MICROBIOLOGIA DEL AGUA

I.

INTRODUCCIN

El agua, alimento esencial para los animales incluido el hombre, frecuentemente acta como vehculo de transmisin de microorganismos entricos. La materia fecal puede accidentalmente alcanzar una fuente de abastecimiento, siendo la forma ms comn el ingreso a travs de los sistemas de pozo ciego a napas profundas. El Cdigo Alimentario Argentino (CAA), la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) en sus Guas para la calidad del agua potable, la Directiva 98/83/CE1 y otras normas internacionales, establecen o recomiendan requisitos de calidad para el agua de consumo humano. En general, la normativa establece que el agua es apta bacteriolgicamente para consumo si se encuentra exenta de microorganismos patgenos de origen entrico y parasitario intestinal. Ellos transmiten enfermedades tales como salmonelosis (Salmonella), shigelosis (Shigella), colera (Vibrio Cholerae), amebiasis (Entamoeba histolytica), alteraciones gastrointestinales (Aeromonas mesfilas, Helicobacter pylori, Campylobacter); giardiasis (Giardia lamblia), cristosporidiosis (Crystosporidium), esquistosomiasis (Schistosoma), desrdenes hepticos (virus de hepatitis), etc. La presencia de microorganismos patgenos en el agua de bebida es un riesgo que se incrementa en las reas marginales de mayor densidad poblacional o en zonas sin disponibilidad de agua potable. La seguridad que un agua contaminada puede ser causal de enfermedades, ha conducido a la necesidad de controlar rutinariamente la calidad microbiolgica de muestras de diversos orgenes. Los controles rutinarios de la totalidad de los microorganismos hdricos, potencialmente riesgosos para la salud, resultan difciles de llevar a cabo debido a la gran variedad de bacterias patgenas cultivables, a la complejidad de los ensayos de aislamientos y a la presencia en baja concentracin de varias especies altamente agresivas, sin que el orden detallado indique prioridad. Por esta razn, los anlisis bacteriolgicos apuntan a la bsqueda de microorganismos indicadores de contaminacin fecal y se centralizan en la cuantificacin de coliformes. Este grupo est integrado por enterobacterias, siendo Escherichia coli el indicador universal de contaminacin fecal.

II.

REVISIN DE BIBLIOGRAFIA
Para estudiar la relacin que existe entre calidad de agua y salud humana, es necesario introducir el concepto de microbiologa, y a partir de ello valorar la presencia de organismos microscpicos en agua potable, los efectos de competencia y/o sinrgicos de las distintas especies y la posibilidad de aplicar tecnologas de desinfeccin. La microbiologa es una rama de la biologa que estudia seres vivientes de tamao microscpico que existen como clulas aisladas o asociadas y tambin incluye el estudio de virus (microscpicos no celulares). En general, los microorganismos a diferencia de los macroorganismos, son capaces de llevar a cabo procesos de creci- miento, generacin de energa y reproduccin, independientemente de otras clulas sean del mismo tipo o diferentes. Las clulas estudiadas en microbiologa pueden pertenecer a dos grandes gru-pos, eucariotas y procariotas. Las eucariotas constituyen la unidad estructural de protozoarios, hongos y algas cuyo tamao las incluye en esta especialidad. Son orga- nismos unicelulares o multicelulares que poseen en su interior estructuras limitadas por membranas llamadas organelas (ncleo, mitocondrias y cloroplastos presentes slo en clulas capaces de realizar fotosntesis). Las clulas procariotas son las bacterias, cuya estructura interna es sencilla.Etimolgicamente el trmino procariota significa ausencia de membrana nuclea.

1. Microbiologa bacteriana
Las bacterias son microorganismos unicelulares que se reproducen por fisin binaria, conocida tambin como biparticin. Su tamao, por lo general es menor que el de una clula eucariota tpica (por ej. Escherichia coli 0,5 2 mm). Sin embargo, existe un amplio rango de tamaos segn las especies que puede variar desde 0,2 mm de dimetro como en el caso de los micoplasmas hasta 40 mm como en la Beggiatoa gigantea. La rigidez de la pared celular determina la morfologa de una clula bacteriana. Los principales tipos de formas que presentan las bacterias son: esfrica, bastn alargado o espiral (figura 1). Las bacterias de forma esfrica se denominan cocos (redondeados, ovoides o elpticos); las de forma de bastn alargado se denominan bacilos (cilndricos, fusiformes, etc.) y las de forma de bastn curvado se denominan espirilos. Aquellas bacterias cuya imagen proyectada sobre el plano tienen forma de coma, se llaman vibrios. Otras formas que pueden presentar las bacterias son filamentosa (ramificada o no), anillos y tambin estructuras con prolongaciones.
Figura 1. Microfotografas de cocos (a) y bacilos (b).

(a)

(b)

Si bien la mayora de las bacterias mantienen su forma, algunas pueden presen- tar modificaciones y se las denomina pleomrficas. El pleomorfismo est relaciona- do a veces a la edad del cultivo y se manifiesta en bacterias sin pared celular (micoplasmas). Las formas L son bacterias que perdieron la pared celular por una situacin de estrs (temperatura, presin osmtica, etc.) pero que son capaces de resintetizarla cuando el estrs cesa. Siendo la morfologa una caracterstica taxonmica, es importante determinar el fenmeno de pleomorfismo originado por las condiciones del cultivo, para evitar falsas identificaciones. Las clulas bacterianas, observadas al microscopio, pueden aparecer como clulas aisladas o agrupadas. Las agrupaciones de dos clulas de formas cocoides se denominan diplococos. El o los planos en los cuales tiene lugar la divisin celular, determina la disposicin caracterstica de especie. As, si existe un solo plano de divisin se originan cadenas, por ej. Streptococcus (cocos en cadena). Cuando la biparticin tiene lugar en dos planos perpendiculares, se originan ttradas, por ej. Pediococcus. La divisin en tres o ms planos ortogonales origina paquetes de 8 clulas o ms, por ej. Sarcina. Finalmente si ocurre fisin binaria en planos no perpendiculares se observa disposicin de racimos irregulares, por ejemplo Staphylococcus. Los bacilos pueden presentar otras disposiciones: en em- palizada (por giros de 180o), en forma de letra V o L (dos bacilos en posicin angu- lar) y varios bacilos que forman letras chinas.

El flagelo, una estructura celular procariota no constante, est involucrada en la motilidad bacteriana; es de naturaleza proteica (flagelina) y su composicin qumica es diferente a la del flagelo de una clula eucariota (estructura microtubular). La disposicin de los flagelos puede ser polar (localizacin en uno o ambo extremos de la bacteria) o pertrica (distribucin alrededor de la superficie celular). Algunos gneros de bacterias, entre ellos Bacillus, Clostridium, Sporolacto- bacillus, Sporosarcina, Desulfotomaculum, etc., tienen la capacidad de formar endosporas, que a diferencia de las esporas fngicas, no son formas de reproduccin sino estructuras de resistencia frente a agentes fsicos y qumicos. El fenmeno de esporulacin bacteriana est codificado a nivel gentico, y en presencia de glucosa los genes responsables se encuentran reprimidos. Una tcnica de coloracin con valor taxonmico, es la tincin diferencial de Gram que permite dividir las bacterias en dos grandes grupos. La respuesta a los reactivos usados, que guarda estrecha relacin con la ultraestructura de la pared celular (principalmente con el peptidoglicano o murena) logra clasificarlas en Gram(+) (gruesa capa de peptidoglicano) y Gram(-) (fina capa de peptidoglicano con membra- na externa de lipopolisacridos). 2.1. Crecimiento microbiano El crecimiento celular se define como el aumento ordenado de todos los com- ponentes qumicos que llevan a un incremento de los constituyentes y estructuras celulares. Los nutrientes, a partir de los cuales los microorganismos sintetizan sus princi- pales biomolculas y obtienen su energa, estn disueltos en agua, razn por la cual el crecimiento celular depende de la disponibilidad de agua. Las distintas especies bacterianas tienen diferentes requerimientos nutricionales (a veces especficos) y condiciones fisicoqumicas que les permiten permanecer viables. Los nutrientes requeridos en grandes cantidades son denominados macronu-trientes mientras que los micronutrientes son necesarios en cantidades trazas. Entre los primeros se encuentran C, H, O, N (los ms abundantes), P, S, K, Ca, Fe y Na, y entre los segundos podemos citar Cr, Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn. Algunos organismos, adems de los minerales, necesitan muy pequeas cantidades de nutrien- tes de naturaleza orgnica llamados factores de crecimiento. stos son vitaminas, aminocidos, purinas y pirimidinas. Los organismos que tienen tales requerimientos se denominan auxtrofos para diferenciarse de los prottrofos que son independientes de tales factores.

Dijimos que la nutricin es el proceso por el cual los seres vivos toman, del medio donde habitan, los nutrientes que necesitan para crecer. Estos nutrientes se requieren para dos fines: energticos (reacciones de mantenimiento) y biosintticos (reaccio- nes plsticas o anabolismo). Desde el punto de vista biosinttico, las bacterias se pueden dividir en auttrofas que crecen sintetizando sus materiales a partir de sustancias inorgnicas sencillas. Usual- mente el concepto de autotrofa se limita a la capacidad de utilizar el CO2 como fuente de carbono (clorofitas, cianofitas, Thiobacillus denitrificans, Nitrobacter, Nitrosomona). En el extremo opuesto se encuentran las hetertrofas cuya fuente de carbono es orgnica (Lactobacillus, Serratia, etc.). Existe una gama de situaciones intermedias con respecto a la utilizacin de fuentes de carbono y nitrgeno. Por ejemplo, las especies pertenecientes al gnero Pseudomonas utilizan compuestos orgnicos e Inorgnicos como fuente de C, y NH3, N2, NO2 y NO3 como fuente de nitrgeno. Como se mencion en prrafos anteriores, el oxgeno es un macronutriente y los Microorganismos se pueden dividir en cuatro grupos sobre la base del papel que juega el O2 en su nutricin. Las bacterias aerobias necesitan O2 para crecer; algunas de ellas requieren presiones de oxgeno inferiores a la atmosfrica (2 a 10% de O , en 2lugar de 20%) y se conocen como microaerfilas. Las anaerobias facultativas pueden realizar metabolismo energtico aerobio (respiracin aerobia) o anaerobio (res- piracin anaerobia y fermentacin), dependiendo del ambiente, la disponibilidad de oxgeno y la concentracin de nutrientes (por ej. las enterobacterias como E. coli). Las bacterias anaerobias estrictas son aquellas para las cuales el oxgeno resulta txico (por ejemplo Clostridium). Las bacterias anaerobias aerotolerantes al igual que las anteriores, presentan un metabolismo energtico anaerobio (fermentacin), pero soportan el oxgeno debido a que poseen enzimas detoxificantes (por ej. Streptococcus). El conocimiento de la nutricin microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el laboratorio. En general, como se ha mencionado, todos los microorganismos tienen requerimientos de macro y micronutrientes semejantes, aunque la forma en que cada uno de ellos es captado y su cantidad relativa pueden variar mucho entre los diferentes gneros. En el laboratorio, el desarrollo de los microorganismos se realiza en medios de cultivos que son ambientes artificiales diseados por el hombre para proporcionar todas las sustancias necesarias para el crecimiento microbiano. Los medios de cultivo se clasifican en: 1) Sintticos o definidos: Contienen concentraciones conocidas de sustancias qumicas puras, de naturaleza orgnica y/o inorgnica. La composicin de un medio sinttico depende del microorganismo que se quiera cultivar; as un medio definido para una bacteria con gran capacidad biosinttica ser ms simple que el de otra bacteria con menor posibilidad de biosntesis.

2) Complejos o indefinidos: Estn constituidos por ingredientes de alta calidad nutricional, pero de composicin qumica desconocida ya que son el producto resul- tante de infusiones y extractos de sustancias naturales complejas. Se usan digeridos crudos de casena (protena de leche), hgado, levadura, carne, soja, sangre, etc. Sin embargo, con ellos no se tiene un control nutricional preciso. Segn la finalidad para la cual fueron formulados, los medios de cultivo se pueden clasificar en: 1) Enriquecidos: Son medios complejos o sintticos con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente hetertrofos exigentes). Se adicionan al medio de cultivo sustancias nutritivas tales como azcares, sangre, suero, extractos de tejidos de animales y plantas. 2) Selectivos: Son aquellos que permiten por su diseo el crecimiento especfico de un determinado microorganismo o grupo de microorganismos e impiden mayoritariamente el desarrollo de los dems. Estos medios son de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de poblaciones microbianas mixtas. Se incorporan ciertas sustancias que otorgan la selectividad buscada al medio. Por ejemplo el agregado de lactosa, bilis, NaCl, azida, taurocolato, antibiticos, permite el desarrollo de un determinado grupo de microorganismos impidiendo el desarrollo de otros. 3) Diferenciales: Son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o ms tipos de bacterias en funcin de su distinto comportamiento respecto de algn nutriente del medio. Ese comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de una sustancia indicadora presente en el medio. Poseen en su composicin un reactivo o sustancia qumica que al combinarse con algn producto del metabolismo origina una coloracin caracterstica. Por ejemplo, el desarrollo de E. coli en medio Endo da colonias rojas ya que la fucsina decolorada con bisulfito de sodio al combinar- se con los aldehdos provenientes del metabolismo bacteriano de lactosa, imprime coloracin roja a la colonia. 4) Selectivos-Diferenciales: Representan una combinacin de los dos ltimos medios. Permiten el desarrollo de una bacteria o un tipo bacteriano y al mismo tiempo producen una coloracin caracterstica del organismo en estudio. 5) Electivos: Favorecen el desarrollo de una especie bacteriana y las restantes crecen poco y lentamente. Cualquiera sea el tipo de medio, se pueden preparar para ser usados en estado lquido, slido o semislido. Los medios de cultivo lquidos se conocen como caldos y a partir de ellos, por el agregado de un agente solidificante estable (agar), se preparan medios de consisten- cia slida o semislida, que se denominan medios slidos o agarizados. El gelificante ms usado es el agar-agar en una concentracin de 1,5-2% y 0,7% para el slido y semislido respectivamente. Presenta la gran ventaja que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los 100oC, lo que permite su uso para la mayora de las bacterias y adems son muy pocos los microorganismos que lo hidrolizan (agarolticos) como ocurre con la gelatina.

El medio de cultivo requiere una esterilizacin, inmediatamente despus de su preparacin, para eliminar los microorganismos contaminantes; esto se hace normalmente por calor hmedo a menos que en su composicin, el medio contenga sustancias termolbiles. Su manipulacin posterior, para mantener las condiciones de asepsia, requiere ciertas precauciones, por ejemplo trabajar en flujos laminares o cerca de llama de mecheros. La transferencia de un cultivo desde un recipiente a otro se lleva a cabo con pipeta estril o con ansa o aguja previamente esterilizadas por incineracin a la llama. Los medios de cultivos agarizados son utilizados para el aislamiento microbiano a partir de muestras donde coexisten diferentes poblaciones, las que posteriormente se siembran en medios de cultivos lquidos adecuados para obtener un crecimiento mxi- mo. Tanto en los medios artificiales de laboratorio como en el ambiente natural, la nutricin de la clula lleva inicialmente a un aumento de tamao y peso que precede a la divisin celular. En la mayora de los microorganismos, el crecimiento contina hasta que la clula se divide en dos clulas hijas mediante el proceso de fisin binaria, el cual conduce al crecimiento de las poblaciones. Es difcil estudiar el crecimiento de la clula individual, especialmente en los microorganismos, debido a que los mtodos analticos no son los suficientemente sensibles como para ser aplicados a estructuras tan pequeas. Es por esto que habitualmente para evaluar el crecimiento se analiza el aumento de la poblacin microbiana. El crecimiento de una poblacin tiene lugar en forma exponencial. Una clula se divide en dos clulas hijas y luego stas se dividen a su vez en dos nuevas clulas, o sea que en cada perodo de divisin, la poblacin se duplica por lo que la multiplicacin corresponde a una progresin geomtrica: 20 21 22 23 2n. El intervalo de tiempo requerido para que una poblacin se duplique se define como tiempo de generacin o tiempo de duplicacin y se representa con la letra g. No todas las bacterias tienen el mismo tiempo de generacin. Para algunas, como E. coli, g es 20 min y para otras, como Nitrosomona y Nitrobacter, g es mucho mayor (5-10 h). El tiempo de generacin depende de los nutrientes y de las condiciones fisicoqumicas del medio. A pesar que las bacterias son capaces de crecer en un amplio rango de condiciones ambientales y utilizar diversos nutrientes, el crecimiento mximo, para una dada especie, se lleva a cabo bajo condiciones ptimas de pH y temperatura. El mtodo ms usado para determinar el tiempo de generacin consiste en ino- cular el medio de cultivo apropiado con las clulas bajo estudio. Al cabo de determina- dos intervalos de tiempo, bajo condiciones ptimas, se toman muestras para el recuen- to de microorganismos.

La velocidad de crecimiento k vara con la naturaleza y concentracin de los nutrientes, pH, temperatura, fuerza inica del medio, etc., adems de factores genticos. El crecimiento de una poblacin bacteriana durante un dado perodo de tiempo se representa grficamente como el log del nmero de clulas en funcin del tiempo (figura 2).
Figura 2. Curva de crecimiento bacteriano.

c d b log x a tiempo
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En la figura 2 se distinguen cuatro fases: fase de latencia o fase lag (a); fase exponencial o fase logartmica (b); fase estacionaria (c) y fase de muerte (d). Entre cada una de estas fases existe un perodo de transicin que representa el tiempo requerido para que todas las clulas entren en una nueva fase. Al inicio del crecimiento, los microorganismos requieren un perodo de adaptacin al nuevo ambiente. Esta es la fase de latencia o fase lag. En ella, las clulas sintetizan enzimas involucradas en el metabolismo de los nutrientes disponibles, se incrementa la sntesis de macromolculas como RNA y protenas. Sin embargo, la sntesis de DNA permanece constante y las clulas no se dividen (k = 0). La longitud de la fase lag depende del estado fisiolgico y gentico del microorganismo al ser introducido en el medio de crecimiento. Si las clulas provienen de un medio de cultivo diferente, o de un cultivo agotado (viejo) con acumulacin de metabolitos txicos para las clulas, stas requerirn mayor tiempo para reiniciar el crecimiento activo y presentarn una fase lag larga. En contraposicin, si las clulas provienen de un medio idntico y han sido obtenidas de un cultivo joven, la fase de latencia ser corta o inexistente. Existen otros factores que pueden influir sobre la fase de latencia: cantidad de microorganismos sembrados (inculo), dao que pudieron sufrir las clulas por la accin de radiaciones, calor, sustancias antimicrobianas, etc.

En la fase logartmica o fase exponencial, las clulas se dividen regularmente segn el tiempo de generacin de cada especie. Por ejemplo, E. coli en un determinado medio de cultivo puede dividirse cada 20 min durante la fase exponencial, mientras que si el crecimiento se produce en un medio ms pobre, la divisin puede suceder cada 30 min o ms. En esta fase, y en condiciones apropiadas, la velocidad de crecimiento es constante y mxima, y de esta manera el valor de k para esta fase es el adecuado para estudiar el efecto de los factores ambientales, la utilizacin de distintos sustratos, etc. Durante esta fase, la poblacin total es casi uniforme en lo que se refiere a composicin qumica de las clulas, actividad metablica y otros caracteres fisiolgicos. Las clulas son viables y su tamao constante. Como consecuencia del agotamiento de nutrientes o la acumulacin de productos txicos del metabolismo, disminuye la velocidad de crecimiento hasta que llega a detenerse (k = 0). En este punto, se dice que el cultivo est en fase estacionaria. La transicin entre la fase log y estacionaria, implica una etapa de crecimiento desequilibrado (crecimiento no balanceado) durante el cual los componentes celulares son sintetizados a diferentes velocidades. En consecuencia, las clulas en fase estacionaria tienen una composicin qumica diferente a la de las clulas en fase exponencial. El nmero de clulas viables permanece constante, porque mientras algunas de ellas se dividen, otras mueren. Las clulas viables continan produciendo cidos y productos txicos. Algunas clulas muertas se lisan y liberan enzimas (proteasas, nucleasas y lipasas) que degradan las macromolculas a molculas ms pequeas, las que a su vez sern usadas por las clulas vivas. Esta fase puede extenderse desde horas hasta varios das dependiendo de la especie bacteriana. Si la incubacin del cultivo se prolonga varias horas despus que la poblacin ha alcanzado la fase estacionaria, las clulas alcanzarn la fase de muerte que se caracteriza porque k es constante, indicando que el nmero de clulas vivas decrece con el tiempo en progresin geomtrica. La velocidad de muerte y la duracin de esta 41 fase varan en las distintas especies bacterianas. En ciertos casos, la muerte se acompaa de lisis celular que se manifiesta por una disminucin del nmero de clulas viables y masa celular. Cuando no hay lisis, decrece el nmero de clulas viables mientras que la masa celular permanece constante.

La medicin del crecimiento microbiano implica distinguir entre el nmero de clulas viables y el nmero de clulas totales. El segundo incluye clulas vivas y muertas, mientras el primero incluye slo las clulas vivas. Para distinguir entre ambos tipos de clulas se utilizan mtodos fsicos y qumicos. Frecuentemente pueden correlacionarse los datos obtenidos a partir de ms de un mtodo. Algunas de las tcnicas empleadas se muestran en la tabla 2. A ttulo informativo, se resumen dos de los mtodos ms empleados.

Recuento en medio slido: El recuento de colonias es la forma ms prctica para distinguir clulas viables y no viables en una suspensin bacteriana. Cada bacteria viable da lugar a la formacin de una colonia despus de la incubacin en un medio agarizado apropiado. Se diluye la muestra, se toma un volumen determinado y se siembra en un medio agarizado contenido en cajas de Petri. Se incuba y una vez desarrollado el cultivo, se cuenta el nmero de colonias expresndose el resultado como UFC mL-1 (unidades formadoras de colonia por mL). Turbidimetra: Las bacterias poseen un elevado ndice de refraccin que permite la dispersin de la luz que incide sobre ellas y el crecimiento queda determinado por el enturbiamiento originado en un medio lquido. Debido a los colores de los medios de cultivo, generalmente se usan longitudes de onda entre 490 y 660 nm. Esta tcnica es de fcil ejecucin y da resultados inmediatos, y se la conoce vulgarmente como mtodo DO (densidad ptica). El desarrollo de un microorganismo en un ambiente, sea ste su ambiente natural o un medio de cultivo de laboratorio, est determinado por los nutrientes disponibles y las condiciones fsicoqumicas. Son muchos los factores fsicoqumicos que pueden afectar el crecimiento microbiano, entre los cuales los ms importantes son: temperatura, pH, biodisponibilidad de agua, presin osmtica, disponibilidad de O2, tensin superficial y radiaciones Ellos modifican la velocidad de crecimiento de los microorganismos, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la detencin del crecimiento e incluso su muerte. Ninguno de los factores ambientales acta independientemente y un cambio en uno de ellos puede afectar la accin del otro. As como los requerimientos nutricionales son diferentes para los distintos microorganismos, tambin lo son las condiciones fisicoqumicas adecuadas para su desarrollo, as se explica la variada distribucin de los mismos en la naturaleza. Conocer la respuesta de los microorganismos a su medio ambiente es importante para darles condiciones ptimas de desarrollo o, por el contrario, para inhibir su crecimiento. Es decir, permite ejercer un control del crecimiento microbiano. La temperatura es uno de los factores ambientales ms importantes por su amplia aplicacin. Temperaturas extremadamente bajas y extremadamente elevadas, se utilizan de manera corriente para la conservacin de microorganismos o para provocar su muerte respectivamente. La razn para ello es que a temperaturas extremadamente bajas, tanto la membrana plasmtica como el citoplasma microbiano pierden fluidez disminuyendo o deteniendo completamente el transporte de nutrientes desde el medio externo y las reacciones enzimticas propias del metabolismo que permitiran la utilizacin de estos nutrientes. Por el contrario, temperaturas demasiado elevadas, inactivan sistemas enzimticos, desnaturalizan protenas y daan las envolturas celulares llevando a la lisis trmica. Existe, entre ambos extremos, un intervalo de temperatura de crecimiento en el cual un dado microorganismo es capaz de incorporar nutrientes del medio ambiente, conducirlos por los caminos catablicos y anablicos necesarios para el crecimiento y divisin celular, que da como resultado el crecimiento de una poblacin.

Los valores de pH superiores e inferiores al rango que corresponde a un dado microorganismo son nocivos, ya que afectan la estabilidad de la membrana plasmtica, inhiben enzimas, y alteran el transporte de solutos y la nutricin. Muchos nutrientes ingresan a las clulas atravesando la membrana plasmtica por transporte pasivo, el que slo puede llevarse a cabo si los nutrientes estn en su forma no ionizada. El pH del ambiente puede tener un efecto nocivo indirecto sobre los microorganismos, produciendo ionizacin de algunos nutrientes e impidiendo su utilizacin. Todos los microorganismos poseen mecanismos de regulacin del pH citoplasmtico que les permite mantener su valor constante. El mantenimiento de un pH constante en el citoplasma es muy importante para la supervivencia de los microorganismos ya que la acidificacin o alcalinizacin del mismo lleva a la desnaturalizacin de componentes vitales de la clula (protenas a pH bajo y cidos nucleicos a pH elevado). ste es el efecto nocivo directo del pH del ambiente. Todos los microorganismos requieren agua para vivir; y la disponibilidad de agua se expresa como actividad de agua (a ).w La actividad est dada por la presin de vapor de agua en el aire que se encuentra en equilibrio con una solucin o sustancia, con relacin a la presin de vapor del agua pura. Su valor vara de 0 a 1, siendo ms alto cunto ms agua libre tiene el ambiente. En el ambiente en el que desarrollan los microorganismos, no toda el agua est disponible. La actividad de agua es alterada por dos efectos: el osmtico (interaccin con solutos) y el mtrico (adsorcin a superficies). Por ambos efectos, la disponibilidad de agua puede ser baja, y en ese caso, los microorganismos tienen dificultades para incorporar nutrientes, limitando esto su desarrollo. Segn el rango de aw al que crecen, los microorganismos se clasifican en: normales (a =1-0,95) como Streptococcus, osmotolerantes (a =0,95-0,80) como w w Staphylococcus, osmfilos (aw=0,80-0,75) y osmfilos extremos (aw=0,75-0,63). Los ambientes de alta osmolaridad contienen principalmente altas concentraciones de cloruro de sodio o azcares. Los microorganismos que toleran o requieren NaCl se pueden clasificar en halotolerantes (toleran elevadas concentraciones de ClNa pero no lo requieren, por ej. Staphylococcus aureus), halfilos moderados (suelen ser bacterias marinas que viven en concentraciones NaCl igual a 0,5 M y tienen requerimientos concretos de a w equivalente a la de agua de mar, as como concentraciones determinadas de iones Na+), halfilos extremos o hiperhalfilos (por ej. Halobacterium y Halococcus que requieren concentraciones saturantes de sales, 4 a 7 M de NaCl). La naturaleza de las paredes celulares favorece la ubicacin de las bacterias en la superficie del lquido, para optimizar la energa superficial. En esas condiciones, la deplecin local de nutrientes puede ocurrir rpidamente; se establecen gradientes pronunciados de nutrientes y de oxgeno, en direcciones opuestas. Para evitar estos efectos se utiliza, en los medios de cultivo, tensoactivos o surfactantes que reducen la tensin superficial y permiten el desarrollo de los microorganismos de manera uniforme en todo el medio. Al reducir la tensin superficial, el O difunde ms fcilmente llegando hasta 2 el fondo de los tubos con medio lquido. Los grumos o agregados que forman algunos microorganismos durante el crecimiento, tambin desaparecen con el uso de estos agentes, favoreciendo la nutricin. El surfactante ms comnmente usado es un detergente no-inico, el Tween 80. En su molcula tiene un cuerpo carbonado (hidrofbico) y una cabeza polar (hidroflica) que recuerda a los fosfolpidos de membrana.

2. Microorganismos Presentes en Aguas Naturales

La variabilidad microbiolgica de las aguas naturales abarca numerosos organismos e incluye clulas eucariotas (algas, protozoarios y hongos), clulas procariotas (bacterias) y virus (microorganismos con capacidad de sntesis nula). Algas Estos microorganismos contienen necesariamente clorofila para la actividad fotosinttica, sin embargo el color verde puede estar enmascarado por otros pigmentos (carotenoides) presentes. Son aerobias, y en ambientes con poco oxgeno, mueren, flotan y se descomponen produciendo mal olor. Podemos encontrar las siguientes familias de algas:

Chlorophyta o algas verdes que huelen a pescado o hierba.

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Cyanophyta o algas verdes azuladas con olores desagradables que pueden producir sustancias txicas. Chrysophita son de color amarillo verdoso y a menudo generan olores aromticos (geranios) o huelen a pescado, por ej. Aulococeira y Cyclotella. Protozoarios Frecuentemente en el agua contaminada con heces se encuentran dos protozoarios parsitos con incidencia en salud humana, responsables de epidemias: Giardia lamblia: es flagelado con un tamao de 15 mm y se transmite al hombre a travs de agua contaminada con materia fecal. Las clulas del protozoario producen un estado de reposo denominado quiste. Los quistes al ser ingeridos germinan y causan giardiasis, enfermedad caracterizada por diarreas, calambres intestinales, flatulencia, nauseas, sntomas que pueden ser agudos o crnicos. La giardisis es una de las enfermedades parasitarias de origen hdrico ms comunes. Cryptosporidium parvum: es un parsito del hombre y animales de tamao muy pequeo (2-5mm), redondeado que crece en el interior de las clulas del epitelio mucoso de intestino y estmago. Los quistes infecciosos producidos por este protozoario poseen una pared muy gruesa. Los quistes de Cryptosporidium son mucho ms resistentes a la cloracin que los de Giardia. La criptoposiosis es una infeccin que se caracteriza por dolores estomacales, nauseas, diarrea y deshidratacin.

Virus El 87% de las enfermedades virales transmitidas por el agua son causadas por el virus de la hepatitis (adenovirus y rotavirus).

Bacterias Ms del 80% de las bacterias descriptas en el Manual de Bergey pueden aislarse del agua. Teniendo en cuenta la respuesta a la tincin de Gram, a continuacin se mencionan y describen algunas de las ms importantes. Bacterias Gram negativas Entre las especies que se han aislado de aguas, podemos mencionar a las pertenecientes a los gneros Pseudomonas, Flavobacterium, Gallionella, Enterobacteriaceae, Aeromonas, Vibrio, Achromobacter, Alcaligenes, Bordetella, Neisseria, Moraxella y Acinetobacter. Las pseudomonas son las ms comunes en napas freticas debido a su versatilidad respecto a fuentes de carbono, y a sus bajos requerimientos nutricionales. Ellas son bacilos psicrfilos, presentan flagelos pertricos, producen pigmentos (verde, azul verdoso, rojo, marrn) y no forman esporas. La morfologa y el hbitat de muchas pseudomonas coincide con el de bacterias entricas como Escherichia coli pero se diferencian en que no fermentan azcares. Segn el Manual de Bergey este grupo admite 7 especies, siendo Pseudomonas aeruginosa la de mayor relevancia sanitaria, es un patgeno oportunista por excelencia y el agente etiolgico principal de infecciones en vas urinaria, intestino, odo y heridas. Por su relativa resistencia al cloro es considerada un indicador de eficiencia de la cloracin. Su presencia en sistemas de almacenamiento, tanque, y cisternas, responde a un estado deficiente de dichas instalaciones. El control de pseudomonas, al igual que el de bacterias aerbicas, debe intensificarse en redes expuestas a contaminacin o cuando se comprueba cloracin deficiente. Flavobacterium es un gnero ampliamente distribuido en aguas y suelos. No ha sido encontrado en sedimentos de acuferos profundos pero si en las aguas que se extraen de ellos. Por esta razn, se duda si las flavobacterias se encuentran naturalmente en un acufero o simplemente colonizan el pozo luego de su perforacin. Son bacilos que se caracterizan por falta de movilidad y produccin de pigmentos de color amarillo.

Los bacilos del gnero Gallionella se caracterizan por ser quimiolittrofas, obtienen energa por oxidacin de Fe2+ a Fe3+ y la precipitacin usualmente de hidrxidos de (III), en o sobre las colonias, les otorga una coloracin marrn caracterstica. Ellas crecen en lugares donde existen mezclas de aguas aerobias y anaerobias, y donde abunda el ion Fe2+. As, en pozos donde existe una interfaz aero-anaerbica, su desarrollo causa obstruccin por la precipitacin de oxihidrxidos de hierro (III). Las enterobacterias o Enterobacteriaceae son las ms importantes dentro de los anaerbicos facultativos y su presencia en agua est asociada a contaminacin fecal. Este grupo de bacterias habita naturalmente el intestino de los animales. Son bacilos no esporulados, no mviles y si lo son es por flagelos de insercin pertrica, con requerimientos nutricionales relativamente simples. Generalmente se identifican por su capacidad para fermentar glucosa por va glucoltica dando cidos como producto final. Escherichia coli, habitante normal del intestino humano, es utilizada como indicador de contaminacin fecal de aguas.

Las cepas patgenas de E. coli causan infecciones del tracto intestinal (generalmente agudas y no presentan mayores complicaciones, excepto en nios y adultos con deficiencias nutricionales). Otros ejemplos de patgenos humanos de este grupo son Shigella, Salmonella y Klebsiella. Shigella dysenteriae es causante de la disentera bacilar, Salmonella typhimurium y typhi producen gastroenteritis y fiebre tifoidea respectivamente. El grupo Vibrio est integrado por bacilos curvados, anaerobios facultativos, poseen flagelos polares aunque algunos son pertricos. Se diferencian de las Pseudomonas en su metabolismo no fermentativo. Estn presentes en aguas dulces o marinas. Vibrio cholerae, especie ms representativa de este gnero, es patgeno para humanos y responsable del clera. Su transmisin es casi exclusivamente por va hdrica. Otras especies patgenas importantes para el hombre que se pueden encontrar en muestras de agua pertenecen a los gneros Neisseria, Moraxella y Acinetobacter. Los cocos del gnero Neisseria, aislados de sedimentos de acuferos aerbicos, son causantes de gonorrea (Neisseria gonorrhoeae) y meningitis ( Neisseria meningitidis). Las especies de Moraxella y Acinetobacter son bacilos y se transforman en cocos solamente en la senectud, y por ello se las propone como cocobacilos. Algunas especies de Moraxella han sido aisladas de aguas profundas originadas de acuferos aerbicos y representantes del gnero Acinetobacter se encuentran frecuentemente tambin en aguas subterrneas aerbicas. Bacterias Gram positivas No representan un grupo muy difundido en agua, sin embargo incluye algunos patgenos humanos aislados especialmente de aguas subterrneas. Los cocos ms comunes pertenecen a los gneros Micrococcus , Staphylococcus y Streptococcus. Los micrococos y estafilococos son aerobios y tolerantes a altas concentraciones salinas que permite diferenciarlos de los estreptococos. Varias especies de los dos primeros son importantes patgenos humanos; aunque no existe certeza acerca de su habitat original, la bibliografa
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las considera procedentes de aguas subterrneas. El gnero Streptococcus incluye a Enterococcus faecalis, patgeno humano que habita normalmente en el intestino de hombres y animales por lo que es un indicador de contaminacin fecal de aguas.

Las bacterias esporulantes, pertenecientes a los gneros Bacillus y Clostridium presentan metabolismo aerbico y anaerbico respectivamente. A partir de suelos y acuferos aerbicos se aslan especies incluidas en el gnero Bacillus; y a partir de suelos, sedimentos, aguas subterrneas anaerobias y ltima porcin del tracto intestinal de animales se pueden encontrar especies de Clostridium. Algunas especies son patgenos para animales, generalmente debido a la produccin de poderosas exotoxinas: la del Bacillus anthracis, conduce al desarrollo de antrax, enfermedad de animales que puede transmitirse a humanos (zoonosis) y la del Clostridium tetani que ocasiona una enfermedad en humanos caracterizada por tetanizacin de msculos, razn por la cual recibe el nombre de ttano. 3. Bacterias Indicadoras de Contaminacin Las condiciones bacteriolgicas del agua son fundamentales desde el punto de vista sanitario. La norma bacteriolgica de calidad establece que el agua debe estar exenta de patgenos de origen entrico y parasitario intestinal que son los responsables de transmitir enfermedades como salmonelosis, shigelosis, amebiasis, etc. Los microorganismos indicadores de contaminacin deben cumplir los siguientes requisitos: fciles de aislar y crecer en el laboratorio; ser relativamente inocuos para el hombre y animales; y presencia en agua relacionada, cuali y cuantitativamente con la de otros microorganismos patgenos de aislamiento ms difcil. Tres tipos de bacterias califican a tal fin:Coliformes fecales: indican contaminacin fecal. Aerobias mesfilas: determinan efectividad del tratamiento de aguas. Pseudomonas: sealan deterioro en la calidad del agua o una recontaminacin. Desde el punto de vista bacteriolgico, para definir la potabilidad del agua, es preciso investigar bacterias aerobias mesfilas y, coliformes totales y fecales. La gran sensibilidad de las bacterias aerobias msfilas a los agentes de los agentes de cloracin, las ubica como indicadoras de la eficacia del tratamiento de potabilizacin del agua. Las bacterias coliformes habitan el tracto intestinal de mamferos y aves, y se caracterizan por su capacidad de fermentar lactosa a 35C. Los gneros que componen este grupo son Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter y Edwardsiella. Todas pueden existir como saprofitas independientemente, o como microorganismos intestinales, excepto el gnero Escherichia cuyo origen es slo fecal. Esto ha llevado a distinguir entre coliformes totales (grupo que incluye a todos los coliformes de cualquier origen) y coliformes fecales (trmino que designa a los coliformes de origen exclusivamente intestinal) con capacidad de fermentar lactosa tambin a 44,5C. La existencia de una contaminacin microbiolgica de origen fecal se restringe a la presencia de coliformes fecales, mientras que la presencia de coliformes totales que desarrollan a 35C, slo indica existencia de contaminacin, sin asegurar su origen.
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Los enterococos fecales cuyo desarrollo ocurre a 35C se usan como indicadores complementarios de contaminacin fecal. La validez de todo examen bacteriolgico se apoya en una apropiada toma de muestra (recipiente estril de boca ancha y metodologa precisa), y en las adecuadas condiciones de transporte desde el lugar de la fuente de agua hacia el laboratorio (refrigeracin, tiempo). El sistema de conservacin de la muestra debe ser confiable, y la misma analizada inmediatamente o al cabo de un corto perodo entre extraccin y anlisis. El anlisis cuantitativo de bacterias indicadoras de contaminacin en una muestrade agua puede realizarse por dos metodologas diferentes:Recuento directo de microorganismos cultivables por siembra de la muestra sobre o en un medio de cultivo agarizado. Recuento indirecto (basado en clculos estadsticos) despus de sembrar diluciones seriadas de la muestra en medios de cultivos lquidos especficos. Se considera, al cabo de una incubacin adecuada, los nmeros de cultivos positivos y negativos. Esta metodologa se denomina Tcnica de los Tubos Mltiples y los resultados se expresan como nmero ms probable (NMP) de microorganismos. Adems de otros mtodos, se puede recurrir a aquellos en los que se aplica biologa molecular como por ejemplo, la tcnica de hibridacin in situ por fluorescencia (FISH) utilizando sondas marcadas en base a secuencia nucleotdica del gen 16S. En este captulo slo se describir el primer mtodo en el cual la muestra se concentra por filtracin sobre membrana, denominada Tcnica de la Membrana Filtrante. En ella, se procede a filtrar un volumen determinado de muestra (normalmente 100 mL) a travs de membranas de steres de celulosa generalmente con dimetro de poros de 0,45 mm y en algunos casos de 0,22 mm. Posteriormente, la membrana se deposita sobre un medio de cultivo selectivo y bajo condiciones favorables (temperatura y tiempo de incubacin) y sobre la membrana desarrollan colonias aisladas con aspectos caractersticos que permiten la identificacin y el recuento. Conociendo el volumen de muestra filtrada es posible determinar el nmero de UFC por unidad de volumen. La obtencin de resultados confiables requiere un intercambio de nutrientes a travs de los poros de la membrana, por ello se debe evitar la filtracin de aguas con alto contenido de material en suspensin que pueden obstruir las membranas.

La importancia de conocer las especies presentes en los sistemas acuosos naturales y el comportamiento en su ambiente, radica en la posibilidad de desarrollar nuevas tecnologas que logren su eliminacin y de esta manera controlar enfermedades de origen hdrico.

MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

I.

INTRODUCCIN

Con el nombre de alimentos generalmente se designan a los productos vegetales y animales utilizados en la nutricin del hombre. Tambin pueden incluirse en esta categora a los condimentos y especias. Algunas sustancias, como por ejemplo el cacao, son a la vez alimentos y condimentos. Los microorganismos tienen gran importancia en los distintos alimentos. Los productos vegetales poseen una flora natural superficial cuya composicin depende de las condiciones del entorno, en particular del contenido microbiano del aire, agua y del suelo. El interior de los tejidos, sin embargo, suele estar exento de grmenes. Tambin los animales poseen microorganismos en la superficie de la piel y en el tracto gastrointestinal, donde se aloja una flora especfica que en parte es eliminada con las heces. Sin embargo, con cierta frecuencia los microorganismos patgenos pueden invadir los tejidos animales y vegetales que normalmente estn libres de grmenes. La presente asignatura forma parte del rea integral profesional, en el campo de las ciencias y tcnicas de apoyo de la dimensin profesional. Su contribucin con el perfil de egreso es: evaluacin de procesos bioqumicos y fisiolgicos de la nutricin y la participacin en el rea de la investigacin contribuyendo al desarrollo de lneas que propicien avances cientficos y tecnolgicos de la nutricin.

II.

REVISIN DE BIBLIOGRAFIA

Criterios Microbiolgicos Un criterio microbiolgico para alimentos define la aceptabilidad de un proceso, producto o lote de alimentos basndose en la ausencia o presencia o el nmero de microorganismos y/o la investigacin de sus toxinas por unidad de masa, volumen o rea. Un criterio microbiolgico, segn se detalla en Principios para el Diseo y la Aplicacin de Criterios Microbiolgicos Para Alimentos - Codex Alimentarius Commission, consiste en: Sealar el alimento al que se aplicar el criterio, Eleccin de microorganismos y/o sus toxinas/ metabolitos a identificar y la razn de la eleccin para el producto, Un plan de muestreo indicando el nmero de muestras a tomar, el tamao de la misma y las caractersticas de la unidad analtica, Los mtodos para su deteccin y/o cuantificacin, los lmites microbiolgicos considerados apropiados para el alimento en el punto indicado de la cadena alimentaria, El nmero de unidades analticas donde se debe verificar el cumplimiento de dichos lmites. Al establecer un criterio microbiolgico se tienen que tener en cuenta los siguientes factores: Evidencia epidemiolgica de que el alimento en cuestin es un vehculo significativo de enfermedad. Susceptibilidad del alimento a ser contaminado por patgenos. Probabilidad de crecimiento microbiano en el alimento durante su manufactura, almacenamiento, distribucin y preparacin. Tratamiento que recibe el alimento antes de ser consumido (proceso de coccin, etc.).

La susceptibilidad de los probables consumidores a agentes patgenos y toxinas.

 Para establecer un criterio microbiolgico se debe definir previamente cual ser el propsito del mismo, ste puede comprender la evaluacin de: La inocuidad del alimento: para este propsito se requiere la determinacin de microorganismos patgenos y/o toxinas y en algunos casos la utilizacin de microorganismos indicadores (relacionados con la presencia de un patgeno). El cumplimiento de las Buenas Prcticas de Manufactura (BPM). La utilidad de un alimento como ingrediente para un propsito determinado. La vida til de un alimento a fin de determinar su fecha de vencimiento.

La comparacin entre los resultados de laboratorio obtenidos y los criterios microbiolgicos establecidos puede brindar informacin importante tanto para el productor/ elaborador como para los servicios de inspeccin en lo referente a la aceptabilidad del producto y / proceso. No basta con los criterios microbiolgicos para lograr este objetivo, sino que es de suma importancia verificar la aplicacin de las Buenas Prcticas de Manufactura u otros sistemas (por ejemplo, HACCP) para asegurar que los microorganismos indeseables sean eliminados o minimizados a un nivel tal que no puedan ocasionar dao a los seres humanos.

En Argentina, el Cdigo Alimentario Argentino establece dos categoras principales en cuanto a los criterios a seguir para la elaboracin de patrones microbiolgicos (provenientes de la internalizacin- Resolucin MSyAS N 003 del 11.01.95- de Principios Generales Para El Establecimiento De Criterios Y Patrones Microbiologicos Para Alimentos MERCOSUR - GMC - RES N 059/93):

 Criterio

obligatorio:

se

utiliza

para

referirse

los

microorganismos

considerados patgenos y/o sus marcadores, considerados de importancia en salud pblica y de acuerdo con la clase de alimento. En este caso su hallazgo constituye razn suficiente para imputar la infraccin y proceder en

consecuencia, en forma preventiva o represiva, imponiendo las sanciones que correspondan. Criterio complementario (recomendatorio): a diferencia del anterior es el criterio relativo a la evaluacin del proceso tecnolgico utilizado para la obtencin de un producto. Puede orientar al fabricante, aconsejarlo acerca de puntos sin control, y su seguimiento permitir inferir o determinar la falla, que se demuestra en los protocolos analticos. No tiene por finalidad la inspeccin final, con lo que se indica que de su incumplimiento no derivarn sanciones. En ese momento se destacar la idoneidad del inspector actuante, quien sugerir las acciones correctivas y se pondr a prueba la responsabilidad del elaborador, a quien de de manifestarse remiso a adecuarse, s se le aplicar la sancin correspondiente.

Eleccin de microorganismos / toxinas Cuando se evala el riesgo microbiolgico asociado a un alimento especfico todos los microorganismos transmisibles a travs de los alimentos deben ser considerados incluyendo bacterias, virus, hongos, levaduras, algas y parsitos. Los riesgos asociados como las toxinas/ metabolitos producidos por estos organismos y algunas propiedades intrnsecas (por ejemplo la resistencia a antibiticos) deben tambin ser considerados en la evaluacin. La presencia de algunos microorganismos en los alimentos no es necesariamente un ndice de riesgo para el consumidor. Vegetales y animales son la principal fuente de los alimentos que comemos y se encuentran naturalmente asociados a microorganismos, lo que implica que los alimentos que de ellos se obtengan tambin estarn asociados naturalmente a microorganismos. Los microorganismos elegidos para la elaboracin del criterio deben ser relevantes para el alimento y circunstancias particulares (producto crudo o listo para consumir, perfil del consumidor del producto). Si el criterio establece la bsqueda de microorganismos indicadores, su propsito debe ser detallado claramente (por ejemplo, detectar higiene inadecuada, indicar posible presencia de patgenos). Es importante tener presente que, mientras para un alimento cocido o listo para consumir la tolerancia para un determinado microorganismo es cero, s se puede permitir la presencia del mismo en el alimento crudo dentro de ciertos niveles- si ste fuera sometido a un tratamiento previo a su consumo por el cual se eliminar dicho microorganismo (por ejemplo, coccin). En este mismo sentido, la interpretacin del resultado es diferente segn se trate de producto crudo o producto cocido o listo para consumir.

Dentro de los microorganismos que componen un criterio microbiolgico se pueden distinguir dos tipos: a) Organismos indicadores: para la evaluacin de la inocuidad microbiolgica de los alimentos, la utilizacin de organismos indicadores es muy frecuente. El anlisis microbiolgico de alimentos para la bsqueda de estos microorganismos suele utilizar tcnicas sencillas y accesibles que permiten evaluar: Calidad de la materia prima, problemas de almacenamiento, abuso de temperatura, vida til (Recuento de aerobios mesfilos). Potencial contaminacin fecal o posible presencia de patgenos (Escherichia coli, Coliformes fecales). Contaminacin por manipulacin humana (Staphylococcus aureus coagulasa positiva). Contaminacin post tratamiento trmico (coliformes, enterobacterias, Staphylococcus aureus coagulasa positiva, estreptococos fecales). Productos metablicos de patgenos que indican un peligro para la salud (termonucleasa). Se utilizan para relevar las condiciones a las que ha sido expuesto el producto que pudieran implicar un posible peligro, no necesariamente presente en la muestra analizada, pero que podra hallarse en muestras paralelas. a) Organismos patgenos: aquellos que pueden encontrarse en el alimento en cuestin que pueden convertir al alimento en un potencial vehculo de enfermedad a quien lo consuma.

Planes de Muestreo para Anlisis Microbiolgicos en Alimentos El plan de muestreo es uno de los componentes del criterio microbiolgico. El plan de muestreo comprende: 1. El procedimiento de toma de muestra y 2. El criterio de decisin a aplicar en el lote de alimentos. El plan de muestreo debe ser econmicamente factible. Existen dos tipos de planes de muestreo reconocidos internacionalmente, definidos por la ICMSF: el plan de dos clases (por ejemplo: n=5, c=0 / n=5, c=2, m=) y el de tres clases (por ejemplo: n=5, c=2, m=103, M=104) donde: n = nmero de muestras examinadas de un lote; m = lmite microbiolgico que, en un plan de dos clases, separa la calidad aceptable de la rechazable y en un plan de tres clases separa la calidad aceptable de la marginalmente aceptable. M = lmite microbiolgico que en un plan de tres clases separa la calidad marginalmente aceptable de la rechazable c = nmero mximo permitido de unidades de muestra defectuosas (plan de dos clases) o marginalmente aceptables (plan de 3 clases). El plan de dos clases es utilizado generalmente para patgenos, mientras que el plan de tres clases es utilizado frecuentemente para el anlisis de indicadores de higiene donde es posible la cuantificacin (en unidades de masa o de volumen) de los microorganismos.

Es importante tener presente que en la prctica ningn plan de muestreo puede asegurar la ausencia de un microorganismo determinado. El nmero de

microorganismos encontrado en la muestra analizada puede ser distinta en una parte no muestreada del lote o de alimento. La representatividad de los resultados de laboratorio en microbiologa de alimentos depende del nmero de muestras recolectadas, de si la distribucin de los patgenos en el lote es homognea o no y de si el muestreo es realizado de manera aleatoria / dirigida. La confiabilidad de los resultados obtenidos depende de la tcnica seleccionada para realizar el anlisis (sensibilidad y especificidad).

Los anlisis microbiolgicos de los productos alimenticios, como as tambin las dems prcticas de laboratorio, deben estar respaldadas por los datos de pruebas de seguridad de una calidad, de un rigor y de una reproductibilidad suficientes. Los Principios de Buenas prcticas de laboratorio (BPL) se han elaborado para promover la calidad y la validez de los datos de anlisis que sirven para establecer la inocuidad de los alimentos. Se trata aqu de un concepto de gestin que abarca la totalidad del proceso de organizacin as como las condiciones en las cuales los estudios de laboratorio se planifican, se aplican, se verifican, se registran y se informan

Mtodos de laboratorio
Los mtodos de laboratorio utilizados para la deteccin o recuento de

microorganismos forman parte del criterio microbiolgico. La eleccin del mtodo a utilizar debe privilegiar a aquellos mtodos estandarizados y de alta sensibilidad que hayan sido validados por organismos internacionales/ nacionales de referencia. (Cdigo Alimentario Argentino, Art. 1413 y 1414) En los ltimos aos ha habido avances significativos en el desarrollo de nuevas tecnologas para la deteccin y la separacin de microorganismos de los alimentos. El desarrollo de tcnicas moleculares (PCR) e inmunolgicas (ELISA) brinda ventajas sobre los mtodos tradicionales, especficamente en lo que refiere a velocidad, pero su uso todava no se ha generalizado.

Consideraciones acerca de las decisiones (acciones correctivas) a tomar cuando el criterio (lmite) es excedido

En general, las decisiones a tomar cuando el lmite microbiolgico establecido en el criterio designado para el alimento en cuestin es excedido, dependern de los motivos que fundamentaron el establecimiento del criterio. Los lmites microbiolgicos del criterio pueden ser utilizados para definir la aceptabilidad de materias primas, la adecuacin de medidas higinicas, la posibilidad de contaminacin ambiental, la presencia de nichos microbianos en los equipos o la aceptabilidad del producto terminado. En la mayora de los casos cuando se analiza el producto final se sabe que los lmites se han excedido se tiene cuando ya es tarde. Si se aplican los criterios microbiolgicos en determinados puntos del proceso de elaboracin para el monitoreo de las condiciones de procesado, cuando se obtienen los resultados, stos sirven como disparador de acciones correctivas apropiadas en beneficio del producto final. Si alguno de los lmites que componen el criterio es excedido, las decisiones deben tomarse segn el tipo de peligro que involucre el lmite excedido y debe realizarse, en todos los casos, en el contexto de una evaluacin integral del proceso. (ver ms adelante criterio obligatorio, criterio recomendatorio) Si bien en la teora cualquier alimento perecedero poco cido puede constituirse en un peligro potencial a la salud si es manipulado incorrectamente, que se desarrolle una enfermedad transmitida por el alimento y la velocidad a la que esto ocurra depender de la cantidad y el tipo de contaminante presente.

Cantidades pequeas de Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens y Bacillus cereus pueden hallarse en los alimentos sin constituir un peligro directo para la salud del consumidor. Sin embargo, si los alimentos con bajos recuentos de S. aureus, B. cereus o C. perfringens son manipulados de manera incorrecta (deficiente refrigeracin, por ejemplo) se permitir el crecimiento de cualquiera de los tres microorganismos pudiendo as constituirse en un peligro directo para la salud: altos recuentos de S. aureus o de B. cereus puede resultar en la produccin de enterotoxinas en los alimentos antes de ser consumidos, mientras que altos recuentos de C. perfringens en el alimento previo a su consumo, puede llevar a la produccin de la toxina in vivo en el consumidor. Como bajos recuentos de S. aureus, B. cereus y C. perfringens pueden ser hallados en alimentos producidos aplicando las Buenas Prcticas de Manufactura, los criterios para estos microorganismos generalmente reconocen cierta tolerancia ya que el lmite establecido en el criterio es tal que incluso si es excesivamente superado, no existe riesgo directo para la salud del consumidor. Sin embargo, debemos tener presente que s podra existir peligro dada la posibilidad de que por crecimiento previo o manipulacin incorrecta del alimento que no se refleje en dichos recuentos (toxina preformada, por ejemplo) que s constituye un peligro directo para la salud. Si los ensayos para las toxinas preformadas son negativos, debe asegurarse que las condiciones de manipulacin sean las adecuadas. Si son positivos, el alimento debe ser destruido.

Si el lmite excedido corresponde a un criterio recomendatorio (no existe peligro directo para la salud), el alimento no necesariamente ha perdido su inocuidad. Este criterio permite un margen de discrecionalidad. Sirve para alertar sobre deficiencias en el proceso, distribucin, almacenamiento o comercializacin. En este punto, debe analizarse una serie de variables, no existiendo linealidad en este proceso, sino que la integracin de las mismas y el criterio del investigador determinarn la decisin a tomar. Debe realizarse inmediatamente una investigacin integral de las BPM, pudiendo incluirse un nuevo muestreo y poniendo especial nfasis en las prcticas de higiene del establecimiento.

Los datos recolectados en este procedimiento sern la base de la toma de decisin: si existe evidencia de que un punto crtico del proceso no se encuentra bajo control, debe generarse accin inmediata. La evidencia puede referir a las materias primas, a las condiciones microbiolgicas de los equipos de proceso, a deficiencias en la manipulacin del alimento, a falta de control de temperaturas de almacenamiento / coccin, al hallazgo de microorganismos indeseables en el ambiente de proceso o la condicin microbiolgica del producto terminado. (Por ejemplo, si el punto que se detect que no se encuentra bajo control son las materias primas no listas para consumo, el ingrediente no debera ser usado. Si ya ha sido utilizado, su influencia en la inocuidad del alimento debe ser evaluada y medidas apropiadas deben tomarse). La situacin es diferente si tenemos evidencia de que existe un peligro directo para la salud, es decir que el criterio obligatorio ha sido excedido. Nunca debe ser excedido el criterio obligatorio, si esto sucediera requiere de la accin inmediata de la Autoridad de aplicacin. Las medidas a tomar pueden ser, segn la situacin particular, destruccin, reprocesamiento, redestinacin. Los productos involucrados son retirados del mercado generalmente de manera voluntaria por el elaborador (las dimensiones del retiro y la forma de darle publicidad dependern de la evaluacin del riesgo -del tipo de producto, de peligro, entre otros-). De todas maneras, si el retiro no es voluntario, la Autoridad Sanitaria debe iniciar el sumario administrativo correspondiente. La legislacin provee alternativas a la destruccin si el producto, por el tratamiento que sufre durante su procesado, al momento de su consumo es inocuo. Cuando se consideran decisiones sobre el destino de alimentos que poseen un peligro directo para la salud, las alternativas diferentes a la destruccin total deben ser analizadas cuidadosamente. El reprocesamiento del producto est permitido y debera ser considerado si el peligro puede ser eliminado de esta manera (por ejemplo, reconstitucin y repasteurizacin de leche en polvo usada como ingrediente alimentario).

Interpretacin de resultados microbiolgicos en carne picada y alimentos a base de carne picada vacuna, porcina y de aves listos y no listos para su consumo segn Criterio Microbiolgico en CAA Alimentos involucrados (no listos para su consumo y listos para su consumo): Hamburguesas de carne vacuna, porcina y de aves, Salchichas frescas, Chorizos frescos y Alimentos elaborados a base de carne picada. Criterio Obligatorio Los alimentos que se incluyen en este criterio deben hallarse libres de Salmonella spp y de Escherichia coli O157:H7/NM. La determinacin es ausencia/ presencia en la cantidad indicada de producto porque ambas bacterias, especialmente la E. coli O157, puede ocasionar enfermedad en pequeas dosis. Criterio Complementario La evaluacin de la inocuidad de los alimentos no debe realizarse basndose en el anlisis de los microorganismos indicadores meramente, sino que es en el contexto de una evaluacin integral de los procesos desde el campo hasta la mesa, que se obtienen las herramientas necesarias para asegurar que se ha alcanzado la inocuidad del producto deseada. Se recomienda que al hallar recuentos superiores al lmite microbiolgico considerado en el criterio complementario Escherichia coli, Recuento -Recuento de Aerobios Mesfilos, Recuento de

de coliformes y Recuento de Staphylococcus aureus

coagulasa positiva, se coloque al pie del protocolo analtico una leyenda con las recomendaciones correspondientes. Por ejemplo: "El valor del recuento de Escherichia coli indicara prcticas de higiene deficientes en la elaboracin y/o conservacin inadecuada del producto.

En este tipo de producto, se utiliza para monitorear la implementacin de Buenas Prcticas de Manufactura. El recuento refleja: contenido microbiano de materiales crudos e ingredientes, la eficiencia del procedimiento de elaboracin / proceso, la condicin de higiene del equipo y utensilios y la almacenamiento y distribucin. relacin tiempotemperatura de

Alimentos

perecederos manipulados

correctamente pueden desarrollar RAM elevados y perder calidad si son almacenados por un perodo de tiempo prolongado. En este caso, el RAM no se encontrara elevado por la condicin de higiene del producto, sino por la vida til del mismo. Por ello es que la utilidad del indicador depende de la historia del producto y el momento de la toma de muestra.

En el uso o la interpretacin del recuento de aerobios mesfilos hay ciertos factores que deben ser tenidos en cuenta: Este recuento es slo de clulas bacterianas vivas. Los procedimientos que sufre el alimento en su elaboracin, por ejemplo proceso trmico, pueden enmascarar productos con altos recuentos o condiciones deficientes de higiene. Adems, el almacenamiento prolongado en congelacin o con pH bajo resulta en la disminucin del recuento. Este recuento no diferencia tipos de bacterias.

Recuento de Staphilococcus aureus coagulasa positiva Los estafilococos se encuentran en las fosas nasales, la piel y las lesiones de humanos y otros mamferos. Se los utiliza como componentes de criterios

microbiolgicos para alimentos cocidos, para productos que son sometidos a manipulacin excesiva durante su preparacin y para aquellos que son sometidos a manipulacin despus del proceso trmico. Generalmente, los estafilococos se eliminan durante la coccin. Altos recuentos en alimentos sometidos a procesos trmicos se deben a contaminacin posterior a este tratamiento (manipulacin, contacto con equipo o aire contaminados y/ o conservacin inadecuada del mismo- falta de refrigeracin-). La presencia de S. aureus puede indicar un riesgo potencial para la salud. Un nmero elevado de estafilococos puede indicar la presencia de toxinas termoestables, no obstante, un recuento bajo no significa ausencia de las mismas, ya que una poblacin numerosa pudo haberse reducido a un nmero ms pequeo debido a una etapa del proceso, por ej., calentamiento o fermentacin. Recuento de Escherichia coli El hbitat natural de este microorganismo es el intestino de los animales vertebrados. Los criterios microbiolgicos que incluyen E. coli son de utilidad en casos en que se desea determinar contaminacin fecal. La contaminacin de un alimento con E. coli implica el riesgo de que puedan encontrarse en el mismo patgenos entricos que constituyan un riesgo para la salud. Sin embargo, la ausencia de E. coli no asegura la ausencia de patgenos entricos. En muchos productos crudos de origen animal, bajos recuentos de E. coli pueden ser esperados dada la asociacin cercana de estos alimentos con el ambiente animal y por la probabilidad de la contaminacin de las carcasas, reses, etc. con materia fecal animal durante la faena.

Recuento de Coliformes: La presencia de bacterias coliformes en los alimentos no significa necesariamente que hubo una contaminacin fecal o que hay patgenos entricos presentes. Las bacterias coliformes son particularmente tiles como componentes de criterios microbiolgicos para indicar contaminacin postproceso trmico. Algunos coliformes (E. coli) son comunes en las heces del hombre y otros

animales, pero otros (Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia) comnmente se encuentran en el suelo, agua y semillas. Generalmente, en la leche cruda, vegetales, carne, aves y otros alimentos crudos se encuentran recuentos bajos de bacterias coliformes naturalmente por lo que presentan poco o ningn valor para el monitoreo de los mismos. Estos organismos se eliminan fcilmente por tratamiento trmico, por lo cual su presencia en alimentos sometidos al calor sugiere una contaminacin posterior al tratamiento trmico o que ste ha sido deficiente. Esto debera generar la determinacin del punto del proceso donde se produjo la contaminacin. Si se obtiene un recuento elevado en alimentos que han sufrido un proceso trmico, debe considerarse que existieron fallas (ausencia o deficiencia) en la refrigeracin postcoccin. Los coliformes se estresan subletalmente por congelacin, por lo que el recuento de coliformes en alimentos freezados debe ser interpretado con cuidado. El uso del recuento de coliformes como indicador requiere un conocimiento amplio del proceso que al alimento ha sufrido (produccin, procesamiento, distribucin, etc.)y del efecto que l ha tenido en las bacterias coliformes.

Referencias bibliogrficas
http:/.wikipedia.unmsm.pe http://www.fsai.ie/publication_list_index.htm http://www.fsai.ie/publications/guidance_notes/supporting_doc%20for_gn3.doc http://www.legislation.hsmo.gov.uk/si/si1995/Uksi_19953205_en_17.htm http://www.fsis.usda.gov/OPHS/rtetest/ttetable1.htm