Sie sind auf Seite 1von 6

ich moechte euch alle herzlich zum Gruppenseminar begruessen.

Das Thema ist Sequenzierung von Proteinen mittels Top-down Massenspektrometrie.

Beim Top-Down Ansatz werden intakte Proteine verwendet und im Massenspektrometer dissoziert, beim Bottom up wird die Probe zuerst enzymatisch Verdaut um kurze Peptide zu erhalten und diese dann anschliessend durch Chromatographische Verfahren getrennt und analysiert, dabei verliert man aber die Information, wie die Fragmente aneinandergereiht sind. Beim Top down wird typischerweise zuerst ein ESI Spektrum aufgenommen. Das liefert Information ber die Homogenitt des Samples und ob Modifikationen vorliegen. Durch Zugabe eines internen Kalibranten kann man die genaue Masse bestimmen und berprfen, ob diese Masse mit der aus einer DNA Datenbank vorhergesagten bereinstimmt.

Anschlieend kann man Ionen selektieren und mit verschiedenen Dissoziationsmethoden fragmentieren. Traditioneller Weise wird das in der Massenspektrometrie im positiven ESI Modus, also an protonierten Protein-Ionen durchgefuerht. Die Verbreitetsten Methoden sind ECD (electron capture dissociation) und collisionally activated dissociation, CAD. Beim ECD warden die Proteinkationen mit langsamen Elektronen beschossen, wodurch sie ein Elektron einfangen knnen und dann via Radikalchemie dissoziieren. Beim CAD werden die Proteinionen langsam durch Ste aufgeheizt und sie dissoziieren durch nichtradikalische Vorgnge. Betrachtet man die pI-Verteilung in dieser Datenbank, ergibt sich ein interessantes Bild. Wenig Proteine mit neutralem pI, viele mit pI groesser 7, die sich gut in protonierter form im positiven Esi Modus untersuchen lassen, aber ebensoviele mit pI kleiner 7. Speziell die sehr aziden protein lassen sich viel leichter deprotonieren als protonieren, sind also im negativen ESI besser analysierbar.

Fr die Dissoziation von ProteinANIONEN gibt es aber noch keine etablierten Methoden. In meiner Diplomarbeit habe ich 2 potentielle Methoden auf ihre Fhigkeit zur Sequenzierung im negativen ESI modus untersucht.

Zum einen CAD, wo wie im positiven die Ionen langsam durch Ste erhitzt werden und diese nichtradikalisch dissoziieren sollen. Zum anderen EDD, was fuer electron detachment dissociation steht, wo die Proteinanionen mit schnellen Elektronen beschossen werden, was zu einem Elektronenverlust und nachfolgender Rckgratspaltung fhren soll.

Cad von Proteinanionen war leider nicht erfolgreich.

Hier sind die mglichen Rckgratfragmente abgebildet. Bricht man zum Beispiel die Amidbindung erhlt man b und y Fragmentionen. Hier ist das CAD des 11 minus Ladungszustand des Ubiquitin abgebildet. CAD liefert keine Sequenzinformation in Form von a/x, b/y oder c/z Ionen, sondern fhrt hauptschlich zum Verlust kleiner Molekle von den Seitenketten. Nur einige wenig intensive Rckgratfragmente in Kombination mit Seitenkettenverlusten konnten identifiziert werden.

EDD von Proteinanionen war hingegen viel erfolgreiche.

Hier abgebildet ein typisches EDD Spektrum. Es gibt 3 Arten von Fragmentionen:

oxidierte Molikuelionen, einfach und mehrfachoxidierte, mit EDD koennen bis zu 3 Elektronen aus dem Proteinanion herausgeschlagen werden.

Verlust kleiner Molekuele von oxidierten Molekuelionen

Rueckgratfragmente und zwar komplementaere a. und x ionen.

Diese Fragmentionen entstehen zwar nur zu 23%, liefern aber eine Sequenzabdeckung von 63%, wie man an diesem barplot sehen kann.

Aufgrund aller gemessenen Daten konnten wir verschiedenen Mechanismen fr EDD Fragmentierung postulieren, die auf der Lage der Deprotonierungsstelle basieren. Rckgratspaltung in a und x ionen findet statt, wenn die negative Ladung am Rckgratamid Stickstoff sitzt und dort ein Elektron herausgeschlagen wird. Die Deprotonierung kann durch Wasserstoffbruecken zwischen Rueckgratcarbonylsauerstoff und basichen Seitenketten unterstuetzt werden, hier abgebildet ein Lysin. Befindet sich die negative Ladung an der Seitenkette, wird das elektron dort abgelst und es kommt zum Verlust kleiner neutraler Molekle, vor allem CO2, weil die carboxylate als erstes deprotoniert werden, aber auch Acrylsaeure und die Aldehyde Formaldehyd und Acetaldehyd von Serin bzw. Threonin seitenketten.

Um diese Hypothese weiter zu testen, wurde das basische Protein Melittin untersucht.

Der Barplot des EDD spektrums vom Melittin 4- Ladungszustand zeigt einen deutlichen Anstieg an Fragmentionen und damit verbundene eine groessere Sequenzabdeckung und wesentlich weniger Seitenkettenverluste. Zusaetzlich zu den a/x Ionen sind auch noch c und z fragmente aufgetreten. Die intensivsten davon, das c 18 und z7 sind neben dem Tryptophan, sie sind aber nicht komplementaer, es fehlt ein neutrales molekuel mit einer masse von 184 Da.

Diese Folie zeigt den postulierten Mechanismus, der diese Tatsache beruecksichtigt. Da das Tryptophanradikal langlebig ist, kann es zu Umlagerungen kommen, die diese Fragmentierung ermglichen.

Das groesste untersuchte Protein ist das BASP1 konstrukt mit 147 Aminosauren. EDD lieferte trotz unzhliger Carboxylate eine Sequenzabdeckung von 19%.

Zusammenfassend fr die Dissoziation von Proteinanionen kann man sagen, dass CAD keine Rueckgradfragmente ohne Seitenkettenverluste liefert

EDD liefert Sequenzinformation fuer mehrfachdeprotonierte Proteine bis 147 AS

Wobei Rueckgradspaltung und seitenkettenverluste unabhaengige Fragmentierungskanaele sind. Befindet sich die negative Ladung am Rueckgratamid: kommt es dort zum electron detachment und zu Rueckgratfragmenten Befindet sich die Ladung an der Seitenkette: und es kommt dort zum electron detachment, kommt es zu Seitenkettenverlusten.

Ausnahme dazu bilden langlebige Radikale, die Fragmentierung in c und z Ionen ermoeglichen.

In meiner Diss werde ich mich mit Posttranslationalen Modifikationen von Proteinen beschaeftigen. PTMs sind alle Modifikationen die nach der Biosynthese am Ribosom stattfinden. Sie sind wichtig fuer Aktivitaet, Stabilitaet, Abbau, Lokalisierung in der Zelle und Protein-Protein Wechselwirkungen. Da durch PTMs die Masse des betreffenden Ptoeins veraendert wird, eignet sich Massenspektrometrie zur Untersuchung optimal.

Hier abgebildet sind die Haeufigsten Modifizierungen, mit der Massenaenderungen und den ihrer Stabilitaet. Unter den PTMs findet man Phosphorylierung von Tyrosinen, Serinen und Threoninen mit einem Massenshift von 80. Methylierungen mit delta M = 14. Acatylierungen mit delta M = 42.

Die Stabilitaet der Posttranslationalen Modifizierung spielt eine Rolle bei der Wahl der Dissoziationsmethode zur Sequenzierung von Proteinen mit PTMs. CAD eignet sich fuer stabile PTMs wie Acetylierung, Methylierung und Disulfidbruecken, ECD hingegen ist auch fuer instabile PTMs geeignet, wie z.B. die Phosphorylierung.

Das 1. Projekt beschaeftig sich mit Disulfidbruecken.

Sie zaehlen zu den wichtigsten PTMs. Es sind sowohl intramolekulare als auch intermolekulare Disulfidbruecken moeglich Bei der Analyse mit MS stellen sich 2 Fragen: Gibt es Disulfidbruecken? Das kann leicht mit einem ESI spektrum beantwortet werden, die Molekuelmasse ist um 2x anzahl der Disulfidbruecken erniedrigt Wo sind Disulfidbruecken? Dafuer ist eine Fragmentierung des Proteins notwendig. ECD: spaltet vor allem die Disulfidbruecken, ist daher nicht geeignet. CAD liefert Fragmente, deren ausbeute haengt aber von der Sequenz ab. Geht z.B. sehr gut neben Prolinen. Bei der Anordnung stellen sich wiederum 2 Fragen: Welche Cysteine sind beteiligt? Wie ist das Verknuepfungsmuster? Bei 2 Disulfidbruecken gibt es 3 Moeglichkeiten der Anordnung. Bei 3 Disulfidbruecken waechst die Zahl der Moeglichkeiten enorm an, dort sind es 15.

Wir haben uns eine Methode zur Analyse der Disulfidbruecken ueberlegt. Sie beruht auf der Annahme, dass die Disulfidbruecken bei der Reduktion nacheinander geoeffnet werden. Es wird die Genaue masse zu einem bestimmten Zeitpunkt bestimmt um den Verlauf der Reduktion zu messen. Ausserdem werden CAD Spektren zu den selben Zeitpunkten aufgenommen um durch die Fragmente Rueckschluss auf das Verknuepfungsmuster zu erhalten.

Die Reduktion wird mit Dithiotreitol durchgefuert. Hier ist der Mechanismus der Reduktion abgebildet. Das Thiol greift an der Disulfidbruecke an und das andere Cystein wird abgespaltet, das findet noch ein weiteres Mal statt und man bekommt 2 freie Thiole und ein cyclisches Disulfid.

Hier sieht man die Reduktionskinetik des NTD proteins. Sie wird aus ESI spektren mit internem Kalibranten fuer genaue Masse bestimmt. Nach 160 minuten Reaktionszeit ist nur eine der 2 Disulfidbruecken geoeffnet, die 2. konnte auch durch laengere Reaktionszeiten nicht geoeffnet werden, da es zum Abbau des Proteins gekommen ist.

Die CAD spektren des reduzierten Proteins liefern das Disulfidbruecken muster. Der in der Sequenz schwarz dargestellte Bereich liegt ausserhalb der Disulfidbruecken, liefert also immer Fragmente. der gruene und der blaue Bereich liefern Fragmente, wenn sich die 1. Disulfidbruecke oeffnet. Daraus kann man schliessen, dass diese Disulfidbruecke zwischen C1 und C4 liegt. Der Rote bereich liefert erst Fragmente, wenn die 2. Disulfidbruecke sich zu oeffnen beginnt, was die Disulfidbruecke zwischen C2 und C3 nahelegt.

Als Ausblick was die naechsten Experimente betrifft. Wir werden die anderen 2 Verknuepfungsmuster von Proteinen mit 2 Disulfidbruecken testen. Dafuer haben wir den Trypsin Inhibitor als Modellprotein fuer dieses Verknuepfungsmuster und das Interferon Alpha 2b fuer diesen Fall gekauft. Ausserdem moechten wir die Methode auf 3 Disulfidbruecken erweitern.

Danke fr die Aufmerksamkeit, und falls es fragen gibt werde ich diese gerne beantworten. Ich moechte mich bei Kathrin Breuker fr die Ausgezeichnete Betreuung bedanken und Bei der Arbeitsgruppe von Prof Bister fr das Exprimieren des BASP1 Proteins. Ausserdem bei allen mitgliedern des Institus fr die nette Gemeinschaft.