Determinacin de protenas de un alimento por el mtodo Kjeldahl. Valoracin con un cido fuerte.

Apellidos, nombre Departamento Centro

Garca Martnez, Eva (evgarmar@tal.upv.es) Fernndez Segovia, Isabel (isferse1@tal.upv.es) Departamento de Tecnologa de Alimentos ETSIAMN. Universitat Politcnica de Valncia

1 Resumen de las ideas clave

El contenido protenico de los alimentos puede determinarse por medio de diversos mtodos. El mtodo Kjeldahl se basa en la determinacin del nitrgeno. La determinacin del contenido de nitrgeno en muestras de naturaleza orgnica es importante en muchos campos de anlisis, como los relacionados con las industrias agroalimentaria o farmacolgica o con el medio ambiente, entre otros. En este artculo se describe el fundamento del mtodo Kjeldahl, recogiendo el nitrgeno sobre cido brico y valorndolo con una disolucin de cido clorhdrico o sulfrico. Tambin se explican los clculos necesarios para obtener el porcentaje de protenas de un alimento a partir del valor del contenido en nitrgeno obtenido.

2 Introduccin
El contenido protenico de los alimentos puede determinarse por medio de diversos mtodos. La forma ms habitual es su cuantificacin de forma indirecta y aproximada, bien a partir del contenido en nitrgeno de la muestra, o bien deduciendo su cantidad a partir del contenido de uno o dos aminocidos particulares que conforman la protena, fciles de identificar y de cuantificar por su reactividad qumica especfica. Este segundo procedimiento conlleva una mayor inexactitud. Desde hace ms de 100 aos se est utilizando el mtodo Kjeldahl para la determinacin del nitrgeno en una amplia gama de muestras (alimentos y bebidas, piensos, forrajes, fertilizantes) para el clculo del contenido en protena. Tambin se utiliza el mtodo Kjeldahl para la determinacin de nitrgeno en aguas residuales y suelos. Es un mtodo oficial descrito en mltiples normativas: AOAC, USEPA, ISO, Farmacopeas y distintas Directivas Comunitarias. La convencin general, sobreentendida, es que la totalidad del nitrgeno de la muestra est en forma proteica, an cuando la realidad es que, segn la naturaleza del producto, una fraccin considerable del nitrgeno procede de otros compuestos nitrogenados (bases pricas y pirimidnicas, creatina y creatinina, urea, amoniaco, etc.), por ello se denomina protena bruta o protena total a la obtenida por este mtodo. Con este anlisis, sin embargo, no se determina el nitrgeno ntrico, el cianhdrico, el de la hidracina, el de grupos azo y el nitrgeno de un ncleo cclico.

3 Objetivos
Con la redaccin de este artculo docente se persigue que los alumnos adquieran la capacidad de:

Comprender los fundamentos del mtodo Kjeldahl para la determinacin del contenido en protena de un alimento. Conocer el procedimiento experimental del anlisis de protenas por el mtodo de Kjeldahl, recogiendo el nitrgeno sobre cido brico y valorndolo con una disolucin de cido clorhdrico o sulfrico.

Calcular el porcentaje de protena de un alimento a partir del contenido de nitrgeno obtenido por el mtodo Kjeldahl.

4 Desarrollo
A continuacin pasamos a describir el fundamento del mtodo Kjeldahl y las etapas que los constituyen. Despus, se describir el procedimiento experimental y los clculos implicados. Para finalizar se expondr un ejemplo prctico real.

4.1 Fundamentos del mtodo y etapas

El mtodo Kjeldahl mide el contenido en nitrgeno de una muestra. El contenido en protena se puede calcular seguidamente, presuponiendo una proporcin entre la protena y el nitrgeno para el alimento especfico que est siendo analizando, tal y como explicaremos ms adelante. Este mtodo puede ser dividido, bsicamente en 3 etapas: digestin o mineralizacin, destilacin y valoracin. El procedimiento a seguir es diferente en funcin de si en la etapa de destilacin el nitrgeno liberado es recogido sobre una disolucin de cido brico o sobre un exceso conocido de cido clorhdrico o sulfrico patrn. Ello condicionar la forma de realizar la siguiente etapa de valoracin, as como los reactivos empleados. En este artculo docente se explica el primer procedimiento, cuando el nitrgeno se atrapa sobre cido brico.

(a) Etapa de digestin: un tratamiento con cido sulfrico concentrado, en presencia de un catalizador y ebullicin convierte el nitrgeno orgnico en in amonio, segn la ecuacin 1.

catalizadores/ calor n - C -NH2 + H2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 (ec. 1)

Procedimiento: Se introducen de 1 a 5 g de muestra un tubo de mineralizacin y se ponen 3 g de catalizador que suele estar constituido por una mezcla de sales de cobre, xido de titanio o/y xido de selenio. De forma habitual se utiliza como catalizador una mezcla de K2SO4 : CuSO4 : Se (10:1:0,1 en peso). Despus se adicionan 10 mL de H2SO4 concentrado y 5 mL de H2O2. Posteriormente se digiere a 420 C durante un tiempo que depende de la cantidad y tipo de muestra. Se sabe que la digestin ha terminado porque la disolucin adquiere un color verde esmeralda caracterstico. En esta etapa, el nitrgeno proteico es transformado en sulfato de amonio por accin del cido sulfrico en caliente. En la actualidad, para llevar a cabo este proceso se utilizan digestores automticos que son capaces de digerir un nmero determinado de muestras al mismo tiempo (imagen 1).

Imagen 1. Unidad de digestin

(b) Etapa de destilacin (imagen 2): se alcaliniza la muestra digerida y el nitrgeno se desprende en forma de amoniaco (ecuacin 2). El amoniaco destilado se recoge sobre un exceso desconocido de cido brico (ecuacin 3). (NH2)SO4 + 2 NaOH NH3 + H3BO3 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O NH4 + H2BO3 (ec. 2) (ec. 3)

Procedimiento: Despus de enfriar se adicionan al tubo de digestin 50 mL de agua destilada, se pone en el soporte del destilador y se adiciona una cantidad suficiente de hidrxido sdico 10 N, en cantidad suficiente (50 mL aprox.) para alcalinizar fuertemente el medio y as desplazar el amoniaco de las sales amnicas. El amoniaco liberado es arrastrado por el vapor de agua inyectado en el contenido del tubo durante la destilacin, y se recoge sobre una disolucin de cido brico (al 4 % p/v).

Imagen 2. Unidad de destilacin

(c) Etapa de valoracin: La cuantificacin del nitrgeno amoniacal se realiza por medio de una volumetra cido-base del in borato formato, empleando cido clorhdrico o sulfrico y como indicador una disolucin alcohlica de una mezcla de rojo de

metilo y azul de metileno (ecuacin 4). Los equivalentes de cido consumidos corresponden a los equivalentes de amoniaco destilados. H2BO3- + H+ H3BO3 (ec. 4)

4.2 Clculos
De la valoracin se puede calcular el nmero de equivalentes de nitrgeno recogidos, y con ste dato se obtiene el porcentaje de nitrgeno en la muestra. Para calcular el porcentaje de protena basta con multiplicar por un factor de conversin el % de nitrgeno calculado. Este factor de conversin est tabulado para cada grupo de alimentos. En la tabla 1 se recogen los factores para algunos alimentos.

Alimentos Harina de trigo Trigo, centeno, cebada Arroz Cacahuetes Almendras Soja Semillas oleaginosas Leche y derivados Carne y derivados Clara de huevo Yema de huevo Huevo entero Gelatina Vegetales

Factor (K) 5,70 5,83 5,95 5,46 5,18 5,71 5,30 6,38 6,25 6,70 6,62 6,68 5,55 6,25

Tabla 1. Factor de conversin para obtener la tasa de protena bruta a partir del nitrgeno total.

4.3 Ejemplo resuelto

El contenido en protena de una muestra de pescado se determin pesando 1.210 g. Tras la digestin la disolucin resultante se alcaliniz con un exceso de NaOH, se destil con vapor de agua y el NH3 liberado se recogi sobre 50 mL de H3BO3 y posteriormente fue valorado con H2SO4 0.3N, gastndose 17.7 mL del mismo. Calcular el % de protena en la muestra de pescado.

Equivalentes de N = Equivalentes de H2SO4 : 17.7x10-3 L H2SO4 x 0.3 N H2SO4= 5.31 x10-3 g N= (5.31 x10-3 equiv N x 14 g/equiv)= 0.07434 g g N/100 g = (0.07434 g N/ 1.21 g muestra) x 100 = 6.143 g N/100 g muestra

Para pasar a contenido de protenas corregir por el factor adecuado segn la naturaleza de la muestra (para el pescado = 6.25, tabla 1). g protenas/100 g = 6.143 g N/100 g x 6.25= 38.39 g protenas/100 g muestra

5 Cierre
A lo largo de este objeto de aprendizaje se ha descrito el mtodo Kjeldahl para la determinacin de protenas de un alimento a partir de la cuantificacin del nitrgeno, empleando cido brico como medio para atraparlo y cido clorhdrico o sulfrico para su valoracin. Adems se han expuesto los clculos necesarios para obtener el porcentaje de protena a partir del contenido en nitrgeno de la muestra y se ha ejemplificado el procedimiento con un caso real.

6 Bibliografa
[1] AOAC International: Official Methods of Analysis. 17ed. Gaithersburg, USA, 2000.

[2] Skoog, D.A.; West, D.M.: Qumica analtica. 4ed, McGraw-Hill, 1989, pg. 231.

[3] Adrian, J.; Potus, J.; Poiffait, A.; Dauvillier, P.: Anlisis nutricional de los alimentos, Ed. Acribia, 2000, pg. 41-43.

[4] Nielsen, S.: Food Analysis, Ed. Kluwer Academic/Plenum Publ, 2003, pg. 131142.