ELETROFORESE CAPILAR

A eletroforese capilar (EC) um mtodo fsico de anlise baseado na migrao, dentro de um capilar, de solutos dissolvidos em uma soluo eletroltica, sob influncia de uma corrente eltrica. uma tcnica que permite a anlise quali e quantitativa ons inorgnicos, cidos nuclicos, protenas, metablitos secundrios e frmacos, sendo bastante aplicvel em diversas reas do conhecimento, como qumica, bioqumica, cincia forense, laboratrios clnicos, indstria farmacutica, entre outros. Trata-se de uma tcnica que apresenta resultados promissores em termos de resoluo, velocidade e potencial para automao, principalmente em relao eletroforese convencional, e apresenta uma instrumentao relativamente simples, como pode ser visto a seguir:

- Uma fonte de alta voltagem, que vai produzir o campo eltrico necessrio separao eletrofortica; - Dois reservatrios de eletrlitos, mantidos no mesmo nvel, que vo conter as solues andica e catdica; - Dois eletrodos (ctodo e nodo), imersos nos reservatrios dos eletrlitos e conectados fonte de alta voltagem e que iro consistir nos polos positivo e negativo do sistema; - Um capilar de slica fundida, de 10-100 m de dimetro e 40 a 100 cm de comprimento, feito geralmente de vidro. Os terminais do capilar so imersos nos reservatrios contendo os eletrlitos. Vai ser o caminho por onde os analitos iro migrar de acordo com sua mobilidade eletrofortica; - Detector capaz de monitorar a quantidade de analitos que passam atravs do segmento de deteco do capilar em intervalo de tempo especfico. Os detectores mais usuais em eletroforese capilar so baseados em espectrofotometria de absoro (UV-VIS) ou fluorimetria, sendo tambm utilizada a deteco eletroqumica ou por espectro de massas. Na eletroforese capilar, dois fatores governam o fluxo dos analitos pelo capilar: a migrao eletrofortica e o fluxo eletro-osmtico. A migrao eletrofortica a migrao de analito baseada em suas propriedades massa-carga, sendo caracterstica de cada analito e podendo ou no se dar no sentido em direo ao detector. Trata-se, portanto, do movimento dos analitos no capilar devido ao campo eltrico (E). A velocidade eletrofortica vai depender de fatores inerentes ao analito (tamanho, forma, carga eltrica) e fatores inerentes ao eletrlito (fora inica, pH, viscosidade e presena de aditivos), conforme a seguinte equao:

Como pode ser observado pela equao, quanto maior a carga e a voltagem aplicada, maior a velocidade eletrofortica. Se a carga lquida do analito for zero (ou seja, partcula neutra), no h mobilidade eletrofortica (velocidade igual a zero). Quanto maior o tamanho da partcula do analito, maior a viscosidade do eletrlito e maior o tamanho do capilar, menor a velocidade eletrofortica. Por isso importante tambm observar, no eletrlito, a viscosidade para que no haja diminuio desnecessria da velocidade eletrofortica que poderia acarretar em falta de reprodutibilidade inter-corrida e diminuio de eficincia. Como ser visto adiante, uma das consequncias do efeito Joule a alterao na viscosidade do eletrlito que pode acarreta em perda de reprodutibilidade. J o fluxo eletro-osmtico o fluxo de eletrlito ao longo do capilar, levando consigo os analitos, devido a superfcie negativamente carregada da parede interna do capilar de slica fundida, sendo a fora adicional que direciona todos os analitos atravs do capilar em direo ao detector, independente de sua carga. Esse fluxo eletro-osmtico ocorre por conta da presena de grupos silanis ionizados (quando em pH acima de 3,0) que vo interagir eletrostaticamente com ons de carga positiva presente no eletrlito, formando uma camada mvel de ctions em direo ao ctodo (polo negativo) formando um fluxo laminar uniforme, que permite que os analitos, independente de sua carga, migrem pelo capilar podendo chegar ao detector.

Uma das principais vantagens da eletroforese capilar em relao s demais tcnicas cromatogrficas que por conta desse bombeamento de fase mvel provocar um fluxo laminar, isto , uniforme em todo o dimetro do capilar, contrrio ao que ocorre no bombeamento por presso (CLAE e CLUE) em que o fluxo se d de forma parablica, podendo acarretar em alargamento de picos, como pode ser visto a seguir:

A velocidade do fluxo eletrosmtico (Veo) depende da mobilidade eletro-osmtica (eo), que, por sua vez, est diretamente relacionada densidade de carga da parede interna do capilar e s caractersticas do eletrlito, como pode ser visto na equao a seguir. Como pode ser observado, a amostra no influencia na velocidade do fluxo

eletroosmtico, que vai depender principalmente das cargas da parede interna do capilar, o que pode ser controlado pelo pH do eletrlito: quanto mais bsico o pH, maior a ionizao dos grupos silanis da parede interna do capilar e portanto maior a densidade de cargas negativas (potencial zeta) e maior a velocidade eletroosmtica.

A mobilidade eletrofortica e o fluxo eletro-osmtico podem, ou no, atuarem na mesma direo, dependendo da carga do soluto. Dessa forma, define-se velocidade total a soma das velocidades eletrofortica e eletroosmtica, o que esquematizado na figura abaixo:

Como pode ser observado, numa mesma corrida eletrofortica, consegue-se separar nions e ctions, de diferentes densidades de cargas. Como pode ser observado, elui primeiro as molculas com maior carga (positiva) e elui por ltimo s que tem menor carga (negativa). No entanto, na separao de nions, a eletroforese convencional seria muito demorada, portanto, nesses casos, para se acelerar o processo, utiliza-se polaridade invertida e fluxo eletroosmtico invertido, o que pode ser conseguido pela adio de tensoativos ao eletrlito, o que esquematizado a seguir:

A eletroforese com voltagem em gradiente uma boa alternativa para a separao simultnea de compostos com mobilidades eletroforticas muito diferentes em um perodo de tempo reduzido, no entanto pouco usual. Consistiria em comear a eletroforese com uma voltagem moderada para a separao dos analitos com mobilidade maior e em seguida aumentar essa voltagem para acelerar a velocidade dos analitos de mobilidade menor (lembrando que, segundo as equaes apresentadas, aumentando-se a voltagem, aumenta-se a velocidade eletrofortica e eletroosmtica). Tempo (t) necessrio para o soluto migrar uma distncia (l) do terminal de injeo do capilar at a janela de deteco (comprimento efetivo do capilar) definido pela equao:

Ou seja, quanto maior o tamanho efetivo do capilar, maior o tempo requerido para a corrida e quanto maior a velocidade total, menor o tempo necessrio para a corrida. Lembrando que o comprimento efetivo do capilar a poro do capilar que se situa entre o ponto de aplicao da amostra e o detector. O nmero de pratos tericos (N) um indicativo de eficincia da eletroforese capilar e que implicar diretamente na sua resoluo, sendo definido pela seguinte equao:

Portanto, como se pode observar, desejvel que aplique altas voltagens para se obter separaes com alta resoluo. Ao contrrios das demais tcnicas cromatogrficas, o nmero de pratos (N) no aumenta como o aumento do comprimento do capilar. N tipicamente 105 com as voltagens usuais aplicadas em eletroforese capilar. Por isso, diz-se que a eletroforese capilar uma tcnica de resoluo bastante elevada quando comparadas s demais. Um dos grandes gargalos da eletroforese o efeito Joule. Embora ele tenha sido enormemente minimizado com uso de capilares, ele ainda um problema que pode ocorrer na eletroforese capilar e que pode influenciar enormemente na resoluo e repetitibilidade das corridas. O efeito joule consiste na converso de energia de eltrica em energia trmica, decorrente da passagem da corrente eltrica pelo capilar, podendo ocasionar alargamento dos picos e piora na resoluo e repetitibilidade. O aquecimento produzido pode alterar a viscosidade do eletrlito o que pode alterar a velocidade de migrao e comprometer a repetitibilidade das corridas. A soluo mais empregada o uso de um sistema de controle de temperatura (capilar resfriado com lquido ou ar) e usar voltagens adequadas (no muito altas). Assim, o nmero de pratos tericos pode ser aumentado com o aumento da voltagem, mas o aumento da voltagem pode provocar efeito Joule que pode comprometer a resoluo e repetitibilidade das corridas.

CAPILARES: Tem de 10 a 100 m de dimetro e 40 a 100 cm de comprimento. So geralmente produzids em vidro, quartzo ou teflon, mas os de vidro so os mais utilizados principalmente por conta do custo mais acessvel. O teflon no muito utilizado pois no suportas elevadas voltagens. O quartzo seria o mais ideal, principalmente quando se pensa em deteco por UV, uma vez que quartzo no absorve luz UV. O vidro absorve UV, mas utiliza-se o artifcio de se criar uma janela no capilar prximo ao detector, que seria uma espcie de buraco que permite que a luz passe pela amostra mas no passe pelo vidro. So fundidos com slica (dixido de silcio) na parte interna, o que vai expor grupos silanis que so importantes para o fluxo eletroosmtico explicado anteriormente. No deve haver interao do analito com a slica, sendo inclusive, em alguns casos, necessrio utilizar eletrlitos aditivados com substncias que inibam essa interao. O capilar refrigerado externamente por ar ou lquido para evitar efeito Joule. O tamanho do capilar influencia na corrida das seguintes formas: - Quanto maior o capilar, menor a corrente eltrica e consequente maior tempo de migrao. - Quanto menor o dimetro interno do capilar, maior a capacidade de dissipao de calor (menor efeito Joule), permitindo maior elevao da voltagem e reduo no tempo de anlise e maior eficincia de separao (maior nmero de pratos tericos)

INJEO DE AMOSTRA: A quantidade de amostra injetada num eletrofergrafo capilar situa-se na ordem de 10 a 100 nL de amostra, o que pode ser justificado pelas micromtricas dimenses dos capilares. Esse aspecto traz tcnica uma enorme vantagem s demais por conta da pequena demanda de amostra, que crucial em algumas reas de aplicao (como por exemplo na rea forense). No entanto, isso tambm pode ser uma limitao quando se pensa em tcnicas preparativas, que exigem grande nmero de amostra. Por isso, ao contrrio das tcnicas cromatogrficas convencionais, na eletroforese capilar no possvel se realizar fracionamento de amostras, ou seja, no h possibilidade de eletroforese capilar preparativa. A injeo da amostra no eletrofergrafo capilar pode ser feita de duas formas: por injeo hidrodinmica ou por injeo eletrocintica. A injeo hidrodinmica consiste na injeo de amostra com base no uso de presso, vcuo ou gravidade. A injeo eletrocintica consiste na injeo com base nas mobilidades eletroforticas dos analitos, atravs da formao de um circuito eltrico entre o recipiente que contm a amostra e o eletrofergrafo. A injeo eletrocintica tem a desvantagem de favorecer a injeo de molculas de maior mobilidade, sendo, portanto, uma forma de injeo que no produz amostras representativas dentro do equipamento. Em ambos os tipos de injeo de amostra, fatores como tempo de injeo, concentrao da amostra, viscosidade da amostra e tamanho efetivo do capilar podem influenciar.

DETECO: Geralmente os mesmos detectores utilizados em CLAE, no entanto, existe uma dificuldade na deteco por conta do menor volume de amostra (nL) e pequeno dimetro interno dos capilares, o que exige que faz com que as mesmas tcnicas utilizadas em CLAE sejam menos sensveis em EC.

Como em qualquer anlise, o detector ideal deve ser verstil, sensvel, baixo nvel de ruido, ampla faixa de linearidade, linha de base estvel, robusto e responsivo a vrios tipos de analitos e a escolha do detector vai depender das propriedas fisico-qumicas do analito. Os principais detectores utilizados em eletroforese capilar podem ser em linha, isto , enquanto a soluo ainda migra capilar, ou aps a coluna, ou seja, na extremidade final do capilar. Os principais detectores em linhas para eletroforese capilar so: - Dectores de absorbncia (UV, visvel, UV-DAD, UV-indireta) - Detectores de fluorescncia (detectores de laser induzido por fluorescncia ou LIF) - Amperometria e condutivimetria (menos empregados em eletroforese capilar) A espectrometria de massas um tipo de deteco que realizado no final capilar.

VANTAGENS DA ELETROFORESE CAPILAR: Separaes de alta eficincia (nmero alto de pratos tericos comparativamente CLAE) Tempos de anlise relativamente curtos (poucos minutos) Instrumentao relativamente simples Pequena demanda de amostra No h alargamento de bandas Diminuio do efeito Joule (o calor dissipado mais facilmente dentro do capilar) Possibilidade de automatizao

REFERNCIAS QUE EU SUGIRO (ARTIGOS EM PORTUGUS): TAVARES, M. F. M. Eletroforese capilar: conceitos bsicos. Qumica Nova, v. 19, n. 2, p. 173-181, 1996. TAVARES, M. F. M. Mecanismos de separao em eletroforese capilar. Qumica Nova, v. 20, n. 5, p. 493-511, 1997. Ler tambm na Farmacopeia Brasileira 5 Edio (a parte de fluxo eletroosmtico muito bem explicadinha l) e no livro de Qumica Analtica de Skoog (tem todas as tcnicas cromatogrficas, praticamente).