UNIVERSIDAD POLITCNICA DE VALENCIA

Estudio de la evolucin de las poblaciones microbianas en el proceso de eliminacin biolgica de materia orgnica y nitrgeno amoniacal en un SBR
Trabajo final de mster

Mara Miralles Domnech

Directores

Dra. Aurora Seco Torrecillas Javier Claros Bedoya

Valencia, Septiembre de 2012

NDICE

ndice

INTRODUCCIN 1.1 Generalidades ambientales y legislacin ________________________________1 1.2 Contaminacin de las aguas _________________________________________5 1.2.1 Caractersticas de las aguas residuales _______________________________5 1.2.2 Presencia de nutrientes en aguas residuales. Fsforo y Nitrgeno __________7 1.2.3 Efectos del nitrgeno en el medio natural y la salud humana _______________8 1.2.3.1 Eutrofizacin ________________________________________________________8 1.2.3.2 Toxicidad en la fauna por presencia de amonio, nitrito y nitratos ____________9 1.2.3.3 Efectos perjudiciales sobre la salud humana ____________________________12 1.3 Sistemas de tratamiento de materia orgnica y nitrgeno __________________12 1.3.1 Procesos fsico-qumicos__________________________________________12 1.3.2 Procesos biolgicos______________________________________________13 1.3.2.1 Nitrificacin ________________________________________________________14 1.3.2.2 Desnitrificacin _____________________________________________________15 1.3.2.3 Factores que afectan los procesos de nitrificacin-desnitrificacin _________16 1.3.2.4 Esquemas de tratamiento ____________________________________________23 1.3.2.4.1 Esquemas convencionales _________________________________________23 1.3.2.4.2 Esquemas no convencionales ______________________________________26 1.3.2.5 Reactor Discontinuo Secuencial o SBR (Sequencing Batch Reactor) ______31 1.3.2.5.1 Etapas de funcionamiento de un reactor SBR _________________________31 1.3.2.5.2 Parmetros de funcionamiento de un reactor SBR _____________________34 1.3.2.5.3 Ventajas e inconvenientes del sistema SBR __________________________36 1.3.2.6 Microorganismos implicados en los sistemas de eliminacin_____________37 1.3.2.6.1 Clasificacin y caractersticas de las bacterias ______________________39 1.3.2.6.2 Tcnicas de caracterizacin y cuantificacin________________________42 1.3.2.6.3 Tcnica de hibridacin in situ (FISH)______________________________45

OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 2 Objetivos y plan de trabajo ___________________________________________47

MATERIALES Y MTODOS 3.1 Descripcin del montaje experimental _________________________________49 3.2 Procedimiento experimental _________________________________________51 3.2.1 Parmetros de operacin _________________________________________51 3.2.1.1 Seleccin del inculo y caractersticas del agua residual________________51

ndice 3.2.1.2 Etapas de operacin del reactor___________________________________52 3.2.1.3 Parmetros de funcionamiento____________________________________54 3.2.2 Puesta en marcha del reactor ______________________________________55 3.2.3 Operacin y seguimiento del proceso ________________________________55 3.2.3.1 Analticas fsico-qumicas ________________________________________56 3.2.3.1.1 Slidos suspendidos totales y slidos suspendidos voltiles_____________56 3.2.3.1.2 cido actico y alcalinidad _________________________________________57 3.2.3.1.3 Amonio, nitrito, nitrato y fsforo _____________________________________58 3.2.3.2 Analticas microbianas __________________________________________58 3.2.3.2.1 Tcnica de Hibridacin In Situ FISH _________________________________59

RESULTADOS Y DISCUSIN 4.1 Puesta en marcha_________________________________________________69 4.2 Seguimiento del proceso ___________________________________________71 4.2.1 Evolucin de los parmetros fsico-qumicos __________________________72 4.2.2 Evolucin de las poblaciones microbianas ____________________________76 4.2.2.1 Anlisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias amonioxidantes _________76 4.2.2.2 Influencia del pH y la concentracin de oxgeno disuelto en la poblacin de AOB __________________________________________________________________84 4.2.2.3 Anlisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias nitritoxidantes ___________86 4.2.2.4 Influencia del pH y la concentracin de oxgeno disuelto en la poblacin de NOB _____________________________________________________________________90 4.2.2.5 Anlisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias desnitrificantes __________93 4.2.2.6 Influencia del pH y la concentracin de oxgeno disuelto en la poblacin de desnitrificantes.____________________________________________________________97 CONCLUSIONES Conclusiones _______________________________________________________100 BIBLIOGRAFA Bibliografa_________________________________________________________102

II

ndice NDICE DE FIGURAS

Figura 1 Esquemas de eliminacin biolgica de nitrgeno: A) Wuhrmann, B) LudzackEttinger, C) Ludzack-Ettinger modificado, D) Bardenpho, E) Canales de oxidacin _____________________________________________________ 25 Esquema del proceso de nitrificacin-desnitrificacin va nitrito____________ 27 Esquema de una EDAR con un reactor SHARON de nitritacin parcial _____ 28 Proceso combinado nitrificacin parcial-ANNAMOX ____________________ 29 Esquema del sistema SBR. Adaptado de Wilderer et al., (2001) __________ 33 rbol filogentico hasta ahora conocido de los organismos amonioxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Las lneas filogenticos asociadas a sistemas de aguas residuales estn indicadas mediante flechas _______________________________________________ 38 rbol filogentico hasta ahora conocido de los organismos nitritoxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Las lneas filogenticos asociadas a sistemas de aguas residuales estn indicadas mediante flechas _______________________________________________ 39 Fotografa del montaje experimental ________________________________ 49 Esquema del montaje experimental _________________________________ 50 Esquema del procedimiento experimental ____________________________ 51 Secuencia y duracin de las 5 etapas de trabajo del reactor SBR__________ 53 rbol filogentico basado en el 16S rARN de los principales linajes de bacterias amonioxidantes. Se ha destacado en azul las sondas empleadas en el presente trabajo de investigacin. Los parntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009) ____________________________________________ 59 rbol filogentico basado en el 16S-rARN de los principales linajes de bacterias nitritoxidantes. Los parntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009) ____________________________________________ 60 rbol filogentico basado en el 16S-rARN de los principales linajes de bacterias desnitrificantes. Los parntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009) ____________________________________________ 61 Evolucin de la concentracin de slidos suspendidos durante la primera semana del perodo experimental __________________________________ 69 Evolucin de la concentracin de amonio, nitrito y nitrato durante la primera semana del perodo experimental en la fase final de la etapa de reaccin ___ 70 Evolucin de la concentracin de cido actico durante la primera semana del perodo experimental en la fase final de la etapa de reaccin _____________ 70 Evolucin de la concentracin de slidos suspendidos en el licor mezcla a lo largo del perodo experimental _____________________________________ 72

Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6

Figura 7

Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12

Figura 13

Figura 14

Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18

III

ndice

Figura 19 Figura 20 Figura 21 Figura 22

Evolucin de la concentracin de cido actico en el licor mezcla en la fase final de la etapa de reaccin __________________________________________ 73 Evolucin de la concentracin de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla en la fase final de la etapa de reaccin __________ 74 Evolucin de la concentracin de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla en la fase final de la etapa anxica _____________ 75 Porcentaje de AOB en el licor mezcla detectado con la sonda NSO1225 en relacin con la sonda EUBmix. Concentracin de nitrgeno amoniacal en la fase final de la etapa de reaccin_______________________________________ 76 Imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias de dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las -proteobacterias AOB identificadas por la sonda NSO 1225. Imgenes tomadas a 63x ____________________________________ 78 Imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias totales del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las -proteobacterias AOB identificadas por la sonda NEU. Imgenes tomadas a 63x ____________________________________ 82 Imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las -proteobacterias AOB identificadas por la sonda Nmo218. Imgenes tomadas a 63x _________________________________ 83 Porcentaje de bacterias amonioxidantes en el licor mezcla detectadas con las sondas NSO1225, Nmo218 y NEu en relacin con la sonda EUBmix _______ 84 Porcentaje de bacterias nitritoxidantes en el licor mezcla detectadas con las sondas NIT3 y Ntspa712 en relacin con la sonda EUBmix. Concentracin de nitrito y nitrato en la fase final de la etapa de reaccin___________________ 87 Imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las -proteobacterias NOB identificadas por la sonda Ntspa712. Imgenes tomadas a 63x ________________________________ 89 Imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las bacterias desnitrificantes identificadas por la sonda AT1458. Imgenes tomadas a 63x__________________________________ 95 Porcentaje de bacterias desnitrificantes (DES) en el licor mezcla detectadas con las sondas AT1458 y PAR651 en relacin con la sonda EUBmix. Concentracin de nitrito y nitrato en el licor mezcla al final de la fase anxica de la etapa de reaccin ______________________________________________________ 97

Figura 23

Figura 24

Figura 25

Figura 26 Figura 27

Figura 28

Figura 29

Figura 30

IV

ndice NDICE DE TABLAS

Tabla 1 Tabla 2 Legislacin espaola para el tratamiento de aguas residuales _____________ 3 Requisitos de los vertidos procedentes de instalaciones de tratamiento de aguas residuales urbanas sujetos a lo dispuesto en el Anexo I (cuadro 1) de la Directiva Europea 91/271/CEE y modificacin de la Directiva Europea 98/15/CEE _____________________________________________________ 4 Listado de parmetros analizados en aguas residuales urbanas____________ 6 Influencia del pH en el procesos de nitrificacin________________________ 18 Procesos influenciados por la presencia de nitrito ______________________ 19 Relacin de la temperatura con el proceso de nitrificacin _______________ 21 Clasificacin de bacterias amonioxidantes y nitritoxidantes_______________ 40 Caractersticas de las bacterias nitrificantes __________________________ 41 Componentes principales en el agua residual _________________________ 52 Temperatura y TRC sugerido para la nitrificacin ______________________ 54 Frecuencia de muestreo y anlisis de los parmetros fsico-qumicos_______ 56 Sondas de hibridacin empleadas en la identificacin micriobiolgica ______ 62 Volmenes de reactivos en funcin del porcentaje de formamida para la preparacin de la solucin de hibridacin ____________________________ 67 Volmenes de reactivos en funcin del porcentaje de formamida para la preparacin de la solucin de lavado ________________________________ 67 Porcentajes de bacterias amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes en relacin con la sonda EUBmix (dominio Eubacteria) en el inculo empleado para sembrar el reactor SBR __________________________________________ 71 Porcentajes de AOB en el licor mezcla en relacin con la sonda EUBmix____ 79 Porcentajes de NOB en el reactor licor mezcla en relacin con la sonda EUBmix (dominio Eubacteria) ____________________________________________ 88 Porcentajes de desnitrificantes en el reactor licor mezcla en relacin con sonda EUBmix (dominio Eubacteria)______________________________________ 93

Tabla 3 Tabla 4 Tabla 5 Tabla 6 Tabla 7 Tabla 8 Tabla 9 Tabla 10 Tabla 11 Tabla 12 Tabla 13 Tabla 14 Tabla 15

Tabla 16 Tabla 17 Tabla 18

INTRODUCCIN

Introduccin

1.1 Generalidades ambientales y legislacin

Los recursos naturales que emplean numerosos sectores en sus sistemas productivos se han incrementado de manera considerable en las ltimas dcadas, tanto por el aumento poblacional como por los cambios en los hbitos de consumo, lo cual ha aumentado el total de residuos generados. Las polticas de conservacin del medio ambiente surgidas en los ltimos 30 aos han impulsado el desarrollo de tcnicas que permiten optimizar el aprovechamiento de los materiales, reduciendo las necesidades de materias primas y por tanto, minimizando la generacin de productos de desecho. La implantacin de sistemas que faciliten la reutilizacin posterior de la materia prima, as como el uso de materiales que al finalizar su vida til puedan ser gestionados desde una perspectiva ms respetuosa con el medio ambiente son algunas de las tcnicas empleadas para reducir los recursos necesarios. Existen un gran nmero de residuos de naturaleza y caractersticas muy diversas cuya gestin vara en funcin de aspectos tales como la tecnologa disponible, los posibles usos posteriores (reutilizacin, reciclaje), etc. En funcin del sistema de produccin al que nos estemos refiriendo, los materiales y las fuentes de energa empleados variarn. No obstante, existe un recurso que se emplea prcticamente en la totalidad de los sistemas productivos, el agua. Se trata de un bien imprescindible para la vida que est sometido a una explotacin continua, lo cual disminuye su disponibilidad al tiempo que su calidad se ve seriamente afectada. Las fuentes de agua (manantiales, ros, lagos, mares, etc.) sufren procesos de contaminacin tanto naturales (precipitaciones que incorporan impurezas contenidas en el aire y el suelo a los medios receptores), como artificiales (incorporacin de sustancias contaminantes orgnicas e inorgnicas de origen industrial y urbano). Sin embargo, mientras que la contaminacin natural puede ser contrarrestada por los procesos de autodepuracin de que constan los sistemas naturales, la degradacin de los cursos y masas de agua por parte de actividades humanas superan en muchos casos los niveles de contaminacin que permiten la regeneracin de las fuentes receptoras. Este hecho se debe al aumento demogrfico y urbanstico, al desarrollo industrial y a la intensificacin de las actividades agrcolas y ganaderas que han provocado el deterioro paulatino de la calidad del agua, entendiendo como calidad el conjunto de caractersticas fsicas, qumicas y biolgicas que hacen que el agua sea apropiada para determinado uso.

Introduccin En los entornos naturales, tanto el estado del agua como su cantidad deben mantenerse en unos estndares ambientales ptimos, para lo cual se han desarrollado polticas de gestin, control y proteccin. Estos mtodos de proteccin adquieren especial relevancia con la disminucin progresiva de las reservas hdricas, tal y como ocurre con los pases enclavados en la cuenta mediterrnea. El problema de la escasez de agua se ha visto agravado por los efectos del cambio climtico mundial, y aunque en las regiones pertenecientes a climas mediterrneos los desequilibrios entre el agua demandada por la poblacin y los recursos hdricos son un hecho histrico, la dinmica de poblaciones y las modificaciones climticas han hecho que esta situacin se agrave de manera considerable. Por este motivo la depuracin de aguas y su posterior reutilizacin se han convertido en actividades necesarias para el mantenimiento tanto de los entornos naturales como de determinadas actividades de produccin. El inters del presente trabajo se centra en el punto a partir del cual el agua ha finalizado su fase productiva y pasa a ser un residuo que debe regenerado para que sea posible su reintroduccin en el medio natural sin que ello suponga ningn tipo de riesgo para el medio ambiente y/o la salud pblica. Las aguas residuales son aquellas que proceden de la utilizacin de un agua natural o de la red, y que por lo general son recogidas mediante un sistema de alcantarillado para su envo a una estacin depuradora de aguas residuales (EDAR). Puesto que constituyen un importante foco de contaminacin, deben ser sometidas a tratamiento antes de su vertido. Deben cumplirse los criterios de calidad establecidos, de forma que los niveles de contaminacin que queden en el efluente tratado puedan ser asimilados de manera natural por el medio receptor. Las tcnicas empleadas as como los requisitos de vertido (expresados como rangos cuantitativos de una serie de caractersticas fisicoqumicas y biolgicas) vienen definidos en la legislacin correspondiente. Legislacin A nivel europeo, la Directiva 91/271/CEE del Consejo, de 21 de mayo de 1991 sobre el tratamiento de las aguas residuales urbanas controla la gestin de las aguas residuales. Esta directiva recoge las medidas necesarias para garantizar que todas las aguas residuales urbanas y de determinados sectores industriales reciban el tratamiento adecuado antes de su vertido. Se complementa con la Directiva 98/15/CE de la Comisin de 27 de febrero de 1998 que modific el cuadro 2 del Anexo I de la Directiva 91/271/CEE, concerniente al vertido a zonas sensibles propensas a la

Introduccin eutrofizacin de aguas residuales urbanas procedentes de instalaciones de tratamiento. Adems de la Directiva europea, en Espaa existe una amplia legislacin referida al control de las aguas residuales. Algunas de las principales normativas se indican en la Tabla 1.
Tabla 1. Legislacin espaola para el tratamiento de aguas residuales Ttulo Contenido Establece las normas aplicables al tratamiento de las aguas residuales urbanas y que constituye la transposicin de la Directiva 91/271/CEE y una complementacin a las leyes 29/1985, de 2 de agosto, de Aguas y 22/1988, de 28 de julio, de Costas.

Real Decreto Ley 11/1995, de 28 de diciembre.

Real Decreto 509/1996, de 15 de marzo, de desarrollo del Real Decreto-ley 11/1995 de 28 de diciembre. Real Decreto 2116/1998, de 2 de octubre, por el que se modifica el Real Decreto 509/1996, de 15 de marzo, de desarrollo del Real Decreto Ley 11/1995, de 28 de diciembre.

Establece las normas aplicables al tratamiento de las aguas residuales urbanas.

Establece las normas aplicables al tratamiento de las aguas residuales urbanas.

Real Decreto 995/2000, de 2 de junio.

Fija objetivos de calidad para determinadas sustancias contaminantes y se modifica el Reglamento de Dominio Pblico Hidrulico, aprobado por el Real Decreto 849/1986, de 11 de abril.

Real Decreto 1620/2007, de 7 de diciembre.

Establece el rgimen jurdico de la reutilizacin de las aguas depuradas.

El objetivo de estas normativas es el de asegurar una correcta gestin de las aguas residuales as como unos niveles de carga contaminante en las aguas tratadas admisibles por el medio natural, tanto si se trata de aguas residuales urbanas como de aguas residuales industriales. En la Tabla 2 se indican los valores mximos permitidos de algunos de los parmetros principales segn la Directiva Europea 91/271/CEE y la modificacin llevada a cabo por la Directiva Europea 98/15/CEE.

Introduccin
Tabla 2. Requisitos de los vertidos procedentes de instalaciones de tratamiento de aguas residuales urbanas sujetos a lo dispuesto en el Anexo I (cuadro 1) de la Directiva Europea 91/271/CEE y modificacin de la Directiva Europea 98/15/CEE. Parmetro Demanda qumica de oxgeno (DQO) Demanda bioqumica de oxgeno sin nitrificacin (DBO5 a 20 C) Total de slidos en suspensin Fsforo Total Nitrgeno Total Concentracin Porcentaje mnimo de reduccin 75

125 mg/L

25 mg/L 35 mg/L 2 mgP/L (10.000-100.000 h-e*) 1 mgP/L (>100.000 h-e) 15 mgN/L (10.000-100.000 h-e) 10 mgN/L (>100.000 h-e)

70-90 90 80 70 - 80

*h-e: habitantes equivalentes: Carga orgnica biodegradable con una demanda bioqumica de oxgeno de cinco das de 60 gramos de oxgeno por da.

En el caso de las concentraciones de nitrgeno y fsforo, los valores de vertido indicados son obligatorios si el medio receptor est considerado como zona sensible a la eutrofizacin o con tendencia a estarlo en un futuro prximo (Directiva 98/15/CEE). Bajo esta consideracin se encuentran embalses, ros, lagos, parques nacionales, parques naturales, lagunas, marjales, estuarios, bahas, ras y calas de toda Espaa. Sin embargo, para los ncleos de poblacin de menos de 10.000 habitantes la Directiva no establece una concentracin lmite de vertido o un porcentaje especfico de reduccin. No obstante afirma que se debe hacer un tratamiento adecuado, que es aquel que despus del vertido permite respetar los estndares de calidad del medio receptor. A falta de objetivos de calidad, en la prctica las estaciones depuradoras localizadas en esos puntos adoptan como requisitos de vertido los valores de la Tabla 1.

Introduccin

1.2 Contaminacin de las aguas

1.2.1 Caractersticas de las aguas residuales
Las aguas residuales pueden ser de tres tipos: Aguas residuales domsticas: aquellas procedentes de zonas de vivienda y de servicios, generadas principalmente por el metabolismo humano y las actividades domsticas. Aguas residuales industriales: todas las aguas residuales vertidas desde locales utilizados para efectuar cualquier actividad comercial o industrial, que no sean aguas residuales domsticas ni aguas de escorrenta pluvial. Aguas residuales urbanas (ARU): las aguas residuales domsticas o la mezcla de las mismas con aguas residuales industriales y/o aguas de escorrenta pluvial. Las aguas residuales domsticas estn compuestas principalmente por materia orgnica, en su mayor parte biodegradable, as como cantidades importantes de nitrgeno, fsforo y sales minerales. En cambio, la composicin de las aguas residuales industriales vara en funcin de la actividad, conteniendo en muchos casos sustancias que por su alta carga contaminante y/o su peligrosidad estn sujetas a una legislacin especfica que prohbe su vertido a colectores, por lo que deben ser tratadas previamente. Las aguas residuales urbanas unifican estos dos tipos de vertidos, sin embargo, las caractersticas de cada vertido urbano van a depender del ncleo de poblacin en el que se genere, influyendo parmetros tales como el nmero de habitantes, la existencia de industrias dentro del ncleo, tipo de industria, etc. La contaminacin generada en el agua puede ser de tres tipos: Fsica: provoca modificaciones en parmetros tales como turbidez, color, olor, sabor, temperatura, radiactividad, espumas, conductividad, etc. Qumica: tanto por la alteracin de los componentes qumicos naturales del agua (incrementando o reduciendo su concentracin) como por la adicin de sustancias que modifican ciertos parmetros como salinidad, pH, oxgeno disuelto, aniones (cloruros, nitratos, nitritos, fosfatos, sulfuros, cianuros), cationes (sodio, calcio y magnesio, amonio, metales

Introduccin pesados) y compuestos orgnicos como grasas y aceites, que modifican tanto las caractersticas fsicas como qumicas. Biolgica: debida a la introduccin de microorganismos patgenos tales como bacterias, virus, protozoos y otros organismos transmisores de enfermedades que son un riesgo a nivel medioambiental y de salud. En la Tabla 3 se presentan algunos de los parmetros que se determinan para la caracterizacin de las aguas residuales urbanas.
Tabla 3. Listado de parmetros analizados en aguas residuales urbanas. Parmetro Color Olor Slidos (suspendidos y disueltos) Temperatura Materia orgnica: Carbohidratos Grasas y aceites Pesticidas Fenoles Protenas Contaminantes prioritarios Tensoactivos Compuesto orgnicos voltiles (COV) Constituyentes biolgicos: Animales Plantas Virus y bacterias
Fuente: METCALF y EDDY, INC (1995)

Parmetro Compuestos inorgnicos: pH Alcalinidad Cloruros Metales pesados Nitrgeno Fsforo Contaminantes prioritarios Azufre Gases: Sulfuro de hidrgeno Metano Oxgeno

En cuanto a los principales parmetros que se determinan a nivel de laboratorio y que permiten controlar el buen funcionamiento del sistema de depuracin de aguas se pueden destacar los siguiente: slidos suspendidos totales (SST) y slidos suspendidos voltiles (SSV), pH, conductividad, DQO, DBO5, nitrgeno amoniacal, nitratos, nitritos, nitrgeno total y fsforo total. Sus valores de concentracin aportan informacin importante acerca del estado de las aguas. La modificacin de las caractersticas fsico-qumicas y biolgicas del agua da lugar a procesos de diversa gravedad en funcin de la naturaleza de los contaminantes.

Introduccin Dentro de la gran variedad de sustancias de origen industrial y domstico que pueden pasar a formar parte de las aguas naturales y que resultan perjudiciales para el medio ambiente, las ms comunes son los compuestos de nitrgeno (N) y fsforo (P).

1.2.2 Presencia de nutrientes en aguas residuales. Fsforo y Nitrgeno

En los ltimos 20 30 aos las concentraciones de nitrgeno y fsforo en muchos mares y masas de agua continentales casi se han duplicado debido a los vertidos de origen industrial, domstico y agrcola, superando los niveles normales de concentracin naturales. A continuacin se indican las fuentes y las formas qumicas de los compuestos de fsforo y nitrgeno de mayor relevancia, haciendo especial hincapi en los compuestos nitrogenados, ya que es la base de estudio del presente trabajo.

Fsforo
Puede presentarse en el suelo en forma orgnica o inorgnica, disuelto o en suspensin. Generalmente procede del desgaste de ciertas rocas (ej. apatita), del lavado de suelos y principalmente de los detergentes polifosfatados (regularizados por el Reglamento 648/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo, sobre detergentes). Este nutriente es absorbido con facilidad por las partculas del suelo y aunque se trata de un elemento de escasa movilidad, en determinadas condiciones puede alcanzar las aguas subterrneas y/o aguas superficiales. En aguas residuales las formas predominantes generalmente son los ortofosfatos (PO4-3 ,HPO4-2 ,H2PO4, H3PO4) con un porcentaje del 85%, mientras que los polifosfatos (P2O7) y el fsforo orgnico, alcanzan valores del 15% (Jimnez, 2010).

Nitrgeno
En cuanto al nitrgeno, una elevada proporcin (alrededor del 30%) llega a travs de la contaminacin atmosfrica. Se trata de un compuesto ms mvil que el fsforo y puede ser lavado a travs del suelo o transferirse al aire por desabsorcin del amoniaco o por desnitrificacin. Inicialmente est presente en el agua residual en forma de nitrgeno orgnico (urea y protenas), pero es transformado rpidamente a partir de reacciones bioqumicas a amoniaco (NH3) o a amonio (NH4+). La forma predominante es el

Introduccin amonio como consecuencia del pH caracterstico del agua residual, aunque a pH bsico el equilibrio se desplaza hacia la forma no ionizada (Russo, 1985). La Ecuacin 1 muestra la relacin entre estas dos formas.

NH 4 + OH NH 3 + H 2O

Ecuacin 1

La forma oxidada predominante es el nitrato (NO3), ya que el nitrito (NO2) es muy inestable, al ser fcilmente oxidable a nitrato. Si existe acumulacin de nitrito en el medio, ste mantiene un equilibrio qumico con el cido nitroso (HNO2) en funcin del pH y la temperatura (Ecuacin 2).

NO2 + H + HNO2

Ecuacin 2

Las variaciones en la concentracin de estos compuestos se deben a los procesos biolgicos que llevan a cabo una gran diversidad de microorganismos. En el campo de la depuracin de aguas, la actividad bacteriana de estos microorganismos se emplea como sistema de tratamiento para la eliminacin del nitrgeno a travs de dos procesos principales: nitrificacin y desnitrificacin.

1.2.3 Efectos del nitrgeno en el medio natural y la salud humana

Las actividades humanas han alterado de manera significativa el ciclo global del nitrgeno, aumentando la presencia de iones de amonio, nitrito y nitrato en el medio acutico en muchas regiones del planeta. La acumulacin de estos compuestos en las aguas superficiales y subterrneas puede dar lugar a efectos adversos en la salud humana y el medio ambiente, algunos de los cuales se describen en los siguientes apartados. 1.2.3.1 Eutrofizacin Se produce por un exceso de nutrientes en el agua y consiste en un crecimiento acelerado de biomasa (fitoplancton, algas asociadas y macrfitas), siendo ms elevada la velocidad de produccin de los niveles trficos inferiores que la velocidad de consumo por parte de los niveles trficos superiores (Paerl, 1988).

Introduccin Los problemas que tienen lugar en un medio eutrofizado son tanto fsicoqumicos como biolgicos: aparicin de olores, incremento de la turbidez, reduccin del oxgeno disponible, incremento de compuestos perjudiciales procedentes de la descomposicin de materia orgnica, variaciones de pH, etc. Estas modificaciones afectan a la biodiversidad del medio natural, perjudicando las especies con mayor sensibilidad a los cambios (por ejemplo, menor tolerancia a bajos niveles de oxgeno disuelto) ya que nicamente son capaces de sobrevivir aquellas que logran adaptarse a las nuevas condiciones del entorno. La problemtica de los vertidos con elevadas cargas de nutrientes vara en funcin de la masa de agua receptora. En el caso de aguas continentales, las aguas lnticas (lagos, lagunas, pantanos, etc.) se ven ms seriamente afectadas por su bajo ndice de renovacin hdrica. En cambio, las aguas lticas (ros, manantiales, barrancos, etc.) son masas de agua de carcter fluvial que permiten la salida de estos nutrientes hacia estuarios, deltas, mares y ocanos. Cuando los nutrientes alcanzan las aguas marinas y ocenicas provocan los denominados blooms de algas por el enriquecimiento en compuestos nitrogenados, que es un factor limitante del crecimiento en los medios acuticos marinos. Los principales parmetros que controlan los fenmenos de eutrofizacin son: la disponibilidad de una fuente de carbono asimilable, la intensidad lumnica para llevar a cabo los procesos fotosintticos y la presencia de oxgeno disuelto. Tambin existen factores que pueden inhibir los procesos de crecimiento de los microorganismos y las algas, como metales pesados y compuestos inorgnicos (EPA,1993). En el caso de que se alcancen niveles graves de eutrofizacin, las aguas pueden dejar de ser aptas para la mayor parte de los seres vivos, convirtiendo entornos naturales en ecosistemas degradados, cuya recuperacin supone importantes inversiones. 1.2.3.2 Toxicidad en la fauna por presencia de amonio, nitrito y nitratos La presencia de estos compuestos en cantidades anormalmente elevadas puede dar lugar a una serie de efectos perjudiciales que varan en funcin de la concentracin y la forma nitrogenada. A continuacin se citan algunas de las posibles consecuencias. Amonio El in amonio (NH4+) y el amoniaco (NH3) se encuentran estrechamente relacionados mediante un equilibrio qumico.

Introduccin El amoniaco tiene carcter txico tanto en masas de agua dulce como salada a concentraciones de entre 1 y 10 mg/L. Su accin txica puede ser debida a algunas de las siguientes causas (EPA, 2007): Destruccin del epitelio branquial Estimulacin de la gluclisis y supresin del ciclo de Krebs Inhibicin de la produccin de ATP y reduccin de sus niveles Alteracin de la actividad osmorreguladora Disrupcin del sistema inmunolgico

Todo ello provoca que a diferentes concentraciones puedan darse problemas de elevada gravedad como daos branquiales a niveles en torno a 0.06 mg/L, muerte de las especies ms sensibles con valores de amoniaco de 0.2 mg/L y muerte de especies tolerantes al NH3 a niveles cercanos a 2.0 mg/L. Adems de prdidas de equilibrio, desorientacin, hiperexcitabilidad, incremento del ritmo respiratorio, reduccin de la excrecin de nitrgeno, reduccin del porcentaje de eclosi y menores tasas de crecimiento (EPA, 2007). Por otro lado, niveles elevados de Na+ y Ca2+ en el medio acutico pueden reducir la susceptibilidad de los animales a la toxicidad del amoniaco (Chambers, et al., 2001). Esto explicara el hecho de que, en general, los animales de agua dulce muestren una menor tolerancia a la presencia de amoniaco respecto de los animales de aguas marinas. Nitrito El nitrito (NO2) y el cido nitroso (HNO2) estn estrechamente relacionados a travs de un equilibrio qumico. Las concentraciones relativas de NO2 y HNO2 dependen bsicamente del valor de pH del agua, ya que elevadas concentraciones de nitrito y bajo pH favorecen la formacin de cido nitroso. (Russo, 1985). Ambos compuestos poseen una elevada toxicidad, sin embargo en rangos de pH entre 7.5 y 8.5, tpicos de ecosistemas acuticos, la concentracin de nitrito es del orden de 4 a 5 veces superior que la concentracin de cido nitroso (Russo, 1985, Camargo y Alonso, 2006). Algunos de los efectos perjudiciales del nitrito son: Reduccin de los niveles de cloro, provocando un desequilibrio electroltico grave. Modificaciones en los niveles de potasio intracelular y extracelular que afectan los potenciales de membrana y los neurotransmisores

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Introduccin provocando contracciones musculares que afectan a la funcin cardiaca. Formacin de compuestos nitrosos de carcter mutagnico y cancergeno. Represin del sistema inmunitario, con la consiguiente la disminucin de la tolerancia a las enfermedades bacterianas y parasitarias. En general, la concentracin de nitrito en aguas superficiales es muy baja, pero puede aparecer ocasionalmente en concentraciones inesperadamente altas debido a la contaminacin de aguas residuales industriales y domsticas (Prat et al., 1999). En aguas superficiales bien oxigenadas, el nivel de nitrito no suele superar la concentracin de 0.1 mg/L (Stumm y Morgam, 1981). Los valores entre 0.1 y 0.9 mg/L pueden presentar problemas de toxicidad dependiendo del pH (Erikson, 1985), y valores por encima de 1 mg/L son totalmente txicos y representan un impedimento para el desarrollo de la vida pisccola y el establecimiento de un ecosistema fluvial en buenas condiciones (Prat et al., 1999). Nitrato El in nitrato en medios acuticos no se encuentra formando especies desionizadas por tanto, la toxicidad de este compuesto se debe nicamente al efecto de la forma inica (Camargo et al., 2005). Puesto que el nitrato tiene una baja permeabilidad branquial, presenta un menor ndice de toxicidad respecto a otros compuestos nitrogenados, Sin embargo, la fauna acutica ms sensible puede verse afectada si es sometida a niveles en torno a 10 mg/L durante perodos prolongados de tiempo (Camargo y Alonso, 2006). En general los animales marinos son ms tolerantes que los animales de agua dulce a la toxicidad del nitrato, aunque determinados invertebrados marinos en estado larvario pueden mostrar sensibilidad a concentraciones relativamente bajas de nitrato en el medio acutico (Muir et al., 1991). Los niveles mximos de nitrato recomendados estn entre 2.9 y 3.6 mg/L con el fin de asegurar la proteccin de la fauna acutica tanto continental como marina y un nivel mximo ms restrictivo de 2 mg/L (Camargo et al., 2005) para proteger aquellas especies ms sensibles.

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Introduccin 1.2.3.3 Efectos perjudiciales sobre la salud humana La ingesta de nitrito y nitrato procedentes de aguas contaminadas puede inducir metahemoglobinemia, que consiste en la transformacin de hemoglobina en metahemoglobina, que no es capaz de realizar el intercambio de oxgeno. En el caso de los infantes (principalmente menores de 4 meses) puede provocar cianosis, taquicardia, convulsiones, asfixia y en ltimo trmino la muerte (Fewtrell, 2004). Evidencias cientficas sugieren adems que la ingestin prolongada de nitratos y nitritos puede resultar en procesos de mutagnesis y teratognesis, en el desarrollo de linfomas y cnceres, enfermedades coronarias, infecciones del tracto respiratorio, y malformaciones en los recin nacidos (Carmago y Alonso, 2006). Adems, la formacin de nitrosaminas a partir de la presencia de elevadas concentraciones de nitritos en el organismo tiene un alto poder cancergeno y txico (Russo, 1985). Por otra parte, el enriquecimiento en nutrientes de los ecosistemas acuticos y la proliferacin de algas txicas pueden causar, de manera indirecta, efectos adversos sobre la salud humana dando lugar a trastornos fisiolgicos y diversos sndromes de intoxicacin (Busse et al., 2006). Como se ha visto hasta ahora, la problemtica derivada del incremento en la concentracin de compuestos nitrogenados en las masas de agua no afecta nicamente el medio ambiente y a la viabilidad de los diferentes hbitats, sino tambin al ser humano. A nivel prctico, las actuaciones para reducir la presencia de estos compuestos en las aguas pueden llevarse a cabo en la fuente de origen (cambios en el sistema de produccin, empleo de sustancias menos contaminantes, etc.) o mediante su eliminacin posterior en estaciones depuradoras empleando esquemas de tratamiento basados en procesos fsicos-qumicos y biolgicos.

1.3 Sistemas de tratamiento de materia orgnica y nitrgeno

1.3.1 Procesos fsico-qumicos
Los procesos fsicos-qumicos empleados para eliminar el nitrgeno de las aguas residuales son tecnologas de tratamiento de uso limitado debido a su elevado coste, su funcionamiento irregular, y los problemas de explotacin y mantenimiento (Metcalf y Eddy, 1995). Las tcnicas de mayor relevancia son (Rodrigo et al., 1999):

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Introduccin Arrastre con aire (stripping) Consiste en la basificacin del agua hasta alcanzar un pH en el que el equilibrio NH4 /NH3 est desplazado hacia la formacin de amonaco, que se elimina por arrastre con aire. Intercambio inico Se basa en la utilizacin de un intercambiador inico (ejemplo, zeolita clinophlolita) que presenta gran afinidad por el amonio. Supone el inconveniente de la saturacin del intercambiador que obliga a regenerarlo peridicamente. Cloracin al breakpoint Consiste en la oxidacin del amonio a nitrgeno gaseoso con hipoclorito. Tiene buenos rendimientos, pero hace necesario un tratamiento del agua con carbn activado o con SO2 para eliminar el exceso de hipoclorito en el agua tratada. Precipitacin por estruvita (MAP, magnesium ammonium phosphate) Este sistema de eliminacin de nitrgeno consiste en la coprecipitacin del nitrgeno amoniacal y el fsforo ortofosfrico mediante la adicin de xido de magnesio, formando una sal llamada estruvita (MgNH4PO4, fosfato amnico magnsico hexahidratado). Se emplea como tratamiento previo al sistema biolgica en aguas residuales urbanas y permite la eliminacin de fsforo y nitrgeno junto con la obtencin de un fertilizante de liberacin lenta si se cumplen las restricciones en cuanto al contenido en metales pesados (Lopetegui et al., 2005).
+

1.3.2 Procesos biolgicos

La eliminacin de materia orgnica y nitrgeno en las estaciones depuradoras se aborda generalmente por la va biolgica, sometiendo a la biomasa a condiciones aerobias, anxicas o anaerobias en funcin de los requerimientos de cada tratamiento. Como principales ventajas de los procesos biolgicos cabe destacar el elevado rendimiento de eliminacin, la alta fiabilidad, la relativa facilidad de control y el moderado coste (Metcalf y Eddy, 1995). En las estaciones depuradoras urbanas, entre un 5% y un 10% del nitrgeno total contenido en el agua residual afluente es eliminado en etapa de decantacin primaria en forma de nitrgeno orgnico particulado. Por otro lado, en los sistemas de fangos activos convencionales se elimina entre un 10% y un 30 % del nitrgeno total

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Introduccin para satisfacer las necesidades nutricionales de la biomasa, que se estiman entre un 12% y un 13 % en peso de la biomasa formada (Sedlak, 1991). En la mayora de los casos esta eliminacin no es suficiente para conseguir cumplir requisitos de vertido por lo que se requiere de la aplicacin de tratamientos especficos de eliminacin de nitrgeno. Las reacciones que permiten la eliminacin de nitrgeno son la nitrificacin y la desnitrificacin, que vienen detalladas a continuacin. 1.3.2.1 Nitrificacin La nitrificacin consiste en la transformacin del nitrgeno amoniacal a nitrato por accin de un conjunto de bacterias auttrofas denominadas nitrificantes. Las bacterias encargadas de realizar este proceso utilizan el carbono inorgnico (CO2 o HCO3) como fuente de carbono, y obtienen la energa necesaria para su crecimiento a partir de la oxidacin del nitrgeno amoniacal. Este proceso se realiza en dos etapas llevadas a cabo por dos grupos diferentes de microorganismos. Las bacterias amonioxidantes (AOB) oxidan el amonio a nitrito en un proceso denominado nitritacin (Ecuacin 3), y posteriormente las bacterias nitritoxidantes (NOB) oxidan el nitrito a nitrato en un proceso denominado nitratacin (Ecuacin 4). La Ecuacin 5 se representa la reaccin de oxidacin global de amonio a nitrato.

AOB + 2 NH 4 + 3O2 2 NO2 + 4 H + + 2 H 2 O ETAPA 1

Ecuacin 3

NOB 2 NO2 + O2 2 2 NO3 ETAPA

Ecuacin 4

+ NH 4 + 2O2 NO3 + 2 H + + H 2 O
REACCIN GLOBAL

Ecuacin 5

En la Ecuacin 6 se considera la reaccin de sntesis de los microorganismos implicados, que asimilan una fraccin del amonio del agua residual para el tejido celular. En esta reaccin de sntesis, se asume como frmula qumica de la biomasa C5H7NO2.

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Introduccin

4CO2 + HCO3 + NH 4 + H 2O C5 H 7 NO2 + 5O2

Ecuacin 6

La reaccin global representativa del proceso de nitrificacin obtenida a partir de las reacciones de oxidacin y sntesis de biomasa corresponde con la ecuacin 7:

4CO2 + HCO3 + 22 NH 4 + 37O2

C 5 H 7 NO 2 + 21NO3 + 20 H 2 O + 42 H +

Ecuacin 7

Teniendo en cuenta esta reaccin, se observa que en el proceso de nitrificacin se produce un consumo considerable de alcalinidad que supone un importante descenso del pH del medio. La compensacin del pH tiene lugar durante el proceso de desnitrificacin, que viene descrito a continuacin. 1.3.2.2 Desnitrificacin Las bacterias encargadas de llevar a cabo este proceso son hetertrofas capaces de (en ausencia de oxgeno) emplear el nitrito o el nitrato como aceptor de electrones para degradar la materia orgnica. La reaccin general de desnitrificacin se representa en la Ecuacin 8, con el metanol (CH3OH) como fuente de carbono orgnico.

NO3 + 0.833CH 3OH + 0.167 H 2CO3

0.5 N 2 + 5CO2 + 1.33H 2O + HCO3

Ecuacin 8

En la Ecuacin 9 se considera la sntesis de biomasa (C5H7NO2), la degradacin de la materia orgnica del agua residual (C10H19O3N) y el consumo de nitrgeno amoniacal. La reaccin global de eliminacin de nitrato se puede escribir como (WEF y ASCE, 1998):

+ NO3 + 0.345C10 H 19 O3 N + H + + 0.267 HCO3 + 0.267 NH 4

Ecuacin 9

0.612C 5 H 7 O2 N + 0.5 N 2 + 0.655CO 2 + 2.3H 2 O

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Introduccin La efectividad de este proceso de eliminacin de nitrgeno es mxima cuando en el sistema no existe oxgeno disuelto disponible (condiciones anxicas). De lo contrario, las bacterias emplean como aceptor de electrones el oxgeno, cuya asimilacin se ve favorecida frente al nitrato, por lo que si existen ambos compuestos, no tiene lugar el proceso de desnitrificacin. El motivo es que el crecimiento bacteriano en presencia de nitrato resulta menos eficiente que el crecimiento en presencia de oxgeno, ya que no se genera la misma cantidad de energa en forma de ATP por unidad de DQO (Demanda Qumica de Oxgeno) degradada (Brock, 2003). Como ya se ha indicado anteriormente, el consumo de protones y la produccin de CO2 asociados a esta reaccin supone un aumento de la alcalinidad, que compensa la disminucin de alcalinidad del proceso previo de nitrificacin. Por ello la desnitrificacin es una etapa de gran importancia, ya que permite estabilizar el sistema adems de que elimina de forma muy eficiente el nitrgeno del agua. 1.3.2.3 Factores que afectan los procesos de nitrificacin-desnitrificacin En relacin a los factores que intervienen en los sistemas de depuracin de aguas residuales, existen numerosos agentes fsico-qumicos que afectan los procesos de nitrificacin y desnitrificacin llevados a cabo por los microorganismos. Por tanto, un adecuado desarrollo de la poblacin bacteriana es la clave para obtener unos rendimientos de eliminacin de materia orgnica y nutrientes que cumplan con los objetivos establecidos. La densidad de bacterias nitrificantes y desnitrificantes en un reactor depende de diversos factores, siendo algunos de los siguiente parmetros ambientales los de mayor relevancia: oxgeno disuelto (OD), pH, alcalinidad, temperatura, concentracin de nutrientes, salinidad, luz, presencia de txicos (como por ejemplo, metales pesados) (Henze et al., 2002). Adems de factores relacionados con el diseo del sistema, como el ratio DBO/Nitrgeno. En este apartado se van a comentar los principales factores que influyen en el desarrollo bacteriano, haciendo especial hincapi en el pH y los nitritos. Alcalinidad y pH El pH es un parmetro que influye en la velocidad de los procesos biolgicos por lo que valores fuera del intervalo fisiolgico de funcionamiento provocan la ralentizacin del crecimiento de los microorganismos.

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Introduccin El rango de valores de pH adecuado para que se den los procesos de nitrificacin y desnitrificacin se halla entre 7 y 9, con un rango ptimo entre 7.5 y 8.5 (Metcalf y Eddy, 1995; Van Haandel y Van der Lubbe, 2007). En la nitrificacin se reduce el nivel de HCO3 generando una disminucin de la alcalinidad del medio. La mayor proporcin de esta alcalinidad se consume en la neutralizacin de los protones liberados en la oxidacin del in amonio (7.14 mg de alcalinidad como CaCO3) mientras que durante la desnitrificacin se producen 3.57 mg de alcalinidad como CaCO3. Para evitar que un sistema de nitrificacin-desnitrificacin se acidifique progresivamente es necesario que la alcalinidad residual sea superior a 50 mg CaCO3/L (Villaseor, 1997, Gerardi, 2002). En cuanto a la influencia del pH en la velocidad de crecimiento bacteriano, aunque afecta a todas las bacterias, su efecto es ms significativo en determinadas poblaciones, como por ejemplo las bacterias auttrofas y las bacterias acumuladoras de polifosfato (PAO). Las bacterias auttrofas presentan su mxima velocidad de crecimiento para valores de pH en torno a 8 y en el caso de las bacterias hetertrofas, el pH adecuado para su desarrollo comprende un intervalo de entre 7 y 8. Cuando el valor de pH excede los rangos mnimo o mximo puede darse la limitacin del crecimiento bacteriano. Los procesos pueden ser biolgicos, afectando directamente a la actividad enzimtica por la inhibicin de los sitios activos de las enzimas debido a la unin de H+ y OH (Garca y Fernndez-Polanco, 1996), lo cual provoca una prdida de actividad en las clulas. O qumicos, reduciendo la concentracin disponible de HCO3 (fuente de carbono) (Carretero, 2010). Segn Grunditz y Dalhammar (2001), el pH ptimo para bacterias amonioxidantes y nitritoxidantes est prximo a 8 y se observa una disminucin similar en la actividad de ambas bacterias para valores de pH inferiores o superiores, aunque las bacterias AOB se encuentran menos afectadas a valores de pH elevados. Por otra parte, Ju y Nallagatla (2003) obtuvieron que para concentraciones elevadas de amonio, la mxima velocidad de nitrificacin tena lugar a un valor de pH de 7.6, mientras que con concentraciones bajas de amonio, el pH ptimo se desplazaba hacia valores superiores ya que conforme aumenta el valor del pH tambin lo hace el porcentaje de molculas de nitrgeno amoniacal en forma de NH3 (verdadero sustrato de las bacterias amonioxidantes). En la Tabla 4 se presentan los rangos de pH y su influencia sobre la actividad de las bacterias nitrificantes.

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Introduccin
Tabla 4. Influencia del pH en el procesos de nitrificacin. pH 4.0 a 4.9 5.0 a 6.7 6.7 a 7.2 7.2 a 8.0 7.5 a 8.5
Fuente: Gerardi (2002)

Efecto sobre la nitrificacin Presencia de bacterias nitrificantes (nitrificacin organotrfica) Velocidad de nitrificacin lenta Velocidad de nitrificacin se incrementa Velocidad de nitrificacin constante Nitrificacin por bacterias nitrificantes

Compuestos nitrogenados: Amonio, nitrito y nitrato Son las fuentes de energa o dadores de electrones de las bacterias nitritoxidantes y desnitrificantes. Por esta razn son factores limitantes de gran relevancia en el crecimiento bacteriano. No obstante, si se hallan presentes en una elevada concentracin puede llegar a inhibir el desarrollo de las bacterias (Anthonisen et al., 1976; Glass y Silverstein, 1998; Surmacz-Gorzka et al.,1996). Tanto el pH como la temperatura modifican el equilibrio en el que se hallan presentes (Anthonisen et al., 1976; Claros et al., 2010). Un pH elevado provoca la inhibicin del proceso de nitrificacin debido al propio efecto del pH (Claros et al., 2010). Mientras que un pH bajo inhibe el proceso por efecto del propio pH y por la generacin de cido nitroso a partir de iones nitrito. Las bacterias nitritoxidantes son ms sensibles que las amonioxidantes a los efectos de inhibicin provocados por amonio y nitrito (Vadivelu et al., 2007), aunque hay una enorme disparidad en los valores recopilados en bibliografa. Las poblaciones de Nitrosomonas y Nitrobacter pueden verse seriamente afectadas cuando la concentracin de amoniaco alcanza valores de 10 mg/L y 0.1 mg/L respectivamente (Gerardi, 2002). Y en cuanto al cido nitroso, ambos gneros se ven inhibidos a una concentracin de 1.0 mg/L. El efecto inhibitorio que causa el nitrito sobre la actividad bacteriana es objeto de inters en numerosos procesos, tal y como muestra la Tabla 5. Zumft (1993) inform que muchas especies de bacterias son susceptibles a la toxicidad del nitrito a causa de la formacin del complejo metal-nitrosyl que ocurre cuando los iones NO o los radicales NO interactan con enzimas bacterianas. Otra posible causa de la inhibicin por nitrito es la presencia de cido nitroso y su influencia en el crecimiento celular (Almeida, 1995).

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Introduccin

Tabla 5. Procesos influenciados por la presencia de nitrito. Proceso

Oxidacin de amonio Oxidacin de amonio Oxidacin de amonio Anammox Remocin anxica de fsforo Remocin anxica de fsforo Sntesis de ATP Desnitrificacin Desnitrificacin a pH 6 Crecimiento de Clostridium spotogenes Crecimiento de Pseudomonas denitrificans Crecimiento de Pseudomonas fluorescens Crecimiento de Pseudomonas fluorescens Metanognesis Nitrificacin Nitrificacin Fuente: Romero (2010)

Inhibicin (%)
60 0-80 50 100 n.s. 100 n.s. 100 100 50 27 60 100 100 40 20

Nitrito (mg/L)
280 80-3000 42-70 >280 5-10 >8 380 308 250 140 100 98 308 70 100 100

Referencia
Stein and Arp (1998) Groenewg et al., (1994) Muller et al., (1995) Jetten et al., (1999) Kuba et al., (1996) Meinhold et al., (1999) Almeida et al., (1995a) Almeida et al., (1995a) Glass et al., (1997) Cui et al., (1992) Komaros and Lyberatos (1997) Almeida et al., (1995a) Almeida et al., (1995a) Klber and Conrad (1998a) Dahl et al., (1997) Philips and Verstraete (2000)

Tambin es importante destacar las implicaciones econmicas que puede tener un incremento en la concentracin de nitrito en plantas de tratamiento biolgico Una concentracin elevada de nitrito en el proceso de cloracin de la etapa terciaria de desinfeccin reduce la capacidad desinfectante del cloro ya que parte de su funcin oxidante es empleada para oxidar estos compuestos (Gerardi, 2002). Provoca el incremento en el consumo de oxgeno debido a la formacin de tetrxido de dinitrgeno (N2O4) que se genera abiticamente a partir de nitrito y compite por el oxgeno en el proceso de oxidacin de amonio llevado a cabo por la encima amoniomonooxigenasa (AMO), que oxida el amoniaco a hidroxilamina. Por tanto, un incremento en la concentracin inicial de nitrito provoca el incremento de la concentracin de N2O4provocando un aumento de la constante de semisaturacin para el oxgeno. Una elevada concentracin de nitrito en el medio tiene un efecto estimulante sobre el desarrollo de microorganismos filamentosos (Musvoto et al., 1999). Casey (1999) hall que bajo condiciones de elevada concentracin de nitrito, cuando el fango activo era sometido a alternancia de condiciones aerbicas/anxicas, se produca una acumulacin intracelular de NO durante el periodo de anoxia en

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Introduccin bacterias formadoras de flculos, aunque no en filamentosas, provocando su inhibicin en la etapa de consumo de oxgeno. De esta manera las bacterias filamentosas experimentaban una ventaja competitiva sobre las formadoras de flculos y proliferan. Oxgeno disuelto El consumo de oxgeno en el proceso de nitrificacin supone que por cada mg de N-NH4 (nitrgeno en forma de amonio) oxidado a N-NO3 (nitrgeno en forma de nitrato) se necesitan 4.57 mg de oxgeno, de los cuales 3.44 mg son consumidos por las bacterias amonioxidantes y 1.13 mg por las bacterias nitritoxidantes. Mientras que en la desnitrificacin, una concentracin que supere valores entre 0.3 mg O2/L y 1.5 mg O2/L inhibe el proceso de desnitrificacin (Ciudad et al., 2005; Zafarzadeh et al., 2011). Las bacterias auttrofas nitrificantes son ms sensibles que las bacterias hetertrofas a la falta de oxgeno, habindose observado que concentraciones de oxgeno disuelto inferiores a 1 mg/L conducen a una reduccin significativa de su velocidad de crecimiento (Grady et al., 1999). En sistemas con bajas edades de fango y alta carga, el consumo de oxgeno es elevado y pueden crearse deficiencias en el interior de los flculos, ante las cuales las bacterias nitrificantes son muchos ms sensibles que las hetertrofas (Villaseor, 1997) Las bacterias amonioxidantes (AOB) tienen una constante de saturacin diferente a la de las bacterias nitritoxidantes (NOB). Existen estudios que indican que las bacterias AOB tienen menor afinidad por el oxgeno que las bacterias NOB (Hellinga et al., 1998; Prez, 2001) y otros que por el contrario, proponen una constante de afinidad mayor para las NOB (Wiesmann, 1994; Guisasola et al., 2005; Ciudad et al., 2005). En cuanto al efecto del oxgeno sobre las bacterias desnitrificantes, es importante tener en cuenta que muchas bacterias nitrificantes son facultativas y por tanto pueden llevar a cabo la desnitrificacin en ausencia de oxgeno y presencia de compuestos oxidados de nitrgeno (Seviour y Nielsen, 2010), por tanto su crecimiento no se ver tan afectado como en el caso de las bacterias no facultativas. Temperatura La temperatura afecta a varios factores, como por ejemplo los valores de las constantes de equilibrio cido/base, la solubilidad de las sustancias, los coeficientes de difusin y la actividad enzimtica.

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Introduccin Una mayor temperatura, dentro del rango considerado como ptimo, supone un aumento de la velocidad de crecimiento debido a que se incrementa la rapidez de las reacciones enzimticas. Sin embargo, si se exceden los lmites mximos se produce la desnaturalizacin de las protenas y la alteracin de las membranas lipdicas, lo que provoca la muerte celular. Por otro lado, temperaturas inferiores a los valores ptimos provocan una disminucin de la velocidad de crecimiento al impedir el adecuado funcionamiento de la membrana celular por el cambio de estado de los lpidos de la membrana, que pasan de ser fluidos a cristalinos. En la Tabla 6 se presentan los rangos de temperatura y su efecto sobre el proceso de nitrificacin.
Tabla 6. Relacin de la temperatura con el proceso de nitrificacin. Temperatura > 45 C 28 C a 32 C 16 C 10 C < 5 C
Fuente: Gerardi (2002)

Efecto sobre la nitrificacin Se detiene el proceso Rango de temperatura ptimo Aproximadamente el 50% de la velocidad ptima Reduccin significativa de la velocidad de nitrificacin. 20% de la velocidad ptima Se detiene el proceso

El proceso de nitrificacin puede desarrollarse en un intervalo de temperatura comprendido entre 8C y 30C (Gerardi, 2002), aunque a temperaturas bajas es necesario incrementar los tiempos de retencin celular para lograr mantener los niveles de eliminacin de nutrientes y materia orgnica. La temperatura ptima para las bacterias amonioxidantes es aproximadamente de 35C y para las bacterias nitritoxidantes el intervalo ptimo de temperatura se encuentra entre 35C y 42C (Gonzlez et al., 2010). Mientras que para las bacterias desnitrificantes el rango de temperatura va de 0C a 50C, con un valor mximo de desnitrificacin a 40C (Lolmede et al., 2000). Luz La inhibicin por luz es significativa en la superficie del agua, donde se observa una reduccin del 50% de la actividad de las bacterias nitrificantes a intensidades de luz de un orden de magnitud tres veces menor que la intensidad a plena luz del da (Prosser, 1989).

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Introduccin Nutrientes En todo proceso biolgico es necesaria la existencia tanto de nutrientes como de micronutrientes, por lo que se debe verificar que la carencia de alguno de ellos no inhiba el proceso: N, S, P, K, Mg, Ca, Fe Na y Cl (Prez, 2001; Gonzlez et al., 2010). Sustancias inhibidoras En sistemas de tratamiento de aguas residuales industriales es frecuente que las poblaciones bacterianas se vean afectadas ante vertidos que provoquen una modificacin en las condiciones del afluente, inhibiendo la actividad bacteriana durante largos perodos de tiempo o incluso provocando su muerte. El efecto de las sustancias txicas sobre las bacterias depende de la concentracin de dicha sustancia y del tiempo de exposicin. Las sustancias txicas ms referenciadas en el campo de las aguas residuales son algunos metales y ciertos compuestos inorgnicos: Z, Cu, Ni, Ci, Cd, As, Cr, fluoruros, yoduros, cloroformo, fenol, tiourea, hidracina, etanol, etilendiamina, anilina y acetona (Blum y Speece, 1991; Prez, 2001, Gonzlez et al., 2010). Ratio Demanda Biolgica de Oxgeno (DBO)/NKT Se ha observado experimentalmente que existe una correlacin entre la capacidad de eliminacin de nitrgeno de los procesos de fangos activos y el cociente DBO/NKT, donde DBO es la demanda biolgica de oxgeno y NKT es el Nitrgeno Kjeldahl, fraccin que contiene el nitrgeno orgnico reducido y el amoniacal. La fraccin de organismos nitrificantes disminuye al aumentar la proporcin DBO5/NKT y por tanto se produce una prdida de eficacia. En sistemas combinados de eliminacin de materia orgnica y nitrgeno esta proporcin es superior a 5, mientras que en los sistemas en los que se separan ambos procesos, en la etapa de nitrificacin la proporcin es superior a 3 (Bitton, 2011). Por otro lado, en el proceso de desnitrificacin a medida que aumenta la relacin DBO/NKT, hay mayor disponibilidad de materia orgnica fcilmente biodegradable lo cual permite un desarrollo eficaz del proceso (Carretero, 2010). Dixido de carbono La limitacin en el crecimiento auttrofo se produce por falta de fuente de carbono (CO2), aunque es difcil encontrar este tipo de limitacin debido a su elevada solubilidad. No obstante, en el caso de que el caudal de aireacin no contenga CO2, es importante asegurar cierto nivel de carbono en el medio para que no se produzca la limitacin.

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Introduccin Transferencia de materia En el caso de cultivos en suspensin, la transferencia de materia entre fases puede limitar el crecimiento de las bacterias. En el caso de biomasa inmovilizada hay que tener en cuenta, adems, la transferencia entre la fase lquida y la slida y la posterior difusin en el slido (Garrido et al., 1997). Salinidad Las bacterias son capaces de sobrevivir en ambientes con altos niveles de salinidad, manteniendo su citoplasma en el mismo nivel osmtico que el del medio ambiente circundante (Oren, 1999). Sin embargo, recientes estudios han determinado que se da una reduccin de la actividad de las bacterias o una inhibicin total cuando se somete la biomasa a elevadas concentraciones de salinidad (Claros et al., 2010; Moussa et al., 2006). Estudios como los llevados a cabo por Vredenbergt et al., (1997) y Dincer et al., (1999) determinaron que la salinidad tiene un efecto ms negativo sobre las bacterias nitritoxidantes que sobre las amonioxidantes. A continuacin se describen los principales esquemas de tratamiento existentes. 1.3.2.4 Esquemas de tratamiento Aunque se ha hecho especial hincapi en el proceso empleado en este trabajo, Reactor Secuencial Discontinuo, ms conocido por sus siglas en ingls como sistema SBR (Sequencing Batch Reactor), en el siguiente apartado se describen algunos de los procesos ms empleados, as como aquellos que se han desarrollado en los ltimos aos y que estn en proceso de investigacin e implementacin. 1.3.2.4.1 Esquemas convencionales Los esquemas de tratamiento ms ampliamente difundidos para la eliminacin biolgica de nitrgeno consisten bsicamente en la disposicin de etapas aerobias y anxicas en las que se realizan los procesos de nitrificacin y desnitrificacin. En funcin de la posicin relativa de las zonas, estos sistemas se clasifican en sistemas de predesnitrificacin y sistemas de postdesnitrificacin (Rodrigo et al., 1999). En la predesnitrificacin el agua residual es tratada primero en una etapa anxica y posteriormente en una etapa aerobia. Los nitratos llegan al reactor anxico

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Introduccin por medio de una corriente de recirculacin interna, utilizndose para la desnitrificacin la materia orgnica contenida en el agua residual. La postdesnitrificacin consiste en una etapa previa aerbica en la cual la materia orgnica contenida en el agua residual ha sido consumida y es necesaria la adicin de una fuente de carbono externa (generalmente, en forma de metanol) o bien la alimentacin de parte del agua residual bruta directamente al reactor anxico. La materia orgnica procedente de la degradacin de la biomasa endgena puede complementar las anteriores fuentes de carbono. Estos sistemas pueden operarse en cultivos de lecho fijo o en suspensin. El mtodo en suspensin est ampliamente extendido, siendo el ms sencillo el que corresponde a una configuracin de etapas anxica/aerobia. Esta configuracin ha dado origen a varios esquemas de proceso, entre los que podemos destacar los siguientes y cuyo esquema de tratamiento viene representado en la Figura 1. Wuhrman Es un proceso de postdesnitrificacin. Esto implica la necesidad de emplear una fuente de carbono orgnico para la desnitrificacin, obtenindose por norma general bajos rendimientos en cuanto a eliminacin de nitrgeno. Configuracin Ludzack-Ettinger y Ludzack-Ettinger modificado Ambos procesos son de predesnitrificacin, diferencindose en que, en el proceso modificado, la corriente de recirculacin interna es independiente de la de recirculacin de fangos, mientras que en el Ludzack-Ettinger la recirculacin de fangos realiza tambin la recirculacin de nitratos. Esquema Bardenpho En este sistema se adicionan dos etapas al proceso base, una anxica o de postdesnitrificacin y una aerobia o de postaireacin. En la etapa de postdesnitrificacin la materia orgnica utilizada es la procedente de la degradacin de la biomasa endgena. De esta manera, se consigue un aumento en el rendimiento de eliminacin de nitrgeno oxidado. La etapa de postaireacin elimina por arrastre el N2 formado durante la desnitrificacin, mejorando de esta forma la sedimentabilidad del fango

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Introduccin

Reactor aerobio

Reactor anxico

Decantador

Recirculacin de fangos

Purga

A. Proceso Wurhmann

Reactor anxico

Reactor aerobio

Decantador

Reactor anxico

Reactor aerobio

Decantador

Recirculacin interna Recirculacin de fangos Purga Recirculacin de fangos Purga

B. Proceso Ludzack-Ettinger

C. Proceso Ludzack-Ettinger modificado

Reactor anxico

Reactor aerobio

Reactor anxico

Reactor aerobio

Decantador

Recirculacin interna Recirculacin de fangos Purga

D. Proceso Bardenpho

Aireadores

Decantador

Aireadores Purga

Recirculacin de fangos

E. Canal de oxidacin

Figura 1. Esquemas de eliminacin biolgica de nitrgeno: A) Wuhrmann, B) LudzackEttinger, C) Ludzack-Ettinger modificado, D) Bardenpho, E) Canales de oxidacin

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Introduccin Canales de oxidacin continuos y de fases Las operaciones de mezcla y aireacin son fundamentales en estos reactores. En uno o en varios puntos del canal se suministra oxgeno, originndose dos zonas entre cada dos puntos de aireacin: una aerobia (en la que conforme aumenta la distancia al punto de aireacin disminuye la concentracin de oxgeno) y una anxica (que comienza cuando la concentracin de oxgeno es cero y se prolonga hasta alcanzar el siguiente punto de aireacin). El tamao de ambas zonas variar a lo largo del tiempo dependiendo del caudal y caractersticas del agua residual, pudiendo ser ajustado mediante el control de la aireacin. Es fundamental un control de la operacin de mezcla para que no se produzca, como consecuencia de la agitacin, una aireacin del fango en las zonas anxicas. Por lo general, estos procesos se operan con elevadas edades de fango para favorecer el proceso de nitrificacin. 1.3.2.4.2 Esquemas no convencionales Muchos estudios se centran en las limitaciones tcnicas y econmicas de los procesos de nitrificacin-desnitrificacin en sistemas que tratan aguas residuales con elevadas cargas de nitrgeno y bajas cargas de carbono orgnico (Paredes et al., 2007). Por este motivo, se han desarrollado diferentes esquemas de tratamiento que han puesto de manifiesto la posibilidad de optimizar el rendimiento de eliminacin de nitrgeno (en su mayor parte en forma de amonio) que suele provenir de corrientes de recirculacin interna de la planta (sobrenadante de la digestin anaerobia) o de vertidos de determinados procesos industriales. Potenciacin de organismos nitrificantes en un sistema BABE Se trata de un proceso biolgico de crecimiento y acumulacin de organismos nitrificantes (Bio-Augmentation Batch Enhanced) (Zilverentant, 1999) que contribuye a optimizar la eliminacin biolgica del nitrgeno de la lnea de aguas de una EDAR. El objetivo de este esquema de tratamiento es potenciar el proceso de nitrificacin en sistemas de fangos activados que trabajan a bajas temperaturas (<15C) y por tanto tienen limitada la velocidad de crecimiento de los organismos nitrificantes (Salem, 2003). El proceso consiste en un reactor independiente que emplea como afluente la corriente procedente de la deshidratacin de fangos y una pequea fraccin del fango de recirculacin proveniente del sistema biolgico. Mediante la alta concentracin de

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Introduccin bacterias auttrofas nitrificantes presentes en la corriente de recirculacin y la elevada concentracin de nitrgeno del agua de deshidratacin, se potencia el crecimiento de los microorganismos, incrementando la eficiencia del sistema y reduciendo el TRC necesario para conseguir la nitrificacin. La corriente generada en el reactor BABE es introducida en la lnea principal de la EDAR, mejorando el porcentaje de eliminacin global de nitrgeno de la planta. Nitrificacin-desnitrificacin va nitrito La Figura 2 muestra el esquema de nitrificacin-desnitrificacin va nitrito. Consiste en la oxidacin del amonio a nitrito, evitando que el proceso de oxidacin contine. En el sistema global, el consumo de oxgeno necesario empleando este proceso se reduce un 25% en la etapa aerobia, y supone un ahorro de materia orgnica de entre un 40% y un 60% en la etapa anxica, adems de que se produce un 300% menos de biomasa (Ciudad, 2007).

O2
+ 4

Nitrificacin
Paso 1

Materia orgnica Desnitrificacin

NH NO NO NO2 NO N 2O N 2 AOB NOB

Paso 2

Figura 2. Esquema del proceso de nitrificacin-desnitrificacin va nitrito

Para llevar a cabo este proceso se requiere reducir la actividad de las bacterias que realizan el paso de nitrito a nitrato, y los principales parmetros sobre los que se puede actuar son: oxgeno disuelto (OD), pH, temperatura y tiempo de retencin celular. La concentracin de OD es un adecuado parmetro de control de la oxidacin de amonio a nitrito debido a que las bacterias amonioxidantes (AOB) y las nitritoxidantes (NOB) poseen distinta afinidad por el oxgeno, con una mayor sensibilidad de las NOB a bajas concentraciones de OD (Wiesmann, 1994; Garrido et al., 1997). Por otra parte, el pH es un parmetro que permite controlar el equilibrio de las formas inicas y no inicas del medio. Alcanzar un pH alcalino tiene dos efectos en las bacterias NOB: la inhibicin por amonaco y la limitacin por sustrato (Ciudad, 2007). Sin embargo, se ha observado que puede darse la aclimatacin a concentraciones crecientes de amoniaco (entre 0.1 y 10 mg N-NH3/L) entre la poblacin de NOB (Villaverde et al., 2000), por lo que se han desarrollado sistemas de trabajo que

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Introduccin emplean la temperatura como parmetro de control. Trabajando en un rango de entre 28C y 34 C y una baja retencin de slidos es posible reducir la concentracin de bacterias nitritoxidantes en el reactor (Hellinga et al., 1998). Dada la dificultad para mantener estable en el tiempo una eficiente oxidacin de amonio junto con la inhibicin de la oxidacin de nitrito a nitrato se han desarrollo diversos esquemas de tratamiento. stos involucran adems de la nitrificacin parcial, la desnitrificacin, empleando para ello los principales sistemas existentes, como son los cultivos en suspensin o en soporte slidos, los reactores secuenciales (SBR) o de flujo continuo (RCTA) y la combinacin de procesos en reactores independientes o en un nico reactor. Algunos de los principales esquemas de tratamiento se describen a continuacin. Nitrificacin parcial: SHARON El sistema SHARON (Single reactor High activity Ammonia Removal Over Nitrite) permite tanto la eliminacin de nitrgeno por la va del nitrito como la desnitrificacin, que puede realizarse con el objetivo de controlar el descenso del pH y/o lograr una completa eliminacin del nitrgeno siguiendo la ruta del nitrito. Se fundamenta en la seleccin de bacterias AOB frente a bacterias NOB al trabajar en rangos de temperatura elevados, que favorecen el crecimiento de las bacterias amonioxidantes de modo que con tiempos de retencin celular adecuados, es posible reducir la concentracin de bacterias nitritoxidantes en el reactor (Hellinga, 1998). El proceso se realiza alternando etapas aerobias y anxicas, en un nico reactor o en un sistema de reactores independientes, operando a altas temperaturas (30C 40C), con un rango de pH entre 7 y 8. En la Figura 3 se representa un esquema de una EDAR que incluye el reactor de nitritacin parcial para el tratamiento independiente de la corriente del sobrenadante procedente de la desnitrificacin del fango digerido anaerbicamente.
Reactor biolgico Decantador

Recirculacin de fangos Deshidratacin Efluente deshidratacin Reactor nitritacin Digestor anaerobio Purga

Figura 3. Esquema de una EDAR con un reactor SHARON de nitritacin parcial

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Introduccin Oxidacin anaerobia de amonio: ANAMMOX Se trata de un proceso en el que bajo condiciones anxicas el amonio es convertido a nitrgeno gaseoso empleando nitrito como aceptor de electrones (Van Dongen, 2003). Este tratamiento necesita de una nitrificacin parcial previa que permita obtener una relacin entre amonio y nitrito prxima al 50%. Los organismos involucrados en el proceso son bacterias auttrofas conocidas como ANAMMOX, (ANaerobic AMMonia OXidation). Al ser auttrofas no requieren de una fuente externa de carbono orgnico, siendo el dixido de carbono su principal fuente de carbono para el crecimiento (Van de Graaf, 1997). Estos organismos emplean nicamente el nitrito como aceptor de electrones (Van Loosdrecht, 2005). Los parmetros ptimos de trabajo deben mantener un pH en un rango de valores entre 8 y 8.5 y una temperatura superior a 25C. Es importante tener en cuenta que si la concentracin de nitrito alcanza valores de entre 20 y 40 mg/L durante un periodo de exposicin superior a 24 horas, el proceso puede verse interrumpido de forma irreversible (Fux, 2003). Combinacin de nitrificacin parcial y ANAMMOX En el proceso ANAMMOX, el amonio y el nitrito son consumidos de forma casi equimolar, por lo que podra ser combinado con un proceso de nitritacin parcial. Una de las posibles opciones es el proceso SHARON, de forma que nicamente la mitad del amonio sea oxidado a nitrito. Parte del amonio del agua residual es oxidado a nitrito y el efluente de este proceso, que contiene amonio y nitrito a partes iguales, se emplea como afluente del proceso Anammox, convirtiendo amonio a nitrgeno gas. La complementacin de ambos procesos auttrofos supone la eliminacin de la necesidad de una fuente de carbono externa y la reduccin del consumo de oxgeno entre un 50 % y un 60% (Van Hulle, 2005). Sin embargo, es importante mantener bajo control dos parmetros principales: el oxgeno residual en el efluente del proceso de nitrificacin parcial, ya que podra inhibir a la actividad de las bacterias Anammox, y la relacin NH4+/NO2, mantenindola en un ratio 1.0:1.3.

0.9 N2 NH4+ O2 NH4+ NO2 0.1 NO3

NITRITACIN

ANAMMOX

Figura 4. Proceso combinado nitrificacin parcial-ANNAMOX

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Introduccin

Eliminacin de nitrgeno con oxgeno limitado: CANON y OLAND Se trata de un mtodo de tratamiento que emplea un reactor de soporte slido que permite generar una biopelcula en la que se combinan simultneamente los procesos de nitrificacin parcial y de oxidacin anaerobia de amonio. En la zona superficial de la biopelcula en contacto con el licor mezcla, la concentracin de OD es mayor y permite los procesos aerobios de nitrificacin parcial, mientras que en las capas inferiores se dan las condiciones que permiten el proceso de oxidacin anaerobia de amonio. Los sistemas ms conocidos son el sistema CANON (Completely Autotrophic Nitrogen removal Over Nitrite) y el sistema OLAND (Oxygen Limited Aerobic Nitrification-Denitrification) que difieren en la configuracin del reactor. Ambos procesos emplean la misma ruta de eliminacin. Por lo tanto, pueden ser denominados de forma colectiva como procesos de eliminacin de nitrgeno con limitacin de oxgeno. Es una alternativa eficiente a la eliminacin convencional de nitrgeno que supone un ahorro de costes, especialmente para el tratamiento de aguas residuales que contienen altas concentraciones de amonio pero carecen de carbono orgnico. Proceso CANON Se trata de un sistema que consiste en la integracin de la nitrificacin parcial y el proceso ANAMMOX y que transcurre en un nico reactor de lecho fijo. Bajo condiciones de oxgeno limitado, los dos grupos de bacterias involucrados en los procesos de nitritacin y ANAMMOX convierten secuencialmente el amonio a nitrito y despus a nitrgeno gas. Este proceso es econmicamente favorable ya que puede llevarse a cabo en condiciones de oxgeno limitado adems de no requerir una fuente externa de carbono orgnico, ya que se trata de un proceso completamente auttrofo (Third et al., 2001). Proceso OLAND El proceso OLAND puede ser considerado como una variacin del proceso CANON. La reaccin del amonio y el nitrito en la segunda fase del sistema (ANAMMOX) es estequiomtrica produciendo nicamente nitrgeno gas, mientras que en el proceso CANON, se genera cerca del 11% de nitrato respecto del total de nitrgeno en forma de N-NH4+ (Third et al., 2001) ya que la relacin nitrito:amonio es 1:3.

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Introduccin 1.3.2.5 Reactor Discontinuo Secuencial o SBR (Sequencing Batch Reactor) Este tipo de reactores, ms ampliamente conocidos por sus siglas en ingls, SBR (Sequencing Batch Reactor), se han desarrollado como una variacin del proceso de fango activado. Es un sistema relativamente simple y compacto, ya que el tratamiento completo tiene lugar en un mismo reactor. El proceso consta de varias etapas que se reproducen de manera secuencial y peridica, empleando tiempos que han sido previamente establecidos. Por tratarse de un sistema por fases que ocurren en un mismo reactor, es posible combinar diferentes etapas en funcin de los objetivos de calidad exigidos en el agua efluente. 1.3.2.5.1 Etapas de funcionamiento de un reactor SBR Las etapas de funcionamiento de que consta este sistema son (Metcalf Eddy, 1995; Wilderer et al., 2001): Etapa 1: Llenado Se lleva a cabo la adicin de sustrato (agua residual) al reactor. Esta fase puede constar de 3 sub-fases, que son: Llenado esttico: el sistema completo est en modo no operativo mientras que el agua es admitida en el reactor. Se produce la acumulacin de materia orgnica y nutrientes. Llenado con mezcla: el sistema de homogeneizacin del tanque est operativo durante el proceso de admisin de sustrato. Tiene lugar una mnima actividad aerbica y generalmente se producen reacciones anaerbicas o anxicas. Llenado con aireacin: los sistemas de homogeneizacin y aireacin forzada estn operativos, de modo que tienen lugar reacciones aerbicas y en muchas ocasiones permiten la simultaneidad de condiciones anxicas y aerobias en el interior de los flculos. Las reacciones que tienen lugar durante la etapa de llenado se completan durante la etapa de reaccin.

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Introduccin Etapa 2: Reaccin Tienen lugar los procesos de degradacin de la materia orgnica y de nitrificacin-desnitrificacin. Existen dos sub-fases posibles: Reaccin con mezcla: se lleva a cabo la homogeneizacin sin emplear el sistema de aireacin forzada, lo que da lugar a un mnimo porcentaje de reacciones aerobias y permite que se produzcan las reacciones anxicas y anaerobias. Reaccin con aireacin: permite la completa aireacin del sistema y los procesos de eliminacin de nitrgeno. El grado de interaccin entre las aguas residuales que entran con un nuevo ciclo y la biomasa que permanece en el tanque al finalizar el ciclo previo depende del grado de aireacin y mezcla del sistema. La duracin de este perodo puede ser previamente establecida para caudales de caractersticas fsico-qumicas y biolgicas estables en el tiempo, o se puede modificar en caso de caudales variables. Para ello se establece como parmetro el consumo de oxgeno disuelto, que es un buen indicador del estado de las reacciones biolgicas de degradacin y eliminacin de materia orgnica y nutrientes. Etapa 3: Sedimentacin Permite la separacin de la biomasa y el agua tratada clarificada (sobrenadante). El tiempo est definido, aunque la flexibilidad de este sistema permite variaciones en la duracin de esta etapa en funcin del estado de los flculos y de la velocidad de sedimentacin. Uno de los parmetros empleados para determinar la finalizacin de esta etapa es el volumen alcanzado por los fangos sedimentados. Etapa 4: Vaciado El sobrenadante clarificado es extrado del sistema. La importancia del control de esta etapa radica en evitar que junto con el clarificado sea arrastrado el fango sedimentado. Para ello se emplean sensores que detienen la extraccin en funcin del nivel del manto. Etapa 5: Purga La eliminacin del exceso de fangos permite mantener el tiempo de retencin celular, asegurando que los tiempo de funcionamiento escogidos sean efectivos. Generalmente se lleva a cabo tras el vaciado, eliminando el porcentaje de fangos que puede variar en funcin de las necesidades de la planta.

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Introduccin En lo que respecta al diseo de este tipo de reactores, los parmetros ms importantes a tener en cuenta son: el nmero de ciclos, la duracin y el orden de cada fase, el tiempo de llenado as como la cantidad de agua residual introducida al reactor y el tiempo de retencin celular. Los elementos principales de que consta un sistema de tratamiento de reactor continuo secuencial son los siguientes y vienen esquematizados en la Figura 5: Pretratamiento: se emplea para la eliminacin de gruesos, arenas y grasas. Tanque de retencin: asegura un caudal homogneo de entrada a los reactores. Reactor biolgico: tiene lugar las reacciones de degradacin y eliminacin de materia orgnica y nutrientes. El nmero de reactores vara en funcin de las necesidades de la planta y determina tanto los tiempos de llenado como la duracin de los ciclos. Cmara de cloracin: elimina elementos patgenos del agua tratada. Tanque de retencin: permite homogeneizar el flujo de caudal efluente.
Reactores biolgicos

Tratamiento primario

Tanque de retencin

Purga

Cmara de cloracin

Tanque de retencin

Purga

Purga

()

Purga

Figura 5. Esquema del sistema SBR. Adaptado de Wilderer et al., (2001)

El nmero de reactores depende de los objetivos de calidad a alcanzar en el agua efluente, ya que al incrementar la cantidad de reactores, se mejora la capacidad de respuesta para tratar caudales variables mediante la modificacin en los tiempos de funcionamiento. De este modo se asegura un caudal efluente estable que facilite la operacin de los tratamiento secundarios, as como un volumen de vertido al medio receptor que no sobrepase la capacidad del mismo.

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Introduccin En cuanto a los posibles sistemas de funcionamiento existen 4 grupos en funcin de la periodicidad del caudal y de las etapas empleadas que engloban los principales mtodos de operacin de los reactores SBR: Caudal afluente peridico, una fase de reaccin y una fase de inactividad. Caudal afluente variable, fase de reaccin y sin fase de inactividad (necesidad de tanque de retencin). Caudal afluente peridico, un selector y fases no reactiva y de inactividad. Caudal afluente continuo.

Estos sistemas pueden orientarse para la eliminacin de materia orgnica, compuestos orgnicos y nutrientes (nitrgeno y/o fsforo). En cuanto a la eliminacin biolgica de nitrgeno, la literatura propone diferentes esquemas de proceso, principalmente a travs de variaciones en el orden y la duracin de las etapas, coincidiendo en la necesidad de asegurar la disponibilidad de sustrato durante la fase de desnitrificacin mediante la adicin de fuentes de carbono externas o modificando los parmetros de funcionamiento, como con la sucesin de fases aerbicas/anxicas breves o dividiendo la carga afluente. 1.3.2.5.2 Parmetros de funcionamiento de un reactor SBR A continuacin se indican los principales parmetros a considerar cuando se trabaja con un reactor SBR (Balaguer, 2012): Variables relacionadas con el volumen (Vi) Se define VT como el volumen total de reaccin, es decir, el volumen del reactor despus de la fase de llenado. VS es el volumen que ocupa el fango sedimentado tras la fase de sedimentacin. V0 es el volumen del licor mezcla en el reactor tras la fase de vaciado y previamente a la fase de llenado del siguiente ciclo, compuesto por el volumen que ocupan los fangos decantados ms el volumen ocupado por el clarificado no extrado en la fase de vaciado. VF es el volumen de agua residual que se aade en la fase de llenado de cada ciclo. Variables relacionadas con la duracin de cada ciclo (ti) Se denomina Tc al tiempo de duracin de cada ciclo y ti al tiempo de duracin de la fase i. Se distinguen las fases de llenado (tF), de reaccin (tR), de sedimentacin

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Introduccin (tS), de vaciado (tD) y de reposo (tI), de forma que el tiempo de duracin del ciclo es la suma de los tiempos de duracin de cada fase. T c = ti = t F + t R + t S + t D + t I
Ecuacin 10

Frecuencia del ciclo (n) Es el nmero de ciclos por da. Define adems del tiempo de duracin del ciclo, Tc, y el volumen de llenado de cada ciclo, VF. Donde Q es el caudal de agua residual a tratar en m3/da.

VF =

Q n

//

Tc =

1 n

Ecuacin 11

Ratio de tiempo de llenado (RTLL) Se expresa como el cociente entre el tiempo de llenado (tF) y el tiempo que dura el ciclo (TC).

RTLL =

tF TC

Ecuacin 12

Ratio de intercambio de volumen (RIV) Se calcula como el cociente entre el volumen de agua residual aadida en la fase de llenado (VF) y el volumen total (VT).

RIV =

VF VT

Ecuacin 13

Tiempo de retencin hidrulico (TRH) Se define como el cociente entre volumen total de reaccin y el caudal a tratar.

TRH =

VT Q

Ecuacin 14

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Introduccin Adems tambin puede expresarse en funcin de TC:

TRH =

VT (VO + VF ) VO = = 1 + V Q m VF F

TC

Ecuacin 15

Tiempo de retencin celular Se trata del tiempo necesario para que los microorganismos puedan desarrollarse y determina el tiempo en el que el fango es extrado del reactor. Se calcula como la masa de fango contenida en el reactor, MX, dividido por el caudal purga de los mismos, PXT.

TRC =

MX t reaccin PXT

Ecuacin 16

Donde:

M X = Vreactor C SST reactor

PXT = Q purga C SST purga
Carga msica Representa la relacin entre la demanda bioqumica de oxgeno que llega al tratamiento biolgico con la masa de fangos del reactor dando idea de la relacin entre el alimento y los microorganismos presentes en el reactor. 1.3.2.5.3 Ventajas e inconvenientes del sistema SBR En cuanto a los inconvenientes y las ventajas podemos destacar los siguientes (EPA, 1999): Inconvenientes En comparacin con los sistemas convencionales, se requiere un nivel mayor de sofisticacin de las unidades de programacin temporal y controles, especialmente en sistemas de mayor tamao. Esto requiere un nivel de conocimientos elevado para su mantenimiento. Existe el riesgo potencial de arrastre de lodos flotantes o sedimentados durante la fase de descarga del reactor en algunas configuraciones de SBR.

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Introduccin La sedimentacin en el propio tanque puede provocar el taponamiento de los dispositivos de aireacin durante ciclos operativos especficos, dependiendo del sistema de aireacin utilizado por el fabricante. Ventajas Las etapas tiene lugar en un nico reactor. Elevada capacidad para la retencin de biomasa, que mejora los procesos en los que intervienen organismos auttrofos. Tiene una gran flexibilidad de operacin y de control. Versatilidad para trabajar con fluctuaciones de caudal y de concentracin de materia orgnica. Ahorro potencial de inversin de capital por la eliminacin de sedimentadores y otros equipos y por las menores necesidades de espacio. Mejor control del crecimiento de organismos filamentosos y de problemas de decantacin. Menor tiempo de control requerido. Fcil reconocimiento y correccin de los problemas de decantacin. Es necesaria la homogenizacin de caudales en funcin de los procesos utilizados aguas abajo.

Este sistema se emplea habitualmente para tratar caudales de pequeo volumen y de carcter intermitente, y se emplean tanto para vertidos industriales como municipales gracias a sus ventajas en la flexibilidad operacional (EPA, 1999). Sin embargo, a pesar de sus importantes ventajas, por tratarse de un mtodo biolgico de tratamiento est sometido a una serie de factores que pueden afectar la evolucin del proceso de depuracin. Una vez repasados algunos de los principales sistemas de tratamiento de aguas residuales, a continuacin se describen los microorganismos que intervienen en los procesos biolgicos de eliminacin de materia orgnica y nutrientes as como las diversas tcnicas empleadas para su deteccin y cuantificacin. 1.3.2.6 Microorganismos implicados en los sistemas de eliminacin Existen numerosos estudios que profundizan en la microbiologa de los procesos de nitrificacin-desnitrificacin (Wagner et al., 1996) y de eliminacin de fsforo (Mino et al., 1998) ya que se trata de los dos contaminantes principales en las

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Introduccin aguas residuales. Sin embargo, el siguiente apartado se centrar en aquellos microorganismos encargados de los procesos de eliminacin de nitrgeno. Como se ha comentado anteriormente, hay dos grupos de bacterias filogenticamente distintos que en conjunto realizan el proceso de nitrificacin. Las bacterias amonioxidantes (AOB) y las bacterias nitritoxidantes (NOB). El proceso final de eliminacin de nitrgeno es llevado a cabo por bacterias desnitrificantes, acerca de las cuales los conocimientos existentes no son tan profundos como en el caso de las AOB y NOB. En las Figuras 6 y 7 se presentan los rboles filogenticos de los microorganismos amonioxidantes y nitritoxidantes hasta ahora conocidos.

Figura 6. rbol filogentico hasta ahora conocido de los organismos amonioxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Las lneas filogenticos asociadas a sistemas de aguas residuales estn indicadas mediante flechas.

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Introduccin

Figura 7. rbol filogentico hasta ahora conocido de los organismos nitritoxidantes basado en la secuencia 16S rRNA (Seviour y Nielsen, 2010). Las lneas filogenticos asociadas a sistemas de aguas residuales estn indicadas mediante flechas.

El desconocimiento acerca de las bacterias desnitrificantes se debe a que pertenecen a muy distintos gneros (Metcalf y Eddy, 1995) y a que los estudios de identificacin que se han llevado a cabo mediante mtodos de aislamiento y cultivo no representan el total de bacterias desnitrificantes que intervienen en los procesos biolgicos de una estacin depuradora (Thomsen et al., 2007). A continuacin se describen los grupos de microorganismos que intervienen de manera ms relevante en la depuracin de las aguas residuales y las tcnicas empleadas para su identificacin. 1.3.2.6.1 Clasificacin y caractersticas de las bacterias Los microorganismos responsables de la nitrificacin biolgica se pueden dividir en dos grupos, los nitrificantes auttrofos y los nitrificantes hetertrofos. Esta clasificacin se basa en el modo de obtener energa para el crecimiento.

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Introduccin
Tabla 7. Clasificacin de bacterias amonioxidantes y nitritoxidantes
CLASE ORDEN FAMILIA GNERO ESPECIE
N. aestuarii N. communis N. europaea N. eutropha N. halophila N. marina N. nitrosa N. oligotropha N. ureae N. briensis N. multiformis N. tenuis N. multiformis

Nitrosomonas

proteobacteria PHYLUM: Proteobacteria

Nitrosomonadales

Nitrosomonadaceae Nitrosospira Nitrosolobus Nitrosovibrio

DOMINIO: Eubacteria

Chromatiaceae proteobacteria Chromatiales Ctothiorhodospiraceae

Nitrosococcus

N. oceani N. halophilus N. nitrous N. mobilis

Nitrococcus

proteobacteria

Rhizobiales

Bradyrhizobiaceae

Nitrobacter

proteobacteria PHYLUM: Nitrospirae

Desulfobacterales

Noctuoidea

Nitrospina

N. gracilis

Nitrospira

Nitrospirales

Nitrospiraceae

Nitrospira

N. marina N. moscoviensis

Fuente: Jimnez (2010)

Los gneros que dominan los diferentes sistemas de tratamientos de aguas residuales (Tabla 7) pertenecen al phylum Proteobacteria, y entre ellos destacan: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosovibrio y Nitrosolobus, que participan en la primera etapa de la nitrificacin. La segunda fase la llevan a cabo las bacterias del gnero Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospira y Nitrospina (Wagner et al., 1995; Brock, 2003; Rodrguez y Peuela, 2009, Avendao et al., 2010). Todos los miembros de estos dos grupos son bacterias gram-negativas quimioauttrofas, es decir, utilizan compuestos qumicos inorgnicos como fuente de electrones para la inmovilizacin de carbono inorgnico. Los microorganismos quimioauttrofos, por lo general, son aerobios (emplean oxgeno como aceptor final de electrones). La Tabla 8 presenta las caractersticas de los principales gneros de bacterias amonioxidantes y nitritoxidantes.

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NITRITOXIDANTES

N. alkalicus N. hamburgensis N. vulgaris N. winogradskyi

AMONIOXIDANTES

Introduccin
Tabla 8. Caractersticas de las bacterias nitrificantes Caractersticas Oxidan amonio Gram-negativas, bacilos cortos o largos, mviles por flagelo polar o inmviles, sistemas de membrana perifricos Cocos grandes mviles, sistemas de membrana vesicular o perifrico Espirales mviles por flagelos peritricos, ningn sistema de membrana aparentes Pleomrficas lobuladas, clulas compartimentadas, mviles por flagelo peritricos Bacilos incurvados Oxidan nitrito Bacilos cortos, se reproducen por gemacin, a veces mviles por flagelo terminal nico o no mviles, sistema de membrana organizada como un casquete polar Bacilos largos inmviles y sin sistema de membrana aparente Cocos grandes, mviles por uno o dos flagelos terminales y sistemas de membrana distribuidos aleatoriamente en tubos Clulas en forma de helicoidal a vibrioide, inmviles, sin membranas internas
Fuente: Brock (2003)

Gnero

Grupo

Hbitats

Nitrosomonas

Beta

Aguas residuales, agua dulce, agua marina y suelos Agua dulce, agua marina y suelos Suelo

Nitrosococcus Nitrosospira

Gamma Beta

Nitrosolobus Nitrosovibrio

Beta ---

Suelo Suelo

Nitrobacter

Alpha

Suelo, agua dulce y agua marina

Nitrospina

Delta

Agua marina

Nitrococcus

Gamma

Agua marina

Nitrospira

Grupo Nitrospirae

Agua marina y suelo

Respecto a las bacterias desnitrificantes, existe una gran variedad taxonmica (Metcalf y Eddy, 1995; Pars y Jurez, 1997). Pueden ser aerobias auttrofas o hetertrofas y pertenecer a distintos gneros, entre los que se pueden destacar: Auttrofas: Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, Agrobacterium Quimiolitrtofos: Thiobacillus, Thiomicrospira, Nitrosomas Diaztrofos: Rhizobium, Azospirillum Fottrofos: Rhodopseudomonas Arqueobacterias: Halobacterium

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Introduccin Hetertrofas: Achromobacter, Aerobacter, Alcalibacter, Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Flavobacterium, Lactobacillus, Micrococcus, Proteus, Pseudomonas y Spirillum. La variedad de tipos de bacterias capaces de llevar a cabo el proceso de desnitrificacin permite que bajo diferentes circunstancias (modificaciones de OD, pH, temperatura, fuente de carbono, etc.) pueda tener lugar este proceso. Sin embargo, los conocimientos acerca de las bacterias que tienen un papel ms relevante en el proceso de desnitrificacin son escasos. De entre los gneros de bacterias desnitrificantes que se consideran de mayor inters en estaciones depuradoras destacan Azoarcus y Aquaspirillum (Thomsen et al., 2007), Thauera y Zoogloea (Juretschko et al., 2002; Thomsen et al., 2007) y Rhodocyclus (Thomsen et al., 2007), pertenecientes al phylum Betaproteobacteria. Los resultados de estos estudios se obtuvieron a partir de muestras procedentes de plantas de tratamiento de aguas residuales de diferentes orgenes, con diseos y sistemas de operacin diversos. Este hecho sugiere la posibilidad de que las bacterias desnitrificantes, gracias a su capacidad para desarrollarse ocupando nichos ecolgicos diferentes en funcin de la fuente de carbono, sean capaces de colonizar ambientes muy diversos pudiendo llevar a cabo su funcin desnitrificante (Thomsen et al., 2007). 1.3.2.6.2 Tcnicas de caracterizacin y cuantificacin Actualmente las tcnicas utilizadas para la deteccin y cuantificacin de la diversidad microbiana se dividen en tcnicas convencionales de cultivo, tcnicas inmunolgicas y tcnicas moleculares basadas en el ADN. A continuacin se citan algunas de las ms empleadas en la identificacin y cuantificacin de poblaciones de microorganismos en sistemas de depuracin de aguas (Seviour y Nielsen, 2010). Mtodos convencionales Corresponden a tcnicas de cultivo convencional y no convencional, anlisis microscpico y Nmero Ms Probable (NMP). Microscopa ptica: que puede ser de contraste de fases, de interferencia, de campo oscuro, de fluorescencia y de luz ultravioleta. Se emplea a nivel de laboratorio en las estaciones depuradoras y

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Introduccin aunque en su mayora no permite realizar la identificacin de bacterias, aporta informacin valiosa acerca del estado del fango. Tincin bacteriana: que permite la diferenciacin celular y la identificacin a grandes rasgos. Son muchas las clases de tinciones disponibles, sin embargo nicamente se emplean determinados tipos en los sistemas de fangos activados (Jenkins et al., 2004), siendo la tincin GRAM unas de las ms extendidas. Tambin es posible llevar a cabo la determinacin de la viabilidad bacteriana in situ mediante kits, cuya metodologa se basa en las diferencias en la permeabilidad de la membrana celular bacteriana (Seviour y Nielsen, 2010). Tcnica del nmero ms probable (NMP) y sembrado selectivo de placas (Matulewich et al., 1975): es uno de los mtodos ms extendidos para la deteccin y cuantificacin de bacterias en sistemas complejos. Sin embargo, estas tcnicas requieren mucho tiempo y a menudo subestiman el nmero de bacterias ya que aslan los microorganismos de acuerdo a sus necesidades nutricionales, lo que da lugar a sesgos al favorecer el crecimiento de determinadas especies frente a otras. Estos procedimientos son lentos y laboriosos puesto que se tiene que aislar el microorganismo (lo cual no en todos los casos es posible) y permitir su desarrollo en un medio de cultivo hasta que alcance un tamao o una etapa de crecimiento adecuados para su identificacin. Adems de que en muchos casos no es posible llevar a cabo la determinacin de los tipos de bacterias presentes en una muestra de manera precisa. Por este motivo se han desarrollado otros mtodos que permiten la identificacin in situ y la cuantificacin. Se basan en la especificidad de los anticuerpos y en las secuencias de cidos nucleicos, son las llamadas tcnicas inmunolgicas y tcnicas moleculares. Mtodos inmunolgicos Se han desarrollado tcnicas inmunolgicas de identificacin y cuantificacin que consisten en el uso de anticuerpos marcados con fluorescencia. Este mtodo es de alta sensibilidad e incluso puede identificar serotipos especficos. Las clulas objetivo tienen que ser aisladas primero como cultivos puros y

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Introduccin los anticuerpos producidos a menudo slo reconocen unas pocas cepas de una especie determinada. Posteriormente se desarrollaron los anticuerpos para la deteccin de enzimas de amonioxidantes y nitritoxidantes que solucionan los problemas de los anticuerpos que nicamente reconocen eptopos de la pared celular (Aamand et al., 1996). Estos nuevos anticuerpos se usaron con xito en la deteccin de bacterias AOB y NOB en muestras ambientales (Bartosch et al., 1999; Fiencke y Bock, 2004), as como en estudios fisiolgicos de enzima clave (Pinck et al., 2001). Sin embargo, se trata de un mtodo de elevado coste, destructivo, no permite la visualizacin de la clula y nicamente permite detectar clulas individuales en suspensin. Otras metodologas que permiten tanto la identificacin como la cuantificacin de bacterias son los mtodos moleculares basados en ADN y ARN. Mtodos moleculares basados en ADN y ARN Los mtodos moleculares de identificacin de microorganismos se basan en el estudio de las molculas de ADN y ARN mediante tcnicas basadas en la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (RCP o PCR, por sus siglas en ingls) y en la hibridacin de ADN. La PCR permite obtener un elevado nmero de copias del fragmento a amplificar a partir de una pequea concentracin de ADN, prescindiendo del cultivo de los microorganismos. Mediante esta tcnica, es posible realizar el anlisis de ciertas regiones de los genes 16S, 23S y 5S del ADN recombinante, usando cebadores que reconocen la secuencia nucleotdica de las regiones especficas. Generalmente se emplea el nucletido 16S rARN (Degrange y Bardin, 1995; McCaig et al., 1999), ya que contiene zonas que son comunes para microorganismos filogenticamente semejantes y se trata de un gen relativamente corto, de aproximadamente 1500pb (Holzer, 2007; Fukushima y Bond, 2010). Dentro de las tcnicas de hibridacin mas utilizadas podemos destacar la tcnica de los Fragmentos de Restriccin de Longitud Polimrfica (RFLPs) (RodrguezHerrera et al., 2009). Consiste en extraer ADN de un cultivo puro de un microorganismo o bien de una muestra y digerir el ADN con enzimas de restriccin (enzimas que cortan el ADN en sitios especficos). Posteriormente estos fragmentos de ADN son separados en un gel de agarosa utilizando electroforesis. Esta metodologa es muy especfica, sin embargo, no es muy rpida ni muy sensible (se requiere 103 a 106 copias de la molcula o secuencia de inters para dar un resultado

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Introduccin fiable) y se considera como un mtodo semi-cuantitativo para el anlisis de la diversidad y la dinmica de ecosistemas microbianos. Otra tcnica que se emplea en el campo de la cuantificacin e identificacin es la Citometra de Flujo. Consiste en medir las caractersticas de dispersin de la luz y la fluorescencia que poseen las clulas conforme se las hace pasar a travs de un rayo de luz. Al atravesar el rayo, las clulas interaccionan con ste causando la dispersin de la luz. Basndose en la difraccin se puede evaluar el tamao de las clulas que pasan (parmetro Forward Scatter) y al medir la reflexin de la luz de manera lateral se evala la granularidad o complejidad de stas (parmetro Side Scatter). Adems de la dispersin de la luz, si previamente a su anlisis las clulas se sitan en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con molculas fluorescentes, se puede evaluar que clulas poseen los antgenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados, permitiendo el anlisis multiparamtrico. Por tanto, esta tcnica permite combinar las medidas de distintos parmetros determinados sobre la misma clula y relacionarlos. Sin embargo, una de sus ms importantes desventajas es que las clulas deben encontrarse individualmente en suspensin en un fluido. Junto con las tcnicas citadas hasta ahora, existen otras metodologas como el estudio de comunidades y su funcionalidad mediante Chips de ADN (del ingls DNA microarray), que consiste en una superficie slida a la cual se une una coleccin de fragmentos de ADN. Su funcionamiento se basa en la medicin del nivel de hibridacin entre la sonda especfica y la molcula diana, indicndose generalmente mediante fluorescencia y analizndose por anlisis de imagen. La Microautoradiografa (MAR) es una tcnica que se emplea para ensayos de viabilidad, cuantificacin de bacterias capaces de consumir un sustrato especfico, estudios de actividad auttrofa, toma de ortofosfatos y el uso potencial de diversos aceptores de electrones por PAO, GAO (Organismos Acumuladores de Glicgeno) y bacterias filamentosas. Consiste en la visualizacin mediante una emulsin sensible a la radiacin de un sustrato radiomarcado que es consumido por clulas individuales (Seviour y Nielsen, 2010). Esta tcnica suele emplearse en combinacin con el mtodo FISH (Fluorescente in situ hybridization), que se desarrolla a continuacin en el siguiente apartado. 1.3.2.6.3 Tcnica de hibridacin in situ (FISH) La tcnica FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) es una metodologa citogentica utilizada para detectar y localizar la presencia o ausencia de

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Introduccin determinadas secuencias de ADN o ARN. Mediante el anlisis FISH podemos identificar in situ bacterias que pertenecen a un grupo taxonmico especfico (clase, gnero, especie, etc.). Esta tcnica utiliza sondas de ADN marcadas con un agente de color fluorescente (fluorocromo), que se unen a la fraccin 16S del rARN de la bacteria, generando una fluorescencia en las bacterias con la fraccin de rARN coincidente (Amann et al., 1990). Se basa en la aplicacin de los procesos de hibridacin que se producen entre secuencias complementarias de material gentico. La doble hlice de ADN se desnaturaliza mediante la aplicacin de una elevada temperatura y al disminuir la temperatura, las hebras se vuelven a unir por sus bases complementarias. Una secuencia de ADN se puede unir a otra de ADN o tambin a una secuencia de ARN complementaria, producindose un hbrido ADN-ADN, o ADNARN. De este modo, una secuencia de ADN o de ARN de cadena simple que es complementaria de la secuencia de inters (tambin llamadas sondas), puede utilizarse para identificar con gran exactitud la presencia de la secuencia en preparaciones de ADN, ARN. La sonda debe ser lo suficientemente grande como para hibridar especficamente con su objetivo, pero no tan grande como para impedir el proceso de hibridacin. Para que una sonda sea especfica, debe hibridar con su diana, pero no con las otras cadenas de cidos nucleicos presentes en la muestra. La especificidad vara con la extensin de la cadena y las condiciones de hibridacin, por lo que es posible ajustarla a diferentes niveles filogenticos. La tcnica FISH permite verificar la existencia de una especie determinada de bacteria en una muestra compleja. Si disponemos de la sonda especfica, es posible identificar la presencia de una bacteria determinada, conocida como bacteria diana. La diana es la cadena de ARN o ADN que se puede detectar utilizando la sonda. Estas secuencias pueden localizarse en cromosomas, en plsmidos, en mitocondrias y en ribosomas. Ciertas regiones de los ribosomas se encuentran en todos los seres vivos, otras son comunes a todas las bacterias, y unas pocas se hallan en los miembros del mismo gnero o especie, lo que permite utilizar la estructura ribosmica para determinar la taxonoma bacteriana. En las tcnicas de hibridacin in situ, el ADN de la clula puede ser teido de forma independiente del marcaje de la sonda especfica. Esto se conoce como contratincin y tie la cantidad total de bacterias presentes en la muestra. De esta forma, podemos saber la cantidad de bacterias hibridadas respecto a la cantidad total de bacterias. El compuesto ms utilizado es el DAPI (diclorhidrato de 4',6-diamidino-2fenilindol), que emite fluorescencia en azul cuando es excitado por luz ultravioleta.

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Introduccin En cuanto a las sondas, se suelen emplear secuencias de ADN y no de ARN ya que las primeras son ms resistentes a la degradacin por nucleasas. Las sondas son marcadas con fluorocromos como el FITC, rodamina, CY-3, CY-5, que emiten fluorescencia bajo las condiciones apropiadas de excitacin, haciendo posible su visualizacin mediante un microscopio de fluorescencia.

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OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

Objetivos y Plan de Trabajo

El objetivo principal de este trabajo de investigacin es el estudio de la evolucin de las poblaciones microbianas en los procesos de eliminacin biolgica de materia orgnica y nitrgeno amoniacal presentes en el agua residual bajo condiciones ambientales estables y variables. Para alcanzar este objetivo principal se plantean los siguientes objetivos especficos: Montaje, puesta en marcha, mantenimiento y monitorizacin de un reactor discontinuo (SBR) operado para la eliminacin biolgica de materia orgnica y nitrgeno amoniacal de una corriente de agua residual con concentracin tpica urbana. Estudio de la influencia del oxgeno y el pH sobre la actividad y el desarrollo de los microorganismos involucrados en los procesos de nitrificacin-desnitrificacin. Seguimiento de la evolucin de los microorganismos implicados en los procesos de eliminacin de materia orgnica y nitrgeno amoniacal mediante la aplicacin de la tcnica molecular de hibridacin in situ FISH. Para alcanzar los objetivos planteados en este trabajo de investigacin se ha llevado acabo el plan de trabajo que se describe a continuacin: 1. Diseo, montaje y puesta en marcha del reactor. Operacin y seguimiento mediante los dispositivos de control y medicin, para unas condiciones de pH y OD fijadas. 2. Mantenimiento del sistema: preparacin de alimento artificial,

calibracin de sondas y tareas de limpieza. 3. Realizacin de analticas fsico-qumicas de los parmetros necesarios para el seguimiento de los procesos biolgicos. 4. Aplicacin de la tcnica FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) para el seguimiento de la evolucin de las poblaciones microbianas.

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MATERIALES Y MTODOS

Materiales y Mtodos

3.1 Descripcin del montaje experimental

Los datos experimentales para el estudio del proceso se obtuvieron mediante el montaje de un reactor secuencial discontinuo (SBR, Sequencing Batch Reactor) a escala de laboratorio. Para ello se emple un reactor cilndrico de metacrilato de dimetro 30 cm y altura 35 cm con un volumen til de 7 L. En la Figura 8 se muestra el montaje experimental.

Figura 8. Fotografa del montaje experimental

En la Figura 9 puede observarse el esquema del montaje experimental. La lnea azul corresponde a los dispositivos que realizaban la toma de datos y la lnea negra indica los elementos que intervenan en el funcionamiento del sistema y que estaban dirigidos por el software de control implementado en el ordenador. La monitorizacin del sistema se realiz en tiempo real mediante sondas de pH, conductividad, potencial redox, temperatura y oxgeno disuelto (OD). La informacin de todas las sondas, excepto la sonda de OD, era transmitida al ordenador a travs de un analizador multiparamtrico (marca Consort C832). El oxgeno era medido y transmitido por un oxmetro (marca Oxi 340 WTW) y supervisado desde el ordenador mediante un sistema de control on-off que mantena la concentracin de OD en niveles previamente establecidos.

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Materiales y Mtodos

Dosificadores Agitador mecnico Oxmetro

Amonio Actico

Electrovlvula

Electrovlvula

Registro de datos Control del proceso

Sensor de nivel Sondas: Amarilla: pH Roja: Redox Negra: Conductividad Gris: temperatura

Agua residual Rebose efluente. Purga Aireacin

Agua residual afluente

Bao termosttico

Figura 9. Esquema del montaje experimental

Los registros de las variables monitorizadas eran almacenados cada 30 segundos para su anlisis posterior. Por otro lado, el llenado y vaciado estaban controlados por el software del ordenador mediante electrovlvulas, bomba peristltica y sensores de nivel. Una electrovlvula permita la entrada del agua residual en el reactor mediante la accin de una bomba peristltica. La salida del agua clarificada estaba controlada por la accin de la electrovlvula ubicada en la conduccin de la corriente efluente. Con el objetivo de evitar el desbordamiento en caso de fallo del sensor de nivel se instal una conduccin de salida en el extremo superior del reactor. El control del tiempo de retencin celular estaba automatizado mediante la programacin de los tiempos de apertura y cierre de la electrovlvula. En cuanto a la aireacin, se llevaba a cabo mediante una soplante que suministraba el aire por una conduccin central a 4 difusores de piedra porosa situados en la parte inferior del reactor. Un sistema de control on-off regido por el ordenador se encargaba de mantener el oxgeno en la etapa de reaccin aerobia en un intervalo de concentracin determinado. La fuente de materia orgnica escogida fue cido actico (CH3-COOH) ya que se trata del cido graso voltil dominante en los sistemas de aguas residuales (Henze

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Materiales y Mtodos

et al., 1994; Raunkjr et al., 1995; Buchauer, 1997, Constantine y Fick, 1997; Bernat y Wojnowska-Barya, 2007; Khanitchaidecha, et al., 2010) y como fuente de nitrgeno amoniacal se empleaba cloruro amnico (NH4Cl). La dosificacin se llevaba a cabo tras la etapa de llenado mediante dos dosificadores de alta precisin (marca Liquino 711 Metrohm). La homogeneizacin del licor mezcla se realizaba con un agitador mecnico (marca Heidolph de 50 Hz y 35-2800 rpm). La velocidad de giro estaba controlada por un regulador de potencia con el objetivo de minimizar la reaireacin del reactor. La temperatura en el reactor se mantuvo a 20C y estuvo controlada mediante la recirculacin de agua procedente de un bao termosttico (marca Haake).

3.2 Procedimiento experimental

El procedimiento experimental est esquematizado en la Figura 10.

Seleccin de los parmetros de operacin

Puesta en marcha del reactor

Operacin y seguimiento del proceso

Figura 10. Esquema del procedimiento experimental

En primer lugar se llev a cabo la seleccin de los parmetros de operacin, establecindose los criterios de funcionamiento. En segundo lugar se procedi a la puesta en marcha del reactor. Y por ltimo durante la fase de operacin y seguimiento se control el funcionamiento del sistema mediante la revisin diaria de los valores aportados por las sondas de monitorizacin. Las tareas de mantenimiento y limpieza del reactor y los aireadores as como la calibracin de las sondas y los dosificadores se realizaron una vez por semana.

3.2.1 Parmetros de operacin 3.2.1.1 Seleccin del inculo y caractersticas del agua residual
El inculo se obtuvo de la EDAR Conca del Carraixet, localizada en Alboraia (Valencia). El esquema de tratamiento de esta planta se basa en la eliminacin de

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Materiales y Mtodos

materia orgnica y nutrientes mediante un sistema de fangos activados con decantacin primaria y secundaria. El agua residual empleada, cuya composicin se presenta en la Tabla 9, se formul para que simulase las principales caractersticas de una corriente de agua residual urbana (Metcalf and Eddy Inc, 1995). La fuente de carbono se obtuvo a partir de una disolucin concentrada (70000 mg DQO/L) de cido actico (CH3COOH) y el nitrgeno amoniacal se obtuvo a partir de una disolucin concentrada (21000 mg N/L) de cloruro de amonio (NH4Cl). El volumen adicionado de cido actico y nitrgeno amoniacal al inicio de cada etapa de reaccin permiti alcanzar en el licor mezcla una concentracin de 210 mg DQO/L y 30 mg N/L, respectivamente.
Tabla 9. Componentes principales en el agua residual. Compuestos CaCl2 K2HPO4 MgSO47H2O NaHCO3 FeCl3.6H2O CuSO4.5H2O Na2MoO4.2H2O ZnSO4.H2O MnCl2.4H2O H3BO3 CoCl2.6H2O KI Concentracin (mg/L) 2.50 14.00 50.70 671.56 0.029 0.060 0.120 0.240 0.240 0.300 0.300 1.274

Con

el

objetivo

de

evitar

reacciones

bioqumicas

en

el

bidn

de

almacenamiento del agua residual, tanto la materia orgnica como el nitrgeno amoniacal se almacenaban y dosificaban de forma independiente.

3.2.1.2 Etapas de operacin del reactor

Las etapas de operacin del reactor se establecieron para un total de 4 ciclos diarios con una duracin de 6 horas/ciclo completo. La representacin esquemtica puede observarse en la Figura 11.

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Materiales y Mtodos

Afluente

Etapa Llenado 6 minutos Efluente

Etapa Vaciado 6 minutos

Ciclo 6 horas

Etapa Anxica 105 minutos

Etapa Decantacin 33 minutos

Etapa Aerobia 210 minutos

Figura 11. Secuencia y duracin de las 5 etapas de trabajo del reactor SBR

El inicio del ciclo tena lugar durante la etapa de llenado. Se trabaj mediante un sistema de llenado con mezcla segn el cual el reactor se llenaba con el agua residual a tratar mediante un bombeo uniforme mientras que el sistema de agitacin aseguraba una buena homogeneizacin con el fin de establecer un ptimo contacto entre los microorganismos y el sustrato existente. El tiempo establecido para realizar esta etapa fue de 6 minutos, asegurando que se alcanzase el volumen til del reactor (7 litros). A continuacin tena lugar la etapa de reaccin con una duracin total de 315 minutos. Esta etapa estaba compuesta por dos fases: la fase anxica que tena una duracin total de 105 minutos y en la que el sistema de aireacin estaba desactivado y se mantena la homogenizacin del licor mezcla, y la fase aerobia en la que la aireacin entraba en funcionamiento. Del tiempo total de reaccin, un 35% correspondi a la etapa anxica y un 65% a la etapa aerobia.

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Materiales y Mtodos

A continuacin comenzaba la etapa de decantacin, cuya duracin se estableci en 33 minutos, y finalmente la etapa de vaciado del agua clarificada durante 6 minutos.

3.2.1.3 Parmetros de funcionamiento

Para la realizacin de los clculos de los parmetros de funcionamiento se fijaron el tiempo de retencin hidrulico (TRH) y el tiempo de retencin celular (TRC): Tiempo de retencin hidrulico: se estableci en 18 horas. Tiempo de retencin celular: se estableci en 14 das para asegurar el proceso de nitrificacin teniendo en cuenta que la temperatura de trabajo fue de 20C (Gerardi, 2002).
Tabla 10. Temperatura y TRC sugerido para la nitrificacin Temperatura 10 C 15 C 20 C 25 C 30 C
Fuente: Gerardi (2002)

Tiempo de retencin celular 30 das 20 das 15 das 10 das 7 das

Los clculos realizados fueron los siguientes: Caudal purga A partir del tiempo de retencin celular se determin el caudal purga:

TRC =

V reactor C SST reactor Q purga C SSTpurga

t reaccin =

V reactor t reaccin Q purga

Ecuacin 17

Donde: CSST reactor= Concentracin de slidos suspendidos totales en el reactor SBR Qpurga= Caudal de purga CSST purga= Concentracin de slidos suspendidos totales en la purga Y puesto que la concentracin de slidos suspendidos en el reactor y en el caudal de purga son iguales ya que la purga se realiza cuando el sistema est

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Materiales y Mtodos

homogeneizado minutos antes de la finalizacin de la etapa de reaccin, la aplicacin de la ecuacin resulta en:

14 das =

1.75horas tanxico + 3.5 horas taerobio 4ciclos / da 7L Q purga 24horas

Qpurga = 0.4375 L/da = 0.1094 L/ciclo

Determinacin del caudal afluente A partir del valor del tiempo de retencin hidrulico se determin el caudal afluente diario, teniendo en cuenta el tiempo real de reaccin en el que los microorganismos realizan el proceso nitrificacin-desnitrificacin (etapa aerobia y etapa anxica). En base a esta premisa y a partir de la ecuacin 18, el caudal afluente obtenido fue el siguiente.

TRH =

Vreactor t reaccin Q Afluente

Ecuacin 18

Q Afluente =

7L 18 horas 1d 24 horas

(1.75horas

t anxico

+ 3.5 horas taerobio 4 ciclos / d 24horas

= 8 L/d

3.2.2 Puesta en marcha del reactor

Una vez establecidos los parmetros de operacin y realizado el montaje se puso en funcionamiento el reactor. En los das posteriores a la puesta en marcha se control el proceso para asegurar que funcionase correctamente. Para ello se llevaron a cabo analticas de amonio, nitrito y nitrato que permitieron confirmar el desarrollo de los procesos de nitrificacin y desnitrificacin y la idoneidad del agua residual formulada as como de la materia orgnica empleada.

3.2.3 Operacin y seguimiento del proceso

A continuacin se describen los procedimientos empleados para las determinaciones fsico-qumicas y microbianas llevadas a cabo para el seguimiento del funcionamiento reactor y de la evolucin de las poblaciones bacterianas.

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Materiales y Mtodos

3.2.3.1 Analticas fsico-qumicas

Los parmetros estudiados y la frecuencia en la toma de muestras y anlisis se presentan en la Tabla 11.
Tabla 11. Frecuencia de muestreo y anlisis de los parmetros fsico-qumicos. Parmetro Slidos suspendidos totales (SST) Slidos suspendidos voltiles (SSV) DQO (cido actico) Alcalinidad Fsforo Amonio Nitrito Nitrato 2 3 veces por semana Frecuencia 1 vez por semana

Las determinaciones analticas se llevaron a cabo empleando las tcnicas que se describen a continuacin. 3.2.3.1.1 Slidos suspendidos totales y slidos suspendidos voltiles Las concentraciones de slidos suspendidos totales y voltiles se obtuvieron siguiendo la metodologa del Standard Methods for the examination of water & wastewater (APHA, AWWA & WEF, 2005): 1. Se toma una cpsula de porcelana a temperatura ambiente del desecador y se pesa en la balanza analtica junto con un filtro de tamao de poro 0.45m. (P1) 2. Se obtiene un volumen del licor mezcla que se pasa a travs del filtro. Para agilizar el proceso de filtracin se emplea una bomba de vaco. 3. El filtro con los slidos retenidos se coloca en la cpsula de porcelana y se introduce en estufa a una temperatura de 105C hasta alcanzar peso constante (eliminacin total de la humedad). 4. Tras enfriarse en el desecador, se pesa el conjunto filtro ms slidos retenidos. (P2) 5. A continuacin, se coloca en la mufla a 550C durante 1 hora. 6. Una vez transcurrida 1 hora, se extrae la cpsula y se aade carbonato amnico (CH5NO3) hasta cubrir totalmente el filtro.

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Materiales y Mtodos

7. Se introduce de nuevo en la estufa a 105 C durante 1 hora. 8. Finalmente, la cpsula con la muestra calcinada se pasa a un desecador y una vez a temperatura ambiente, se obtiene un nuevo peso. (P3) El valor de los slidos suspendidos totales se obtiene mediante la siguiente frmula:

SST =

P2 P 1 Volumenmuestra

Ecuacin 19

Los slidos restantes tras el proceso de calcinacin corresponden a los slidos suspendidos no voltiles (ecuacin 20) y la diferencia entre estos y los slidos totales da como resultado los slidos suspendidos voltiles.

SSNV =

P3 P1 Volumen muestra

Ecuacin 20

3.2.3.1.2 cido actico y alcalinidad El equipo empleado para llevar a cabo este anlisis fue un titrador marca 716 DMS Titrino de la firma comercial Metrohm. Este dispositivo emplea el mtodo de valoracin cido-base propuesto por Moosbrugger et al., (1992, 1993) para la determinacin de los siguientes parmetros: Sa: cidos grasos voltiles considerados como cido actico (mg/L) CT: concentracin total de carbonato: [H2CO3] + [HCO3] + [CO32] (mol/L) El mtodo consiste en la realizacin de una valoracin mediante un cido, en este caso cido clorhdrico (HCl) 0.1N, hasta alcanzar los puntos de pH seleccionados, que son: 6.7, 5.9, 5.2 y 4.3. Una vez se dispone de los volmenes de cido que han sido necesarios para alcanzar los valores de pH, es posible examinar la influencia de concentraciones conocidas de otros cidos y bases (adems del carbonato y los cidos voltiles). Para ello, se introducen los siguientes parmetros en un software desarrollado por el grupo de trabajo denominado VALORA:

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Materiales y Mtodos

Temperatura, (C) Conductividad, (mS/m) pH inicial Volmenes empleados de cido, (mL) Concentracin de amonio, (mg/L) Concentracin de fosfato inorgnico, (mg/L) Concentracin de sulfuro, (mg/L)

Adems del anlisis de los cidos grasos voltiles, este procedimiento permite la determinacin de la alcalinidad asociada al carbonato, que viene expresada como carbonato de calcio (CaCO3). 3.2.3.1.3 Amonio, nitrito, nitrato y fsforo Las concentraciones de amonio (NH4+), nitrito (NO2-), nitrato (NO3-) y ortofosfato (PO43-) fueron determinadas mediante la utilizacin de un analizador multiparmetro selectivo espectrofotomtrico, SmartchemTM200 de la casa Metrohm. Este analizador se basa en mtodos colorimtricos siguiendo los procedimientos establecidos en el Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater (2005). Las muestras son previamente filtradas y colocadas en las cubetas de anlisis. Una vez introducidos los protocolos de anlisis de cada muestra, el brazo robtico succiona un volumen del orden de microlitros de muestra y de reactivos, mezclndolos en una cubeta individual para obtener los resultados del anlisis colorimtrico. Finalmente toma una lectura directa en la cubeta a la longitud de onda correspondiente. A continuacin, realiza una prueba de calidad midiendo una concentracin conocida con el objetivo de asegurar la fiabilidad del anlisis.

3.2.3.2 Analticas microbianas

La toma de muestras para las determinaciones microbianas se llev a cabo una vez por semana en funcin de las condiciones del reactor. Las muestras eran preparadas mediante un proceso de fijacin para determinar posteriormente la poblacin bacteriana existente mediante la tcnica de Hibridacin Fluorescente In Situ o FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) por sus siglas en ingls Este procedimiento permiti llevar a cabo un seguimiento del estado de las poblaciones de las bacterias amonioxidantes (AOB), nitritoxidantes (NOB) y

58

Materiales y Mtodos

desnitrificantes y su evolucin a lo largo de las diferentes fases del periodo experimental. 3.2.3.2.1 Tcnica de Hibridacin In Situ FISH La tcnica FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation) consiste en la hibridacin de una sonda con una parte especfica del 16S RNA bacteriano (Wagner et al., 1995). La sonda se elabora mediante la sntesis qumica de nucletidos y se marca con un agente de color fluorescente (fluorocromo). Las bacterias de un grupo taxonmico especfico (especie, gnero o clase entre otros), al ser hibridadas con una sonda especfica, pueden ser identificadas empleando un microscopio de fluorescencia. En las Figuras 12, 13 y 14 se pueden ver las principales sondas disponibles para la deteccin de bacterias amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes respectivamente, as como los rangos de cobertura. En azul se han destacado las sondas empleadas en el presente trabajo de investigacin.

Figura 12. rbol filogentico basado en el 16S rARN de los principales linajes de bacterias amonioxidantes. Se ha destacado en azul las sondas empleadas en el presente trabajo de investigacin. Los parntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009)

Nse1472

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Materiales y Mtodos

Figura 13. rbol filogentico basado en el 16S-rARN de los principales linajes de bacterias nitritoxidantes. Los parntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009)

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Materiales y Mtodos

Figura 14. rbol filogentico basado en el 16S-rARN de los principales linajes de bacterias desnitrificantes. Los parntesis indican la cobertura de las sondas. (Nielsen et al., 2009)

61

Materiales y Mtodos

En la Tabla 12 se detallan las sondas empleadas en este estudio, as como algunos datos de inters (secuencia de nucletidos, bacterial seal y referencia donde ha sido descrita la sonda).
Tabla 12. Sondas de hibridacin empleadas en la identificacin micriobiolgica.
Sonda Secuencia (5-3) Organismo Referencia

Bacterias totales (Dominio Eubacteria) EUB338 I * EUB338 II EUB338 III

GCT GCC TCC CGT AGG AGT GCA GCC ACC CGT AGG TGT GCT GCC ACC CGT AGG TGT

Planctomycetales Verrucomicrobiales

Amman et al., (1990) Daims et al., (1999) Daims et al., (1999) Mobarry et al., (1996) Wagner et al., (1995)

Bacterias Amonioxidantes NSO1225 LNA NEU

CGC CAT TGT ATT ACG TGT GA CCC CTC TGC TGC ACT CTA

Betaproteobacterial AOB Nitrosomonas spp. Comamonas spp., Acidovorax spp., Hydrogenophaga spp., Aquaspirillum spp. Brachymonas denitrificans, Rhodocyclus purpureus y Leptothrix discophora Nitrosospira spp. Nitrosomonas oligotrophalineage Nitrosomonas europea, N. halophila, N. eutropha, Kraftisried-Isolat Nitrosococcus mobilis (Nitrosomonas) lineage

Competidora NEU : CTE

TTC CAT CCC CCT CTG CCG

Schleifer et aI., (1992)

Nsv443 Nmo218 Nse1472 Nmv

CCG TGA CCG TTT CGT TCC G CGG CCG CTC CAA AAG CAT ACC CCA GTC ATG ACC CCC TCC TCA GAG ACT ACG CGG

Mobarry et al., (1996) Gieseke et al., (2001) Juretschko et al., (1998) Juretschko et al., (1998) Daims et al., (2001) Daims et al., (2001) Wagner et al., (1996) Wagner et al., (1996)

Bacterias Nitritoxidantes Ntspa712 Competidora Ntspa712 NIT3 Competidora NIT3 : CNIT3

CGT CTT CGC CAC CGG CCT TCC CGT CTT CGC CAC CGG TCT TCC CCT GTG CTC CAT GCT CCG CCT GTG CTC CAG GCT CCG

Mayora phylum Nitrospirae Desulfovibrio.desulfuricans Nitrobacter spp. Competidora

Bacterias Desnitrificantes DEN67 AT1458 PAR651

CAA GCA CCC GCG CTG CCG GAA TCT CAC CGT GGT AAG CGC ACC TCT CTC GAA CTC CAG

Grupo desnitrificantes a partir de methanol Grupo Azoarcus-ThaueraCastellaniella Gnero Paracoccus

Ginige et al., (2005) Rabus et al., (1999) Neef et al., (1996)

* A partir de las las tres sondas EUB338 (I, II y III) se obtuvo una sonda denominada EUBmix.

62

Materiales y Mtodos

A continuacin se describen los procedimientos para la identificacin microbiana mediante la tcnica FISH (Alonso, 2003): I. Preparacin de los portaobjetos: 1. Se preparan los portaobjetos, que en este caso son de 10 celdas, 8 mm de dimetro y estn impresos con una capa de tefln. 2. Se lavan en una solucin jabonosa de agua desionizada. 3. Se enjuagan con agua desionizada. 4. El secado se lleva a cabo a temperatura ambiente y con medidas de proteccin para evitar que se depositen impurezas en la superficie de los portaobjetos (24 horas). 5. Se prepara una solucin de inmersin, compuesta por 100 mL de agua destilada a una temperatura de 60C en los que se disuelven 0.1 gramos de gelatina y 0.01 gramos de KCr(SO4)212H2O. Una vez obtenida la solucin, se enfra a 50C y los portas se sumergen durante 5 segundos. 6. Se dejan secar al aire, nuevamente protegidos. 7. Una vez secos estn ya preparados para su almacenaje y posterior utilizacin. II. Procedimiento de fijacin de muestras: Bacterias GRAM negativas 1. Se extrae 1 mL de biomasa de la muestra, se vierte a un tubo de microcentrfuga y se centrifuga a 5000 rpm durante 3 minutos. 2. Se retiran 750 L de sobrenadante. 3. Se aaden 3 volmenes de paraformaldehdo (PFA) (750 L) por 1 volumen de muestra (250 L) y se mantienen a 4C durante 1 hora. 4. Se centrifuga a 5000 rpm durante 3 minutos y se retira el sobrenadante. 5. Se aaden 900 L de tampn fosfatos salino (PBS) 1X, se resuspende y se centrifuga a 5000 rpm durante 3 minutos. Se repite este paso 3 veces. 6. Se retira todo el PBS 1X y se aaden dos soluciones: 700 L de etanol fro (4C) y 300 L de PBS 1X y se homogeneiza. 7. Se almacena a 4C. 8. La concentracin final de biomasa es de entre 108 y 109 clulas/mL. 9. Las muestras se guardan a -20 C.

63

Materiales y Mtodos

Protocolo para la obtencin de las soluciones de paraformaldehdo (PFA) y tampn fosfatos salino (PBS): PFA:

Se calientan 65 mL de agua mili-Q a 60C. Se aaden 4 g de paraformaldehido. Se aade una gota de solucin NaOH y se agita con rapidez hasta que la solucin se ha clarificado (entre 1 y 2 minutos). Se quita de la fuente de calor y se aaden 33 mL de PBS 3X. Se ajusta el pH a 7.2 con cido clorhdrico (HCl). En caso de que se produzcan cristales, es importante eliminarlos mediante un procedimiento de filtracin estril a travs un filtro de 0.2 m. Se enfra rpidamente y se almacena a 4C.

PBS 1X: Se disuelven 257.9 gramos de Na2HPO412H2O y 43.7 gramos de NaH2PO42H2O en 1000 mL de agua destilada. Despus se disuelven en esta solucin 754 gramos de NaCl. Se ajusta a pH 7.2. Para obtener PBS 3X, se prepara una dilucin 1 en 30 a partir del PBS 1X y agua destilada (1 PBS 3X+ 29 agua destilada). Se esteriliza mediante autoclave.

Previamente a la hibridacin de las muestras es importante su identificacin en funcin de la numeracin y del porcentaje de formamida para asegurar la correcta hibridacin posterior, ya que cada sonda requiere una concentracin de formamida determinada para el proceso de hibridacin. A continuacin se hace la seleccin de las sondas para posteriormente pasar a la fijacin de las muestras y posterior hibridacin. III. Aplicacin de las muestras en los portaobjetos: 1. Se pone un volumen de 6 L de muestra en los pocillos del portaobjetos. 2. Se seca en estufa a 55 C. 3. Se realiza la deshidratacin de las muestras de los portaobjetos mediante la inmersin progresiva en tres tubos Falcon que contienen

64

Materiales y Mtodos

soluciones de etanol (CH3CH2OH) de concentracin creciente: 50% 80% - 98%, dejando transcurrir un tiempo de 3 minutos para cada inmersin. 4. Tras la deshidratacin y el secado al aire, las muestras estn listas para ser hibridadas. Protocolo para la obtencin de las soluciones de alcohol: Etanol 50%: Se disuelven 100 mL de etanol en 100 mL de agua destilada Se conserva en tubos Falcon a temperatura ambiente. Se disuelven 160 mL de etanol en 40 mL de agua destilada Se conserva en tubos Falcon a temperatura ambiente. Reactivo etanol absoluto grado PRS. Se conserva en tubos Falcon a temperatura ambiente.

Etanol 80%: -

Etanol 98%: -

IV. Procedimiento de hibridacin: 1. Se ponen 8 L de la solucin de hibridacin (ver Tabla 13) en cada pocillo con muestra. 2. Las sondas han sido previamente atemperadas y mantenidas en oscuridad. Se vierte 1L de sonda general EUBmix y 1 L de la sonda especfica sobre la muestra en cada pocillo. 3. Se introduce un papel de celulosa en un tubo Falcon de 50 mL de forma que cubra el 50% de las paredes del tubo. 4. La solucin de hibridacin restante se vierte en el tubo Falcon para humedecer el papel de celulosa y crear una cmara de hibridacin. 5. El portaobjetos con las muestras hibridadas se introduce dentro del tubo Falcon, manteniendo siempre la posicin horizontal. 6. Se mantiene en estufa a 46C entre 1 y 2 horas. 7. Se prepara 50 ml de la solucin de lavado (ver Tabla 14) en un tubo Falcon, se recubre con un film protector para evitar que la luz ambiente pueda daar las sondas y se calienta en un bao trmico a 48C durante el tiempo necesario para la hibridacin.

65

Materiales y Mtodos

8. Se saca el tubo Falcon que contiene el portaobjetos de la estufa. Se extrae el portaobjetos y se introduce en el tubo que contiene la solucin de lavado y se mantiene en el bao durante 15 minutos. 9. Se extrae el portaobjetos y se lava con agua mili-Q enfriada. 10. Se seca al aire en oscuridad. 11. Se almacena a 20C en oscuridad. En este punto la muestra ya est preparada para ser observada al microscopio de epifluorescencia Protocolo para la preparacin de los reactivos necesarios para la obtencin de las soluciones de hibridacin y de lavado. En las Tablas 13 y 14 se indican los volmenes correspondientes en funcin del porcentaje de formamida: Solucin de hibridacin: 360 L de Cloruro Sdico 5M (NaCl)

Disolucin patrn: 292.2 g de cloruro sdico en 1000 mL de agua destilada. Disolucin 5M: 800 mL de NaCl y ajustar hasta 1000 mL. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos y posteriormente filtrar.

40 L de HCl-Tris

Se pesan 121.1 gramos de Tris y se disuelven en 800 mL de agua destilada. Se aaden 42 mL de HCl concentrado y ajusta hasta 1000 mL con agua destilada. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos y posteriormente filtrar.

x L de formamida y L de agua Mili-Q

Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos y posteriormente se filtran 200 mL de agua Mili-Q.

2 L de SDS 10%

Se pesan 121.1 gramos de SDS y se disuelven en 100 mL de agua destilada. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos y posteriormente filtrar.

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Materiales y Mtodos

Solucin de lavado: x L de Cloruro Sdico 5M (NaCl) 1 mL de HCl-Tris y L de EDTA 0.5M 50 L de SDS 10% Agua Mili-Q hasta ajustar a 50 mL

Tabla 13. Volmenes de reactivos en funcin del porcentaje de formamida para la preparacin de la solucin de hibridacin
Reactivos (L) Formamida Agua Mili-Q NaCl 5M HCl-Tris 1M SDS 10% Formamida (%) 5 100 1498 360 40 2 10 200 1398 360 40 2 15 300 1298 360 40 2 20 400 1198 360 40 2 25 500 1098 360 40 2 30 600 998 360 40 2 35 700 898 360 40 2 40 800 798 360 40 2 45 900 698 360 40 2 50 1000 598 360 40 2

Tabla 14. Volmenes de reactivos en funcin del porcentaje de formamida para la preparacin de la solucin de lavado.
Reactivos (L) NaCl 5M HCl-Tris 1M EDTA SDS 10% Agua Mili-Q Formamida (%) 5 6300 1000 --50
42650

10 4500 1000 --50

44450

15 3180 1000 --50

45770

20 2150 1000 500 50

46300

25 1490 1000 500 50

46960

30 1020 1000 500 50

47430

35 700 1000 500 50

47750

40 460 1000 500 50

47990

45 300 1000 500 50

48150

50 180 1000 500 50

48270

V. Observacin al microscopio: 1. Se sacan los portaobjetos almacenados a -20C para que alcancen la temperatura ambiente mantenindolos en oscuridad. 2. Se aade una pequea cantidad de aceite de montaje en la esquina de cada pocillo y se recubre con un cubreobjetos eliminado el exceso de aceite.

67

Materiales y Mtodos

3. Se observa al microscopio de epifluorescencia empleando los filtros adecuados segn los fluorocromos utilizados. 4. Una vez enfocada la muestra, se toman 20 parejas de fotografas (40 en total). 20 con el filtro de la sonda general EUBmix y 20 con el filtro de la sonda de la bacteria diana, manteniendo el mismo campo en ambas fotografas. La tcnica de anlisis microbiolgico empleada permite tanto la identificacin de los grupos de bacterias, como la obtencin de datos cuantitativos. Se ha utilizado un microscopio de fluorescencia DM2500 dotado de una cmara digital Leica DFC420c para la identificacin y captura de imgenes. La visualizacin de las muestras se realiz con un objetivo de 63x (Leica63x/0.80 N PLAN). La cuantificacin bacteriana se ha realizado siguiendo la metodologa desarrollada por Borrs (2008). La tcnica establece la captura de imgenes de entre 20 y 40 campos que sean representativos de la muestra hibridada. Posteriormente, las imgenes son introducidas en un software de cuantificacin, que devuelve un informe detallado de los porcentajes de rea ocupados por las bacterias presentes en la muestra hibridada. Este programa trabaja con las imgenes tomadas bajo el microscopio de epifluorescencia en trminos de reas, comparando la superficie ocupada por el total de bacterias presentes en el campo (sonda EUBmix) y el rea ocupada por las bacterias que han sido hibridadas con la sonda especfica. El resultado final es un nmero que representa el porcentaje en rea de una especie bacteriana en la muestra, acompaado de su error estndar, calculado como la desviacin estndar dividida por la raz cuadrada del nmero de campos analizados.

68

RESULTADOS Y DISCUSIN

Resultados y Discusin

4.1 Puesta en marcha

Al inicio de la puesta en marcha se llevaron a cabo analticas fsico-qumicas para confirmar la adaptacin de la biomasa a las nuevas condiciones de operacin. En la Figura 15 se puede observar como durante la primera semana la concentracin de slidos suspendidos totales se fue reduciendo de forma progresiva pasando de un valor medio en torno a 2750 mg SST/L a aproximadamente 2000 mg SST/L. El ratio SST/SSV se mantuvo estable y los slidos suspendidos no voltiles se mantuvieron en un valor en torno a 500 mg SSNV/L.

SST

SSV

SSNV

3000
Concentracin de slidos suspendidos (mg/L)

2500 2000 1500 1000 500 0 0 1 2 3 4

T (das)

10

Figura 15. Evolucin de la concentracin de slidos suspendidos en el licor mezcla al final de la etapa de reaccin durante la primera semana del periodo experimental

En las Figuras 16 y 17 vienen representadas la evolucin de los compuestos nitrogenados y la materia orgnica respectivamente, medidos al final de la fase de reaccin durante la primera semana. Tal y como se puede observar en la Figura 16 los organismos presentes fueron capaces de llevar a cabo el proceso de nitrificacin adecuadamente. Asimismo, en la Figura 17 se puede observar que la materia orgnica adicionada fue consumida prcticamente en su totalidad, por lo que el proceso de desnitrificacin se estaba produciendo correctamente.

69

Resultados y Discusin

20
Concentracin de compuestos nitrogenados (mg N/L)

AMONIO EFLUENTETtulo del grfico NITRITO EFLUENTE

NITRATO EFLUENTE

16

12

0 0 1 2 3 4
T (das)

Figura 16. Evolucin de la concentracin de amonio, nitrito y nitrato en el licor mezcla al final de la etapa de reaccin durante la primera semana del periodo experimental
MATERIA ORGNICA EFLUENTE (CIDO ACTICO)

Concentracin de actico en el efluente (mg DQO/L)

10

0 0 1 2 3 4
T (das)

Figura 17. Evolucin de la concentracin de cido actico durante la primera semana del perodo experimental al final de la etapa de reaccin

En la Tabla 15 se muestran los resultados obtenidos en el estudio microbiolgico llevado a cabo sobre el inculo. Como se observa, la prctica totalidad de bacterias amonioxidantes estaba formada por organismos de la especie Nitrosomonas oligotropha-lineage. En cuanto a las bacterias nitritoxidantes no se detectaron microorganismos del gnero Nitrobacter pero si del gnero Nitrospira, acerca del cual numerosos autores citan en investigaciones de los ltimos aos como

70

Resultados y Discusin el de mayor abundancia en estaciones de depuracin de aguas residuales (Wagner et al., 1996; Princic et al., 1998; Juretschko et al., 1998; Schramm et al., 1998; Okabe et al., 1999; Daims et al., 2000; Nogueira et al., 2002; Konrad et al., 2003, Carvalho et al., 2006). Respecto a las bacterias desnitrificantes, con las sondas disponibles se han identificado en el inculo microorganismos de los gneros Azoarcus, Thauera, Castellaniella, y Paracoccus en menor proporcin.
Tabla 15. Porcentajes de bacterias amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes en relacin con la sonda EUBmix (dominio Eubacteria) en el inculo empleado para sembrar el reactor SBR
AMONIOXIDANTES NITRITOXIDANTES DESNITRIFICANTES

Nitrosospira spp.

Mayora phylum Nitrospirae

Amonioxidantes

Nitrobacter spp.

Desnitrificantes que emplean metanol AzoarcusThaueraCastellaniella

Nitrosomonas europaea, N. eutropha, N. halophila Nitrosococcus Mobilis

Nitrosococcus Mobilis

Nitrosomonas europaea, N. eutropha, N. halophila

Nitrosomonas oligotrophalineage

Ntspa712

Nmo 218

Nso1225

Nse1472

(%)
82

(%)
0.2 0

(%)
00

(%)
00

(%)
72

(%)
00

(%)
00

(%)
10 3

(%)
00

(%)
11 2

(%)
31

4.2 Seguimiento del proceso

Una vez transcurrido el periodo de puesta en marcha del reactor se pas a estudiar la evolucin del sistema a lo largo 176 das de experimentacin. Durante ese tiempo el reactor SBR se mantuvo en funcionamiento alternando condiciones anxicas y aerobias con el objetivo de que los procesos de desnitrificacin y nitrificacin ocurrieran de forma completa. Para clarificar la evolucin del sistema, el periodo de experimentacin fue dividido en 4 fases en base a modificaciones llevadas a cabo en dos parmetros, el pH y la concentracin de oxgeno disuelto (OD). Fase I: Incluye la puesta en marcha del sistema. Durante esta fase el sistema fue operado con un pH de inicio de ciclo de 6.5 y una concentracin de OD de 2.5 mg O2/L.

PAR651

Nsv 443

AT1458

DEN67

NIT3

NEU

Nmv

Gnero Paracoccus

71

Resultados y Discusin Fase II: Inicio de fase con una limitacin puntual de oxgeno que tuvo una duracin de 12 horas. Se mantuvieron constantes tanto la concentracin de pH como el OD. Fase III: Inculo de 2 L compuesto principalmente por bacterias hetertrofas facultativas y una fraccin de bacterias auttrofas amonioxidantes y nitritoxidantes. Al inicio de esta fase se increment el oxgeno disuelto de 2.5 mg O2/L a 3.5 mg O2/L, y se mantuvo el pH al inicio de ciclo en 6.5. Fase IV: La concentracin de oxgeno disuelto se mantuvo en 3.5 mg O2/L y se increment el pH de 6.5 a 7.5.

4.2.1 Evolucin de los parmetros fsico-qumicos

En la Figura 18 se presentan las concentraciones de slidos suspendidos totales (SST), slidos suspendidos voltiles (SSV) y slidos suspendidos no voltiles (SSNV) a lo largo del periodo experimental. Se puede observar como la concentracin de slidos suspendidos totales experiment un descenso cercano al 70% durante los 25 primeros das de experimentacin, pasando de un valor en torno a 2700 mg SST/L de slidos suspendidos en el fango activo original, a oscilar en torno a valores de 700 a 1000 mg SST/L. Esta concentracin se mantuvo a lo largo de todo el periodo experimental.
3000
Concentracin de slidos suspendidos (mg/L)
SST SSV SSNV

2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 T (das)
OD 3.5 mg O2/L pHinicio ciclo 7.5
OD Resiembra

FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

OD 2.5 mg O2/L pHinicio ciclo 6.5

Figura 18. Evolucin de la concentracin de slidos suspendidos en el licor mezcla al final de la etapa de reaccin

72

Resultados y Discusin Este hecho se debi al lavado de parte de la biomasa al reducir la carga de carbono orgnico respecto a la concentracin en el fango activado original y a que el agua residual empleada como afluente no contena slidos suspendidos. No obstante, aunque la concentracin de SST en el reactor fue inferior a los valores de un reactor SBR a escala industrial, que oscilan entre 2000 mg/L y 4000 mg/L, la biomasa presente fue capaz de llevar a cabo la nitrificacin desde los primeros das de experimentacin. En cuanto a la concentracin de slidos suspendidos voltiles, a medida que la biomasa se fue adaptando a las nuevas condiciones de operacin, el porcentaje de SSV respecto a los SST fue en aumento, alcanzando un valor cercano al 90% que se mantuvo estable a lo largo de todo el periodo experimental. El incremento observado en la concentracin de SSV indica la capacidad de las poblaciones microbianas para adaptarse a las nuevas condiciones de operacin. En la Figura 19 se presenta la evolucin de la concentracin de materia orgnica (cido actico) en el licor mezcla medida en la fase final de la etapa de reaccin a lo largo del periodo experimental. Se observa como la concentracin de cido actico permaneci en la corriente efluente en valores inferiores a 10 mg DQO/L, lo cual supone un porcentaje de eliminacin de materia orgnica del orden del 95.2%. Este hecho indica que no se produjo limitacin por sustrato.
MATERIA ORGNICA (CIDO ACTICO)

100
Concentracin de cido actico (mg DQO/L)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

10

20

30

40

50

60

70

80

90 100 110 120 130 140 150 160 170 T (das)

OD 3.5 mg O2/L pHinicio ciclo 7.5

OD 2.5 mg O2/L pHinicio ciclo 6.5

Figura 19. Evolucin de la concentracin de materia orgnica (cido actico) en el licor mezcla al final de la etapa de reaccin

73

Resultados y Discusin Sin embargo, aunque el porcentaje de eliminacin de materia orgnica como cido actico fue elevado, a partir del da 110 se observ una ligera acumulacin que se mantuvo hasta el final del periodo experimental. En la Figura 20 se presenta la evolucin de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla en la fase final de la etapa de reaccin a lo largo del periodo experimental. Durante los 25 primeros das de operacin se alcanz la nitrificacin completa ya que la concentracin de nitrato al final de la etapa de reaccin se mantuvo en torno a 8 mg N-NO3/L mientras que la concentracin de nitrito fue prcticamente despreciable durante este periodo de operacin. Este hecho indica que en el licor mezcla se desarroll una poblacin de bacterias amonioxidantes y nitritoxidantes adecuada.

Figura 20. Evolucin de la concentracin de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla en el licor mezcla al final de la fase aerobia de la etapa de reaccin

Sin embargo a partir del da 43 comenz a incrementarse la concentracin de nitrito en el licor mezcla hasta alcanzar el da 77 un valor de 5 mg N-NO2/L. Este hecho fue indicativo de que la poblacin de bacterias NOB estaba vindose afectada, posiblemente debido a la limitacin previa de oxgeno disuelto en el licor mezcla

74

Resultados y Discusin durante 12 horas. Con el objetivo de recuperar la actividad de las bacterias nitritoxidantes se llev a cabo una resiembra de 2 L de fango activo el da 83, lo cual dio lugar a que el proceso de nitrificacin se recuperase. Sin embargo 14 das despus de la resiembra se produjo de nuevo la acumulacin de nitrito, que se mantuvo hasta el final del periodo experimental alcanzando un valor mximo de en torno a 7 mg NNO2/L. El incremento de la concentracin de nitrito a partir del da 110 coincide con la ligera acumulacin de cido actico observada (Figura 19) y puesto que en el proceso de desnitrificacin a partir de nitrito la toma de carbono orgnico es menor que en el proceso de desnitrificacin a partir de nitrato (Ciudad, 2007), este hecho podra ser una de las causas de la menor toma de carbono orgnico por parte de la poblacin microbiana. Por otro lado, en la Figura 21 se presenta la concentracin de amonio, nitrito y nitrato medidos en el licor mezcla al final de la fase anxica. Como puede observarse el proceso de desnitrificacin se produjo de manera estable durante todo el periodo experimental, tanto a partir de nitrato como de nitrito.

AMONIO 30

NITRITO

NITRATO

Concentracin de compuestos nitrogenados (mg N/L)

25

FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

20

15

10

OD

Resiembra

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 T(das)

OD 2.5 mg O2/L pHinicio ciclo 6.5

OD 3.5 mg O2/L

pHinicio ciclo 7.5

Figura 21. Evolucin de la concentracin de los compuestos nitrogenados (amonio, nitrito y nitrato) en el licor mezcla al final de la fase anxica de la etapa de reaccin

75

Resultados y Discusin

4.2.2 Evolucin de las poblaciones microbianas

A lo largo del periodo experimental se realizaron 18 muestreos del licor mezcla en la fase aerobia de la etapa de reaccin. A partir de las muestras obtenidas se realizaron los procesos de hibridacin con las sondas escogidas para el estudio de la poblacin microbiana, realizando rplicas para confirmar los resultados obtenidos. A continuacin se presentan los resultados de la evolucin de las poblaciones de bacterias amonioxidantes (AOB), nitritoxidantes (NOB) y desnitrificantes. 4.2.2.1 Anlisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias amonioxidantes La Figura 22 muestra la evolucin de los organismos AOB en relacin con la concentracin de nitrgeno amoniacal determinada al final de la fase aerobia de la etapa de reaccin. Durante los 25 primeros das (Fase I) se observa que el porcentaje de microorganismos amonioxidantes se mantuvo constante en torno a un valor del 7%.

Figura 22. Porcentaje de AOB en el licor mezcla detectado con la sonda NSO1225 en relacin con la sonda EUBmix. Concentracin de nitrgeno amoniacal en el licor mezcla al final de la fase aerobia de la etapa de reaccin

76

Resultados y Discusin La poblacin de bacterias amonioxidantes llev a cabo la oxidacin del amonio mientras la concentracin de oxgeno disuelo fue estable (valor medio de 2.5 mg O2/L). Sin embargo, la limitacin puntual de oxgeno el da 25 (2 ciclos sin suministro de oxgeno durante la etapa aerobia, en total 12 horas bajo condiciones anxicas alcanzando la anerobiosis) produjo el cese de su actividad, as como una reduccin drstica de su poblacin, que pas de un 7% a un 1%. La concentracin de amonio en el licor mezcla se increment hasta alcanzar un valor mximo de 25 mg N-NH4/L al final de la etapa aerobia, ya que continu la adicin de amonio en la corriente afluente. Transcurridos 8 das de la limitacin de oxgeno la poblacin de AOB se haba recuperado alcanzado un valor del 4% y era capaz de oxidar todo el amonio del sistema. El da 42 la concentracin de bacterias amonioxidantes se haba restablecido hasta alcanzar los niveles iniciales (8%) aunque durante la segunda mitad de la fase II el porcentaje de bacterias se situ en torno al 6% para el da 79. Tal y como se ha comentado anteriormente, debido a la necesidad de reestablecer la poblacin de organismos NOB, el da 83 se realiz una resiembra de 2 L de fango activo procedente de la EDAR utilizada para inocular el reactor biolgico SBR inicialmente. El inculo potenci el desarrollo de la poblacin de bacterias AOB que alcanz un valor en torno al 14% el da 124 y cercano al 17% el ltimo da del periodo experimental. La Figura 23 muestra ocho imgenes obtenidas con la tcnica FISH correspondientes a la sonda Nso1225 (-proteobacterias amonioxidantes). Se puede observar como las bacterias forman agregados compactos y ligeramente esfricos, con clulas claramente visibles.

77

Resultados y Discusin FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

Figura 23. Imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias de dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las -proteobacterias AOB identificadas por la sonda NSO 1225. Imgenes tomadas a 63x.

La sonda Nso1225 hibrida para una elevada variedad taxonmica de bacterias AOB y por tanto aporta informacin relevante acerca del potencial nitrificante de la poblacin microbiana presente en el licor mezcla. Sin embargo, puesto que se trata de una sonda general, se realiz un estudio ms en profundidad de las especies que conformaban la poblacin de bacterias amonioxidantes. Para ello se llev a cabo un anlisis cualitativo y cuantitativo de las

78

Resultados y Discusin principales especies de bacterias amonioxidantes, cuyos resultados se presentan en la Tabla 16.
Tabla 16. Porcentajes de AOB en el licor mezcla en relacin con la sonda EUBmix
Nitrosomonas europaea, N. eutropha, N. halophila Nitrosococcus mobilis Nitrosomonas oligotropha-lineage Nitrosospira spp. Nsv443

Fase

Da

Nso1225

NEU

Nse1472

Nitrosococcus mobilis Nmv

Nitrosomonas europaea, N. eutropha, N. halophila

AOB

Nmo218

(%)
1

(%)
<1 <1 <1 <1 <1 31 41 51 51 51 31 41 61 81 71 81 12 1 12 1

(%)
0 0

(%)
0 0

(%)
51 51 51

(%)
0 0

61 71 71 <1 31 61 91 81 81 61 71 81 12 1 14 2 15 2 15 1 16 1 16 1

12 20 29 33 42

0 0

0 0

<1 11 11 62 41

0 0

II

56 61 70 79 91

41 51

0 0

0 0

31 <1 31 51

0 0

III

104 111 124 139

0 0

0 0

51 41 31 31

0 0

IV

154 168 174

Estos resultados (media error estndar) indican que prcticamente la totalidad de bacterias amonioxidantes identificadas mediante la sonda general Nso1225 correspondieron a las sondas especficas NEU y Nmo218, que hibridan bacterias de las especies Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha, Nitrosomonas halophila, Nitrosococcus mobilis y Nitrosomonas oligotropha-lineage, respectivamente. Las hibridaciones de las sondas que inicialmente dieron resultados negativos, fueron hibridadas posteriormente para confirmar los resultados obtenidos.

79

Resultados y Discusin Las sondas Nse1472 y Nmv dieron seal negativa a lo largo de todo el periodo experimental. Sin embargo la sonda NEU, que engloba las sondas Nse1472 y Nmv, dio resultados positivos con un valor que se fue incrementando progresivamente. Este hecho podra deberse a varias causas: En primer lugar es posible suponer una incorrecta hibridacin de las sondas Nse1472 y Nmv debido a fallos en el proceso o a la degradacin de sus fluorocromos. Sin embargo, para asegurar la fiabilidad de los resultados se introdujeron controles positivos durante las hibridaciones que permitieron constatar que el procedimiento se realizaba adecuadamente y que las sondas estaban en buen estado, por lo que se descart esta posibilidad. Tambin se pudo producir la hibridacin de bacterias con la sonda NEU que tienen coincidencias en su cadena de cidos nucleicos con la seccin de la cadena para la que hibrida esta sonda especfica, pero que sin embargo no son bacterias amonioxidantes. Por este motivo, el protocolo establece el uso de una sonda competidora (CTE) sin fluorescencia para descartar hibridaciones errneas (Wagner et al., 1995; Schleifer et al., 1992). Este tipo de sonda hibrida con bacterias que actan en el proceso de hibridacin como competidoras del grupo de bacterias identificadas con la sonda NEU, como Comamonas testosteroni, Brachymonas denitrificans, Rhodocyclus purpureus y Leptothrix discophora (Schleifer et aI., 1992). De modo que la sonda CTE sin fluorocromos hibrida sobre la secuencia de nucletidos objetivo de las bacterias competidoras, impidiendo que lo haga la sonda NEU. Otra opcin es la existencia de bacterias que hibridan para la sonda NEU pero no para Nse1472 y Nmv. En relacin a este tercer supuesto, Wagner et al., (1995) identificaron una serie de bacterias que daban positivo para la sonda NEU pero no para Nse1472 y Nmv: Nitrosomonas marina, Nitrosomonas aestuarii y Nitrosovibrio tenuis. No obstante, estas bacterias suelen presentarse por lo general en ambientes marinos (Nielsen et al., 2009) aunque se ha llegado a identificar Nitrosomonas marina en un biofiltro asociado a un sistema de produccin acucola. Existe constancia de otros autores (Gieseke et al., 2001; Persson et al., 2002) que obtuvieron resultados positivos para la sonda de hibridacin NEU mientras que Nmv y Nse1472 aportaron resultados negativos en muestras de sistemas de depuracin de aguas residuales urbanas. Teniendo en cuenta estos resultados, sera interesante llevar a cabo una investigacin ms en profundidad en relacin con las secuencias para las que hibrida la sonda NEU y las especies de bacterias identificadas ya que se trata de una sonda que al hibridar para bacterias halotolerantes o moderadamente haloflicas con afinidad por medios con elevadas concentraciones de nutrientes, suele dar resultados positivos

80

Resultados y Discusin en sistemas de tratamiento de aguas residuales (Seviour y Nielsen, 2010). Adems de que como numerosos estudios indican, el gnero Nitrosomonas tiene una presencia mayoritaria en plantas de tratamiento de aguas residuales (Prosser, 1989; Dionisi et al., 2002; Egli et al., 2003; Dong-Jin et al., 2006; Rodrguez et al., 2011). Por otro lado, las bacterias pertenecientes a la especie N. mobilis (sonda Nmv) suelen desarrollarse en medios que tienen elevadas concentraciones de amonio y sales (Juretschko et al., 1998) que no es el caso del presente trabajo. En cuanto a la sonda Nmo218, que hibirida para Nitrosomonas oligotrophalineage, durante los primeros das del periodo experimental supuso prcticamente la totallidad de la poblacin de bacterias AOB. Mientras que las bacterias identificadas mediante la sonda NEU fueron detectadas en el fango pero con una concentracin inferior al 1%. Tras 25 das en los que el sistema permaneci estable se mantuvo esta dinmica de poblacin. Sin embargo, progresivamente las bacterias identificadas mediante la sonda NEU fueron incrementando su concentracin en el licor mezcla, pasaron a situarse como la poblacin microbiana amonioxidante mayoritaria. En cuanto a la sonda restante, Nsv443, que hibrida para Nitrosospira spp., dio resultados negativos y aunque ocasionalmente se han podido identificar en sistemas de fangos activados, es un tipo de bacteria que generalmente va asociado a hbitats terrestres (Nielsen et al., 2009; Seviour y Nielsen, 2010). A continuacin, en las Figuras 24 y 25 se presentan imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH sobre muestreos realizados a lo largo del periodo experimental empleando las dos sondas que dieron resultados positivos, NEU (Figura 24) y Nmo218 (Figura 25). Se puede observar como las agrupaciones de bacterias identificadas mediante la sonda NEU dieron lugar a formaciones globosas y con poca distancia entre ellas. Mientras que las poblaciones microbianas correspondientes a la especie Nitrosomonas oligotropha-lineage (Figura 25) dio lugar a formaciones de menor tamao, ms dispersas y con clulas ms claramente visibles.

81

Resultados y Discusin FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

Figura 24. Imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias totales del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las -proteobacterias AOB identificadas por la sonda NEU. Imgenes tomadas a 63x.

82

Resultados y Discusin FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

Figura 25. Imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las -proteobacterias AOB identificadas por la sonda Nmo218. Imgenes tomadas a 63x.

83

Resultados y Discusin 4.2.2.2 Influencia del pH y la concentracin de oxgeno disuelto en la poblacin de AOB Desde el da 1 del periodo experimental y hasta el da 135, el pH al inicio de ciclo se mantuvo en torno a un valor de 6.5. Existen estudios que indican que al pasar de pH 7.0 (valor tpico de una depuradora) a pH 6.6, el ratio de oxidacin de amonio puede verse afectado (Konrad et al., 2003). Sin embargo, desde el inicio del ensayo la poblacin de AOB fue capaz de adaptarse y llevar a cabo la oxidacin de amonio tal y como se observa en la Figura 26, en la que se muestran los porcentajes de bacterias amonioxidantes identificadas en el licor mezcla respecto al dominio Eubacteria en relacin con la concentracin de amonio al final de la fase aerobia de la etapa de reaccin.

Figura 26. Porcentaje de bacterias amonioxidantes en el licor mezcla detectadas con las sondas NSO1225, Nmo218 y NEu en relacin con la sonda EUBmix. Concentracin de nitrgeno amoniacal en el licor mezcla al final de la fase aerobia de la etapa de reaccin

El da 26, debido a la limitacin de oxgeno en el reactor, todas las especies de AOB detectadas se vieron seriamente afectadas. Sin embargo, existen estudios que indican la capacidad de determinadas especies de bacterias nitrificantes para mantener su actividad en condiciones de limitacin de oxgeno. A este respecto, en la Figura 26 puede observarse como las bacterias detectadas con las sondas especficas NEU y Nmo218 fueron capaces de recuperar paulatinamente los porcentajes previos a

84

Resultados y Discusin la reduccin en la concentracin de oxgeno, especialmente las especies detectadas con la sonda NEU, que incrementaron su presencia hasta alcanzar un 5%. Sin embargo, estos niveles no se mantuvieron y a partir del da 60 del periodo experimental, la poblacin de bacterias amonioxidantes fue reducindose progresivamente, aunque este hecho no afect el ndice de oxidacin de amonio. Al tiempo que se realiz la resiembra de 2 L el da 83, se increment la concentracin de oxgeno disuelto en el reactor de 2.5 mg O2/L a 3.5 mg O2/L. Probablemten debido tanto al inculo como a la mayor concentracin de oxgeno disuelto en el licor mezcla, tuvo lugar un incremento progresivo en la poblacin de AOB identificadas con la sonda Nso125, que alcanz un porcentaje en torno al 16%. Tambin se produjo un cambio en la poblacin microbiana, ya que las bacterias identificadas por la sonda NEU se duplicaron a partir del da 83, pasando de un 3% a un 7%, superando los niveles de Nitrosomonas oligotropha-lineage y haciendo ms patente el cambio observado entre los da 25 y 83, en los que ambas poblaciones se haban igualado. A este respecto, Park y Noguera (2004) hallaron que en un reactor alimentado con agua residual artificial las bacterias predominantes inicialmente fueron Nitrosomonas oligotropha. Sin embargo, progresivamente la poblacin predominante pas a ser la especie Nitrosomonas europaea. Estos resultados coinciden con los observados en cuanto al cambio de poblacin en el presente trabajo, en el que se observa que aunque inicialmente la poblacin predominante fue claramente Nitrosomonas oligotropha-lineage, progresivamente las bacterias identificadas por la sonda NEU pasaron a ser mayoritarias. Tras el incremento de pH el da 134, el porcentaje de Nitrosomonas oligotropha-lineage se redujo pasando de un 5% a un 3%, mientras que las bacterias identificadas por la sonda NEU alcanzaron un valor cercano al 13%, pasando a suponer el 75% del total de bacterias AOB detectadas en el fango activo. Bae et al., (2002) hallaron que con el incremento de pH de 6.5 a 7.5 el ratio de oxidacin de amonio por parte de las bacterias AOB se increment en un 67%. Y Konrad et al., (2003) observaron que a pH 7.5 la poblacin microbiana dominante fue la detectada mediante la sonda NEU, aunque a pH inferior a 7, la poblacin de bacterias NEU decreci a favor de otras poblaciones detectadas mediante la sonda Nso190 (sonda general para AOB). Por ello concluyeron que las variaciones de pH tenan una mayor influencia en las poblaciones de Nitrosomonas eutropha y Nitrosomonas europaea, siendo el pH 7.5 ptimo para el desarrollo de estas especies en medio artificial, lo cual coincide con los resultados obtenidos en el presente trabajo. En lo referente al efecto del incremento en la concentracin de nitrito, Bock et al., (1995) y Kuai et al., (1998) hallaron que N. europaea/eutropha podan emplear el

85

Resultados y Discusin nitrito como aceptor de electrones en caso de limitacin de oxgeno. Por tanto, es posible que bacterias detectadas mediante la sonda NEU se viesen favorecidas ya que se produjo acumulacin de nitrito desde el da 97, pasando de una concentracin en el efluente de 1.5 mg N-NO2/L a alcanzar los 7 mg N-NO2/L como valor promedio a partir del da 134 y hasta el final del periodo experimental. Respecto a la reduccin de la poblacin de N. oligotropha en relacin con la concentracin de nitrito, Bollmann et al., (2002) hallaron que la poblacin de bacterias amonioxidantes G5-7 (muy relacionada con Nitrosomonas oligotropha) se vio afectada cuando en el reactor se increment la concentracin de nitrito, de lo que dedujeron una posible sensibilidad de estas bacterias a la presencia de este compuesto en el medio, lo cual coincide con los resultados obtenidos en este trabajo. La predominancia de bacterias detectadas por la sonda NEU viene referenciada por otros estudios (Logemann et al., 1998; Egli et al., 2003). Fux et al., (2003) obtuvieron una modificacin poblacional en un sistema SBR operado con influente artificial, con un incremento de bacterias identificas con la sonda NEU respecto al total de bacterias detectadas con la sonda Nso1225, lo cual coincide con los resultados presentados en relacin al cambio poblacional observado en este trabajo. 4.2.2.3 Anlisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias nitritoxidantes Las sondas empleadas fueron Ntspa712 (hibrida para la mayor parte de miembros del gnero Nitrospira) y NIT3 (gnero Nitrobacter spp.), aunque el total de bacterias que dieron resultado positivo en la hibridacin correspondieron a la sonda Ntspa712 y por tanto al phylum Nitrospira. Para confirmar estos resultados se llevaron a cabo 8 hibridaciones, 2 al inicio de cada fase mediante la sonda NIT3 y su competidora sin obtenerse resultados positivos en ninguna fase. Estudios llevados a cabo en plantas de tratamiento de aguas residuales coinciden en que las bacterias pertenecientes al gnero Nitrospira son dominantes en estos ambientes frente a las bacterias del gnero Nitrobacter (Wagner et al., 1996; Juretschko et al., 1998; Schramm et al., 1998; Okabe et al., 1999; Daims et al., 2000; Nogueira et al., 2002; Konrad et al., 2003, Carvalho et al., 2006). La Figura 27 presenta la evolucin de la poblacin de bacterias nitritoxidantes y de las concentraciones de nitrito y nitrato en la fase final de la etapa de reaccin.

86

Resultados y Discusin

Figura 27. Porcentaje de bacterias nitritoxidantes en el licor mezcla detectadas con la sonda Ntspa712 en relacin con la sonda EUBmix. Concentracin de nitrito en el licor mezcla al final de la fase aerobia de la etapa de reaccin

Al inicio del ensayo el proceso fue estable con una poblacin de NOB cercana al 3% respecto al dominio Eubacteria. A pesar de que sta se redujo durante los 25 primeros das de experimentacin hasta un 1%, la concentracin de nitrito no se increment y la concentracin de nitrato en el medio vari en un intervalo de entre 5 y 3 mg N-NO3/L. Desde el da 25 (Fase II) la poblacin de nitritoxidantes fue en aumento y alcanz un valor cercano al 8% hasta el da 56. Sin embargo, posteriormente la poblacin de NOB se fue reduciendo de forma progresiva hasta un valor cercano al 1% el da 79. Al mismo tiempo se observ un incremento progresivo de la concentracin de nitrito en el licor mezcla, hasta alcanzar un valor de 5.5 mg N-NO2/L. Por tanto, es posible que las bacterias detectadas mediante el procedimiento de hibridacin fueran bacterias viables en torno al da 25 y no viables en torno al da 79, lo cual explicara la acumulacin de nitrito con una misma concentracin de NOB en el licor mezcla. El da 83 (inicio de la Fase III) se realiz la resiembra de 2 L, tras la cual el sistema dio muestras de recuperacin del proceso de oxidacin de nitrito. Se observ una rpida respuesta de la actividad de las bacterias nitritoxidantes, ya que su poblacin pas de un 1% a un 10% tras un periodo de aproximadamente 10 das y se

87

Resultados y Discusin logr la nitrificacin completa. Sin embargo, hacia el da 97 del proceso experimental se produjo de nuevo la acumulacin de nitrito en el licor mezcla. Este hecho mostr que la bioaumentacin no es un mtodo efectivo para la recuperacin de determinadas poblaciones bacterianas, como indican otros estudios (Bouchez et al., 2000; Seviour y Nielsen, 2010) En la Tabla 17 pueden observarse los resultados obtenidos para las dos sondas estudiadas.
Tabla 17. Porcentajes de NOB en el reactor licor mezcla en relacin con la sonda EUBmix (dominio Eubacteria)
Phylum Nitrospirae Ntspa712 Nitrobacter spp. NIT3

Fase

Da

(%)
1

(%)
21 11 11

0 0

12 20 29 33 42

0 0

21 31 51 82 72 52 11

II

56 61 70 79 91

0 0

10 2 31 21 21

III

104 111 124 139

0 0

11 11 11 11

IV

154 168 174

En sistemas que trabajan bajo condiciones variables se puede dar el caso de que una restriccin en determinada fase de la actividad de las bacterias pueda permitir el desarrollo de poblaciones de NOB diversas (Gieseke et al., 2001). Sin embargo, en este caso la poblacin dominante ha sido la perteneciente al gnero Nitrospira.

88

Resultados y Discusin A continuacin, en la Figura 28 se presentan imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH sobre muestreos realizados a lo largo del periodo experimental empleando la sonda Ntspa712. Se puede observar como las agrupaciones de bacterias Nitrospira dan lugar a formaciones irregulares de pequeo tamao y por lo general dispersas. FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

Figura 28. Imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las -proteobacterias NOB identificadas por la sonda Ntspa712. Imgenes tomadas a 63x.

89

Resultados y Discusin 4.2.2.4 Influencia del pH y la concentracin de oxgeno disuelto en la poblacin de NOB La ausencia de oxgeno disuelto en el medio durante 12 horas el da 25 provoc una reduccin importante en la actividad de las bacterias. A este respecto, Daims et al., (2001a) hallaron que bajo condiciones anaerobias, bacterias del gnero Nitrospira spp. no llevaron a cabo la toma de carbono, lo que indica que en ausencia total de OD su actividad se reduce de forma significativa. A partir del da 25 (Fase II), tras la limitacin de oxgeno, la poblacin de bacterias NOB se recuper con una concentracin de OD en el medio de 2.5 mg O2/L, aunque se produjo una acumulacin progresiva de nitrito. Otros autores (Nogueira et al., 2002) obtuvieron resultados semejantes, con valores crecientes en la poblacin de bacterias nitritoxidantes y acumulacin simultnea de nitrito. El da 83 (Fase III), tras incrementar el OD a 3.5 mg O2/L y realizar el inculo de 2 L, durante los 14 primeros das se produjo la nitrificacin completa. Sin embargo, como ya se ha comentado, posteriormente la poblacin de bacterias NOB se redujo de manera progresiva y comenz a observarse de nuevo la acumulacin de nitrito en el licor mezcla. Como posible solucin para la recuperacin del proceso de nitrificacin, el da 134 (inicio de la Fase IV) se increment el pH pasando de un valor de inicio de ciclo de 6.5 a un valor de 7.5 ya que existen estudios que indican que el crecimiento y la actividad de las bacterias NOB se ve incrementado a valores de pH en torno a 7.5 8.0 (Prosser, 1989; Gieseke et al., 2006; Gu et al., 2007) mientras que a valores inferiores a 6.5 la velocidad de nitrificacin se reduce de forma brusca (Gonzlez et al., 2010). Sin embargo, la modificacin del pH no influy en la recuperacin de la poblacin de NOB y la acumulacin de nitrito se mantuvo hasta el final del periodo experimental. En cuanto al efecto inhibitorio del nitrito, el autntico inhibidor es el cido nitroso (HNO2) cuya concentracin va en funcin del pH del medio. Varios autores (Vadivelu et al., 2006; Sinha y Annachhatre, 2007) han observado que a un valor de pH inferior a 6 se incrementa la concentracin de cido nitroso, afectando los procesos de nitrificacin. A este respecto existen trabajos (Anthonisen, 1976; Almeida, 1995) que indican que el cido nitroso tiene un impacto considerable sobre las bacterias NOB. Estos trabajos indican que una concentracin de HNO2 superior a 2.8 mg/L no permite la nitrificacin completa ya que inhiben la actividad de las bacterias nitritoxidantes. No obstante, Vadivelu et al., (2006) hallaron que una concentracin de 0.02 mg N-HNO2/L provoc un descenso del 15% en el ratio de toma de oxgeno en una

90

Resultados y Discusin poblacin de Nitrobacter. Y aunque las poblaciones pertenecientes al gnero Nitrospira son predominantes en estaciones depuradoras de aguas residuales, podra resultar interesante el estudio del efecto de la concentracin de cido nitroso en su actividad nitrificante. A partir de los clculos de equilibrio qumico (Ecuacin 21 y 22) entre el nitrito y el cido nitroso se calcul la concentracin de cido nitroso correspondiente a 10 mg/L de nitrito con un pH de 6.5 (menor pH a lo largo del periodo experimental) y una temperatura de 20C.

HNO 2 =

TNO 2 Ke NO 1+ 10 pH

Ecuacin 21

Siendo TNO2 = NO2 + HNO2

Ke NO = e T + 273 = 3.9 10 4
2300

Ecuacin 22

Donde KeNO (mol L-1) es la constante de equilibrio qumico a 20C de NO2/HNO2. La concentracin de cido nitroso obtenida fue de 0.008 mg N-HNO2/L, valor muy por debajo del umbral de inhibicin propuesto por Anthonisen (1976). Por esta razn se puede desestimar la hiptesis de que la inhibicin de las NOB se produjo a causa de la presencia de cido nitroso en el sistema. Kim et al., (2008) estudiaron la acumulacin de nitrito a diferentes temperaturas, y observaron que a 20C no se produjo acumulacin de nitrito en el reactor. Mientras que los resultados obtenidos por Gerardi (2002) indican que a pesar de obtener la nitrificacin completa a 20C, a menor temperatura (16 C) el porcentaje de nitrificacin obtenido fue un 50% inferior respecto al proceso a 30C. Por tanto, ligeras variaciones en el rango de temperatura son de gran importancia cuando se trabaja en valores de temperatura en torno a 20C. Otro parmetro importante a tener en cuenta en el desarrollo de las poblaciones bacterianas es la fuente de carbono (orgnico o inorgnico). Por lo general, el contenido en materia orgnica de las aguas residuales suple las necesidades de la poblacin microbiana, sin embargo, en determinados sistemas de tratamiento se emplean fuentes alternativas de carbono (principalmente en sistema con desnitrificacin).

91

Resultados y Discusin En el presente trabajo se emple cido actico como fuente de carbono, que es el cido graso voltil dominante en los sistemas de aguas residuales, aunque tambin se pueden emplear glucosa ometanol. La relacin del cido actico con la acumulacin de nitrito en sistemas de nitrificacin viene referenciada por diversos autores. Ge et al., (2012) no hallaron diferencias notables en cuanto a la acumulacin de nitrito al comparar como fuente de carbono el actico con la glucosa y el metanol. Por otro lado, Carley y Mavinic (1991) hallaron una acumulacin de nitrito del orden del 21% al emplear actico como fuente de carbono y del 23 y el 17% al emplear glucosa y metanol respectivamente. Mientras que Sun et al., (2009) obtuvieron un incremento del 10% en la acumulacin de nitrito al emplear cido actico con respecto al uso de metanol y Eilersen et al., (1994) hallaron que diversos cidos (frmico, propinico y actico) inhibieron por igual el proceso de nitrificacin. A este posible efecto inhibitorio del cido actico sobre la poblacin de NOB, Nogueira et al., (2002) hallaron que Nitrospira tena cierta resistencia a desarrollarse bajo esta fuente de carbono orgnico, recuperndose tras la interrupcin de la adicin de cido actico en el reactor. Y estudios llevados a cabo por Daims et al., (2001) hallaron que bacterias relacionadas con el gnero Nitrospira no empleaban acetato como fuente de carbono orgnico, sino piruvato. Adems de los factores indicados hasta ahora, la intensidad lumnica es tambin un parmetro importante a tener en cuenta en la evolucin de poblaciones microbianas. En ensayos de laboratorio en los que se emplean reactores piloto de materiales translcidos se ha detectado que puede tener un cierto efecto negativo en los procesos de nitrificacin/desnitrificacin que en el caso de reactores industriales pasa desapercibido por tratarse de materiales opacos. Kaplan et al., (2000) y Vanzella et al., (1989) hallaron que las bacterias NOB eran ms sensibles a la luz solar que las bacterias AOB. Por otro lado, Olson (1981) en un estudio llevado a cabo en un depsito de aguas residuales observ cierto grado de inhibicin de la actividad de bacterias nitritoxidantes al incrementar la intensidad lumnica durante las pocas de finales de primavera y verano, que dependi de la dosis de luz. Al comparar con un estado de oscuridad total, un incremento en la luminosidad del 5% provoc una inhibicin del 15% y de un 67% al recibir plena intensidad lumnica. Tal y como se observa en la Figura 8 correspiente al apartado de 3.1 de Materiales y Mtodos, el montaje experimental se realiz en un reactor semitransparente sometido a luz directa. Por tanto, el incremento de la intensidad lumnica durante las ltimas fases del ensayo (correspondientes a los meses de abril y mayo) podra haber afectado la capacidad de las bacterias NOB para desarrollarse.

92

Resultados y Discusin Por tanto, sera interesante realizar un estudio ms en profundidad a este respecto, enfocado a la influencia de la intensidad lumnica en la realizacin de ensayos a escala de laboratorio. 4.2.2.5 Anlisis cualitativo y cuantitativo de las bacterias desnitrificantes La Tabla 18 presenta los porcentajes obtenidos para las tres sondas empleadas.
Tabla 18. Porcentajes de desnitrificantes en el reactor licor mezcla en relacin con sonda EUBmix (dominio Eubacteria)
Desnitrificant es a partir de metanol DEN67 Gneros Paraccocus PAR651 Gneros AzoarcusThaueraCastaniella AT1458

Fase

Da

(%)
1

(%)
21 21 21 21 21 21 21 21 21 11 11 41 71 10 3 82 73 73 73

(%)
0 0

11 2 11 2 11 2 12 2 14 2 15 2 20 6 25 6 29 7 33 8 45 5 50 6 58 7 61 7 63 8 67 8 70 9 72 9

12 20 29 33 42

0 0

II

56 61 70 79 91

0 0

III

104 111 124 139

0 0

IV

154 168 174

Desde el primer da del ensayo y hasta el da 25 el porcentaje de ambas poblaciones de bacterias se mantuvo estable. A partir del da 25, la poblacin de bacterias detectadas por sonda AT1458, que hibrida los gneros de bacterias Azoarcus, Thauera y Castellaniella aument de forma progresiva hasta alcanzar un

93

Resultados y Discusin valor en torno a un 70% en la fase final del periodo experimental. A este respecto, diversos autores (Juretschko et al., 2002; Wagner et.al, 2002; Ginige et al., 2005; Thomsen et al., 2007; Nielsen y Seviour, 2010) coinciden en situar los gneros Thauera y Azoarcus como mayoritarios en estaciones depuradoras con etapa de desnitrificacin, coincidiendo con los resultados obtenidos en el presente trabajo. En el caso del gnero Azoarcus los valores que suelen presentarse en estaciones depuradoras de aguas residuales varan entre un 3% y un 16% pudiendo alcanzar valores superiores a un 30% cuando se emplean fuentes de carbono orgnico externas (Thomsen et al., 2007). Y en el caso de Thaurea los valores hallados ms comnmente se encuentran entre un 2% y un 11%, por lo que en conjunto pueden llegar a suponer un porcentaje relevante de la poblacin de desnitrificantes en una estacin depuradora con suplemento de carbono orgnico. Por otro lado, las bacterias del gnero Paracoccus, hibridadas mediante la sonda PAR651, redujeron su concentrancin en el licor mezcla de forma progresiva. Sin embargo, 5 das despus de la resiembra llevada a cabo para recuperar la poblacin de NOB, su concentracin se increment hasta alcanzar una concentracin del 10%, que posteriormente se estabiliz en torno a un valor del 7% en la fase final del periodo experimental. Respecto a la sonda DEN67, que hibrida para bacterias que emplean metanol como fuente principal de carbono orgnico, no dio resultados positivos. A continuacin se presentan imgenes tomadas a lo largo del periodo experimental para las sondas AT1458 y PAR651. Se puede observar como las agrupaciones de bacterias Azoarcus/Thaurea (Figura 29) dan lugar a colonias agrupadas e irregulares y Paracoccus (Figura 30) dan lugar a colonias irregulares o circulares en funcin del nmero de bacterias que la conforman, aunque por lo general forman grupos dispersos.

94

Resultados y Discusin FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

Figura 29. Imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las bacterias desnitrificantes identificadas por la sonda AT1458. Imgenes tomadas a 63x.

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Resultados y Discusin FASE I

FASE II

FASE III

FASE IV

Figura 30. Imgenes obtenidas mediante la tcnica FISH a lo largo del periodo experimental. En verde se muestran las bacterias del dominio Eubacteria (sonda EUBmix) y en rojo las bacterias desnitrificantes identificadas por la sonda PAR651. Imgenes tomadas a 63x.

96

Resultados y Discusin 4.2.2.6 Influencia del pH y la concentracin de oxgeno disuelto en la poblacin de desnitrificantes. En la Figura 31 puede observarse la evolucin de las poblaciones de bacterias desnitrificantes hibridadas mediante las sondas AT1458 y PAR651 en relacin con la concentracin de nitrito y nitrato en el licor mezcla al final de la fase anxica de la etapa de reaccin.

Figura 31. Porcentaje de bacterias desnitrificantes (DES) en el licor mezcla detectadas con las sondas AT1458 y PAR651 en relacin con la sonda EUBmix. Concentracin de nitrito y nitrato en el licor mezcla al final de la fase anxica de la etapa de reaccin

La

reduccin

de

los

compuestos

nitrogenados

durante

la

fase

de

desnitrificacin no se vio afectada por la concentracin de oxgeno ya que sta se mantuvo en valores en torno a 0 mg O2/L. En cuanto al efecto del pH, los resultados obtenidos indicaron que tras incrementar el pH de inicio de ciclo de 6.5 a 7.5, las bacterias hibridadas mediante la sonda AT1458 (gneros Azoarcus, Thauera y Castellaniella) no se vieron afectadas, manteniendo el ritmo de crecimiento a lo largo de todo el periodo experimental. El porcentaje de bacterias detectadas por la sonda PAR651 se mantuvo en torno a valores del 2% respecto al dominio Eubacteria hasta el da 91. Transcurridos 8

97

Resultados y Discusin das de la resiembra, su concentracin se incremento hasta alcanzar un porcentaje del 10% que tras el incremento de pH a 7.5 se estabiliz en valores en torno al 7%. Esta reduccin pudo deberse tanto al efecto del pH como a la competencia generada por las bacterias de los gneros Azoarcus y Thauera. Ginige et al., (2005) observaron en un reactor que tena una elevada concentracin de los gneros Azoarcus y Thaurea, una reduccin en la concentracin de nitrito de 107 mg N-NO2/L a 0.02 mg N-NO2/L durante la etapa anxica con un pH de 7.5 y cido actico como fuente de carbono externa. De lo cual dedujeron que estos gneros son capaces de llevar a cabo el proceso de desnitrificacin de forma ptima en presencia de nitrito y cido actico, lo cual coincide con los resultados obtenidos en el presente trabajo. A este respecto, Morgan-Sagatsume et al., (2008) hallaron que bacterias del gnero Azoarcus se desarrollaron ms en un medio rico en nitrito y con cido actico como fuente de carbono. En cuanto al efecto de la concentracin de nitrito en el licor mezcla, tras la resiembra (da 83), la concentracin de nitrito se redujo pasando de 10 mg N-NO2/L a una concentracin de prcticamente 0 mg N-NO2/L. No obstante, la poblacin de bacterias desnitrificantes no se vio afectada y durante los das posteriores increment su concentracin de un 45% (da 91) a un 60% (da 124) alcanzando un porcentaje en torno al 70% en la etapa final de la Fase IV (da 174). Existen numerosos estudios que relacionan el desarrollo de una determinada poblacin de bacterias hetertrofas desnitrificantes con el sustrato empleado como fuente de carbono. Ginige et al., (2007) observaron que al emplear actico como fuente de carbono se potenci una poblacin determinada de bacterias en un sistema de fangos activados. Otros autores (Hallin et al., 1995; Isaacs y Henze, 1995; Lee y Weelander, 1996) indican que en sistemas de fangos activados en los que se aaden fuentes de carbono externas se pueden provocar modificaciones en la poblacin de bacterias hetertrofas. Sin embargo, en este estudio se observ que durante lo primeros das de experimentacin las poblaciones de bacterias no se vieron modificadas respecto a los valores del fango activo. Segn Ginige et al., (2005) y Osaka et al., (2006) el uso de cido actico promueve el desarrollo de miembros de Comamonadaceae y Rhodocyclaceae como Comamonas, Acidovorax y Thaurea. Thomsen et al., (2007) hallaron que empleando como fuente de carbono orgnico el cido actico se obtuvo la mayor toma de carbono por parte de los gneros Thaurea y Azoarcus, con un 50% y un 45% respectivamente identificando Azoarcus como desnitrificantes a partir de nitrato y Thaurea y Aquaspirillium a partir de nitrito.

98

Resultados y Discusin Gu et al., (2007) trabajaron bajo condiciones similares a las empleadas en el presente trabajo (23C y pH 6.5 - 8.3) y la desnitrificacin en presencia de cido actico fue ms favorable a partir de nitrito. Adems, observaron una menor demanda de materia orgnica, lo cual coincide con los resultados obtenidos, ya que en la etapa final del periodo experimental se observ una ligera acumulacin de actico en el efluente.

99

CONCLUSIONES

Conclusiones En este trabajo se ha estudiado el efecto de ciertos factores ambientales y de operacin sobre la evolucin y el comportamiento de diversas especies de microorganismos amonioxidantes, nitritoxidantes y desnitrificantes, presentes en un proceso biolgico de eliminacin de materia orgnica y nitrgeno de una corriente de agua residual tpicamente urbana. A continuacin se describen las conclusiones obtenidas ms importantes: 1. Mediante la aplicacin de la tcnica FISH se ha identificado que en el inculo los microorganismos amonioxidantes (AOB) dominantes correspondieron mayoritariamente a la especie Nitrosomonas oligotropha-lineage. Asimismo, se ha determinado que el gnero de bacterias nitritoxidantes presentes en el inculo ha correspondido prcticamente en su totalidad a microorganismos pertenecientes al genero Nitrospira. Por otro lado, las sondas de hibridacin disponibles para identificar organismos desnitrificantes han mostrado en este inculo microorganismos pertenecientes principalmente a los gneros Azoarcus, Thauera y Castellaniella, y en menor proporcin organismos del gnero Paracoccus. 2. Hibridaciones realizadas durante la evolucin del proceso a lo largo del periodo experimental, en las que se ha empleado la sonda general NSO1225 (organismos amonioxidantes -proteobateria) y diversas sondas especficas (NEU, Nse1472, Nmv, Nmo218 y Nsv443) para microorganismos amonioxidantes, han indicado un cambio poblacional. El porcentaje de microorganismos AOB identificados como ms abundantes en el inculo de puesta en marcha (Nitrosomonas oligotropha-lineage) descendi ligeramente a lo largo del periodo experimental, mientras que los microorganismos identificados con la sonda NEU se incrementaron de forma considerable, ya que fueron detectados en el inculo de puesta en marcha en un porcentaje inferior al 1% y alcanzaron unvalor del13%. 3. Dentro del grupo de microorganismos AOB identificados con la sonda NEU no se ha logrado determinar las especies de AOB presentes en el licor mezcla. Los resultados obtenidos empleando las sondas Nse1472 y Nsv443 han sido negativos. 4. La concentracin de oxgeno disuelto en un reactor biolgico es un parmetro fundamental para llevar a cabo el proceso de nitrificacin. De los

100

Conclusiones microorganismos involucrados en este proceso: microorganismos

amonioxidantes y nitritoxidantes, los microorganismos AOB han mostrado una mayor capacidad de superar situaciones puntuales de baja concentracin de oxgeno disuelto en el licor mezcla. Los microorganismos NOB, pertenecientes mayoritariamente al gnero Nitrospira, no lograron recuperarse de manera satisfactoria y su poblacin no alcanz valores estables a lo largo del periodo experimental, por lo que estos microorganismos son ms sensibles a bajas concentraciones de oxgeno disuelto en el medio. 5. El pH es un parmetro que influye de diversas formas en los procesos de eliminacin biolgica de nitrgeno de las aguas residuales, tanto por su accin intrnseca como inhibidor del proceso, como por su efecto en el equilibrio qumico entre sustrato e inhibidor (amoniaco - NH3 y cido nitroso - HNO2) de los organismos involucrados en el proceso de nitrificacin. Valores puntuales de pH 6.5 durante la operacin del proceso (inicio de cada ciclo) pudieron afectar la actividad de los organismos NOB, ocasionando que la nitrificacin se realizara slo hasta nitrito. Debido a que la concentracin de cido nitroso en el licor mezcla no ha sido suficientemente elevada, es importante destacar que esta reduccin de la actividad de NOB puede ser debida al propio efecto del pH bajo. Por otro lado, a pesar de incrementar el pH a 7.5 al inicio del ciclo, no se observ actividad de NOB y el nitrito continu acumulndose en el licor mezcla. 6. Las bacterias desnitrificantes de los gneros Azoarcus y Thaurea no se han visto afectadas por la modificacin del pH (periodos a pH 6.5 y 7.5) al inicio de cada ciclo de operacin. Asimismo, se ha observado que el incremento en la concentracin de nitrito potencia su desarrollo, por tanto estos microorganismos pueden emplear tanto el nitrato como el nitrito como aceptor de electrones durante el proceso de desnitrificacin. 7. Las bacterias desnitrificantes del gnero Paracoccus se han visto afectadas al pasar el pH al inicio de cada ciclo de 6.5 a 7.5. 8. La tcnica FISH puede ser empleada de manera satisfactoria en combinacin con otras tcnicas microbiolgicas y analticas, para llevar a cabo el seguimiento de poblaciones microbianas y diagnosticar el estado del proceso biolgico en una estacin de depuracin de agua residual.

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