos Animales, Facultad de Veterinaria, Universidad de la Repblica Oriental del Uruguay, Montevideo, Uruguay. bBanco de rganos y Tejidos, Facultad de Medicina, Hospital de Clnicas, Montevideo, Uruguay.

SUMMARY The aim of this study was to describe and evaluate the treatment of perineal herniorrhaphy in dogs using allogeneic fascia lata. For this purpose, fascia lata was obtained from dog weighing 15 kg or more, whose death cause did not involve infectious or oncologic conditions, nor collagen- disease or trauma, or surgical scars to the thighs. The fascia lata was preserved in 75% glycerin solution. Seven patients with unilateral perineal hernia were selected for this clinical trial. Using a perineal approach, the hernia was reduced, muscles repositioned, and reconstruction was achieved suturing the fascia lata with interrupted 0 Nylon monofilament suture. Evaluations were made at 7, 15, 30 and 60 days, to assess the following parameters: defecation, micturition, local inflammation, and pain. The allogeneic graft was not rejected, and the herniorrhaphy technique was successful in all cases. No post-surgical complications were observed at 60 days after, while defecation, micturition and regional anatomy returned to normality. Allogeneic processed fascia lata has herein demonstrated to be biocompatible and well tolerated, thus allowing to be considered a safe and useful option to perineal herniorrhaphy technique in dogs. Palabras clave: herniorrafia, injerto, alognico, canino. Key words: herniorrhaphy, graft, allogeneic, dogs.

INTRODUCCIN La hernia perineal (HP) ha sido reportada en varias especies, siendo la canina la ms afectada (Hosggod y col 1995, Fossum y col 1999, Duval y col 2001). Esta patologa resulta de la debilidad y separacin de los msculos y la fascia que conforman el diafragma plvico, permitiendo que el recto y contenido plvicos y/o abdominales se desplacen hacia caudal (Hedlund 2004). El diafragma plvico est compuesto por los msculos elevador del ano, coccgeo y la fascia perineal profunda y superficial (Hedlund 2004). Cualquier canino de raza pura o mestiza puede afectarse, pero hay ciertas razas predispuestas como el Terrier de Boston, Collie, Bxer, Pekins, Corgi gals, Kelpie, Caniche miniatura, Pastor alsaciano, Boyero de flandes, Antiguo pastor ingls, Dachshund y mestizos (Anderson y col 2001, Hedlund 2004). La HP afecta fundamentalmente a machos adultos a partir de los 5 aos de edad, en su mayora enteros, aunque pueden verse afectados tambin los castrados, y se han documentado unos pocos casos en hembras (Brown y

Aceptado: 06.10.2010. * Juan Spikerman 2180, CP 11.700, Montevideo, Uruguay. gsemigli@adinet.com.uy

Udall 1964, Anderson y col 2001). Los contenidos de la HP son en orden de prevalencia la grasa retroperitoneal, lquido seroso, recto, prstata, vejiga urinaria e intestino delgado (Anderson y col 2001). Los signos clnicos incluyen tumefaccin en regin perineal unilateral o bilateral con predominio del lado derecho, tenesmo fecal y urinario, constipacin, obstipacin, disquecia y retencin urinaria (Bellenger y Canfield 2003, Hedlund 2004). La causa especfica de la hernia perineal an no ha sido establecida. Sin embargo, factores causales postulados incluyen: desequilibrio de hormonas gonadales (Hosggod y col 1995), esfuerzo contra el diafragma plvico como resultado de prostatomegalia (Dorn y col 1985) y/o enfermedad rectal (Hosggod y col 1995), y variacin anatmica de la musculatura del diafragma plvico por atrofia muscular de origen neurognico (Bellenger y Canfield 2003, Hedlund 2004). El tratamiento de eleccin para la HP es el quirrgico, existiendo varias tcnicas para su resolucin; las dos ms comunes son la herniorrafia convencional (estndar) (Weaver y Omamegbe 1981) y la transposicin del msculo obturador interno (Anderson y col 2001). Otras tcnicas descritas son: la transposicin de colgajos musculares tales como los msculos semitendinoso (Mann y Constantinescu 1998), glteo superficial (Weaver y Omamegbe 1981) o la combinacin de ambos; la utilizacin de flap miocutneo del msculo gracilis (Bellenger y Canfield 2003). 59

GG SEMIGLIA Y COL

Diferentes tcnicas y materiales tales como colgeno porcino (Frankland 1986), submucosa intestinal porcina (Stoll y col 2002), mallas de polipropileno (Matera y col 1981, Fossum y col 1999, Shoukry y col 1997) y fascia lata autgena (Bongartz y col 2005) se han utilizado en la plastia de hernias perineales en caninos. Se han reportado varios usos de fascia lata en ciruga veterinaria, tales como en la reparacin de ligamento cruzado craneal (Carvalho Buquera y col 2002), reparacin de tendn calcneo comn (Shani y Shahar 2000), reparacin de defectos uretrales (Gultekin y col 2005), reemplazo total de ligamento patelar (Gemmil y Carmichael 2003), estabilizacin de articulacin coxofemoral (Seullner Brando y col 2002) y en herniorrafia perineal (Bongartz y col 2005). En este ltimo caso de forma autgena. Sin duda los materiales biolgicos obtenidos de fuentes seguras y procesados adecuadamente aseguran su biocompatibilidad y buena tolerancia en injertos e implantes alognicos. El objetivo de este estudio fue determinar la biocompatibilidad de la fascia lata alognica conservada en glicerina al 75%, para ser utilizada en la herniorrafia perineal canina. MATERIAL Y MTODOS Para la extraccin de fascia lata fueron elegidos animales mayores de 15 kg, cuyo motivo de muerte no fue ninguna enfermedad infecciosa u oncolgica, adems de carecer de colagenopatas y presencia de traumatismos o abordajes quirrgicos previos a nivel del muslo. Los cadveres fueron obtenidos del Hospital del Departamento de Pequeos Animales de la Facultad de Veterinaria de la Repblica Oriental del Uruguay, con previa autorizacin firmada de los propietarios. La extraccin de la fascia lata se realiz dentro de las primeras 6 horas de la muerte del animal, respetando medidas de asepsia quirrgica que incluyeron rasurado del miembro posterior desde la cadera hasta la articulacin tibio-tarsal y antisepsia con solucin acuosa de povidona yodada al 1%. Se procedi a la colocacin de campos estriles, se identificaron los reperes seos, hacia proximal el trocnter mayor del fmur y hacia distal la articulacin fmoro-tibio-rotuliana. Se realiz incisin de piel y celular subcutnea, siguiendo una lnea longitudinal que una a ambos puntos de referencia proximal y distal con una leve curvatura hacia craneal. Llegado al plano de la aponeurosis, se cambia la hoja de bistur. Se extrajo el tejido adiposo que la cubre, quedando as expuesta la fascia lata en toda su extensin. Para facilitar el procesamiento es importante liberar en forma minuciosa el tejido adiposo de la fascia in situ. Luego se procedi a la identificacin de la unin musculotendinosa, de los bordes craneal y caudal, incidiendo los mismos con bistur, de proximal a distal. La fascia lata se libera del plano profundo hacia proximal y se secciona transversalmente a nivel de la unin musculotendinosa. 60

El material extrado se coloc sobre campos estriles, se procedi a cambiar guantes y por medio de rugina se retiraron restos de tejido adiposo. La remocin completa del tejido adiposo se obtuvo sumergiendo el tejido en solucin de ter y alcohol etlico, en proporcin 1:1 por un perodo de 24 hs a 4 C. Posteriormente se lava con 1 litro de solucin fisiolgica en tres etapas, quedando sumergida en suero fisiolgico durante 15 min. Se tomaron muestras para estudio microbiolgico con tapa rotulada, con el autogenerado del donante y fecha de extraccin. Toda la tcnica de coleccin y procesamiento de la fascia lata fue segn lo reportado por Zunino y col 2001. Posteriormente la fascia fue colocada en frasco estril con tapa, conteniendo glicerol al 75% (en proporcin 1:50) (Zunino y col 2001), que fue previamente esterilizado en autoclave modelo Scanlan Morris, Ohlo Chemical & Surgical Equipment Co, Madison, Wisconsin, U.S.A, a 120 C y 1 atmsfera de presin durante 20 minutos. El tiempo de conservacin mximo a una temperatura de 4 C hasta su utilizacin fue de 6 meses. Despus de este tiempo el material es descartado. Siete caninos machos con un rango de edades de 7 a 12 aos, y rango de peso de 4 a 40 kg, que ingresaron al Hospital de Pequeos Animales de la Facultad de Veterinaria de la Repblica Oriental del Uruguay con motivo de consulta de HP unilateral, participaron del trabajo. Fueron evaluados clnicamente, para descartar otras patologas coexistentes (cuadro 1). El estado general de los pacientes fue analizado mediante estudios de Hemograma, Plaquetas, Funcin renal y Funcin heptica. El protocolo anestsico utilizado fue basado en acetilpromazina1 a dosis de 0,05 miligramos por kilo (mg/kg) va intramuscular (IM) y clorhidrato de ketamina2 a dosis de 5 mg/kg va IM como premedicacin; la induccin fue realizada 20 minutos despus con lidocana3 al 2% a dosis de 2,2 mg/kg va intravenosa (IV) lenta y tiopental4 al 2,5% a efecto por va IV; para el mantenimiento fue utilizado isofluorano5 entre 1,5% a 3% con una mezcla de oxgeno del 1%; la analgesia fue realizada junto a la premedicacin y fue realizada con dipirona6 a dosis de 25 mg/kg IV y clorhidrato de tramadol7 a dosis de 2 mg/kg IV; 30 minutos antes de comenzar el acto quirrgico fue administrado bencilpenicilina procanica y dihidroestreptomicina8 a una dosis de 11.000 UI/kg (unidades internacionales por kilo). La regin perineal fue tricotomizada y preparada de forma asptica, y el paciente fue colocado en decbito ventral con la cola llevada hacia craneal. Posterior a la

1 2 3 4 5 6 7 8

Acedan, Holliday. Vetanarkol, Knig. Lidocana, Dispert. Pentovet, Richmond. Isoflurane USP, Halocarbon corporation. Neusal, Dispert. Dalgion, Gramn Bag. Repen, Fatro.

HERNIORRAFIA, INJERTO, ALOGNICO, CANINO

Cuadro 1. Resea y datos patolgicos de 7 caninos machos intervenidos quirrgicamente para reparacin de hernia perianal
Clinical and pathological data of seven patients undergoing herniorrhaphy surgery

Animal 1 2 3 4 5 6 7

Edad (aos) 10 8 12 7 10 10 7

Raza Cruza Ovejero Alemn Cruza Cruza Cruza Cruza Ovejero Alemn

Peso (Kg) 15 40 12 4 17 5 35

Contenido herniario GR, R GR, P GR, R, P, V GR, R, P GR, R GR, R GR, R

Patologa rectal Saculacin Ausente Divertculo Saculacin Divertculo Divertculo Divertculo

Lado afectado Derecho Derecho Derecho Derecho Derecho Derecho Izquierdo

GR: grasa retroperitoneal R: recto P: prstata V: vejiga

colocacin de los campos quirrgicos, se realiz incisin en piel sobre la hernia desde lateral hasta la base de la cola, casi por debajo de la masa herniaria; la incisin es curvada ligeramente hacia lateral en direccin dorsoventral. Una vez que fueron identificados los msculos comprometidos y liberados de sus adherencias, se procedi a la reduccin de la hernia, para posteriormente suturar la fascia lata en el defecto. Para permitir una mejor manipulacin de la fascia lata sta fue sumergida en solucin de suero fisiolgico por 20 minutos para su hidratacin, para posteriormente ser suturada a los msculos esfnter anal externo, coccgeo, obturador interno y ligamento sacrotuberal mediante puntos simples de vicryl N 0 (figura 1). El tamao de la fascia lata a suturar va a ser directamente proporcional al tamao del defecto. Al momento de pasar los puntos por el msculo obturador interno y ligamento sacrotuberal se debe tener cuidado con los nervios perineal y pudendo, y la arteria y vena pudendas internas. Antes de realizar la sntesis rutinaria de subcutneo y piel se realiz palpacin rectal para descartar la posibilidad de presencias de sutura en la luz intestinal. En todos los casos la ciruga es acompaada de orquiectoma escrotal. Los animales fueron medicados en el postoperatorio va oral con amoxicilina ms cido clavulnico9 a dosis de 22 mg/kg cada 12 hs por 15 das, carprofeno10 a razn de 2,2 mg/kg cada 12 h por 3 das y dipirona11 a una dosis de 25 mg/kg durante 7 das. La alimentacin realizada en el postoperatorio fue de racin comercial con alto contenido en fibras en un intervalo de tres horas. Los controles postoperatorios se realizaron a los 7, 15, 30 y 60 das. La valoracin clnica fue realizada

considerando los siguientes criterios usados por Bongartz y col 2005: grado de defecacin (0 = defecacin normal, 1 = leve dificultad, 2 = moderada dificultad y 3 = severa dificultad); grado de inflamacin local (0 = no hay inflamacin, 1 = leve, 2 = moderada, 3 = severa), grado de dolor (0 = sin dolor, 1 = dolor leve, 2 = dolor moderado, 3 = dolor grave). Los parmetros fueron evaluados por el mdico veterinario y por el propietario. RESULTADOS Y DISCUSIN Del total de animales sometidos a ciruga, cinco fueron caninos sin raza definida y dos de la raza Ovejero Alemn. Las patologas rectales encontradas fueron: saculacin (2) divertculo (4) y un animal no present alteraciones rectales. Seis de los pacientes presentaron hernia unilateral derecha y el restante present hernia unilateral izquierda. El contenido herniario fue: grasa retroperitoneal, recto, prstata y vejiga variando su combinacin en cada paciente (cuadro 1). La tcnica quirrgica en todos los casos tard aproximadamente una hora y treinta minutos, y en el transcurso de la misma no se presentaron complicaciones. En la primera semana del postoperatorio se identificaron los mayores grados de inflamacin (figura 2), dolor y dificultades en la defecacin, que fueron disminuyendo en las semanas siguientes llegando a cero en todos los casos en el momento del alta (cuadro 2). El paciente N 2 en la primera semana presenta dehiscencia de tres puntos de la sutura en piel que fue tratada con lavados con solucin fisiolgica al 0,9% tres veces por da, logrndose la cicatrizacin a los 25 das del postoperatorio, luego de cuatro meses de haber recibido el alta mdica regresa a consulta por hernia perineal contralateral al sitio de la ciruga. El paciente N 3 regresa a los 3 meses de haber recibido el alta mdica con una falla renal, que 61

9 10 11

Clavamox, Pfizer. Rimadyl, Pfizer. Novemina, Laboratorio Lazar.

GG SEMIGLIA Y COL

C C A B A B

Figura 1. Sutura de la fascia lata a los msculos (A) esfnter anal externo, (B) obturador interno y (C) coccgeo, descritos en la tcnica quirrgica para herniorrafia perianal en caninos
Suture of the fascia lata to the muscles (A) external anal sphincter, (B) internal obturator, (C) coccygeal, described in the surgical techniques for perineal herniorrhaphy in dogs

Figura 2. A - Preoperatorio, B - 15 das del postoperatorio de paciente canino hembra tratado quirrgicamente por hernia perianal.
A - Preoperative, B - 15 Posoperative days of a patient treated for herniorrhaphy.

no es posible compensar y fallece. A la fecha en el resto de los pacientes no se presentaron recidivas ni indicios de rechazo del injerto (fstulas y/o inflamacin). Tradicionalmente la tcnica ms empleada para la HP en caninos ha sido la herniorrafia tradicional en base a puntos simples de material absorbible o no absorbible. Varios autores como Bellenger (1980), Mattheison (1989), 62

Anderson y col (2001) y Hedlund (2002) reportan las complicaciones encontradas despus de esta tcnica como lesin del nervio pudendo, incontinencia fecal, infeccin en el sitio de la incisin, dehiscencia de la sutura, incontinencia urinaria y recidiva de la hernia. Estas complicaciones no fueron encontradas en nuestro trabajo con la tcnica de fascia lata alognica. La lesin del nervio pudendo se

HERNIORRAFIA, INJERTO, ALOGNICO, CANINO

Cuadro 2 Evaluacin postoperatoria (7, 15, 30 y 60 das) en los 7 caninos intervenidos quirrgicamente para reparacin de hernia perianal.
Postoperative evaluation (7, 15, 30 and 60 day) in 7 dogs after perineal herniorrhaphy.

Signos clnicos Animal Dolor 1 2 3 4 5 6 7 2 2 2 1 0 2 2 0 1 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 2 2 0 1 2 2 Defecacin 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 3 1 1 1 2 Inflamacin 1 1 1 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 Ninguna Dehiscencia Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Complicaciones

Alta mdica postintervencin (das) 60 60 30 30 60 30 60

evita, porque no es necesario realizar suturas bajo tensin y abarcando gran cantidad de msculo, ya que el defecto creado va a ser cubierto por la fascia lata. La incontinencia fecal, urinaria y recidiva de la hernia no se present hasta el momento en ninguno de los 7 pacientes. Las tcnicas de colgajos musculares (msculos obturador interno, gluteosuperficial y semitendinoso) publicadas por Chambers y Rawling (1991) requieren experiencia por parte del cirujano para disminuir las complicaciones posquirrgicas y el tiempo operatorio. Si bien no son reportadas grandes complicaciones con estas tcnicas, el hecho de manipular los tejidos blandos de alrededor, genera una inflamacin mayor, y el cirujano que realiza la tcnica debe ser experimentado para disminuir los tiempos quirrgicos. La simplicidad de la tcnica mencionada en este trabajo permite que cirujanos con poca experiencia obtengan buenos resultados pre y posquirrgicos con tiempos de ciruga relativamente cortos. Materiales sintticos como mallas de polipropileno reportado por Matera y col (1981), al ser un material extrao al organismo puede generar reacciones inflamatorias que complican la adecuada cicatrizacin y evolucin. En nuestro caso el material utilizado si bien es externo al organismo del animal, es de la misma especie con un componente inmunolgico bajo, por lo que no genera grandes reacciones inflamatorias como fue observado. Ms recientemente se comenz con la utilizacin de materiales biolgicos tales como la submucosa intestinal porcina reportada por (Stoll y col 2002), colgeno dermal porcino (Frankland 1986) y fascia lata autgena (Bongartz y col 2005). Los materiales biolgicos tienen la ventaja de no provocar grandes reacciones inflamatorias como los sintticos. Con respecto a la mucosa intestinal porcina y el colgeno porcino, son injertos xenognicos, los cuales tienen un mayor ndice de rechazo por su mayor antigenicidad que los implantes alognicos (Frankland 1986). La fascia lata autgena implica un aumento de la morbilidad del sitio dador, as como aumenta el tiempo

operatorio (Bongartz y col 2005), lo que no ocurre con la tcnica de fascia lata alognica. Segn los resultados obtenidos en 7 pacientes operados y evaluados en nuestro trabajo podemos concluir que la fascia lata alognica conservada en glicerina al 75% resulta un buen injerto para la utilizacin en la herniorrafia perineal canina, disminuyendo tiempo y complicaciones quirrgicas. Esta tcnica no produce grandes reacciones inflamatorias manifiestas que indiquen un rechazo en el organismo receptor, permitiendo una buena evolucin a mediano plazo, sin recidivas de la hernia. Estudios posteriores sern necesarios con el propsito de aumentar el nmero de animales intervenidos, compararla con otras tcnicas con objetivo de evaluar objetivamente sus ventajas y desventajas y realizar estudios histopatolgicos. RESUMEN
Este estudio describe y evala la tcnica para la herniorrafia perineal utilizando fascia lata alognica. Para esto se procedi a la extraccin quirrgica de fascia lata de caninos mayores de 15 kg, que posteriormente fue conservada en glicerina al 75%. Se seleccionaron siete pacientes caninos machos con hernia perineal unilateral. Los animales fueron sometidos a ciruga mediante un abordaje perineal, reduciendo la hernia, reposicionando los msculos y utilizando la fascia lata alognica como material de reconstruccin del diafragma plvico fijada a puntos simples con nylon monofilamento N 0. Se realizaron controles a los 7, 15, 30 y 60 das postciruga, evaluando los siguientes parmetros: defecacin, inflamacin local y dolor. El injerto alognico fue compatible en todos los casos tratados, logrndose una herniorrafia exitosa, sin complicaciones posoperatorias a los 60 das. En todos los casos la defecacin, miccin y anatoma regional volvieron a la normalidad. Este material demostr ser biocompatible y muy bien tolerado, permitindonos disponer de una opcin segura para la tcnica de herniorrafia perineal en el perro.

AGRADECIMIENTOS
A Marcos Ishimoto Della Nina, MV, por la realizacin del diseo grfico.

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GG SEMIGLIA Y COL

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Arch Med Vet 43, 65-71 (2011) COMMUNICATION

Supplementing transition cows with calcium propionate-propylene glycol drenching or organic trace minerals: implications on reproductive and lactation performances#
Suplementacin de vacas en periodo de transicin con propionato-propilen glicol o minerales traza orgnicos: implicancias para la eficiencia reproductiva y la lactancia
OA Peraltaa*, D Monardesb, M Duchensb, L Moragab, and RL Nebela
aDepartment

of Dairy Science, Virginia Polytechnic Institute and State University, Blacksburg, VA, 24061, USA. bFacultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

RESUMEN El objetivo del presente estudio fue el de evaluar los efectos de una suplementacin de propionato de calcio-propilen glicol y una formulacin de minerales traza orgnicos (4-Plex) en la eficiencia reproductiva y productiva de vacas durante el periodo postparto. En el ensayo 1 se suplement aleatoriamente a vacas en lactancia (n = 37) con una mezcla de propionato de calcio-propilen glicol (DR) o con un control (CODR), al parto (da 0) y al pico de lactancia (da 30). En el ensayo 2 se trat a las vacas (n = 33) con una frmula de minerales trazas (TM) o un placebo (COTM) durante el postparto. Los niveles de calcio, fsforo y cidos grasos no esterificados (NEFA) fueron detectados en suero. Se evalu la composicin de grasa, protena, clulas somticas y cuerpos cetnicos en la leche. Los estros fueron detectados utilizando un sistema HeatWatch y las ovulaciones fueron estimadas mediante deteccin de progesterona en la leche. La suplementacin de DR result en mayores (P < 0,05) concentraciones de calcio en suero comparado con CODR. No se detectaron diferencias en la composicin de la leche entre los grupos tratados. La suplementacin de TM result en un menor (P < 0,0001) nmero de servicios por concepcin comparado con COTM. Por lo tanto, la suplementacin de DR fue efectiva en aumentar los niveles de calcio en suero; sin embargo, no fue suficiente para inducir otras respuestas metablicas, reproductivas o productivas. La suplementacin diaria de minerales redujo el nmero de servicios requeridos para la concepcin; sin embargo, no mostr otros efectos reproductivos o productivos. Key words: calcium propionate, propylene glycol, trace minerals, fertility. Palabras clave: propionato de calcio, propilen glicol, minerales traza, fertilidad.

INTRODUCTION Lactating dairy cows undergo important changes in energy and mineral metabolism during the transition period corresponding from the last three weeks of gestation until the first three weeks post-partum (Grummer 1993). These changes are consequence of the increased nutritional demand associated with the later stages in fetal development followed by the onset in milk production. Furthermore, the gradual decrease in dry matter intake results in considerable mobilization of body reserves and deterioration of body condition (Butler and Smith 1989). Nutritional status of high producing dairy cattle during transition period has important implications for fertility performance and productive state (Butler 2000). Calcium and energy precursors such as calcium propionate and propylene glycol have been used for several years for prevention of metabolic disorders in transition cows (Johnson 1954). Feeding calcium propionate at
Accepted: 18.08.2010. # Financed by College of Agriculture and Life Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University y Zinpro Corporation, Eiden Prairie, MN, USA. * Edificio Federico Saelzer, 4to piso, Campus Isla Teja, Valdivia, Chile; oscarperalta@uach.cl

calving and 12 h after calving has been shown to reduce the number of cows suffering from subclinical hypocalcemia (Goff et al 1996). Propionate plays a major glucogenic effect as a volatile fatty acid in the rumen and can decrease beta-hydroxy butyrate (BHB) and non-esterified fatty acids (NEFA) during the first 2 days post-partum (Goff et al 1996). Similarly, propylene glycol as an oral drench can reduce concentrations of NEFA and BHB (Christensen et al 1997) and increase levels of glucose and insulin before parturition (Studer et al 1993). Nevertheless, the effect of energy precursor has also been tested in fertility performance during post-partum in dairy cows. Oral supplementation of calcium propionate plus propylene glycol showed no effect on fertility performance in cows fed anionic diets (Melendez et al 2003). However, propylene glycol administration during post-partum improved ovarian activity as showed by earlier first ovulation and longer first luteal phase after calving (Miyoshi et al 2001). We hypothesized that supplementation of a calcium propionate and propylene glycol drenching at parturition and peak of lactation may have a positive metabolic effect and improve reproductive and productive performance in lactating dairy cows. Supplementation at parturition may help in reducing NEB, while administration at Day 30 post-partum may impact over the physiology of first 65

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ovulation and the start of luteal activity (Beam and Butler 1998, Vries and Veerkamp 2000). Trace minerals such as zinc, magnesium, copper and cobalt have important roles in protein synthesis, vitamin metabolism and immune function (Spears and Weiss 2008). The final impact of mineral supplementation to dairy cows; however, may depend on the presence of a dietary mineral imbalance or deficiency (Vanegas et al 2004). Particularly, copper supplementation at the dry period has showed to improve fertility during post-partum (Black and French 2004). The role of copper in the immune function may have a beneficial effect in the resumption of the reproductive performance after calving (Torre et al 1996). Trace minerals has also been reported to improve lactation performance by increasing milk production and reducing somatic cells count (Nocek et al 2006). Thus, our second hypothesis for this study postulates that daily TM supplementation during two months of the post-partum period may improve reproductive and productive performances. The aim of this study was to evaluate the metabolic, reproductive and productive impacts of two different dietary supplements 1) calcium propionate-propylene glycol drenching, and 2) commercial organic trace mineral formulation during the post-partum period.

MATERIAL AND METHODS

COWS AND TREATMENT PROTOCOLS

This study was conducted at the Virginia Tech Dairy Center using 70 Holstein cows fed twice daily a TMR of corn silage, alfalfa hay, and cotton seed (table 1). No anionic salts were included in the diet. Mean milk yield for the herd was 9500 kg/year with 380 kg of fat and 280 kg of protein using twice daily milking and freestall barn housing. Cows were randomly assigned to each dietary supplement group. In trial 1, the drenched group (DR; n = 18) received 3 liters of a mixture of calcium propionate, propylene glycol, water, and minerals (table 1), and the control group was administered 3 liters of a saline solution (NaCl 0.9%) (CODR; n = 19). Both groups were dosed 12 h post-partum and at 30 days in milk (DIM) using a Cattle Pump System (Springer Magrath Company, Mc Cook, Nebraska). In trial 2, cows were supplemented daily with one gel cap bolus containing 14 g of a trace mineral (TM; n = 17) formula (4-Plex, Zinpro Corporation, Eden Praire, MN) or with an empty bolus as a control (COTM, n = 16) from 12 hrs post-partum until 60 DIM (table 1). Boluses were administered orally using a plastic balling

Table 1. Nutrient composition of basal diet1 and propionate-propylene glycol (DR) and trace minerals (TM) supplements for lactating cows.
Composicin nutricional de la dieta basal1 y suplementos de propionato-propilen glicol (DR) y minerales trazas (TM) para vacas en lactancia.

Basal Diet Components (DM basis) Crude protein (%) NEL (Mcal/kg) Fiber (ADF) (%) Ca (%) P (%) Mg (%) K (%) S (%) Na (%) Zn (mg/kg) Mn (mg/kg) Cu (mg/kg) Co (mg/kg)
1 2 3 4 5

Supplements NRC1 requirements 14.1 0.28 17 to 21 0.62 0.32 0.2 1.0 0.3 0.22 43 13 11 0.11 Components Calcium propionate2 (g) Propylene glycol (g) NaCl (g) Ca3 (g) P4 (g) Mg5 (g) Mn (mg/kg) Zn (mg/kg) Cu (mg/kg) Co (mg/kg) Methionine (mg/kg) Lysine (mg/kg) DR 375 400 50 97.8 26.5 15 > 14,300 > 25,800 > 9,000 > 1,800 > 82,100 > 38,000 TM

Lactating cow diet 16 0.32 25 1.2 0.38 0.32 1.78 0.24 0.4 60 71 8 1

NRC requirements for a Holstein cow, 680 kg BW, 25 kg/d of milk production. Dry matter intake of 20 kg/d. 98% purity and 80.6 g of Ca. in 100 g of Monocalcium Phosphate and 375 g of Calcium propionate. in 100 g of Monocalcium Phosphate. in 25 g of Magnesium oxide.

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CALCIUM PROPIONATE, PROPYLENE GLYCOL, TRACE MINERALS, FERTILITY

gun. All animal experimentation was performed according to the Institutional Animal Care and Use Committee at Virginia Tech.
SAMPLING AND ANALYSES

Blood samples for calcium and phosphorus concentrations were obtained at 0, 6 and 12 h post-treatment administration corresponding to 12, 18, and 24 h postpartum, respectively. Analysis for calcium and phosphorus was performed using a colorimetric enzymatic kit (Olympus diagnostica GnbH Irish Branch, Lismeehan, OCallaghans Mills, Co. Clare, Ireland). Serum samples for NEFA analysis were taken by venipuncture of the median coccygeal vein or artery using vaccutainer tubes (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) at 7 days before partum, at calving, at treatment administration, and weekly during 9 weeks post-partum. Samples were allowed to clot for 4 hrs and spun at 900 x g for 15 min. Serum was decanted and frozen at -20 C. NEFA was measured using a colorimetric enzymatic kit (Wako NEFA C kit, Wako chemicals Inc., Osaka, Japan). Milk samples were taken 3 times weekly until 60 DIM for determination of acetoacetate using a qualitative test for detection of ketone bodies (Ketocheck test, Great States, Animal Health, St. Joseph, MO). Liver biopsies were taken 30 days before and 30 days after parturition for determination of trace mineral content. Liver samples were obtained trans-cutaneously between the 11th and 12th ribs on the right side of the cow using a reverse cutting custom made biopsy instrument. Element analysis was conducted by inductively coupled plasmaatomic emission spectrometry (ICP-AES). Progesterone concentration was measured in milk 3 times weekly from 7 days post-partum until 60 DIM for estimation of the time of ovulation using a non extraction progesterone assay kit (Coat-A-Coat, Diagnostic products Corp., Los Angeles, CA). An increase in milk progesterone concentrations of > 1 ng mL-1 for a period of 2 to 3 days was considered as an indication of ovulation 3 to 4 days before. A HeatWatch transmitter (DDx Inc., Denver, CO) was installed by 10 DIM to determine time of onset of estrus and number of standing events. Cows were artificially inseminated (AI) after voluntary waiting period (60 DIM) and pregnancies were diagnosed by palpation per rectum. Daily milk yield and weekly somatic cells, fat and protein content were estimated until 70 DIM.
DATA AND STATISTICAL ANALYSIS

error covariance structure. The fixed effects part of the model included the effects of treatment, day of sampling, parity and interactions between variables. Intervals of days from calving to first ovulation and first detected estrus were compared between groups using the Lifetest analysis. The survival data curves were compared using a log-rank test. The Phreg procedure was used for calculation of the equality of the survivor function and risk ratios for ovulation and estrus occurrence considering treatment, parity, and service number effects. Control cows were considered to have a risk ratio of 1. Milk yield, fat, and protein accumulated until 60 DIM were compared between groups using the GLM procedure including treatment, parity, and interactions between variables. Presence of acetoacetate was compared between groups using a logistic regression analysis. The level of significance was determined at P < 0.05. RESULTS AND DISCUSSION We first analyzed metabolic response of lactating cows supplemented with DR at parturition. Calcium levels increased (P < 0.05) at 6 h and remained higher for 12 h after DR supplementation (Figure 1A). Other studies have shown a rise in calcium concentration within 30 and 60 min of calcium propionate administration and then sustained levels within the next 6 to 8 h (Goff and Horst 1994). Sustained levels of calcium in serum for the initial 6 h may be explained by the slow gastrointestinal absorbance of the calcium propionate constituent of the DR formula (Goff and Horst 1994). Goff et al (1996) reported higher levels of calcium 12 h after treatment in cows supplemented with two doses of calcium propionate at calving and 12 h later. Our data showed that a single dose of calcium propionate 12 h after calving was sufficient to increase calcium concentrations for at least 12 h. Although, there was not a clear effect after treatment administration, lower values of phosphorous in cows supplemented with DR (Figure 1C) may be a homeostatic response after increased concentrations of calcium. Supplementation of this glycogenic formula at 12 h post-partum was not effective in reducing NEFA concentrations (Figure 2A). The acute increase of NEFA values at calving are associated with fat mobilization consequence of decreased DMI and increased NEB before parturition (Grummer 1993, Gerloff and Herdt 1999). Previous studies have supplemented propylene glycol for more than10 days during pre-partum in order to increase glycemia and subsequently reduce NEFA levels during transition period (Studer et al 1993, Grummer et al 1994, Goff et al 1996, Stockes and Goff 2001). However, this data indicate that a single day supplementation is insufficient to reduce fat mobilization and consequent NEFA levels in cows under NEB. Moreover, concentrations of NEFA in our herd were within normal values during post-partum indicating that an energetically balanced diet may have minimized the effect of 67

All statistical analyses were performed using SAS software package (SAS version 9.1.3., SAS Institute, Inc., Cary, NC). Serum concentrations of calcium, phosphorous, NEFA, copper and zinc content, and somatic cell score were compared between treatments using a linear mixed model appropriate for repeated measurements per subject (animal) with the compound symmetry for modeling the

OA PERALTA ET AL

Figure 1. Serum calcium (a,b) and phosphorous (c,d) concentrations at 0, 6, and 12 h post-treatment (12, 18, and 24 h post-partum, respectively) for cows supplemented with drench (DR, ) or trace minerals (TM, ). Control cows (CODR, ; COTM, ) for each respective treatment. Different superscripts indicate significant (P < 0.05) difference between hours (1, 2) and treatments (a, b).
Concentraciones de calcio (a,b) y fsforo (c,d) a las 0, 6 y 12 h post-tratamiento (12, 18 y 24 h post-tratamiento, respectivamente para vacas suplementadas con propionato de calcio-propilen glicol (DR, ) y minerales trazas (TM, ). Vacas control (CODR, ; COTM, ) para cada tratamiento respectivo. Superndices diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05) entre horas (1,2) y tratamientos (a,b).

Figure 2. Serum NEFA concentrations detected at pre- and post-partum for cows treated with (a) drench (DR, ) or (b) trace minerals (TM, ). Control cows (CODR, ; COTM, ) for each treatment. Different superscripts indicate significant (P < 0.05) difference treatments (a, b).
Concentraciones de NEFA en suero detectadas durante el pre- y post-parto para vacas tratadas con (a) mezcla propionato de calcio-propilen glicol (DR, ) o (b) minerales trazas (TM, ). Vacas control (CODR, ; COTM, ) para cada tratamiento. Superndices diferentes indican diferencias significativas (P < 0,05) entre horas (1,2) y tratamientos (a,b).

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CALCIUM PROPIONATE, PROPYLENE GLYCOL, TRACE MINERALS, FERTILITY

energy supplements. We do not have a clear explanation for the higher NEFA concentrations at day 35 in cows supplemented with DR. The metabolic response of TM supplementation in lactating cows during post-partum showed no differences for calcium, phosphorus and NEFA concentrations (Figures 1B-D and Figures 2B). Analyses of trace mineral in liver showed no differences in zinc and copper content between treatments groups; however, cows supplemented with TM showed an increase (P < 0.05) in copper levels from 220 ppm at the dry period to 319 ppm at lactation period compared with 268 and 280 ppm in the dry and lactation periods in the COTM group. Prevalence of ketosis was not significantly different between groups (DR = 4.67, CODR = 3.54%; TM = 5.50%; COTM = 3.08%). We analyzed the return of ovarian activity using a HeatWatch electronic estrus detection system and progesterone measurements in milk. Supplementation of DR at parturition and at peak of lactation had no significant impact over reproductive variables (table 2). Similarly, Melendez et al (2003), using 161 cows found no effect of a single supplementation of a similar drench on several reproductive variables including conception rates, calving to conception interval, and services per conception. As

described above, the lack of a significant effect of DR supplementation on reproduction performance may be associated to the limited metabolic impact of the administration of a single dose of this supplement separated by a 30-day interval during post-partum. Depending on the concentration present on the diet, supplementation of trace minerals has showed a positive effect on reproductive performance in dairy cows (Campbell et al 1999, Vanegas et al 2004). In our study, cows supplemented with TM displayed lower (P < 0.0001) services per conception (1.14) compared to COTM (2.10) cows (table 2). Previous trials using different supplements containing copper during the dry period have showed significant improvements in fertility (Black and French 2004). The physiological effect of copper on the reproductive physiology of dairy cows is not completely understood; however, copper mediation of the immune function may have a beneficial effect on cellular processes occurring during post-partum including uterine involution, ovarian activity and embryonic development (Torre et al 1996). There were no significant differences in milk yield, fat, protein and somatic cell count at 60 DIM between treatments groups (table 3). Previous reports have showed inconsistent results of a similar glycogenic drench administration on productive variables with studies

Table 2. Reproductive parameters for cows supplemented with drench (DR), trace minerals (TM), and respective controls (CODR and COTM) during early lactation.
Parmetros reproductivos para vacas suplementadas con mezcla de propionato de calcio-propilen glicol (DR), minerales trazas (TM) y controles respectivos (CODR y COTM) durante la lactancia temprana.

Variable Conception rate Days to first ovulation Mean Median Risk ratio Days to first estrus Mean Median Risk ratio Standing events at first estrus (no) First to second estrus interval (d) Standing events at second estrus (no) Days to first service Mean Median Risk ratio Services per conception

DR 41.9 32.8 29 0.8 45.7 46 0.60 2.3 46.2 3.5 98 94 0.68 2.21

CODR 44.1 31.7 22.5 1 46.4 66 1 3.1 35.6 4.4 108 105 1 2.06

TM 45.8 29.7 22 0.87 42.7 42 0.57 4.3 38.6 4.8 90 92 0.71 1.14a

COTM 47.6 30.5 21.7 1 45.3 68 1 3.3 36 4.2 103 98 1 2.10b

SEM1

2.73

6.96

0.50 7.35 0.10 7.04

0.26

Different superscripts (a,b) indicate significant (P < 0.05) difference. 1 Standard error of the mean. Superndices diferentes (a,b) indican diferencias significativas (P < 0,05). 1 Error estndar de la media.

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OA PERALTA ET AL

Table 3. Milk yield, fat and protein composition, and somatic cell score for cows supplemented with drench (DR), trace minerals (TM) and respective controls (CODR and COTM) cows during early lactation.
Produccin de leche y composicin de grasa, protena e ndice de clulas somticas en vacas suplementadas con mezcla de propionato de calcio-propilen glicol (DR), minerales trazas (TM) y controles respectivos (CODR y COTM) durante la lactancia temprana.

Variable Milk yield2 (kg) Fat2 (kg) Protein2 (kg) Somatic cells (Score)

DR 2.181 87.1 60.1 2.5

CODR 2.270 94.1 66.12 1.73

TM 2.204 89.4 60.64 2.28

COTM 2.189 88.4 58.3 2.23

SEM1 122.9 2.99 4.29 1.35

Different superscripts (a, b) indicate significant (P < 0.05) difference. 1 Standard error of the mean. 2 Accumulated until 70 days in milk.

indicating a positive effect (Higgins et al 1996, Stockes and Goff 2001) or no effect (Melendez et al 2003). Similarly, supplementation of TM has showed a positive effect on milk yield and somatic cell count (Kellog and Lane 1996) or no effect on milk production and composition (Kellog et al 1996, Campbell et al 1999). In conclusion, supplementation of a calcium propionatepropylene glycol drenching at parturition and at peak of lactation was effective in increasing calcium in serum shortly after treatment; however, was not sufficient in inducing other metabolic, reproductive or productive responses. Administration of TM during 60 days after calving resulted in lower number of services required per conception; however, this supplementation showed no effect on other reproductive or productive variables. The impact of DR and TM supplementation on lactation cows during transition period might have been minimized by the proper diet management of the herd used in this study. SUMMARY
The aim of this study was to estimate the effect of the supplementation of a calcium propionate-propylene glycol drenching and a commercial organic trace mineral formulation (4-Plex) on reproductive and lactation performances in cows during the post-partum period. In trial 1, lactating dairy cows (n = 37) were randomly assigned either to a calcium propionate-propylene glycol drenching (DR) or to a control (CODR). Both groups were treated at 12 h post-partum and at 30 DIM. In trial 2, (n = 33) cows were treated with either a trace mineral (TM) formula or a placebo (COTM) daily from 12 h post-partum until 60 DIM. Blood samples were collected to evaluate calcium, phosphorus and non-esterified fatty acids serum levels. Milk samples were obtained for fat, protein, somatic cell, and ketone bodies composition. Liver biopsies were taken for zinc and copper content. Estruses were detected using a HeatWatch system and ovulations were estimated by detecting progesterone concentrations in milk samples. Supplementation with DR resulted in higher (P < 0.05) concentrations of calcium compared to the control group. There were no differences in NEFA, ketone bodies, milk yield, protein, fat and somatic cell count between treatment groups. Supplementation of TM resulted in less (P < 0.0001) services per conception compared to COTM. Thus, DR supplementation during post-partum was effective in increasing calcium in serum shortly after treatment; however, was not sufficient

to induce other metabolic, reproductive or productive responses. Daily trace mineral supplementation resulted in lower services required per conception; however, this supplementation showed no effect on other reproductive or productive variables.

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CALCIUM PROPIONATE, PROPYLENE GLYCOL, TRACE MINERALS, FERTILITY

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Arch Med Vet 43, 73-78 (2011) COmmuniCaTiOn

Efficacy of a commercial disinfectant against Vibrio ordalii, Vibrio anguillarum, Francisella sp. and Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV) pathogens of Atlantic salmon (Salmo salar) farmed in Chile
Eficacia de un desinfectante sobre Vibrio ordalii, Vibrio anguillarum, Francisella sp. y Virus de la necrosis Pancretica infecciosa (iPnV), patgenos de salmn del atlntico (Salmo salar) cultivado en Chile
M Mullera, P Ilardib, R Avendao-Herrerac*
Divisin de acuicultura, Veterqumica S.a., Puerto montt, Chile. de investigacin y Desarrollo-Veterqumica, Cerrillos, Santiago, Chile. cuniversidad andrs Bello, Facultad de Ciencias Biolgicas, Departamento de Ciencias Biolgicas, Via del mar, Chile.
bLaboratorio aaQuaFaRma,

REsuMEN En el presente trabajo se evalu la eficacia in vitro del desinfectante Duplalim, una combinacin sinrgica de glutaraldehdo y sales de amonio cuaternario de cuarta generacin, contra 4 patgenos de peces prevalentes de la salmonicultura chilena. Los resultados muestran que todas las concentraciones ensayadas (diluciones entre 1:200 a 1:400) fueron eficaces sobre los aislados de Vibrio ordalii y Vibrio anguillarum post-30 s de exposicin, detectando niveles de reduccin igual a 1.8 x 106 uFC/ ml. Concentraciones superiores de Duplalim (dilucin 1:50) y un tiempo de exposicin no menor a 5 min. fueron necesarios para eliminar completamente al patgeno intracelular Francisella sp. Cuando el desinfectante fue ensayado contra el Virus de la necrosis Pancretica infecciosa (iPnV), se detect que la dilucin 1:400 tiene un efecto significativo despus de 2 minutos sin importar los ttulos de iPnV testeados (mayor concentracin evaluada 107.6 TCiD50/ ml). Duplalim se evalu en condiciones masivas contra los miembros de la familia Vibrionaceae. En comparacin a los controles (sin adicin desinfectante), la dilucin 1:400 de Duplalim elimin completamente V. ordalii y V. anguillarum despus de 15 minutos de tratamiento, tanto en el agua de cultivo como en la superficie de mallas usadas en el cultivo del salmn. as, el anlisis microbiolgico del agua de los controles mostr concentraciones de 1.4 0.3 106 uFC/ ml, mientras en el caso de las mallas 7.6 3.2 105 uFC/ ml1. En resumen, los antecedentes obtenidos indican que el uso del desinfectante Duplalim es efectivo contra V. ordalii, V. anguillarum y iPnV en bajas concentraciones y cortos periodos de exposicin (dilucin 1:400 por 15 min.), mientras que para el patgeno intracelular se requiere una concentracin mayor. Key words: disinfectant, Chilean fish pathogens, atlantic salmon. Palabras clave: desinfectante, patgenos de peces, salmn del atlntico.

inTRODuCTiOn Fish diseases of major importance in Chilean salmon farming includes infectious pancreatic necrosis (iPn) and Piscirickettsia salmonis (Fryer and Hedrick 2003), which cause significant economic losses due to mortalities of atlantic salmon, Salmo salar, fry and post-smolt in seawater. in addition, an increase in disease detection of emergent pathogens as Vibrio ordalii (Colquhoum et al 2004), Streptococcus phocae (Gibello et al 2005, Romalde et al 2008), Francisella (Birkbeck et al 2007) and, lately, Vibrio anguillarum (avendao-Herrera et al 2007) has been observed in the last decade. To date, economic losses caused by these bacterial pathogens, except V. ordalii, have decreased; however, it remains one of the

accepted: 18.08.2010. * ravendano@unab.cl, reavendano@yahoo.com

most important pathogen in the salmon industry in Chile because no commercial vaccines are available. in general, most treatments proposed for the outbreaks are based on the administration of drugs through feed. Considering that a selective effect of antimicrobial use on the emergence of resistant fish bacteria has been documented in several reports (Smith et al 1994, alderman and Hastings 1998), alternative treatments to the use of drugs are necessary. in salmonids aquaculture facilities, disinfectants are vital tools for effective farm biosecurity, used to reduce pathogenic microorganisms on biological surfaces by rather non-specific actions. They include iodophores used for eggs and equipment disinfectants, salts, organic chlorocompounds (e.g. chloramines-T), aldehydes (e.g. formalin), hydrogen peroxide and quaternary ammonium compounds (e.g. benzalkonium chloride) (Burka et al 1997). The majority of these chemicals have also been used to inactivate bacterial and virus pathogens on contaminated rearing equipment, seawater pipes, air hoses, tanks, and nets as well as the hands and feet of the working staff. Besides its disinfecting 73

m muLLER et al

properties, few studies have been designed to assess the quaternary ammonium compounds, particularly a synergistic blend of superquats and glutaraldehyde (Duplalim, Veterqumica S.a., Chile), which is commercialized as a disinfectant of broad spectrum, presenting fast action and low toxicity. For these reasons, the aims of this study were to determine the efficacy of Duplalim in treating various fish pathogens under in vitro conditions and large scale and validate the treatment regimes for controlling these diseases in salmon production. maTERiaL anD mETHODS

were run simultaneously in exactly the same conditions as described above. To determine the cultivable cells in the seawater, samples of 0.5 ml were taken aseptically, after each treatment. all samples were serial-diluted in SS and 0.1 ml of each dilution was plated in duplicate on TSa-1 plates for the count of total heterotrophic marine bacteria. after incubation, biochemical identification tests (aPi20E; Biomrieux) and slide agglutination tests (Silva-Rubio et al 2008a, b) were carried out to determine the presence of the inoculated V. ordalii and V. anguillarum strains in each multidish.
ExPERimEnT 2

This study was done in two experimental stages: i) In vitro susceptibility of the extracellular bacteria V. ordalii and V. anguillarum, intracellular pathogens as Francisella sp. and iPnV. ii) Large scale assays conducted at the hatchery of the Laboratory of Research and Development at Veterqumica. The experiments 1 and 2 of the stage i was carried out in triplicate for each bacterial strain, while the experiment 3 considered the use of iPnV. STaGE i: In VItro aSSayS in LaBORaTORy
ExPERimEnT 1

The effectiveness of different Duplalim treatments against V. ordalii and V. anguillarum was assessed following the procedures of avendao-Herrera et al (2006). The V. ordalii strains used in this work, au2, au3 and PF180, were isolated in Chile during 2003-2005 from clinically infected atlantic salmon (Silva-Rubio et al 2008a). in the case of V. anguillarum, three strains isolated from atlantic salmon coded as PF2, PF7 and PF8 and belonging to serotype O3 of this fish pathogen (Silva-Rubio et al 2008b) were employed. The reference strains of Vibrio ordalii aTCC 33509T and Vibrio anguillarum aTCC 43307 from the american Type Culture Collection were used for comparative purposes. The experimental assays were conducted in sterile 6-well multidishes (nunclon Surface) containing 10 ml of natural sterilized (filtered and autoclaved) seawater. inocula were prepared from bacteria grown on tryptone soy agar (Oxoid) supplemented with 1% naCl (Winkler) plates (TSa-1), washed in 0.85% sterile saline solution (SS), resuspended and diluted in SS, and then each well was seeded with 500 l of the bacterial suspension to achieve an initial V. ordalii and V. anguillarum concentration of 5 x 106 cells ml-1 as determined by direct microscopy count (equivalent to 1.8 x 106 CFu x ml-1, respectively). after a stabilization period of 30 min. at 19 1 C, susceptibility of each fish pathogens and bacterial strain to different Duplalim concentrations was examined in triplicate, adding this chemical compound to 1:200; 1:300 and 1:400 dilutions. Duplalim was evaluated during 30, 60, 120 and 180 s at 20 C. Controls without the addition of the disinfectant 74

The Francisella sp. strain used in this work was isolated in Chile in 2006 from spleen of clinically infected atlantic salmon. To determine the effect of different Duplalim concentrations on Francisella sp, bactericidal assays were conducted according to a previously described protocol of avendao-Herrera et al (2006) with minor modification. Pure colonies of Francisella sp. cultivated at 20 C were picked up from cysteine heart agar (Difco) plates containing 5% sheep blood (Olsen et al 2006), adjusted in sterile freshwater to contain 3 x 108 CFu x ml-1. Duplalim was evaluated during 2, 5 and 15 min treatment periods for the control of Francisella sp. using diluted disinfectant to a 1:50; 1:200 and 1:400 concentrations. Francisella sp. controls were run simultaneously without the addition of the disinfectant. The experiment was also carried out in triplicate. Treatments were considered effective if a pure culture of grey white, slightly mucoid convex colonies of Francisella sp. was absent when the samples which were taken aseptically at the end of the incubation period were spread onto media.
ExPERimEnT 3

infectious pancreatic necrosis virus (iPnV) strain 483, of the serotype Sp, originated from an outbreak in Salmo salar cultured in Chile in 2005, was used for the assay. The virulent iPnV isolate was previously identified from tissue according to Espinoza and Kuznar (2002). The virus was subjected to two rounds of plaque purification on Chinook salmon embryo cells (CHSE-214) before propagation in the same fish cell line to obtain a stock (Johansen and Sommer 2001). The infected cell cultures were kept frozen at -80 C until they were used. a small aliquot of the material was frozen separately and was used for the determination of TCiD50 (50% tissue culture infective dose) by end-point dilution (Reed and muench 1938). The experimental assays were conducted in sterile 6-well multidishes (nunclonTm Surface) containing 10 ml of the CHSE-214 with iPnV at titres of 105.6; 106.6 and 107.6 TCiD50 ml-1. Susceptibility of iPnV to Duplalim was examined in triplicate, with

DISINFECTANT, CHILEAN FISH PATHOGENS, ATLANTIC SALMON

the addition of this chemical compound at final dilution of 1:400, and then incubated for 2, 5 and 15 min at 19 1 C. The action of the disinfectant was stopped using a specific neutralizer (polysorbate 80 (3%), lecithin 3 g/L, sodium thiosulphate 5 g/L, L-histidine 1 g/L and saponin 30 g/L), which was validated for all disinfectants before use in the tests. Negative controls, consisted of a harvested cell culture medium from uninfected cell cultures exposed to the same Duplalim concentration but not inoculated with IPNV. The infected cell cultures but not treated with the disinfectant were included as positive controls. All controls were run simultaneously in the exact same conditions as described above. To test the efficacy of superquats and glutaraldehyde compounds to inactivate IPNV, 0.5 ml aliquots of the virus solution were taken aseptically and transferred to plates containing the CHSE-214 cells. Each sample was passaged three times every seven days and incubated at 18 C. The cytopathic effect was observed by inverted microscopy for up to 7, 14 and 21 days post-infection. Moreover, attempt was made to check if the inhibition caused by Duplalim was produced only by the disinfectant or contributed to the persisted active residues in the media. The IPNV isolate 483 was cultured as previously described and concentrated by successive ultrafiltrated steps until 1015 TCID50/ml was obtained. Two aliquots of 5 ml each was taken, one of them being used as control (no disinfectant added) and the other aliquot treated with Duplalim at final dilution of 1:400, followed by incubation for 2 min at 18 C. Each solution was transferred to a Centricon ultrafiltration device with 10-kDa molecular mass cutoff (Millipore), and supernatants were removed by centrifugation (3500 x g for 60 min at 4 C). IPNV were resuspended in phosphate buffered saline (pH 7.4) and dialysis was repeated until a concentration of residual Duplalim reached 1:10000 dilutions. The control sample (without disinfectant) was treated in the same way. Finally, 100 l of the treatment and control were left in a 24-well plate containing CHSE-214 cells and mixed. Serial ten-fold dilutions (from 10-1 to 10-5) were made in quadruplicate and then incubated at 18 C for two weeks. Each plate was observed by inverted microscopy for the appearance of cytopathic effect for 7 and 14 days.
STAGE II: LARGE SCALE ASSAY

a concentration of 1:400 was performed to two buckets, while the remaining inoculated buckets without the disinfectant were considered as positive controls. The negative control corresponded to a new bucket with only seawater, no bacteria nor chemical disinfectant added. In order to evaluate the effect of Duplalim on the microorganisms attached to the surface of the fishing net (net used in salmon cages) at the end of incubation (24 h), the thread mesh of each experimental set was sampled. For this, ten pieces of net were carefully cut into 1 cm2 pieces, washed repeatedly with SS and put into Falcon tubes containing 10 ml of SS. The bacteria that were attached to the pieces of mesh were removed using an Ultrasonics Homogenizer for 15 seconds. Bacteriological sampling of water was carried out at 15 min, 4 h and 24 h post-treated with Duplalim. Samples were serial diluted in SS and 0.1 ml of each dilution was plated on TSA-1 for the total count of Vibrionaceae. To increase the sensitivity of the technique, samples of 1 ml were taken directly from the water of each bucket and seeded onto the same bacteriological medium. The plates were incubated at 20 C for one week. After incubation, selective counts of CFU (according to the morphotypes grown on TSA-1 plates) and confirmation by serological identification tests (i.e. slide agglutination assays) according to Silva-Rubio et al (2008a, b) were carried out to determine the presence of each bacterium inoculated in seawater. RESULTS AND DISCUSSION The addition of Duplalim at concentrations among 1:200 to 1:400 to seawater killed completely V. ordalii and V. anguillarum in all in vitro treatments, regardless of the period tested and strains used. In contrast, there was no loss of viability in the un-disinfectant controls with values of 1.6 0.56 x 106 CFU x ml-1 for V. anguillarum, and 1.4 0.97 x 106 CFU x ml-1 for V. ordalii (similar to initial inoculate of each pathogen). The addition of Duplalim to freshwater killed completely Francisella sp. at a concentration of 1:50 within 5 and 15 min. (table 1). When the concentration of the disinfectant was decreased, a higher degree of resistance to Duplalim was observed. Interestingly, in freshwater with a dilution of 1:400, Francisella sp. cells were recovered regardless the incubation time. Similar cultivability pattern to Francisella sp. cells was observed in the negative control groups (without disinfectant). In spite of the limited number of the isolates tested (only one) it seems that Francisella sp., an intracellular facultative microorganism, had the highest resistance to Duplalim than the extracellular pathogens such as V. ordalii and V. anguillarum. In a recent study, Verner-Jeffreys et al (2009) reported that two Gram-positive bacteria (Lactococcus garviae and Carnobacterium piscicola) were apparently more resistant to four biocide products than other two 75

To mimic a near real-life the assays for the evaluation of Duplalim was performed in buckets containing 10 L of 0.45 m filtered seawater. Four buckets were inoculated with the strains of V. anguillarum Au2 and V. ordalii PF2 at a final concentration of 1.8 x 106 CFU x ml-1 of a 1:1 mix concentration. Each bucket was seeded with the bacterial suspension prepared as described for experiment 1 and homogenized with a fish net for 60 s. Each fish net was maintained inside the buckets. Following a 30 min acclimatization period, addition of Duplalim at

M MULLER ET AL

Table 1. In vitro bactericidal effect of Duplalim on Francisella sp. at 20 C. Efecto bactericida in vitro de Duplalim en Francisella sp. a 20 C.

Duplalim dilutions Untreated-control 1:50 1:200 1:400

a

Exposure time (min) 2 +++a + +++ +++ 5 +++ ++ +++ 15 +++ ++

Data correspond to the results of the Francisella sp. isolate in triplicate. Effective (no CFU after exposure). Growth of Francisella sp.: +, < 102; ++, 103 and +++, > 105.

Gram-negative pathogens. In general, in the case of the Gram-positive bacteria it is suggested that the presence of some cell structures (i.e. capsular material) may confer resistance to antibacterial compounds (i.e. activity of serum). Considering that Francisella sp. replicates and grows within the membrane-bound cytoplasmatic vacuoles

of infected host cells (Olsen et al 2006) the resistance shown by the isolate to Duplalim might be explained by the low concentration that can be attained by this disinfectant compound. Until now, the molecular base of this resistance is unknown. Further studies are needed to elucidate the composition and chemical structure and/ or the role of some enzyme produced by Francisella in its protection. The survival capacity of the IPNV isolate 483 in the CHSE-214 cells after the Duplalim treatments is shown in table 2. The concentration of the disinfectant had a significant effect with 2, 5 and 15 min. of exposure, regardless of the IPNV titres employed (until a concentration of 1015 TCID50 ml-1). As expected, the results of cytopathic effect test showed that IPNV produced degenerative changes in the CHSE cell line without disinfectant passed three times. On the other hand, it is important to denote that the action of active residues was efficiently stopped with the addition of the neutralizer as well as by the dialysis procedures. Therefore, no toxicity of the disinfectant and solvent either detected over the cells. In fact, after incubation (IPNV with and/ or without Duplalim) only total cytopathic effect was detected in the CHSE-214 plates without the disinfectant, therefore, IPNV was re-isolated at 10-5 serial dilutions during two weeks.

Table 2.

Effect of Duplalim at final dilution of 1:400 on in vitro inactivation of Infectious Pancreatic Necrosis Virus.
Efecto de Duplalim en dilucin final de 1:400 sobre la inactivacin in vitro del Virus de la Necrosis Pancretica.

Titre viral (TCID50/ ml) 105.6

Exposure time (min) 2 5 15 Untreated-control 2 5 15 Untreated-control 2 5 15 Untreated-control 2 Untreated-control

Passage 1a + + + +

Passage 2 + + + +

Passage 3 + + + +

106.6

107.6

1015

Three replicates per passage. Effective (no cytopathic effect after exposure). Positive Sample for IPNV with an extensive cytopathic effect of approximately 90% was observed at 7 days.

76

DISINFECTANT, CHILEAN FISH PATHOGENS, ATLANTIC SALMON

In general, most of the disinfection studies in IPNV have been carried out using other chemical disinfectants such as iodine, chlorine and formalin. Both iodine and chlorine inactivated IPNV, although the efficacy depended on the pH, virus concentration and the presence of organic matter in water (Elliott and Amend 1978). Studies of Desaultes and MacKelvie (1975) reported that a 30 min exposure to chlorine at a concentration of 40 ppm effectively inactivates a concentration of 107.5 TCID50/ ml, while using 35 ppm iodine for the same time is appropriate to eradicate a concentration of 106.6 TCID50/ ml. These authors also denoted that although formalin exhibited some virucidal activity, it was not a good choice for the inactivation of IPNV (MacKelvie and Desaultes 1975). With the aim to asses if Duplalim can be a suitable candidate for the treatment of seawater and surface of tanks, nets and/or rearing equipment, bioassays were performed in buckets with seawater containing a mesh to stop fish and seeded with two different fish pathogens. In this study, members of the genus Vibrio were selected because they constitute part of the microbiota of marine fish as well as part of the normal microbiota of the aquatic environment, and therefore present a constant threat for any susceptible host (Austin and Austin 2007). The culture of V. ordalii and V. anguillarum in the buckets treated with 1:400 disinfectant concentrations had a significant effect on the survival of the microbiota in the seawater, with no viable bacteria being detectable from 15 min post-treatment. In contrast, controls without the addition of Duplalim maintained 1.37 0.29 x 106 CFU/ ml during the experiment. Similarly, there was no evidence of Vibrionaceae culture adhered on the fishing net compared to untreated Duplalim tries. It is important to note that survival for an aquatic bacterium in seawater outside the fish host may depend on biofilm formation. V. anguillarum is normally found attached to surfaces, as opposed to a free-swimming form, which is likely to provide an adaptive or survival advantage for bacteria in the aquatic environment (Costerton et al 1987, 1995). In each of these environments, the bacterium likely utilizes its external membrane to protect its intracellular contents from damaging agents or conditions (Wang et al 2003). When attempt of resuscitation of the non-culturable bacteria with the addition of fresh medium was employed, no cells from the mesh samples were recovered onto TSA-1 (data not shown), indicating that all microorganisms were completely killed. On the other hand, cultivable bacteria remained constant in the positive controls (without the disinfectant), regardless of the period sampled, and showing an average value of 1.4 0.3 106 CFU/ ml. The bacteria adherence on the mesh without exposure to the disinfectant was about 55.3% (7.6 3.2 105 CFU/ ml) lower in concentration than those containing in the seawater after 24 h. Selective counts of V. anguillarum on TSA-1 sampled from the buckets with no treatment represented an average of 49.7% of the total microbiota counted. As expected, seawater without

the mixed bacteria and disinfectant remained with a low load of bacteria (6.3 105 CFU ml-1) through the entire period of the study. Although Duplalim is one of the most used disinfectants in the Chilean salmon industry, it has been legally registered and recently validated to be used against Infectious Salmon Anaemia Virus (ISA) virus and its effective use may be well established in this study; we cannot discard that organic matter present in the water column or dirty conditions in the water could interfer on the efficiency of the disinfectant. Studies are being carried out to test this condition using the Verner-Jeffreys et al (2009) protocol. It can be concluded that, apart from the fact that in this work we used a methodology that is different to the test standards used for the evaluation of bactericidal and virucidal activity of disinfectants and antiseptics for use in the veterinary field published recently by VernerJeffreys et al (2009), our results demonstrate that the use of Duplalim in aquaculture is effective in low concentration and short time of exposure (15 min. at a concentration of 1:400 dilutions), with the exception of the intracellular pathogen used in this work. It is important to highlight that Verner-Jeffreys et al (2009) tested disinfectants of different nature than Duplalim (i.e. hydrogen peroxide, peracetic acid, acidic iodophore and Chloramine T) and suggested that when studying other desinfectants (i.e. superquats and glutaraldehyde), the procedure can be adopted or modified to be used in countries outside Europe. Therefore, the use of Duplalim may be appropriate as a general preventive disinfection method against V. ordalii, V. anguillarum and IPNV for treating water culture, surface of tanks, nets and/ or rearing equipment, but all these equipments would need to rinse off before they could be used in contact with fish. SUMMARY
The efficacy of the disinfectant Duplalim, a synergistic blend of superquats and glutaraldehyde, was analysed in vitro against 4 fish pathogens. All concentrations tested (1:200 to 1:400 dilutions) were efficacious on killing Vibrio ordalii and Vibrio anguillarum in seawater after 30 s, being the level of reduction equal to 1.8 x 106 CFU/ ml. Higher concentration of Duplalim (1:50 dilutions) and time of exposure (at least 5 min) is needed to kill completely Francisella sp, an intracellular freshwater pathogen. When Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV) was treated with 1:400 disinfectant dilution, this concentration had a significant effect after 2 minutes, regardless of the IPNV titres employed (concentration greater than 107.6 TCID50/ ml). Duplalim was tested in large scale against Vibrionaceae members. In comparison to the controls (without the disinfectant), 1:400 dilutions of Duplalim totally killed V. ordalii and V. anguillarum in seawater as well as on the surface of the fishing net (used in the cages of cultured salmon) after 15 min. Cultivable bacteria remained constant in the buckets without the disinfectant (1.4 0.3 106 CFU/ ml), regardless of the period sampled. In the case of the adherence on the fishing net, bacteria not exposed to the disinfectant were detected at a concentration of 7.6 3.2 105 CFU/ ml. These data indicate that the use of Duplalim against V. ordalii, V. anguillarum and IPNV is effective in low concentration and short time of exposure (15 min at a concentration of 1:400 dilutions), while the intracellular pathogen requires higher concentration.

77

M MULLER ET AL

ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported in part by Grant IPC 019 from the Program Bicentenario Ciencia y Tecnologa, CONICYT-Chile and also by Grant DI-01-10/R from the Universidad Andrs Bello.

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Arch Med Vet 43 79-83 (2011) COMMUNICATION

Insects associated with chicken manure in a breeder poultry farm of Central Chile
Insectos asociados a fecas de pollo en una avcola de Chile Central
J Retamalesa, *, F Vivalloa, b, J Robesona
aInstituto

bLaboratorio

de Biologa, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, Valparaso, Chile. de Biologa Comparada de Hymenoptera, Programa de Ps-Graduao em Entomologia, Universidade Federal do Paran, Curitiba, PR, Brasil.
RESUMEN

Los insectos son muy comunes en las instalaciones de la industria avcola y diferentes medidas de bioseguridad se aplican para evitar su propagacin debido al hecho que pueden acarrear agentes patgenos. Por lo tanto, es de suma importancia saber qu insectos comnmente estn presentes en los galpones avcolas para optimizar los protocolos de control. Ya que la informacin sobre este tema es escasa, el objetivo de la presente investigacin fue determinar los principales grupos taxonmicos de insectos presentes en el guano de una granja avcola industrial en la zona central de Chile. Las muestras de guano fueron recolectadas en una granja avcola en la Regin de Valparaso, Chile, de reas adyacentes a las lneas de alimentacin y depsitos de agua. Las muestras fueron refrigeradas, transportadas al laboratorio y procesadas para la clasificacin taxonmica de los adultos y estados inmaduros de insectos. Los resultados indican una colonizacin marcada por el escarabajo Alphitobius diaperinus y por los dpteros Fannia sp. en relacin con otras seis familias de insectos que se determinaron. Alrededor del 94% de los insectos encontrados en el guano estaban presentes en las muestras procedentes de las zonas adyacentes a las reservas de agua. Por lo tanto, las fugas de los dispositivos de suministro de agua se han convertido en un punto crtico de control de estas plagas entomolgicas de las aves de corral, las cuales han sido reportadas como portadoras de una gran variedad de virus, bacterias y parsitos eucariotas. Key words: Alphitobius diaperinus, insect vectors, poultry farms. Palabras clave: Alphitobius diaperinus, insectos vectores, galpn avcola.

INTRODUCTION The Chilean poultry industry has increased its production with the incorporation of new control technologies to prevent insect colonization (Armijo 2006). However, insects are very invasive and the implemented biosecurity measures do not curtail completely the entry of insects into hatcheries. Therefore, they may become active agents that mediate outbreaks of infectious diseases in birds, generating significant financial losses (Ced 2001, Ricaurte 2005). There is evidence that insects have an active role in the transport and spread of various avian pathogens in broiler breeder houses (Gray et al 1999, Olsen and Hammack 2000). Alphitobius diaperinus Panzer (Coleoptera: Tenebrionidae) is a major insect pest on poultry farms worldwide, and besides generating structural damage, pest control expenses and decreased feeding efficiency (Roche et al 2009), it has been associated with the ability to transmit disease agents such as bacteria of the genera Escherichia, Salmonella and Campylobacter (Chernaki-Leffer et al 2002, Segabinazi

et al 2005, Templeton et al 2006), viruses such as fowl pox and Newcastle (De las Casas et al 1976), fungi of the genera Aspergillus, Penicillium and Candida (De las Casas et al 1972), and protozoans such as Eimeria (Coccidiosis) (Goodwin and Waltman 1996). A. diaperinus also acts as a vector of cecal worms and avian tapeworms (Watson et al 2000). Despite the importance of insect pest control in the poultry industry, little is known about the entomofauna associated with poultry production and it is scarcely studied in Chile. Therefore, we decided to determine the major insect taxa present in chicken manure in poultry breeder facilities on a major poultry farm in Chile. As a result of this investigation we generated a checklist of the different taxonomic groups of insects associated with poultry faeces in order to facilitate optimization of control measures to minimize dissemination of infectious agents and to preserve or improve the quality of poultry production. MATERIALS AND METHODS
SAMPLING

Accepted: 11.08.2010. * Av. Universidad 330, Curauma, Valparaso, Chile; julio_retamalesl@ yahoo.es

Insects were collected from eight industrial poultry houses (10 birds/m2) located in the Province of San Antonio, Region 79

J RETAMALES ET AL

of Valparaso, Chile, during April and May of 2005; a total of 432 manure samples of were collected from this site. Each house was open-sided with the long axis oriented east to west and containing chickens 43-48 weeks of age at the time of collection. The concrete house floors were covered with a 20 cm layer of accumulated manure that is removed on a yearly basis. Above that, two feeder lines spanned the length of each house, located at 2 m from both the north and south walls. The sampling sites, Sector 1 (S1) and Sector 2 (S2), were located under the north and south feeder lines, respectively. Furthermore, two water drinking lines spanned the central region; sampling sites of Sector 3 (S3) were located under these drinking lines. The moisture content of faeces was determined through a visual and tactile analysis of manure (Rivera et al 2007). We found that moisture increased significantly in S3 compared to S1 and S2. Populations of insects established at 48 weeks of flock age were sampled following Strother and Steelman (2001) with modifications; samples (0.2 kg each) were collected using a garden shovel from sites at S1, S2 and S3 to a maximum depth of 15 cm, zigzagging along the slopes of the barn houses. The 432 samples were individually deposited in labeled transparent plastic bags and brought to the laboratory in a refrigerated cooler to avoid the deterioration of specimens.
IDENTIFICATION OF THE ENTOMOFAUNA

family and/or species level, depending on the abundance percentage (number of individuals per family / total number of insects found of these taxa) and the distribution (presence of insect family / total number of samples examined) thoughout the breeding barns. The criteria for identifying adults were based on the taxonomical characters cited by Artigas (1994) and Toro et al (2003). Immature stages were identified according to Chu (1949). RESULTS AND DISCUSSION Insects have the ability to colonize poultry manure and therefore key factors for the establishment of a particular entomofauna are the reproductive and developmental characteristics of insects, the food availability present in the poultry houses and the physical and chemical characteristics, humidity in particular (Strother and Steelman 2001). In fact, both larvae and adults of orders Hymenoptera, Diptera, Coleoptera and Lepidoptera were found in the poultry farm studied. The same groups of insects were described by other investigators (Kaufman et al 2000) with the exceptions of Lepidoptera (Incurvariidae and Eriocraniidae) and Hymenoptera (Formicidae) which presumably were not using the poultry farm houses as a site for oviposition and the development of immature stages (figure 1). Of the 1,131 insects examined, 74.6% belonged to the order Coleoptera, the most frequently represented families being Histeridae and Tenebrionidae. The most abundant insect found associated with poultry manure on the farm examined was the beetle Alphitobius diaperinus. This is in agreement with results obtained by

Insects were taken out from the faeces samples and placed in labeled vials according to their place of collection and preserved in 70% ethanol. Within 3 days they were processed for identification. The insects were identified at

Figure 1. Percentage of abundance (number of individuals per family / total number of insect found) and distribution (presence of family insect / total number of samples examined) of insect families in chicken manure.
Porcentaje de abundancia (nmero de individuos por familia / nmero total de insectos encontrados) y distribucin (presencia de la familia de insecto / nmero total de muestras examinadas) de las familias de insectos en el guano avcola.

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ALPHITOBIuS DIAPERINuS, INSECT VECTORS, POULTRY FARMS

Calibeo-Hayes et al (2005) as well as by Strother and Steelman (2001), and Salin et al (2003), who reported that this insect is the most resistant and persistent in avian rearing facilities even when a combination of insecticides is applied. A. diaperinus is known to be actively involved in the transmission of various infectious agents and parasites found in birds (table I). In natural conditions, results obtained by Chernaki-Leffer et al (2002) and Segabinazi et al (2005) suggest a limited role of A. diaperinus in the spread of Salmonella, a pathogen associated with the poultry industry. Nevertheless, there are still disputes about the role of A. diaperinus in the dispersal of Salmonella in experimental conditions depending on the serovar involved. For example, Davies and Wray (1995) indicate that A. diaperinus does not possess the ability to transmit S. Enteritidis whereas Roche et al (2009) found that larvae and adults of A. diaperinus could act as vectors for the transmission of S. Typhimurium to broilers.
Table 1. Transport of avian pathogens.
Transporte de patgenos aviares.

Fannia sp. (Diptera: Fanniidae) was the second most abundant insect found in poultry faeces (23.4%, only immature stages). It had also been cited as an important colonizer of this kind of faeces worldwide (Kaufman et al 2000). This taxon serves as a mechanical vector of different diarrheal pathogens (Manrique and Delfn 2007). Moreover, Fannia sp. has been recently reported as a vector of Dermatobia hominis larvae (Diptera: Oestridae), an agent that causes myasis in humans and animals (Barreto and Souto 2004). A. diaperinus and Fannia sp. are present in similar percentages of distribution in the chicken breeding barns examined, followed by Carcinops pumilio (figure 1). Another important feature observed for A. diaperinus and other groups of insects is that the et al onize and establish mainly in areas of high substrate moisture. In fact, 94.1% of the insects found were associated with the high-humidity manure sector S3. Also, the abundance of A. diaperinus adults and Fannia larvae decreases significantly from sector S3 towards sectors S2 (3.4%) and S1 (2.5%).

Insect A. diaperinus Virus

Pathogens Fowl pox and Newcastle virus Avian leukosis virus Infectious Bursal Disease (Gumboro Disease). Escherichia coli Salmonella sp. Campylobacter sp.

Reference De las Casas et al 1976 Eidson et al 1966 McAllister et al 1995 Chernaki-Leffer et al 2002 Skov et al 2004 Roche et al 2009 Templeton et al 2006 Strother et al 2005 Bates et al 2004 Vittori et al 2007 Goodwin and Waltman 1996 De las Casas et al 1972 De las Casas et al 1972 Goodwin and Waltman 1996 Watson et al 2000 Elowni and Elbiharis 1979 Barreto and Souto 2004 Gray et al 1999 Skov et al 2004

Bacteria

Fungi Protozoa Helminths

Clostridium perfringens Staphylococcus sp., Streptococcus sp. Bacillus subtilis. Aspergillus, Penicillium Fusarium, Candida Eimeria sp. Cecal worms Choanotaenia infundibulum (tapeworm) Dermatobia hominis Salmonella enteritidis Campylobacter sp.

Fannia sp. C. pumilio

Insect Bacteria

Relation of the main insects found in poultry houses with the transport f avian pathogens. Relacin de los principales insectos encontrados en las granjas avcolas y el transporte de patgenos aviares.

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J RETAMALES ET AL

The activity of the histerid beetle Carcinops pumilio is interesting to highlight. This insect is known worldwide for its ability to prey upon fly larvae, including the house fly and representatives of the genus Fannia (Tobin et al 1999, Achiano and Giliomee 2006). Therefore, the presence of both tenebrionids and fanniids in sectors of high moisture could be accounted for by the fact that A. diaperinus eats the eggs of C. pumilio, thus reducing the number of the natural biological controllers of Fannia sp. (Dunford and Kaufman 2006). Overall, it seems important to investigate the complex interactions between insects in poultry rearing facilities to enhance the use of biological pest control tools in these environments, an approach that could considerably reduce the economic cost incurred by the massive use of insecticides (Kaufman et al 2002). In summary, the insects reported in this study could generate significant financial losses due to destruction of facilities, parasitism in birds and spread of infectious agents. Nevertheless, some of them play important ecological roles in poultry farms, acting as controlling agents of other insect pest populations, a trait that could be positively employed. Moreover, improvements in water drainage systems become mandatory since they are critical control points for insect pest management. SUMMARY
Insects are common in poultry facilities and different biosecurity measures are enforced to prevent their spread due to the fact that they may carry pathogenic agents. Therefore, it is of utmost importance to know what insects are commonly present in poultry sheds to optimize control protocols. Since information on this subject is scarce, this investigation aimed to determine the main insect taxa present in chicken manure on a major poultry farm in Central Chile. Samples of hen manure were collected at a poultry farm in the Region of Valparaso, Chile, from areas adjacent to feeding lines and water reservoirs. Samples were chilled, transported to the laboratory and processed for taxonomic classification of both adult and immature stages of insects. Results indicated a marked colonization of the beetle Alphitobius diaperinus and of the dipterans Fannia sp.,compared to other six families of insects that were also determined. About 94% of the insects found in chicken manure were present in samples from areas adjacent to water reservoirs. Therefore, leaks from water supply devices become a critical point of control of these entomological poultry pests that have been reported to carry a variety of viral, bacterial and eukaryotic parasites.

ACKNOWLEDGMENTS
This work was partially funded by Vicerrectora de Estudios Avanzados of the Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, Chile. Project: DI-UCV 122.705/2008. J Retamales is the recipient of a CONICYT Doctoral Scholarship. We thank Ms. Paola Arenas for revising the manuscript.

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Arch Med Vet 43 85-89 (2011) COMUNICACIN

Uso de bacterifagos en gallinas de postura infectadas con Salmonella enterica serotipo Enteritidis: prevencin de la colonizacin intestinal y reproductiva#
Bacteriophage use in laying hens infected with Salmonella enterica serovar Enteritidis: prevention of intestinal and reproductive colonization
C Boriea*, C Hauvaa, J Quirogaa, V Bravoa, ML Sncheza, MA Moralesa, P Retamala, J Retamalesb, J Robesonb
de Medicina Preventiva Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Santiago, Chile. bLaboratorio de Bacteriologa, Instituto de Biologa, Pontificia Universidad Catlica de Valparaso, Valparaso, Chile.
aDepartamento

SUMMARY Salmonella enterica serovar Enteritidis (SE) remains an important enteropathogen in the poultry industry and public health. Due to the limited effectiveness of control measures, lytic bacteriophages have shown a potential use as biocontrollers of SE in birds. The aim of this study was to determine the effectiveness of prophylactic therapy with phages to control intestinal and reproductive tract colonization of SE in laying hens. 22-week old HyLine Brown hens free of Salmonella, were treated with a mixture of three bacteriophages (1011 PFU/dose/phage) and challenged with 2.4 x 108 CFU of SE, 24 hours post phage treatment. On day 10 post challenge, hens were euthanatized, and individual samples of cecum, ovary and oviduct, were analyzed using qualitative and quantitative bacteriology. Eggs laid during the experience were collected and processed to detect SE. The incidence of Salmonella in ceca was similar between positive control and treated groups (96.67%) and cecal bacterial counts did not present significant differences between them (P > 0.05). In reproductive tissues, phagetherapy was able to slightly reduce the SE count in the ovary (P < 0.05), but not in oviducts (P > 0.05). This lytic activity of phages observed in ovaric tissue, encourages further efforts to elucidate the real contribution of bacteriophages as SE biocontrollers in laying hens. Palabras clave: Salmonella, prevencin, bacterifagos, gallinas de postura, aves. Key words: Salmonella, prevention, bacteriophages, laying hens, poultry.

INTRODUCCIN Las infecciones por Salmonella spp corresponden a una enfermedad transmitida por alimentos, de fuerte impacto en la salud pblica. En la Unin Europea, durante el ao 2008, la salmonelosis fue la segunda enfermedad zoontica ms frecuente, donde S. enterica serotipo Enteritidis (SE) fue uno de los serotipos ms prevalentes (EFSA 2010). Una situacin similar se notific en Estados Unidos de Norteamrica durante el ao 2009 (MMWR 2010). En Chile, en el ao 2006 se increment en un 300% el nmero de casos confirmados de salmonelosis (2.219 casos) respecto al ao 2000, correspondiendo en el 50% de los casos al serotipo S. Enteritidis (Figueroa 2007). De la misma forma se observ un aumento en el nmero de hallazgos de Salmonella spp en mataderos de aves, de 37 en el ao 2004 a 74 en el ao 2006 (Figueroa 2007).

Aceptado: 01.09.2010. # Proyecto Fondecyt 1080291. * Casilla 2 Correo 15 La Granja, Santiago, Chile; cborie@uchile.cl

Entre los alimentos ms frecuentemente asociados se encuentran los derivados de la industria avcola, especialmente el consumo de huevos y sus derivados (Gast 2007). En Chile, entre los aos 1975 y 1996, un 38,2% de los aislados alimentarios de Salmonella Enteritidis se detectaron en alimentos que contenan huevo (tortas, mayonesa), mientras que slo un 6,4% de ellos se detect en alimentos derivados de carne de ave (Prat y col 2001, Figueroa 2007). Para enfrentar este problema la industria avcola ha implementado varias medidas de control incluyendo vacunas, pre y probiticos, normas de bioseguridad y uso de antimicrobianos, entre otros (Gast 2007). Pese a lo anterior, la enfermedad an est presente en el ser humano, situacin agravada por la emergencia de multirresistencia tanto en las cepas aisladas de casos clnicos como de reservorios animales. Por esta razn, el estudio de bacterifagos lticos ha concitado el inters en el control de Salmonella gracias a su habilidad para infectar slo bacterias especficas, mantenindose inocuos para la microflora intestinal y para clulas eucariotas. Estos virus o fagos, una vez que reconocen receptores especficos de la superficie bacteriana, inyectan 85

C BORIE Y COL

su genoma, el cual se multiplica generando una nueva progenie viral; el ciclo termina con la lisis bacteriana y la liberacin de la progenie viral al ambiente (Joerger 2003, Dabrowska y col 2005). Gracias a esta actividad ltica, ellos han sido exitosamente usados como herramienta terapetica y profilctica frente a patgenos tales como Listeria monocytogenes (Leverentz y col 2003), Campylobacter spp. (Atterbury y col 2003, Bigwood y col 2008), Escherichia coli (OFlynn y col 2004) y Salmonella spp (Leverentz y col 2001, Modi y col 2001, Whichard y col 2003, Fiorentin y col 2005a, Higgins y col 2005). En el caso especfico de Salmonella spp, la fagoterapia ha disminuido la incidencia y el recuento en intestino, as como tambin la invasin sistmica en pollos (Fiorentin y col 2005b, Toro y col 2005, Filho y col 2007). La aplicacin profilctica de bacterifagos ha producido resultados promisorios. As, utilizando una mezcla de tres fagos (108 Unidades Formadoras de Placas/dosis/fago) en pollos de 6 das de edad pretratados con un probitico (Broilact) y luego de tres das, desafiados con SE (2,95 x 105 Unidades Formadoras de Colonias/dosis/ave), la incidencia de infeccin se redujo en 61,3% y el recuento promedio disminuy en 0,36 log10 UFC/g en las aves que recibieron probitico y fagos, valores que demuestran mayor eficiencia que lo obtenido cuando ambas terapias se administraron por separado (Borie y col 2009). Los estudios han sido realizados en pollos jvenes y no existen publicaciones sobre el efecto de una fagoterapia en gallinas de postura, cuyos huevos son considerados alimentos de riesgo para la poblacin humana. Este estudio tuvo como objetivo determinar la eficacia de una mezcla de bacterifagos en la prevencin de la colonizacin de SE en tejido reproductivo (ovario/oviducto) y ciegos de gallinas comerciales de postura. MATERIALES Y MTODOS
AVES

AISLAMIENTO, PROPAGACIN Y CARACTERIZACIN DE BACTERIFAGOS (BP)

Se seleccionaron tres bacterifagos lticos previamente caracterizados (Santander 2003, Robeson y col 2008). En breve, 1 mL de agua de alcantarillado de un plantel avcola de la V Regin (zona central de Chile) fue mezclado con 10 mL de caldo Luria Bertani (LB, Difco) con rifampicina (100 g/mL, Arlab) y con 0,5 mL de un cultivo en fase exponencial de crecimiento de SE ATCC 13076 (mutante rifampicina resistente), incubando esta mezcla en agitacin a 37 C por 24 horas. Un mL fue centrifugado a 9.300 g por 5 minutos y el sobrenadante fue tratado con cloroformo y posteriormente sembrado en una placa con desarrollo de SE ATCC 13076 (mtodo de la doble capa de agar). Luego de 24 horas a 37 C se purificaron las placas lticas existentes. Se prepararon stocks de bacterifagos mediante propagacin de los fagos purificados en caldo LB con SE ATCC 13076. Este mtodo produjo stocks de fagos con un ttulo > a 1012 UFP. Cada fago fue administrado va oral forzada (intraesofgico), suspendido en agua destilada para alcanzar una multiplicidad de infeccin (MOI) de 103 UFP.
DISEO EXPERIMENTAL

Se trabaj con gallinas comerciales de postura Hy-Line Brown de 22 semanas de edad negativas a Salmonella por cultivo y PCR de deposiciones y por prueba serolgica de microaglutinacin (Servicio Agrcola y Ganadero, Chile). Las aves fueron criadas y manejadas siguiendo las recomendaciones de los Comit de Biotica y Bioseguridad de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile y recibieron alimento sin antimicrobianos y agua ad libitum.
CEPA DESAFO

Se trabaj con 80 aves de 18 semanas de edad, separadas en cuatro grupos: el grupo 1 constituido por 10 aves que no recibieron terapia ni infeccin con SE (control negativo), el grupo 2 con 30 aves que recibieron slo SE (control positivo), el grupo 3 con 10 aves que slo recibieron bacterifagos y el grupo 4 con 30 gallinas que fueron tratadas con fagos e infectadas con SE. Los cuatro grupos se mantuvieron en salas experimentales separadas, atendidas por personal exclusivo para evitar contaminacin entre ellos. A las 22 semanas de edad, las 10 aves del grupo 3 (slo BP) y las 30 aves del grupo 4 (BP +SE) recibieron por va oral forzada (intraesofgico) la mezcla de bacterifagos (1011 UFP/dosis/fago) durante tres das consecutivos. Veinticuatro horas ms tarde, las 30 aves del grupo 2 (slo SE) y las 30 aves del grupo 4 fueron desafiadas por va oral forzada (intraesofgico) con una Dosis Mnima Infectante (DMI) (2,4 x 108 UFC) de SE nalR rifR suspendida en 3 mL de agua peptonada fosfatada (Oxoid). Diez das postdesafo, todos los grupos fueron sometidos a eutanasia con T61 (Shering Ploug Animal Health) (AVMA, 2001), obteniendo muestras individuales de ciegos, ovarios y oviductos para anlisis de bacteriologa cualitativa y cuantitativa. Adicionalmente, en los grupos 2 y 4 se procesaron todos los huevos puestos durante la experiencia (10 das) para la deteccin de SE, considerando un pool de 10 huevos.
BACTERIOLOGA

Se utiliz una cepa de SE aislada de pool de rganos (hgado, bazo y corazn) de una gallina reproductora. Se seleccion, en el laboratorio, una mutante espontnea resistente a cido nalidxico y rifampicina (nalR rifR). 86

Cada muestra de ciego, ovario y oviducto fue pesada y colocada en una bolsa plstica estril (Whirl Pak, Nasco)

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adicionada de caldo Rapapport-Vassiliadis (RV, Difco) en razn 1:10. Una vez trituradas y homogeneizadas (un mL fue separado para bacteriologa cuantitativa), las muestras se incubaron a 37 C por 72 horas, sembrando cada 24 horas en placas de agar XLD (Difco) adicionado de rifampicina y cido nalidxico (20 g /mL de cada uno) e incubadas a 37 C por 24 horas. Las colonias sospechosas se confirmaron con suero anti O-Salmonella poly A-I y Vi (Difco). Las muestras negativas fueron procesadas por PCR para la deteccin genmica de SE, de acuerdo a metodologa implementada y descrita previamente (Borie y col 2008). Los huevos se procesaron como pool, con un mximo de 10 unidades/pool/grupo. Se consider un animal positivo cuando se detect SE al menos en una de sus tres muestras (ciegos, ovario, oviducto). Para la bacteriologa cuantitativa, un mL de las muestras suspendidas en caldo RV sin incubar fueron diluidas al dcimo en agua peptonada fosfatada (Oxoid), sembrando en superficie 100 L sobre agar XLD adicionado de cido nalidxico y rifampicina. Las placas se incubaron a 37 C por 24 horas, procediendo a contar las unidades formadoras de colonias (UFC).
ANLISIS ESTADSTICO

Cuadro 1. Aislamiento de Salmonella Enteritidis desde ciegos, ovarios y oviductos de gallinas de postura experimentalmente infectadas y pretratadas con una mezcla de bacterifagos.
Isolation of Salmonella Enteritidis from cecum, ovaries and oviducts of experimentally infected laying hens pre-treated with a mixture of bacteriophages.

Grupo

N aves 30

Tejidos positivos a SE (%) Ciegos 29 (96,67) 29 (96,67) Ovarios 13 (43,3) 9 (30,0) Oviductos 7 (23,3) 3 (10,0)

Control (SE)

Tratado (BP + SE) 30

SE: Salmonella Enteritidis, BP: bacterifago.

Los resultados de la bacteriologa cualitativa fueron expresados como porcentaje de aves infectadas (aves positivas a SE) y las diferencias entre los grupos experimentales (2 y 4) fueron determinadas por Chi cuadrado (INFOSTAT 2004). Los recuentos (UFC) de SE en ciegos y tejidos reproductivos (ovarios/oviductos) fueron transformados a unidades logartmicas (UFC log10) y sometidos a anlisis de varianza (ANOVA); las diferencias entre las medias se evaluaron por Test de Tukey (INFOSTAT 2004). Toda muestra que fue positiva en la bacteriologa cualitativa pero negativa en la cuantitativa, se le asign valor 1; por otro lado, toda muestra negativa por bacteriologa cualitativa y cuantitativa se le asign valor 0. Un valor de P < a 0,05 fue considerado con significancia estadstica. RESULTADOS Y DISCUSIN El anlisis de la bacteriologa cualitativa demostr que la proporcin de infeccin cecal y de tejidos reproductivos no fue diferente (P > 0,05) entre el grupo control positivo y el grupo que recibi la mezcla de fagos (cuadro 1). En todas las muestras cecales donde se aisl SE tambin se detectaron fagos, a diferencia de lo observado en ovarios y oviductos, donde escasamente se aislaron bacterifagos (datos no mostrados). En ambos grupos experimentales (grupos 2 y 4) no se detect SE en los huevos frescos puestos durante toda la experiencia (10 das). Todas las muestras de ciegos, ovarios, oviductos y huevos que fueron negativas por bacteriologa cualitativa tambin lo fueron por PCR (datos nos mostrados).

Los promedios de recuentos de SE en ciegos y tejidos reproductivos se observan en la figura 1. En comparacin con el grupo control positivo, las aves tratadas con bacterifagos presentaron una leve disminucin de los recuentos, diferencia que fue significativa slo en ovarios (P < 0,05). No se observaron cambios de conducta ni manifestaciones clnicas sugerentes de enfermedad digestiva en los grupos experimentales, as como tampoco lesiones macroscpicas en la necropsia. Bajo el presente diseo experimental la mezcla de bacterifagos no disminuy la colonizacin cecal de SE en las gallinas de postura, situacin similar a lo observado por Sklar y Joerger 2001 en pollos tratados con diferentes concentraciones de bacterifagos y por Higgins y col 2007 en pavos tratados con bacterifagos asociados a un anticido. La baja eficiencia de los fagos en gallinas de postura, comparada con los buenos resultados obtenidos previamente en pollos, podra ser explicada por el bajo pH del tracto digestivo en gallinas adultas comparadas con pollos y mamferos (Rosales 2005, Ghise 2009). Se ha demostrado que el pH cido reduce la actividad ltica de algunos fagos (Leverentz y col 2001, Dabrowska y col 2005), efecto que puede ser revertido por la adicin de anticidos (Smith 1987, Koo y col 2001, Higgins y col 2007). Los fagos utilizados en el presente estudio mantienen un ttulo estable entre pH 3 y 11 (Santander 2003), por lo que no se consider usar anticidos. Otros factores adicionales que pudieran incidir en los resultados seran: i) Viscosidad y flora bacteriana normal que actuaran como barrera mecnica, disminuyendo la probabilidad de contacto entre bacterias y fagos (Joerger 2003). ii) motilidad intestinal que disminuira el tiempo de contacto efectivo entre bacterias y fagos (Fiorentin y col 2005b, Atterbury y col 2007, Higgins y col 2007). En este estudio los fagos se administraron 72, 48 y 24 horas antes del desafo con SE, por lo que es factible que los ttulos de fagos disminuyeran antes de encontrarse con la bacteria blanco. Para evitarlo, se utilizaron elevadas dosis 87

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Figura 1. Recuento promedio de Salmonella Enteritidis (SE) desde tejidos de gallinas infectadas y pretratadas con bacterifagos (BF) (*P < 0,05).
Average of Salmonella Enteritidis (SE) counts from tissues of chickens experimentally infected and pre-treated with bacteriophages (BF) (*P < 0.05).

de fagos (1011 UFP/da) en relacin a la concentracin de bacterias inoculadas. iii) Resistencia bacteriana a los fagos (Atterbury y col 2007, Higgins y col 2007), situacin que se reduce utilizando dos o ms bacterifagos (Sklar y Joerger 2001, Fiorentin y col 2005a, Toro y col 2005), como es el caso del presente estudio. La DMI utilizada para infectar las gallinas fue similar a la sealada por otros autores para gallinas adultas (Keller y col 1995, Kinde y col 2000, Gast y col 2004a, Gast y col 2004b). Esta dosis logr una elevada tasa de colonizacin en ciegos (> 95%) pero escasa en ovarios y oviductos (43,3% y 23,3%, respectivamente), esto ltimo probablemente debido a la baja invasividad de la cepa. El escaso aislamiento de SE obtenido en tejidos reproductivos contrasta con lo observado por otros investigadores, donde los porcentajes de aislamiento van de 50-70% para ovarios y 37-60% para oviductos (Gast y Beard 1990, Gast y col 2004a). La invasividad de esta cepa podra mejorarse mediante pasajes en tejidos reproductivos de gallinas (Gast y col 2003). Finalmente, se puede concluir que bajo el presente diseo experimental la administracin preventiva de bacterifagos en gallinas de postura infectadas con SE es menos efectiva que lo descrito previamente en pollos y que, por lo tanto, mayores estudios son necesarios para definir su potencial para disminuir el riesgo en salud pblica. El modelo experimental debe ser reevaluado en cuanto a la concentracin de bacterifagos (aumento de la MOI) y a la invasividad de la cepa desafo.

RESUMEN
Salmonella enterica serotipo Enteritidis (SE) contina siendo un importante enteropatgeno para la industria avcola y para la Salud Pblica. Debido a la limitada efectividad de las medidas de control, los bacterifagos lticos han mostrado un uso potencial como biocontroladores de SE en aves. El propsito de este estudio fue determinar la efectividad de una terapia profilctica con fagos para el control de la colonizacin de SE en el tracto intestinal y reproductivo de gallinas de postura. Gallinas Hy-Line Brown, de 22 semanas de edad, libres de Salmonella, fueron tratadas con una mezcla de tres bacterifagos (10 11 UFP/dosis/fago) y desafiadas con 2,4 x 108 UFC de SE, veinticuatro horas postratamiento. Al da 10 postdesafo, las gallinas se sometieron a eutanasia, obtenindose muestras individuales de ciegos, ovario y oviducto, las cuales fueron analizadas por bacteriologa cualitativa y cuantitativa. Se recolectaron los huevos puestos durante la experiencia y se procesaron para detectar SE. La proporcin de Salmonella Enteritidis en los ciegos fue similar entre los grupos control positivo y tratado (96,67%) y el recuento bacteriano cecal tampoco present diferencias significativas (P > 0,05). En los tejidos reproductivos, la administracin de fagos no disminuy la incidencia de infeccin (P > 0,05), pero fue capaz de reducir levemente los recuentos de SE en ovario (P < 0,05), aunque no en oviducto (P > 0,05). La actividad ltica de los fagos demostrada en tejido ovrico, aunque escasa, sugiere realizar mayores esfuerzos para dilucidar la real contribucin de los bacterifagos como biocontroladores de SE en gallinas de postura.

AGRADECIMIENTOS
Esta investigacin fue financiada por el proyecto Fondecyt N 1080291.

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Arch Med Vet 43 91-94 (2011) COMUNICACIN

Carcinoma folicular de tiroides en perros. Reporte de casos

Follicular thyroid carcinoma in dogs. Report of cases
AB de Nardiab*, CR Daleckc, MCV Silvac, JC Canolac, LGGG Diasc, SG Calazansc, SC Fernandesc, D Euridesd, LAF Silvae, RR Huppesa
aUniversidad bUniversidad cUniversidad

de Franca, San Pablo, Brasil.

Federal de lo Tocantins, Tocantins, Brasil.

Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal, San Pablo, Brasil. Federal de Uberlndia, Minas Gerais, Brasil. Federal de Gois, Gois, Brasil.
SUMMARY
eUniversidad

dUniversidad

The aim of this study was to report the occurrence of two cases of thyroid neoplasm in dogs. The treatment of choice for these cases was surgical removal. In both cases the diagnostic was infiltrative follicular carcinoma of thyroid. The first animal did not present a good recovery after the surgery, and died four hours after the procedure. In the second case, the diagnosis was more precocious and antineoplastic chemotherapy was used after the surgery. At the time of submission of this manuscript, this animal had survived for fourty months. Currently, there is a need to define the protocols of chemotherapy to avoid relapse and metastases, in order to increase the life expectancy in dogs with thyroid neoplasm. Palabras clave: neoplasia, tiroides, carcinoma folicular, perro. Key words: neoplasia, thyroid, follicular carcinoma, dog.

INTRODUCCIN nmero de casos, principalmente en los linfondulos satlites, pulmones, hgado y vrtebras cervicales (Lurye y Behrend 2001, Page 2001). Las radiografas torcicas son importantes en el preoperativo para identificar metstasis pulmonares o la presencia de tumores en el tejido tiroideo ectpico (De Nardi y col 2009). La escisin quirrgica de las neoplasias de tiroides es el tratamiento de eleccin (De Nardi y col 2009). De acuerdo con Fossum (2001), la remocin quirrgica de los carcinomas es difcil, debido a la naturaleza invasiva e irrigacin acentuada, pero debe ser considerada cuando las metstasis an no se presentan. En los tumores malignos de tiroides est siempre indicada la quimioterapia adyuvante con el objetivo de evitar recidivas y promover la destruccin de las micrometstasis, aumentando as supervivencia de los pacientes (Rodaski y De Nardi 2004). Segn Page (2001) y Morris y Dobson (2002) la media de supervivencia a tumores invasivos despus de la reseccin quirrgica es de siete a ocho meses. El presente trabajo tiene como objetivo relatar la ocurrencia de dos casos de neoplasia de tiroides en perros, teniendo en cuenta la presentacin clnica, diagnstico y las formas de tratamiento empleadas.

Las neoplasias de la tiroides son poco frecuentes en perros y corresponden entre 1,2% y 4% de todos los tumores caninos (Page 2001, De Nardi y col 2002), siendo las neoplasias malignas las ms comunes y representan de 63% a 88% de todos los tumores tiroideos (Bezzola 2002, Silva y col 2005). Segn Grubor y Haynes (2005), los tumores malignos de la tiroides pueden ser originados de las clulas foliculares (tipo compacto, papilar o mixto) o de las clulas parafoliculares (medulares o de clulas C) que son raros en perros. Las neoplasias de tiroides son ms comunes en perros de razas medianas y grandes (Bezzola 2002). La edad media del diagnstico es entre nueve y diez aos (Page 2001, Morris y Dobson 2002). En las neoplasias malignas de tiroides es frecuente la invasin del tumor en el interior de la laringe, trquea, esfago, msculos, vasos y nervios cervicales (Lurye y Behrend 2001). Las metstasis estn presentes en un gran

Aceptado: 01.09.2010. * Rua Rui Barbosa 502-casa 05, Jardim Filadlfia, CEP: 77813-205, Araguana, Tocantins, Brasil; andrigobarboza@yahoo.com.br

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AB DE NARDI Y COL

MATERIALES Y MTODOS Dos caninos con aumento de volumen en la regin cervical ventral fueron examinados en el Servicio de Oncologa del Hospital Veterinario Governador Laudo Natel de la Facultad de Ciencias Agrarias y Veterinarias - UNESP / Jaboticabal, San Pablo, Brasil. El primer caso era un macho de 12 aos, de raza Cocker Spaniel, de 19 kg presentando una masa de 14 cm de dimetro con poca movilidad. El segundo caso era una hembra de 12 aos, de raza Poodle, de 6 kg, presentando una masa de 3,5 cm de largo y 2,5 cm de dimetro no adherida a los tejidos vecinos. Como procedimiento de rutina durante la evaluacin clnica de los pacientes con sospecha de neoplasia de tiroides se procedi a la realizacin de la anamnesis, examen fsico (evaluacin del tamao del tumor), de laboratorio (hemograma, alanino aminotransferasa, creatinina y urinalisis), examen radiogrfico de la cabeza, cuello y del trax en las proyecciones ventrodorsal, laterolateral, derecha e izquierda, con el objetivo de evaluar el compromiso de estructuras adyacentes e investigar la presencia de metstasis. RESULTADOS Y DISCUSIN A travs del anlisis de la historia clnica de estos pacientes no fue posible correlacionar ninguna etiologa con el desarrollo de estas neoplasias (Page 2001). Relacionando la incidencia de las neoplasias de tiroides con la edad de los animales atendidos, se nota mayor predisposicin al desarrollo neoplsico en animales viejos (Lurye y Behrend 2001, Bezzola 2002). Los signos clnicos encontrados en estos animales fueron alteraciones respiratorias y disfagia provocadas por la compresin ocasionada por la neoplasia sobre la trquea y/o esfago, respectivamente (figura 1A y 1B). En ninguno de los casos los pacientes presentaban signos clnicos de hiper o hipotiroidismo. El hipotiroidismo puede ser una consecuencia de la destruccin del tejido tiroideo provocada por el desarrollo de la neoplasia (Morris y Dobson 2002). Generalmente estos tumores no son funcionales, pues solamente 10% de los casos son hiperfuncionales y los animales pueden presentar signos de hipertiroidismo (Page 2001). A travs de la evaluacin radiogrfica no fue posible identificar alteraciones neoplsicas en el tejido tiroideo ectpico que es principalmente encontrado en la regin cervical, el cual tambin puede estar localizado en mediastino craneal y en la porcin torcica de la aorta caudal (De Nardi y col 2009). El prediagnstico de carcinoma tiroideo fue obtenido por citologa por aspiracin con aguja fina (CAAF) y el diagnstico definitivo a travs de la evaluacin histopatolgica. Siguiendo lo recomendado por Lurye y Behrend (2001) y De Nardi y col (2002), cuando los linfondulos satlites estaban aumentados se procedi 92

a CAAF, con el fin de evaluar la presencia de clulas neoplsicas en estas estructuras. La citologa por aspiracin con aguja fina permiti adems la realizacin del diagnstico diferencial en relacin a la presencia de otras afecciones, como abscesos, sialodenopatas, linfoma, tumor de la cartida y hemangiosarcoma (Morris y Dobson 2002). Contrariamente a lo descrito por Fossum (2001), la CAAF no result en hemorragias significativas y aspirados de mala calidad. Los animales de este estudio, en el momento del diagnstico de la neoplasia, presentaban elevacin de las enzimas hepticas conforme lo descrito por Morris y Dobson (2002). De acuerdo con Fineman y col (1998), Bezzola (2002) y Grubor y Haynes (2005) el tratamiento de los carcinomas de tiroides fue seleccionado teniendo en cuenta el tamao del tumor, el grado de invasin, la presencia de sntomas sistmicos y las modalidades teraputicas disponibles. El tratamiento elegido para los dos casos fue la exresis quirrgica. La remocin quirrgica del

Figura 1. A) Imagen radiogrfica de la regin cervical de un canino de la raza Cocker Spaniel revelando aumento de opacidad de tejidos blandos, con reduccin del rea de la oro y nasofaringe. B) Neoplasia de tiroides de aproximadamente 14 cm de dimetro, localizada en la regin ventral izquierda del cuello. C) Imagen radiogrfica de la regin cervical de una perra de la raza Poodle indicando metstasis de carcinoma folicular de tiroides en linfondulo cervical caudal profundo, provocando colapso de trquea. D) Imagen del transoperatorio revelando la presencia de carcinoma folicular de tiroides (Flecha grande). La flecha pequea indica la presencia de metstasis en linfondulo cervical caudal profundo.
A) X ray image of the cervical region of a Cocker Spaniel revealing increase of the soft tissues opacity, with reduction of the oral and nasopharynx area. B) Thyroid neoplasia of approximately 14 cm diameter located in the left ventral region of theneck. C) X ray image of the cervical region of a poodle bitch showing folicular thyroid carcinoma metastasis in the deep flow cervical lymphonode, provoking trachea collapse. D) Transoperative image revealing the presence of a thyroid folicular carcinoma (big arrow).The small arrow shows the presence of metastasis in the deep flow cervical lymphonode.

NEOPLASIA, TIROIDES, CARCINOMA FOLICULAR, PERRO

carcinoma de tiroides en el primer paciente, el cual no presentaba metstasis en las evaluaciones preoperatorias, fue difcil debido a la naturaleza invasiva y vascularidad acentuada de este tumor como es relatado por De Nardi y col (2009) y Fossum (2001). En este paciente, sin embargo, estructuras, como vena yugular, arteria cartida, nervio vago y linfondulo retrofarngeo estaban comprometidos dificultando la obtencin de mrgenes de seguridad adecuados (Brearley 2000, Worth y col 2005). En el segundo caso conjuntamente con el tumor primario fue realizada la exresis de dos linfondulos satlites (Lurye y Berrend 2001, De Nardi y col 2002), pues el linfondulo cervical caudal profundo estaba comprometido por metstasis (figuras 1C y 1D). El examen histopatolgico del primer caso revel la presencia de clulas redondas gigantes, con citoplasma escaso y ncleo evidente con alto ndice mittico, frecuentes mitosis atpicas e infiltracin angiolinftica intratumoral; adems haba focos de necrosis y calcificacin. En el segundo caso se observ material representativo de neoplasia constituido por clulas redondas pequeas, con escaso citoplasma y ncleo hipercromtico dispuestos en acinos, constituyendo puentes celulares. Coexistan reas de hemorragia y calcificacin, con frecuentes figuras de mitosis. En ambos casos la conclusin fue de carcinoma folicular infiltrativo de tiroides. La quimioterapia debe considerarse para todos los carcinomas de tiroides independientemente del xito quirrgico (De Nardi y col 2009). Este tratamiento debe hacerse como una herramienta teraputica para prevenir la repeticin y fomentar la destruccin de micrometstasis (De Nardi y col 2009). La quimioterapia antineoplsica utilizando doxorrubicina es ms eficaz para el tratamiento de carcinoma tiroideo en perros, pero la respuesta puede variar de animal a animal (De Nardi y col 2009). En los dos casos fue empleada la quimioterapia antineoplsica. En el primer paciente, el tratamiento tuvo como objetivo promover la citorreduccin tumoral antes del procedimiento quirrgico (Silva y col 2005), pues el tumor se encontraba adherido y afectaba estructuras importantes. Se administra, inicialmente, quimioterapia citotxica utilizndose lomustina11 (90 mg/m2, por va oral, cada 21 das, en un total de dos sesiones), vincristina2 (0,5 mg/m, por va intravenosa, cada 7 das, en un total de cuatro sesiones) y prednisona3 (1 mg/kg, por va oral, diariamente, por cuatro semanas) (De Nardi y col 2006). Sin embargo, no se observ ninguna regresin neoplsica con el tratamiento quimioteraputico. Segn Page (2001) y Grubor y Hayner (2005), pacientes con tumores extensos, metastticos y con elevado ndice mittico tienen pronstico reservado, generalmente con pocos meses de supervivencia.
1 2 3

En el segundo caso la quimioterapia fue empleada como terapia adyuvante en el posoperatorio. El protocolo utilizado fue la asociacin de doxorrubicina4 (30 mg/m, por va intravenosa, cada 21 das, en un total de cuatro sesiones) y ciclofosfamida5 (250 mg/m, por va oral, cada 21 das, en un total de cuatro sesiones). De acuerdo con la clasificacin TNM de las neoplasias de tiroides en perros propuesta por Morris y Dobson (2002), el primer paciente presentaba estado 3 de evolucin neoplsica (T3b, N0, M0), mientras que el segundo paciente presentaba estado 2 (T2b, N1a, M0). El pronstico de los animales de este estudio present estrecha correlacin con el estadio clnico de la neoplasia. El primer animal no present buena recuperacin posquirrgica y falleci cuatro horas despus de terminada la ciruga. En el segundo caso, el animal se encuentra hasta el momento con una sobrevida de cuarenta meses, probablemente debido a que el paciente tuvo un diagnstico precoz y adems recibi quimioterapia postquirrgica. Conforme a lo descrito por Brearley (2000), el pronstico de perros con carcinoma de tiroides puede ser mejorado con el empleo de la radioterapia, pues esta forma de tratamiento confiere buenos resultados cuando es empleada como terapia adyuvante despus de la reseccin quirrgica. Otra terapia que puede ser utilizada es iodo radioactivo (I). Este tipo de tratamiento destruye selectivamente el tejido tiroideo neoplsico, por lo tanto, preserva el tejido tiroideo normal y las glndulas paratiroides. Este est indicado como terapia adyuvante despus de la remocin quirrgica del tumor y puede ser empleado en perros con neoplasias de tiroides (Worth 2005). Los estudios epidemiolgicos de todos los tipos de cncer que afectan a los perros y a los gatos son de suma importancia, pues de esta forma se conoce mejor la incidencia de estas afecciones, mejorando el tratamiento y pronstico de los casos futuros. Adems de esto, hay necesidad de definir protocolos quimioteraputicos ms eficaces para combatir las recidivas y metstasis, aumentando la expectativa de vida de estos pacientes. RESUMEN
El presente trabajo tiene como objetivo relatar la ocurrencia de dos casos de neoplasia de tiroides en perros. El tratamiento de eleccin para estos casos fue exresis quirrgica. En ambos casos el diagnstico fue carcinoma folicular infiltrativo de tiroides. El primer animal no present buena recuperacin posquirrgica, y muri cuatro horas despus del trmino de la ciruga. En el segundo caso el diagnstico fue ms precoz y despus de la ciruga se asoci el uso de la quimioterapia antineoplsica. Hasta el momento, este animal presenta cuarenta meses de supervivencia. Actualmente, existe la necesidad de definir protocolos quimioteraputicos ms eficaces para evitar la ocurrencia de recidivas y metstasis, aumentando la expectativa de vida de los perros con neoplasia tiroidea.

Citostal (Bristol-Myers Squibb - So Paulo - SP - Brasil). Vincristex (Cristlia - Itapira - SP - Brasil). Meticorten (Schering-Plough - Rio de Janeiro - RJ - Brasil).

4 5

Doxolem (Zodiac - Pindamonhangaba - SP - Brasil). Ciclofosfamida (Neovita - Rio de Janeiro - RJ - Brasil).

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REFERENCIAS
Bezzola P. 2002 Thyroid carcinoma and hyperthyroidism in a dog. Can Vet J 43, 125-126. Brearley MJ. 2000. Radiation therapy for unresectable thyroid carcinomas. J Am Vet Med Assoc 217, 466-467. De Nardi AB, S Rodaski. 2002. Prevalncia de neoplasias e modalidades de tratamentos em ces atendidos no Hospital Veterinrio da Universidade Federal do Paran. Arch Vet Sci 7, 15-26. De Nardi AB, FM Ferreira, JPE Pascon, AM De Brun, AS Lima. 2009. Neoplasias do Sistema Endcrino. En: Daleck CR, De Nardi AB, Rodaski S (eds). Oncologia em ces e gatos. Roca, So Paulo, Brasil, Pp 438-444. Fineman LS, TA Hamilton, A De Gortari, P Bonney. 1998. Cisplatin chemotherapy for treatment of thyroid carcinoma in dogs: 13 cases. J Am Vet Med Assoc 34, 109-112. Fossum TW. 2001. Cirurgia do sistema endcrino. En: Fossum TW y col (eds). Cirurgia de Pequenos Animais. Roca, So Paulo, Brasil, Pp 476-490.

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Arch Med Vet 43 95-98 (2011) COMUNICACIN

Evaluacin del mtodo del tubo para concentrar plaquetas caninas: estudio celular
Evaluation of the tube method for concentrating canine platelets: cellular study
RF Silvaa, b*, CMF Rezendeb, FO Paes-Lemeb, JU Carmonaa
aGrupo bEscola

de Investigacin Terapia Regenerativa, Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Manizales, Caldas, Colombia.

de Veterinria, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.

SUMMARY The aim of this study was to evaluate a manual method for concentrating canine platelets and consequently produce autologous platelet concentrates (APCs) for clinical and experimental proposals. The APCs were obtained by venous blood collection in tubes with ACD solution and were spun at 191 g for 6 minutes. The cell counts of whole blood and APCs, were statistically different (P < 0.01) between the values for platelets, leukocytes, granulocytes, monocytes, but not for lymphocytes. A strong negative correlation ( = -0.702 P = 0.011) between the number of lymphocytes and platelets in the APCs was found. The collection efficiency of platelets was 29.9% and the concentration of platelets was 49.4% higher in APCs when compared to the whole blood samples. The results indicated that this simple centrifugation method allows concentrating canine platelets. Palabras clave: perro, plasma rico en plaquetas autlogo, medicina regenerativa, mtodo del tubo. Key words: dog, autologous platelet rich plasma, regenerative medicine, tube method.

INTRODUCCIN Los concentrados autlogos de plaquetas (APCs) son fuente de diversos factores de crecimiento (GFs), entre los que se destacan el GF transformante beta I (TGF-1), GF insulnico tipo I (IGF-I), GF derivado de las plaquetas (PDGF) y otras molculas que modulan la inflamacin y la reparacin tisular (Anitua y col 2004, Argelles y col 2006). Los APCs han sido ampliamente usados en medicina humana en procedimientos tales como la reconstruccin alveolo-maxilar (Thor y col 2007), y su uso se ha extendido a la ciruga plstica, ciruga ortopdica, medicina deportiva (tratamiento de lesiones tendinosas en atletas), tratamiento de lceras gstricas, lceras cutneas crnicas y lceras corneales (Anitua y col 2007). En medicina veterinaria se ha reportado la utilizacin clnica de APCs en equinos para tratar afecciones locomotoras crnicas (Carmona y col 2009a, b) y heridas de las extremidades (Monteiro y col 2009), entre otras. A pesar del uso creciente de APCs en medicina equina (Carmona y Prades 2009), existen escasos reportes sobre el uso clnico de APCs en caninos. Aunque esta especie ha sido ampliamente usada como modelo experimental para evaluar el efecto de esta sustancia como coadyuvante (nico o combinado con biomateriales) en la regeneracin sea

Aceptado: 08.09.2010. * Calle 65, N 26-10, Manizales, Caldas, Colombia; raul.silva@ ucaldas.edu.co

maxilar (Moreno y col 2004, Bonomi y col 2007, Dutra y col 2008) o apendicular (You y col 2007) y en pruebas de osteointegracin (Casati y col 2007). Cabe resaltar que los resultados experimentales obtenidos en estos estudios no han sido muy satisfactorios. Esto debido a la gran disimilitud metodolgica y a la falta de una estandarizacin experimental para elegir el anticoagulante ideal y los parmetros de centrifugacin que permitan concentrar un adecuado nmero de plaquetas en esa especie. Hasta el momento se han descrito dos mtodos para obtener APCs a partir de sangre canina, el mtodo del tubo (manual) (Jensen y col 2004, Choi y col 2005) y el mtodo semiatomatizado SmartPReP 2 system (Thoesen y col 2006). Los autores evaluaron el mtodo descrito para concentrar plaquetas mediante el mtodo del tubo (Jensen y col 2004, Choi y col 2005) y no encontraron reproducibilidad alguna (datos sin publicar) al seguir las recomendaciones de esos investigadores. Por otra parte, el uso de dispositivos semiatomatizados (Thoesen y col 2006) para concentrar plaquetas caninas son costoprohibitivos en la mayora de los pases del continente. El objetivo fundamental de la presente investigacin fue estandarizar un mtodo manual que permitiera concentrar plaquetas caninas de manera reproducible con la finalidad de poder usar APCs tanto en el campo clnico como experimental en caninos. La hiptesis del estudio fue que las plaquetas de perro podran ser concentradas mediante la recoleccin de sangre entera en tubos con cido ctrico-citrato de sodio-dextrosa (ACD) centrifugados de manera nica. 95

RF SILVA Y COL

MATERIAL Y MTODOS Este estudio fue aprobado por el comit de tica en experimentacin animal de la Universidad Federal de Minas Gerais, Brasil, protocolo nmero 125/2009. ANIMALES Se utilizaron doce perros de raza Fila Brasilero, seis machos con edades entre 24 y 108 meses y seis hembras con edades entre 18 y 60 meses, clnicamente sanos al momento de la recoleccin de la sangre y serolgicamente negativos a leishmaniosis y erliquiosis. OBTENCIN DEL CONCENTRADO AUTLOGO DE PLAQUETAS Se realiz extraccin de sangre mediante puncin de la vena safena con un catter mariposa 21 G (Shandong Weigao Group, China). La sangre de cada animal fue depositada en un tubo de 10 mL con 1,5 mL de solucin A de ACD, citrato de trisodio (22 g/L), cido ctrico (8 g/L) y dextrosa (24,5 g/L) (BD, New Jersey, USA). Una muestra adicional de sangre fue depositada en un tubo de 5 mL con k3EDTA para realizar un hemograma. La sangre del tubo con ACD fue centrifugada (SIGMA 3K30, Alemania) a 191 g durante 6 minutos. Posteriormente, con la ayuda de una micropipeta de volumen fijo de 1000 L se recolectaron (aproximadamente) los primeros 100 L de la porcin roja y los primeros 900 L de plasma, por debajo y por encima de la interfaz eritrocitos-plasma, respectivamente. Los APCs obtenidos fueron analizados mediante hemograma automatizado por impedancia volumtrica (Abacus Junior Vet, Austria). Cada muestra fue analizada por triplicado. Los parmetros hematolgicos evaluados

incluyeron hematocrito (PCV), recuentos de plaquetas (PLT), leucocitos (WBC), valores relativos y absolutos de linfocitos (LYM), monocitos (MID), neutrfilos, eosinfilos y basfilos (GRA). ANLISIS ESTADSTICO Las variables hematolgicas estudiadas presentaron distribucin normal (prueba de Kolmogorov-Smirnov (P > 0,05)). Los valores de sangre entera y del APC fueron comparados mediante la prueba de Student (t) para muestras pareadas. Los factores sexo y edad fueron analizados mediante un anlisis de varianza (ANOVA). Todos los resultados se presentaron como media y error estndar. Se emple el coeficiente de correlacin de Pearson () para determinar el grado de asociacin entre los parmetros evaluados en el APC y en sangre entera. Finalmente, para estudiar la relacin entre variables se realiz un anlisis de regresin lineal simple. Se acept una diferencia estadsticamente significativa de P 0,01 para t, y P 0,01 y P 0,05 para . La eficiencia de coleccin de plaquetas se determin mediante la frmula de Weibrich y col (2003): (volumen de APC x recuento de plaquetas en el APC/volumen de sangre entera x recuento de plaquetas en sangre entera) x 100. RESULTADOS Y DISCUSIN Los recuentos celulares de la sangre entera y de los APCs, presentaron diferencias estadsticamente significativas (P < 0,01) respecto a los valores de PLT, WBC, valores relativos y absolutos de GRA, absolutos de MID, relativos de PCV y LYM, mas no en los valores absolutos de LYM y relativos de MID (cuadro 1). Tampoco se hallaron diferencias entre el sexo y la edad de los animales

Cuadro 1. Valores promedios ( error estndar) de las variables hematolgicas en muestras de sangre entera y concentrado de plaquetas.
Mean ( standard error) values for the hematologic variables in the whole blood samples and the platelet concentrates.

Variable PLT (fragmentos x 103 / L) PCV % WBC (clulas x 103 / L) LYM (clulas x 103 / L) LYM% MID (clulas x 103 / L) MID% GRA (clulas x 103 / L) GRA%

Sangre entera 345,3 (44,93)* 44,2 (1,96)* 16,6 (2,08)* 5,05 (1,45) 26,6 (4,01)* 0,79 (0,22)* 4,2 (0,58) 10,7 (0,93)* 69,3 (4,19)*

Concentrado de Plaquetas 515,9 (60,74) 3,97 (1,14) 6,9 (0,48) 3,07 (0,27) 46,6 (5,76) 0,275 (0,04) 3,9 (0,50) 3,6 49,2 (0,54) (5,53)

PLT: plaquetas; PCV: hematocrito; WBC: leucocitos; LYM: linfocitos; MID: monocitos; GRA: neutrfilos, eosinfilos y basfilos. *Variable significativamente diferente (P < 0,01) entre la sangre entera y el concentrado autlogo de plaquetas.

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PERRO, PLASMA RICO EN PLAQUETAS AUTLOGO, MEDICINA REGENERATIVA, MTODO DEL TUBO

Cuadro 2. Coeficientes de correlacin de Pearson () y ecuaciones de regresin lineal para la variable dependiente (nmero de plaquetas en el APC).
Pearson correlation coefficient () and lineal regression equation for the response variable (numbers of platelets in APC).

Variable PLT MID GRA LYM-APC WBC

0,946** 0,819** 0,797** 0,702* 0,602*

P 0,000 0,001 0,002 0,011 0,038

Ecuacin de regresin lineal PLT-APC = 74.432,699 + 1,279 (PLT) PLT-APC = 337.459,058 + 225,286 (MID) PLT-APC = 41.894,228 + 51,673 (GRA) PLT-APC = 986.142,041 153,162 (LYM-APC) PLT-APC = 223.619,431 + 17,572 (WBC)

R2 0,946 0,671 0,635 0,493 0,363

PLT: plaquetas; PCV: hematocrito; WBC: leucocitos; LYM: linfocitos; MID: monocitos; GRA: neutrfilos, eosinfilos y basfilos. PLT-APC, nmero de plaquetas en el concentrado de plaquetas. *P < 0,05. **P < 0,01. PLT-APC, numbers of platelets in autologous platelet concentrate. *P < 0.05. ** P < 0.01.

y los recuentos celulares en el anlisis hematolgico. Se encontr correlacin negativa ( = -0,702 P = 0,01) entre el recuento de linfocitos y de plaquetas presentes en los APCs. Las respectivas ecuaciones de regresin lineal son presentadas en el cuadro 2. La eficiencia en la coleccin de plaquetas fue de 29,9%. La concentracin de plaquetas fue 49,4% superior en los APCs respecto a las muestras de sangre entera. Jensen y col (2004) describieron un mtodo manual para concentrar plaquetas de perros con EDTA, mediante centrifugacin nica. Ellos obtenan un incremento de plaquetas y leucocitos en el APC en relacin a sangre entera de 670% (1.884.000 PLT/L) y 720% (64.200 WBC/L), respectivamente. Sin embargo, el EDTA no es un anticoagulante ideal para concentrar plaquetas (White y Escolar 2000). Comparado a los resultados de Jensen y col (2004), el mtodo descrito en este artculo concentra una menor cantidad de plaquetas, mientras que presenta una concentracin de leucocitos 58% inferior. Por otra parte, el uso de APCs con EDTA podra provocar lesiones estructurales, bioqumicas y funcionales a las plaquetas (White y Escolar 2000) y ser irritante para los tejidos tratados. Existen algunos reportes en los que se describe el uso del citrato de sodio como anticoagulante (Ferraz y col 2007, Bonomi y col 2007, Choi y col 2005, You y col 2007) para concentrar plaquetas caninas. En esos trabajos describen la concentracin de plaquetas en esa especie mediante dos tiempos de centrifugacin. Normalmente, el producto final de esos protocolos oscil entre 400.000 a 1.300.000 PLT/L. En esas investigaciones las plaquetas fueron contadas manualmente (microscopia ptica) y no se present otra informacin hematolgica adicional de las caractersticas de los APCs obtenidos. El mtodo del tubo planteado en este estudio con una centrifugacin nica concentra plaquetas de una manera cercana al rango descrito para dos centrifugaciones. Lei y col (2009) concluyeron que la calidad del APC est estrechamente relacionada con el anticoagulante empleado. El uso de ACD produce superior calidad del

APC que cuando se emplea citrato de sodio o heparina. Lo anterior plantea una ventaja del mtodo descrito en este artculo. Li y col (2009) usaron ACD como anticoagulante y mediante doble centrifugacin concentraron una media de 1.100.000 PLT/L en el APC. Esto corresponde, aproximadamente, al doble de la cantidad de plaquetas concentradas con el mtodo desarrollado por nuestro grupo. Sin embargo, desde el punto de vista clnico y tal como ha sido evaluado en caballos, no existe correlacin alguna entre el nmero de plaquetas concentradas y la respuesta clnica de los caballos tratados (Carmona y col 2011). La cantidad de plaquetas que se concentran con el mtodo evaluado en este estudio podra ser suficiente para producir efectos biolgicos (Weibrich y col 2004, Carmona y col 2011). Es necesario recordar que lo ms importante de un mtodo para concentrar plaquetas es que adems de concentrar altos nmeros de las mismas permita obtener plaquetas vivas e inactivas (Marx 2004, Carmona y col 2011). El mtodo evaluado permiti concentrar plaquetas y disminuir de manera significativa los MID y GRA y porcentualmente los LYM. Es decir, la poblacin celular concentrada fue en su totalidad diferente a la sangunea basal. Quizs esa modificacin pueda tener alguna influencia en la utilizacin clnica de los APCs, debido al importante efecto regulador que tienen los neutrfilos, macrfagos y linfocitos sobre la reparacin tisular (Park y col 2004). Cabe aclarar que hasta el momento el papel (perjudicial o benfico) de los WBC no ha sido completamente esclarecido (Carmona y col 2011). Las correlaciones positivas encontradas entre la concentracin de plaquetas en el APC con MID, GRA y cuya significancia tiende a disminuir con la totalidad de los WBC, podran deberse a la baja velocidad y tiempo inherentes a la tcnica de centrifugacin y no necesariamente a que la concentracin de PLT-APC est asociada con los valores basales de estas variables. La correlacin negativa encontrada entre PLT y LYM en el APC sugiere que a medida que aumenta la cantidad de LYM la concentracin de PLT-APC disminuye exponencialmente, 97

RF SILVA Y COL

lo que podra indicar que el mtodo concentra plaquetas asociadas a valores de LYM similares a los encontrados en sangre entera. La correlacin altamente significativa entre las concentraciones basales de plaquetas y PLT-APC y la correspondiente ecuacin de regresin lineal indican que para este mtodo el pronstico del valor de PLT-APC estara basado en un incremento constante de 74.432,699 ms 1,279 veces el valor del nmero de plaquetas en sangre entera. Si bien la eficiencia de recoleccin de plaquetas se presenta aparentemente baja, esto podra deberse al hecho de que para efectos del presente estudio slo se obtuvo 1 mL de plasma por tubo. Los resultados obtenidos permiten concluir que la metodologa empleada para concentrar plaquetas podra ser aceptable para obtener efectos biolgicos en la utilizacin clnica de los APCs como terapia regenerativa en medicina y ciruga canina. El anlisis de regresin linear podra permitir predecir el valor de PLT-APC a partir del conocimiento de las variables conocidas en sangre entera tales como PLT, MID, GRA, LYM y WBC. La relevancia del mtodo descrito radica en que permite concentrar plaquetas mediante utilizacin de ACD como anticoagulante para incrementar la calidad de APC y que ste se obtiene mediante una nica centrifugacin a baja velocidad y corto tiempo. En el futuro se debern evaluar las caractersticas bioqumicas y ultraestructurales del APC activado, para determinar su calidad biolgica como biofrmaco autlogo. RESUMEN
El objetivo de este estudio fue evaluar un mtodo manual para concentrar plaquetas caninas y en consecuencia producir concentrados autlogos de plaquetas (APCs) para propsitos clnicos y experimentales. Los APCs fueron obtenidos a partir de sangre venosa depositada en tubos con solucin ACD que fueron centrifugados a 191 g durante 6 minutos. Para los recuentos celulares de sangre entera y APCs, se encontraron diferencias estadsticamente significativas (P < 0,01) entre los recuentos de las plaquetas, leucocitos, granulocitos, monocitos, pero no entre los valores de linfocitos. Se encontr una correlacin negativa ( = -0,702 P = 0,011) entre el nmero de linfocitos y plaquetas en los APCs. La eficiencia de recoleccin de plaquetas fue de 29,9% y la concentracin de plaquetas fue de 49,4% mayor en los APCs, en comparacin con las muestras de sangre entera. Los resultados indicaron que este mtodo de centrifugacin simple permite concentrar plaquetas caninas.

REFERENCIAS
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Carmona JU, M Prades. 2009. Platelet concentrates to treat musculoskeletal disease in horses. VDM Verlag Dr. Mller Aktiengesellschaft & Co. KG, Saarbrcken, Germany. Carmona JU, M Prades, D Argelles. 2009a. Autologous platelet concentrates as a treatment for soft tissue musculoskeletal lesions in horses. Arch Med Vet 41, 77-82. Carmona JU, C Lpez, M Prades. 2009b. Use of autologous platelet concentrates obtained by the tube method as a treatment for arthropathies in horses. Arch Med Vet 41, 175-179. Carmona JU, C Lpez, CE Giraldo. 2011. Uso de concentrados autlogos de plaquetas como terapia regenerativa de enfermedades crnicas del aparato musculoesqueltico. Arch Med Vet 43 (1-10). Casati MZ, BC Vasconcelos-Gurgel, PF Gonalves, SP Pimentel, G Rochanogueira, JRFH Nociti, EA Sallum. 2007. Platelet-rich plasma does not improve bone regeneration around peri-implant bone defects - A pilot study in dogs. Int J Oral Macillofac Surg 36, 132-136. Choi BH, SJ Zhu, BY Kim, SH Huh, SH Lee, JH Jung. 2005. Effect of platelet-rich plasma (PRP) concentration on the viability and proliferation of alveolar bone cells: an in vitro study. Int J Oral Maxillofac Surg 34, 420-424. Dutra CEA, MM Pereira, R Serakides, MCF Rezende. 2008. In vivo evaluation of bioactive glass foams associated with platelet-rich plasma in bone defects. J Tissue Eng Regen Med 2, 221-227. Ferraz VCM, CRA Ferrigno, A Schmaedecke. 2007. Platelet concentration of plateletrich plasma from dog, obtained through three centrifugation speeds. Braz J Vet Res Anim Sci 44, 435-440. Jensen TB, O Rahbek, S Overgaard, K Sballe. 2004. Platelet rich plasma and fresh frozen bone allograft as enhancement of implant fixation - An experimental study in dogs. J Orthop Res 22, 653-658. Lei H, L Gui, R Xiao. 2009. The effect of anticoagulants on the quality and biological efficacy of platelet-rich plasma. Clin Biochem 42, 1452-1460. Li NY, RT Yuan, T Chen, LQ Chen, XM Jin. 2009. Effect of PlateletRich Plasma and Latissimus Dorsi Muscle Flap on Osteogenesis and Vascularization of Tissue-Engineered Bone in Dogs. J Oral Maxillofac Surg 67,1850-1858. Marx RE. 2004. Platelet-rich plasma: evidence to support its usage. J Oral Maxillofac Surg 62, 489-496. Monteiro SO, O M Lepage, CL Theoret. 2009. Effects of platelet-rich plasma on the repair of wounds on the distal aspect of the forelimb in horses. Am J Vet Res 70, 277-282. Moreno L, J Marn, F Enrquez, G Gonzlez, L Moreno, L Cisneros, LM Sancha. 2004. Utilizacin de plasma rico en plaquetas para regeneracin periodontal en un perro. Rev Odont Mex 8, 64-69. Park JE, A Barbul. 2004. Understanding the role of immune regulation in wound healing. Am J Surg 187, 11S-16S. Thoesen MS, WS Vander- Berg-Foels, T Stokol, KM Rassnick, MS Jacobson, SB Kevi, RJ Todhunter. 2006. Used of a centrifugationbased, point-of-care device for production of canine autologous bone marrow and platelet concentrates. Am J Vet Res 67, 1655-1661. Thor A, V Franke-Stenport, CB Johansson, L Rasmusson. 2007. Early bone formation in humans bone grafts treated with platelet-rich plasma: preliminary histomorphometric results. Int J Oral Maxillofac Surg 36, 1164-1171. Weibrich G, KGK Wilfried, B Rainer, WE Hitzler, G Hafner. 2003. The Harvest Smart PRePTM system versus the Friadent-Schtze platelet-rich plasma kit. Clin Oral Impl Res 14, 233-239. Weibrich G, T Hansen, W Kleis, R Buch, WE Hitzler. 2004. Effect of platelet concentration in platelet-rich plasma on peri-implant bone regeneration. Bone 34, 665-671. White G, G Escolar. 2000. EDTA-induced changes in platelet structure and function: adhesion and spreading. Platelets 11, 56-61. You TM, BH Choi, J Li, JH Jung, HJ Lee, SH Lee, SM Jeong. 2007. The effect of platelet-rich plasma on bone healing around implants placed in bone defects treated With Bio-oss: a pilot study in the dog tibia. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 103, 8-12.

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INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Fundada en 1969 ISSN 0301-732x Revista seleccionada por los siguientes repertorios cientficos internacionales: Current Contents Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and ES), Commonwealth Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science Abstracts, Veterinary Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts S.A., Biological Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and Medicine.

Archivos de Medicina Veterinaria publica, en espaol o ingls, contribuciones cientficas originales en la forma de artculos cientficos, revisiones bibliogrficas y comunicaciones cortas que pueden incluir observaciones clnicas, descripciones de tcnicas o mtodos, y avances en todos los aspectos de las ciencias veterinarias y bienestar animal. ENVO DE LA PUBLICACIN Los artculos deben ser enviados al Editor en forma electrnica a travs de www.equipu.cl, e incluir: Una versin electrnica del texto, cuadros (preferentemente en formato MS Word), figuras (en formato Excel, JPG o TIFF, 300 dpi) y una declaracin de la responsabilidad de autora, con la firma de todos los autores. Los trabajos deben ser originales y, por lo tanto, no deben estar en proceso de arbitraje en otra revista. Los artculos que se presenten sin considerar las normas de estilo sern devueltos sin ser sometidos a revisin. Para experimentos con animales o humanos, el Comit Editor podr solicitar que se adjunte la autorizacin de un Comit de Biotica o instancia similar. Se deber incluir una carta dirigida al Editor solicitando la publicacin de su trabajo y sealando a uno de los autores como responsable de la revisin de las pruebas de imprenta y de la correspondencia. La propiedad intelectual de los trabajos publicados pertenece a los autores. Los revisores de Archivos de Medicina Veterinaria asesoran al Comit Editor para decidir si el trabajo puede ser publicado. Los autores podrn sugerir revisores. Todos los artculos enviados para publicacin sern enviados a dos revisores seleccionados por el Comit Editor y pueden incluir, o no, los sugeridos por los autores. En caso de existir controversia en los informes, se recurrir a un tercero en carcter de rbitroarbitrador, que asesorar al Comit Editor para decidir el destino del trabajo. Los revisores estn obligados a mantener el carcter confidencial de toda la informacin de los trabajos, aun cuando no sean publicados. Previo a la publicacin de un trabajo aceptado se debe pagar un valor cuyo monto se seala en la Web www.veterinaria.uach.cl

FORMA Y PREPARACIN DEL ARTCULO Tipos de artculos Artculos de revisin: son realizados por expertos que resumen y proyectan el conocimiento actualizado en un campo particular en las Ciencias Veterinarias, y no necesariamente se ajustan a un formato definido de presentacin. Los autores deberan previamente consultar a los editores antes de iniciar el trabajo de revisin. El Comit Editor podr solicitar a expertos el envo de artculos de revisin, los que tambin sern sometidos al proceso de arbitraje y edicin. No deben exceder de 30 pginas, incluidos cuadros, figuras y referencias. Slo se aceptarn revisiones escritas en ingls. Artculos cientficos: stos informan un nuevo avance en Ciencias Veterinarias basados en una investigacin original. El formato de ellos deber incluir summary, introduccin, material y mtodos, resultados, discusin, resumen, agradecimientos (cuando corresponda) y referencias. No deben exceder de 20 pginas, incluidos cuadros, figuras y referencias. Comunicaciones cortas: informan de manera breve un avance, resultado de un experimento, observaciones clnicas o nueva metodologa, ajustndose al siguiente formato: summary, introduccin, material y mtodos, resultados y discusin (seccin conjunta), resumen, agradecimientos (cuando corresponda) y referencias. No deben exceder de 12 pginas, incluidos cuadros, figuras y referencias. ESTILO Y FORMATO DE LA REVISTA Presentacin general: la revista publica artculos en espaol o ingls. Los artculos debern ser escritos con letras Times New Roman 12, por un solo lado de las hojas, a interlineado y medio, en tamao carta (21,5 x 27,9 cm), dejando un margen de 2 cm en los cuatro bordes. Todas las pginas deben ser numeradas de manera consecutiva en el ngulo superior derecho, y las lneas debern ser numeradas en cada pgina, inicindose con el nmero 1, junto al margen izquierdo, en todo el trabajo. Los ttulos de captulos deben ser escritos en mayscula, justificados al lado izquierdo, en lneas separadas y sin punto final. Ejemplo: MATERIAL Y MTODOS. En los subttulos slo la primera letra es mayscula (Ejemplo: Diseo experimental) y deber ser justificado al lado izquierdo. Subttulo secundario debe ser justificado al lado izquierdo y en letra cursiva. No debern usarse subrayado ni numeracin de subttulos o lista de tems.

Las cifras deben ser escritas en nmeros. Cuando estn al inicio de una frase, o cuando la claridad del texto lo requiera, deben ser expresadas en palabras. Un decimal deber ser precedido de un numeral usando punto cuando el artculo es en ingls o coma cuando el artculo es en espaol (Ejemplo: 0,5 no, 5). Mltiplos de mil deben escribirse separados por punto (Ejemplo: 1.000). Las medidas de cantidad debern ajustarse al Sistema Internacional de Unidades, a menos que la prctica en una disciplina use derivados de ellos (Ejemplo: la unidad internacional de Curie). Las fechas deben ser expresadas como 07 de septiembre de 1954 en el texto, pero pueden presentarse abreviadas en los cuadros y figuras. El tiempo diario se debe expresar segn las 24 horas cronolgicas (Ejemplo: 13:00 h). Para la nomenclatura qumica se deben utilizar las normas de la Sociedad de Bioqumica (Biochem J 209, 1-27, 1983), los frmacos o drogas deben ser mencionados por sus nombres genricos (en minsculas), si es necesario colocar marcas y sus fuentes debern ir a pie de pgina. Las enzimas deben ser identificadas, cuando se mencionan por primera vez, segn la Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry. Los trminos en latn y sus abreviaciones que son de uso comn en la literatura cientfica, tales como: in vitro, in vivo, ad libitum debern ir en cursiva. Los valores de probabilidad deben ser dados en la forma de P < 0,05 o P < 0,01. Desviacin estndar, error estndar de la media e intervalos de confianza, se abreviarn en la forma siguiente: DE, EE y IC, respectivamente. Ttulo El ttulo del trabajo debe ser conciso, especfico e informativo. Slo la primera letra ser mayscula, en negritas, centrado, inicindose en la lnea 10, sin usar marcas comerciales o abreviaciones. Se deber sealar, con superndice (#) la fuente de financiamiento, si lo hubiese, que se detallar a pie de pgina. Separado por el espacio de una lnea se deber escribir el ttulo en ingls. Autores y direcciones Los nombres de los autores se escribirn bajo el ttulo separados por un espacio. Use iniciales (sin puntos) y apellido separando por comas entre los autores, ajustndose al siguiente ejemplo: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean. Al trmino de cada nombre de autor debe identificarse con una letra en superndice, el nombre de la seccin, departamento, servicio o institucin a la que pertenece o perteneci dicho autor, durante la ejecucin del trabajo. La letra con un asterisco indica el autor responsable de la correspondencia, debindose sealar a pie de pgina el nmero de fax, correo electrnico y casilla de correo. Pie de pgina Sern usados para elaborar abreviaciones citadas en el ttulo de cuadros, marcas comerciales, nombre y direccin de empresas. Deben ser indicados con nmeros.

Summary La segunda pgina debe contener un summary, de no ms de 250 palabras y que describa los propsitos del estudio o investigacin, el material y mtodos empleados, los resultados principales y las conclusiones ms importantes. No se deben emplear abreviaturas no estandarizadas. En lnea aparte, separado por un espacio y justificadas a la izquierda se deben incluir key words (palabras clave) en minsculas, las que no deben ser ms de 4. Introduccin En la tercera pgina en la lnea 1 se escribir el ttulo del captulo. En la lnea siguiente, con sangra, predeterminada de un tabulador en 5 espacios, se plantearn los antecedentes que sustentan el propsito del artculo, sin un despliegue extensivo del tema y utilizando slo las referencias ms pertinentes. Se deben indicar, cuando corresponda, la hiptesis que se postula y los objetivos de la investigacin. Entre prrafos debe conservar el interlineado y medio. Material y Mtodos Separado por un espacio de la seccin anterior, se deber describir el captulo con suficientes detalles para permitir a otros repetir el estudio. Despus de la primera referencia en el texto a drogas o reactivos, se deben sealar el nombre genrico, dosis y va de administracin. Para el caso de equipo especializado se indicarn la marca, el modelo y el nombre del fabricante. Los mtodos estadsticos utilizados deben ser sealados como subttulos: Anlisis estadstico y deben incluir un adecuado detalle, que permita a los lectores establecer con precisin cmo han sido analizados y presentados los datos y las unidades de medidas en que estn expresadas (medias aritmticas, desviaciones estndares, errores estndares de la media, medianas, rangos o lmites de confianza, etc.). Si las pruebas usadas fueron paramtricas (Chi cuadrado, prueba t de Student, Anova, etc.) o no paramtricas (Wilcoxon, Kruskal-Wallis, etc.). Se debern identificar el nombre, la versin y el proveedor del programa computacional utilizado, ejemplo: SPSS versin 9.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago IL, USA). Resultados Separado por el espacio de una lnea de la seccin anterior, se deber describir el captulo de resultados, presentado en forma concisa y lgica, sin discusin o referencia a otro trabajo. Los cuadros y figuras deben ser los mnimos necesarios y los datos no deben ser repetidos en el texto y tampoco debern ser mostrados simultneamente o reiterados. Discusin Esta seccin, separada por una lnea de la anterior, debe evaluar e interpretar los resultados, relacionndolos a los de otros estudios relevantes. No debe repetir resultados o presentar nuevos. Debe ser diligentemente tratada en su desarrollo, hacindola de manera lgica y concisa, estableciendo conclusiones, relevancias y proyecciones del trabajo. Debe evitarse formular conclusiones

que no estn respaldadas con sus hallazgos ni sustentadas en trabajos an no publicados. Resumen El resumen en espaol deber ser escrito en hoja aparte, y deber ajustarse a las mismas normas sealadas para el summary. Separadas por el espacio de una lnea se debern escribir las palabras clave en letras minsculas, no debiendo ser ms de cuatro y justificadas en el lado izquierdo. Agradecimientos Deben ser breves y slo incluir personas o instituciones que han hecho una contribucin directa, han provisto material necesario o dado las facilidades para la realizacin del estudio. Referencias La precisin con la que son sealadas las referencias es de responsabilidad de los autores y deben corresponder al artculo original; asegrese que todos los artculos citados en el texto estn incluidos en el listado de referencias y viceversa. En el texto, las citas se deben indicar entre parntesis y en orden cronolgico, citando el apellido del autor y la expresin y col despus del apellido del primer autor, cuando son ms de dos, Ej.: (Prez 1994, Castro y Martnez 1996, Cifuentes y col 2002). El listado de referencias debe ir en orden alfabtico de acuerdo al apellido del primer autor y debe incluir el apellido e iniciales de todos los autores. Cuando no se dispone del nombre del autor, use el trmino annimo entre comillas, tanto en el texto como en el listado de referencias. Las referencias, cuando son del mismo autor, solo o con ms autores, deben ser escritas en orden cronolgico. Las letras a, b, c, etc., deberan ser agregadas como superndice cuando un autor escribe ms de un trabajo en el mismo ao. Los nombres de los autores deben escribirse en minsculas, sin punto entre las iniciales. Los nombres de las revistas y de los libros deben ser en letra cursiva, usando la abreviatura estandarizada. Use los siguientes ejemplos como gua. Para artculos en revista: Matamoros R, C Gmez, M Andaur. 2002. Hormonas de utilidad diagnstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34, 167-182. Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373. Para captulos en libros o publicaciones ocasionales: Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total nitrogen in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of Reference Methods foor Plant Analysis. 2nd ed. CRC Press, Washington DC, USA, Pp 75-83. Flrez J. 1992. Frmacos analgsicos opiceos. En: Flrez J (ed). Farmacologa Humana. 2 ed. Masson-Salvat, Barcelona, Espaa, Pp 25-28. WHO, World Health Organization. 1972. International Drug Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser WHO N 48.

SAG, Servicio Agrcola y Ganadero, Chile. 1996. Resolucin Exenta N 3599 del 29 de noviembre de 2006. Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of invading microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA (eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472. Para artculos y resmenes publicados en series regulares: Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Bhmwald. 1998. Valores sanguneos de triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) en vacas lecheras del sur de Chile. Resmenes del X Congreso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile, Pp 135-136. Para memoria de ttulo: Matthei SM. 2002. Determinacin de la presencia del receptor del factor activante plaquetario en membranas de neutrfilos de bovino. Memoria de ttulo, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. Para tesis: Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor GMCSF en espermatozoides bovinos y su relacin con la motilidad espermtica. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. Minimice el uso de resmenes como referencias. Evite usar datos no publicados o comunicacin personal al menos que de ello exista una forma escrita. Si esto ocurriera, debe hacerse referencia en el texto como pie de pgina, pero no debe aparecer en el listado de referencias. Las referencias a trabajos que han sido aceptados para publicacin deben ser citados como en prensa; sin embargo, trabajos que han sido sometidos a publicacin, pero no han sido aceptados todava, deben ser referidos como datos no publicados. Direcciones de pginas Web no deben ser incluidas en las referencias; si su uso es imprescindible, la direccin debe ser sealada en el texto como pie de pgina, incluyendo fecha de consulta. INSTRUCCIONES COMPLEMENTARIAS Cuadros Las leyendas de los cuadros y figuras deben ser autoexplicativos y presentarse en espaol e ingls. Los cuadros deben ser el menor nmero posible, presentados en hoja aparte, con sus respectivos ttulos en espaol e ingls en la parte superior. La informacin de los cuadros no debe repetir lo del texto. Los cuadros deben ser numerados consecutivamente con nmeros arbigos, en el orden en que aparecen en el texto, asignndoseles un ttulo breve y autoexplicativo que indique su contenido. Sobre cada columna del cuadro debe colocarse un encabezamiento corto o abreviado. Slo los encabezamientos de las columnas y los ttulos generales se separan con lneas horizontales. Las columnas de datos deben separarse por espacios y no por lneas verticales. Cuando se requieran notas aclaratorias, deben agregarse al pie del cuadro. Las notas aclaratorias para todas las abreviaturas no estndar y las unidades de medidas deben ser agregadas entre parntesis. Si se usan superndices para sealar diferencias entre valores use a, b, c, minimice el nmero

de dgitos en cada columna. Informe el valor de cero como 0. El ancho mximo de los cuadros no debe exceder los 80 mm para una columna, o los 170 mm para dos columnas. Figuras Las figuras deben ser presentadas en hojas separadas con sus respectivos ttulos en espaol e ingls en la parte inferior y numeradas consecutivamente usando nmeros arbigos, segn el orden en que aparecen en el texto. Ej.: Figura 1, no Fig. 1. Denomine figura a cualquier ilustracin que no sea cuadro, Ej.: grficos, radiografas, ecografas, electrocardiogramas, fotografas, etc. Las figuras deben ser orientadas verticalmente y acompaadas de una corta descripcin que contenga la explicacin de todos los marcadores, lneas y smbolos usados. Si la figura tiene secciones, stas deben ser identificadas como a, b, c, etc., en la esquina superior derecha y debern ser descritas en la leyenda. Para el caso de fotografas, en el reverso y con lpiz a carbn, deben sealarse con flecha la orientacin espacial, el nmero de la figura y el nombre del autor principal. Los smbolos, flechas o letras, empleados en las fotografas, deben tener un tamao y contraste suficientes para distinguirlos de su entorno. Enve las

figuras protegidas en un sobre grueso y de tamao apropiado. Las figuras pueden disearse a una o dos columnas de ancho (80 y 170 mm, respectivamente). Las reproducciones en colores de las figuras deben ser financiadas por los autores. Cuando las figuras no son originales debe sealarse la autora, y cuando corresponda, se debe adjuntar la autorizacin del autor para ser reproducidas. Pruebas de imprenta Una prueba de imprenta ser enviada al autor encargado de la correspondencia, para su lectura y correccin puntual, y debe ser devuelta al editor dentro del plazo que se especifique. Por otra parte, el editor se reserva el derecho a corregir la prueba de imprenta cuidadosamente, pero sin asumir responsabilidad de tal, y de esta manera agilizar el proceso de publicacin. La decisin final para la publicacin del trabajo ser en el momento en que el Comit Editor acepte las correcciones, que a sugerencia de los rbitros han realizado los autores. Modificaciones a las pruebas de imprenta que no sean de errores menores no sern aceptadas. Ni los editores ni la imprenta aceptarn responsabilidad por la impresin de errores de los artculos que los autores no hayan corregido en la prueba de imprenta.

DIRECCIN Comit Editor Archivos de Medicina Veterinaria Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile e-mail: archmv@uach.cl - Fono-Fax: (56-63) 221459 www.veterinaria.uach.cl www.scielo.cl Casilla 567, Valdivia, CHILE Representante Legal: Vctor Cubillos Godoy Rector de la universidad Austral de Chile

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS JOURNAL ARCHIVOS DE MEDICINA VETERINARIA

Founded in 1969 ISSN 0301-732x Journal indexed by the following international scientific repertoires: Current Contents Agriculture, Biology and Environmental Sciences (CC/AB and ES), Commonwealth Agricultural Bureaux, International (C.A.B.I.), Dairy Science Abstracts, Veterinary Bulletin, Animal Breeding Abstracts; Helminthological Abstracts S.A., Biological Abstracts; Agrindex, Periodica, Focus on: Veterinary Sciences and Medicine.

Archivos de Medicina Veterinaria publishes, in Spanish or English, original scientific contributions such as scientific articles, reviews and short communications which can include clinical observations, descriptions of methods or techniques and advances in all aspects of veterinary science and animal welfare. SUBMISSION OF MANUSCRIPTS Manuscripts should be submitted to the Editor via the on line platform www.equipu.cl and it must include: An electronic version of the text, tables (preferably in MS Word format), figures (in Excel format, JPG or TIFF, with 300 dpi), and a letter declaring authorship, signed by all authors. The manuscripts must be original, and may not be considered for publication in another journal. Manuscripts that do not conform to editorial requirements will be returned without review. The editor may require a copy of the appropriate Bioethical Committee Certification for manuscripts describing studies involving animals or humans. A covering letter to the Editor must be included requesting publication of the work, and naming the corresponding author who will also revise the proof of the article, should it be accepted for publication. The intellectual property of the work will be retained by the authors. Referees of Archivos de Medicina Veterinaria will aid the Editorial Committee to determine whether the manuscript fulfills publication requirements. The authors may suggest possible referees. All articles submitted for publication will be assessed by two referees. The referees will be selected by the Editorial Committee, and may or may not include those nominated by the authors. In the case of a disagreement between the referees reports, a third referee will aid the Editorial Committee to reach a decision. Referees are obliged to keep all information from the articles confidential, including unpublished information. Previous to the publication of accepted articles, the publication charge must be paid, the amount of which can be found at www.veterinaria.uach.cl.

PREPARATION AND FORM OF MANUSCRIPTS Types of articles Review articles: provide expert summaries of current knowledge in a particular field of veterinary science, and do not necessarily have a set format. Authors should consult with the Editor before initiating a review. The Editorial Committee may solicit an expert to prepare a review, which will also be refereed and edited. Reviews must not exceed 30 pages in length, including tables, figures and references. Only reviews in english will be accepted. Scientific articles: report new advances in veterinary science based on original research. The format must include summary, introduction, material and methods, results, discussion, resumen, acknowledgements (when pertinent) and references. The maximum length of the manuscript is 20 pages, including tables, figures and references. Short communications: briefly inform of an advance, experimental result, clinical observations or new methodology, with the following format: summary, introduction, material and methods, results and discussion (combined), resumen, acknowledgements (when pertinent) and references. The maximum length of the manuscript is 12 pages, including tables, figures and references. JOURNAL STYLE AND LAYOUT General presentation: The journal publishes articles in English or Spanish. Manuscripts must be written using 12 point Times New Roman font with one and a half-line spacing, on one side only of letter paper (21.5 x 27.9 cm) using 2 cm margins on all sides. Pages must be numbered consecutively in the top right corner, and lines must be numbered on the left, starting with number one, on all pages. Headings must be in upper case, left-justified on a separate line with no full stop following, eg. MATERIAL AND METHODS. Only the first letter of sub-headings is capitalized. Primary sub-headings (eg. Experimental design) should be left-justified; secondary sub-headings are left-justified and italicized. Do not use underlining and do not number sub-headings or itemized lists. In the text, numbers must be written in numerals. When a sentence begins with a number or when necessary for clarity, this should be written in words. A decimal point must be preceded by a number (eg. 0.5 not .5) and a point is used to denote the decimal in English and a comma in Spanish. All measurements should be reported in IS units unless it is normal practice in a discipline to use derivatives (eg. the Curie international unit).

Dates must be formatted as 07 September, 1954 in the text, but they may be abbreviated in tables and figures. Use the 24-hour clock for times of day (e. g. 13:00 h). Chemical nomenclature must be expressed using the Biochemical Society Standards (Biochem J 209, 1-27, 1983), generic names (in lower caps) must be used for medications. If brands and sources of medications need to be included, this should be included as a foot-note. Enzymes must be identified at first mention, in accordance with the Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry. Latin terminology and abbreviations commonly used in scientific literature, such as in vitro, in vivo, ad libitum must be italicized. Probability values must be presented as P<0.05 or P<0.01. Standard deviation, standard error of the mean and confidence intervals are abbreviated as follows: SD, SEM and CI, respectively. Title Titles should be short, specific and informative. The title is centred in bold, starting at line 10 without using trade names or abbreviations. Only the first letter is capitalised. The superscript symbol # should be used to indicate the source of funding, with details given as a footnote, if appropriate. Authors names and addresses Authors names are written underneath the title, separated by a space. Use initials (without stops) and surnames only, separated by comas, as in the example: CT Westwood, E Bramley, IJ Lean. Superscript letters should be used after each authors name to identify the section, department, service or institute of the author where the work was conducted. The corresponding author is indicated using the superscript letter followed by an asterisk, with the full contact details, including fax number and email address indicated in the footnote. Footnotes These are used to define abbreviations used in table titles, commercial brands, the name and address of companies. They must be indicated with numbers. Resumen The second page must contain a summary in Spanish (Resumen), of no more than 250 words, that describes the objectives of the study or research, the material and methods used, the principal results and the most important conclusions. Non-standard abbreviations must not be used. On a separate line, left-justified and separated by a space, up to four palabras clave (key words) should be identified. Introduction The subheading Introduction is written on the third page on line 1. In the following line, indented by 5 spaces, the context of the study is briefly presented without an extensive revision of the theme, and only citing the most relevant references. When appropriate, the hypothesis and objectives of the study must be clearly and concisely presented. The one and a half-line spacing between paragraphs must be kept. Material and methods Separated by one space from the previous section, this section should contain sufficient detail to allow others to repeat the study. When the first reference in the text is made to medications or chemicals, the generic name, dose and route of administration

should be indicated. For specialized equipment, the brand, model and manufacturers name must be indicated. Details of all statistical methods used must be given at the end of this section under the sub-heading Statistical analysis and should include adequate detail to allow readers to determine precisely how data have been analysed and the units that are used to express the results (mathematical mean, standard deviation, standard error of the mean, mediums, ranges or confidence limits, etc.). The use of parametric (Chi-square, students T-test, ANOVA, etc.) or non-parametric (Wilcoxon, Kruskal-Wallis etc.) analyses must be indicated. The name, version and sources of computational statistical analysis programs must be identified, eg. SPSS version 9.0 for Windows (SPSS Inc, Chicago IL, USA). Results Separated by one space from the previous section, this section should contain a concise and logical description of the results obtained without discussion or reference to other work. The minimum number of tables and figures should be included to present the pertinent data without repetition, and data presented in tables and figures should not be repeated in the text. Discussion This section, separated by one space from the previous section, should evaluate and interpret the results and relate these to other relevant results. The results should not be repeated and new results must not be presented in this section. Care should be taken to ensure that the discussion is developed in a logical and concise manner, and conclusions are reached, as well as a discussion of their relevance. Conclusions that are not directly supported by the data of the study or other unpublished studies should not be presented. Summary The summary is written in English, and must be presented on a separate page. The summary should contain the same elements as the Resumen. On a separate line, following the summary, left-justified in small caps and separated by a space, up to four key words should be identified. Acknowledgements This section should be brief, and should only include people or institutions that have made a direct contribution, provided necessary material or have provided the facilities for the studys development. References The accuracy of the reference section is the responsibility of the authors and references must be verified against the original article. Please ensure that all articles cited in the text are included in the reference list and vice versa. In the text, citations should be listed in parentheses in chronological order, citing authors names, and using et al after the first authors name where there are more than two (e.g. Prez 1994, Castro and Martnez 1996, Cifuentes et al 2002). The reference list must be ordered alphabetically according to the first authors name, and all authors names and initials must be included. When no author is given, use the term Anonymous in both text and reference list. References with the same author, single or with coauthors, should be listed in chronological order. The letters a, b, c, etc. should be appended as a superscript when more than one work is cited from the

same author within the same year. Authors names should appear with the initials and first letter of the surname in upper caps and the remainder of the surname in lower caps, with no dots between initials. Journal titles and names of books should be in italics using standard abbreviations. Use the following examples as a guide: For journal articles: Matamoros R, C Gmez, M Andaur. 2002. Hormonas de utilidad diagnstica en medicina veterinaria. Arch Med Vet 34, 167-182. Severino G, M del Zompo. 2004. Adverse drug reactions: role of pharmacogenomics. Pharmacol Res 49, 363-373. For chapters in books or occasional publications: Horneck DA, RO Miller. 1998. Determination of total nitrogen in plant tissue. In: Kalra YP (ed). Handbook of Reference Methods foor Plant Analysis. 2nd ed. CRC Press, Washington DC, USA, Pp 75-83. Flrez J. 1992. Frmacos analgsicos opiceos. En: Flrez J (ed). Farmacologa Humana. 2 ed. Masson-Salvat, Barcelona, Espaa, Pp 25-28. WHO, World Health Organization. 1972. International Drug Monitoring: The role of national centres. Tech Rep Ser WHO N 48. SAG, Servicio Agrcola y Ganadero, Chile. 1996. Resolucin Exenta N 3599 del 29 de noviembre de 2006.. Weinstein L, MN Swartz. 1974. Pathogenic properties of invading microorganisms. In: Sodeman WA Jr, Sodeman WA (eds). Pathogenic physiology: Mechanism of Disease. WB Saunders, Philadelphia, USA, Pp 457-472. For articles and proceedings published in regular series: Contreras PA, V Ruiz, F Wittwer, H Bhmwald. 1998. Valores sanguneos de triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) en vacas lecheras del sur de Chile. Resmenes del X Congreso Chileno de Medicina Veterinaria, Valdivia, Chile, Pp 135-136. For dissertations: Matthei SM. 2002. Determinacin de la presencia del receptor del factor activante plaquetario en membranas de neutrfilos de bovino. Memoria de ttulo, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. For Theses: Vilanova LT. 2002. Presencia y funcionamiento del receptor GMCSF en espermatozoides bovinos y su relacin con la motilidad espermtica. Tesis Doctoral, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile. Minimise the citation of abstracts as references. Authors are specifically discouraged from citing unpublished data or personal communication, unless this information exists in written form, in which case the text should be referred to as a footnote, but this should not appear in the list of references. References to papers which have been accepted but not published should be cited as in press, whereas manuscripts which have been submitted for publication but not accepted should be referred to as unpublished data. Web pages should not be included as references. If so required, web page addresses should be written as footnotes, including date of consultation.

COMPLEMENTARY INSTRUCTIONS Tables The titles to tables and figures should be self-explanatory and must be presented in both Spanish and English. The number of tables should be kept to a minimum and presented on separate pages with their respective titles in English and Spanish at the top. Information in tables must not be repeated in the text. Tables must be numbered consecutively with Arabic numbers in the order in which they are referred to in the text. The brief title to the table should indicate the contents of the table and should be understandable without reference to the text. Each column of each table must have a short or abbreviated heading. Only column headings and general titles should be separated with horizontal lines. Data columns should be separated by spaces and not vertical lines. When additional explanatory information is required, this should appear at the foot of the table. Explanatory information for non-standard abbreviations and units should appear within parentheses. If superscripts are used to indicate significant differences between values, use a, b, c. Minimise the number of digits in each column. Indicate a zero value as 0. Table widths should not exceed 80 mm for one column or 170 mm for two columns. Figures Figures should be submitted on separate pages, with their respective titles in English and Spanish at the bottom and numbered consecutively using Arabic numerals in the order they are referred to in the text. Eg. Figure 1, not Fig. 1. Figures include all illustrations that are not Tables, eg. graphs, radiographies, ecographies, electrocardiograms, photographs, etc. Figures must be vertically oriented and be accompanied by a short descriptive caption that contains an explanation for all markers, lines and symbols used but no abbreviations. If the figure contains sections, these should be labelled as a, b, c, etc. in the top right corner and must be described in the caption. The reverse of photographs must be marked using graphite pencil with the number of the figure, the first author and an arrow showing the orientation of the photograph. Symbols, arrows or letters used should be of an adequate size and contrast to be easily visible. Photographs should be submitted in a protective, adequately sized envelope. Figures may be one or two columnwidths (80 or 170 mm, respectively). The cost of printing coloured figures must be met by the authors. The authorship of non-original figures must be acknowledged, and when appropriate, authorization to reproduce these figures must be provided. Proofs A proof will be sent to the corresponding author for proofreading, and must be returned within the specified time. Otherwise the Editor reserves the right to carefully proof-read the article but without assuming responsibility for errors, to continue with the publication process. The final decision regarding acceptance of the manuscript will be taken when the Editorial Committee accepts the manuscript following correction according to the referees comments. Alterations to the proof that do not correspond to minor errors will not be accepted. Neither the Editor nor the Publisher accept any responsibility for printed errors which were not noted by the authors at the time of proof-reading the proof.

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