COLORACIN GRAM I) INTRODUCCIN La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias,

sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa. La coloracin de Gram ideada por Hans Cristian Gram en 1844, permite la diferenciacin de los microorganismos en dos grupos: Gram positivos y Gram negativos. La diferencia de color que presentan los microorganismos tratados con estos colorantes, se debe a la formacin de un complejo Violeta-Yodo que es "atrapado" dentro de la bacteria segn las caractersticas de su pared. Los Gram positivos tienen una pared predominantemente proteica que se deshidrata con la aplicacin del alcohol-acetona y no permite que el colorante violeta salga de la bacteria. Los Gram negativos tienen una pared con una capa lipdica que se disuelve con el alcohol-acetona, permitiendo la salida de complejo violeta-yodo. Para poder observar entonces estos microorganismos, se colorean luego con la Safranina que se agrega al final del procedimiento. Nota: Para que esta reaccin ocurra es necesario que las bacterias que se van a colorear tengan su pared ntegra, para esto se deben utilizar cultivos jvenes. II) FUNDAMENTO TERICO El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teir por el mtodo de Gram. La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras causas. Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram

negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente: El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas gramnegativas, los lpidos de la pared (ms abundantes que en las clulas grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teora, pero es indudable la importancia general de la pared celular. III) OBJETIVOS Emplear tcnicas bacteriolgicas simples. Conocer el fundamento estructural de la tincin gram Utilizar colorantes y comprender su utilizacin Observar clulas procariotas

IV) EQUIPOS Y MATERIALES 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) Microscopio Asa de inoculacin Lminas de vidrio Alcohol Acetona o alcohol 95 Solucin de cristal violeta Solucin de lugol Solucin de safranina Aceite de cedro Cultivos de Sreptococcus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae 10) Tenemos 4 muestras: -

Lactobacillus

bulgaricus

Sepas de yogurt a cultivo Sepas de levadura Fleishman deshidratada, levadura de pan Vino con sedimento tiene clulas muertas se retiro lo de arriba Muestra de aceituna con nata, son microbios

V) PREPARACIN DEL REACTIVO 1) Solucin de cristal violeta: A) COMPOSICIN: - Cristal violeta 2 gr Alcohol etlio a 95% . 20 ml. Oxalato amnico 0,8gr.

Agua destilada 80 ml. B) PREPARACIN: - Disolver el cristal violeta en el alcohol y el oxalato amnico en el agua destilada. Mezclar las dos soluciones y esperar 24 horas antes de utilizar la mezcla.

2) Solucin de yodo: A) COMPOSICIN: Yodo 1 gr. Yoduro potsico 2 gr. Agua destilada 100ml B) PREPARACIN: - Triturar el yoduro potsico y el yodo juntos en un mortero aadiendo sucesivamente pequeas cantidades de agua durante la operacin. Pasar la solucin a un matraz volumtrico y enjuagar el mortero completando el volumen a 100ml. C) NOTA: Puede utilizarse tambin la modificacin de Gram de la solucin de Yodo de Lugol. Esta solucin es la misma que la de Burke, excepto que la cantidad de agua es de 300ml. en lugar de 100ml. 3) Colorante de Contraste: A) COMPOSICIN: Safranina 0,25gr. Alcohol etlico 10 ml. Agua destilada 100ml. B) PREPARACIN: - Disolver la Safranina en el alcohol y mezclar la solucin resultante con el agua destilada. VI) PROCEDIMIENTO: 1) Limpie 2 lminas portaobjetos. Realizar en cada una un frotis de los cultivos indicados. Yo trabaje con levadura de pan 2) Secar al mechero Bunsen a una temperatura moderada; pasando varias veces la lmina por la llama hasta que toda el agua sea evaporada. 3) Recubrir la lmina con la solucin de cristal violeta por 1 minuto. 4) Lavar suavemente con agua. 5) Recubrir con la solucin de lugol por 1 minuto. Eliminar el exceso. 6) Lavar suavemente con agua

7) Decolorar con alcohol-acetona 8) Lavar con agua para eliminar el alcohol-acetona residual 9) Recubrir la lmina de safranina por 30 segundos 10) Lavar suavemente con agua 11) Secar con un papel de filtro o al calor del mechero 12) Observar al microscpio con objetivo de inmersin. (Emplear aceite de cedro). VII) RESULTADOS Y GRFICOS: Yo trabaje con levadura de pan. Son 2 portaobjetos a los 2 se les hace 2 frotis 1. Secamos la muestra, pasando varias veces la lmina por la llama hasta que toda el agua sea evaporada.

2. Recubrir la lmina con la solucin de cristal violeta por 1 1/2 minuto. Lavamos suavemente con agua

3. Agregar la solucin de Lugol y dejar actuar por 1 minuto, y eliminar el exceso, lavamos con agua

4. Decolorar con el alcohol-acetona por 5 segundos y enjuagar con agua corriente.

5. Agregar la solucin de Safranina y dejar actuar por 30 segundos, enjuagar, escurrir y dejar secar al calor del mechero

6. Observar al microscopio con objetivo de inmersin (Empleando aceite de cedro) A) Muestra de aceituna.- Presentan gram positivos, tienen bacilos

B) Muestra de yogur.- Presenta gram positivos

C) Muestra de levadura de pan.- Observamos que son gram positivos

D) Muestra de vino.Presentan gram positivos

VIII) EXPLICACIN DE RESULTADOS El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas). El lugol est formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.

Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azl-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina) Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; despus se lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante. Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras causas. IX) CONCLUSIONES: 1. Las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta y se teirn en azul morado. Deben destacarce algunos aspectos cruciales de la tincion de Gram. 2. El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas. 3. La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. X) REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

1. http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram 2. http://sabanet.unisabana.edu.co/medicina/semestre4/microbiologia/guia2.doc