PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE QUIMICA DEPARTAMENTO DE QUIMICA FISICA Integrantes: Bryan Olgun. Marcel Olgun.

PROPUESTA DE TRABAJO EXPERIMENTAL LABORATORIO BIOQUIMICA QIM-117 ENZIMAS, TRANSAMINASAS OBJETIVO GENERAL: Estudiar la reaccin de la transaminacin OBJETIVOS ESPECIFICOS: 1. Estudiar el proceso de la transaminacin en presencia de un extracto enzimtico de origen animal. 2. Separar e identificar aminocidos y cetocidos obtenidos como producto en la reaccin de transaminacin. FUNDAMENTOS: Los aminocidos son los monomeros que forman las protenas. Las sustancias proteicas estn construidas gracias a 20 aminocidos, estas forman los msculos, tendones, rganos, glndulas, las uas y el pelo. Existen dos tipos principales de aminocidos que estn agrupados segn su procedencia y caractersticas. Estos grupos son aminocidos esenciales y aminocidos no esenciales. Los aminocidos que se obtienen de los alimentos se llaman "Aminocidos esenciales". Los aminocidos que puede fabricar nuestro organismo a partir de otras fuentes, se llaman "Aminocidos no esenciales". El crecimiento, la reparacin y el mantenimiento de todas las clulas dependen de ellos. Despus del agua, las protenas constituyen la mayor parte del peso de nuestro cuerpo. Todos los aminocidos componentes de las protenas son alfa-aminocidos. Por lo tanto, estn formados por un carbono alfa unido a un grupo carboxilo, a un grupo amino, a un hidrgeno y a una cadena (habitualmente denominada R) de estructura variable, que determina la identidad y las propiedades de los diferentes aminocidos; existen cientos de cadenas R por lo que se conocen cientos de aminocidos diferentes, pero slo 20 forman parte de las protenas y tienen codones especficos en el cdigo gentico. La unin de varios aminocidos da lugar a cadenas llamadas polipptidos o simplemente pptidos, que se denominan protenas cuando la cadena polipeptdica supera los 50 aminocidos o la masa molecular total supera las 5.000 uma. Reacciones en el metabolismo de los aminocidos

Las dos reacciones principales en el metabolismo de los aminocidos son: transaminacin y desaminacin oxidativa. Transaminacin: proceso realizado en el citosol y en las mitocondrias, por el que un aminocido se convierte en otro. Se realiza por medio de transaminasas que catalizan la transferencia del grupo alfa-amino (NH3+) de un aminocido a un alfa-cetocido, tal como piruvato, oxalacetato o ms frecuentemente alfa-cetoglutarato. Consecuentemente se forma un nuevo aminocido y un nuevo cetocido. Las transaminasas que ms habitualmente intervienen en la transaminacin son: alaninaaminotransferasa (ALT) y asparto-aminotransferasa (AST). Requieren, como cofactor, piridoxalfosfato (PLP), un derivado de la vitamina B6. Deaminacin oxidativa: Proceso, realizado en las mitocondrias, y en el que la enzima cido glutmico-deshidrogenasa elimina el grupo amino del cido glutmico. Se forma amonaco que entra en el ciclo de la urea y los esqueletos carbonados vienen a ser productos intermedios glucolticos y del ciclo de Krebs. Las aminotransferasas (o transaminasas) son un conjunto de enzimas del grupo de las transferasas, pues transfieren grupos amino desde un metabolito a otro, generalmente aminocidos. Estas enzimas son inducibles, porque su actividad puede aumentarse por la accin de diversas hormonas como la tiroxina o los glucocorticoides, su reaccin es libremente reversible y su constante de equilibrio est cerca a la unidad. Su nomenclatura se establece a partir del aminocido des del cual transfieren el grupo amino. Los nmeros representan a las enzimas transferasas que transfieren grupos que contienen nitrgeno. En la transaminacin participan normalmente, como donante y receptor, el glutamato y el cetoglutarato, que participan en las diferentes reacciones catalizadas por las diferentes aminotransferasas. La transaminacin consiste en transportar un grupo -amino desde un aminocido donador, al carbono ceto de un -cetocido receptor. Este proceso ocurre en dos etapas y es catalizado por las distintas aminotransferasas especficas de cada sustrato. a) En la primera etapa un -aminocido que actuar como donador, transfiere el grupo -amino a la enzima transaminasa, produciendo el correspondiente -cetocido y la enzima quedar aminada. b) En una segunda etapa, el grupo amino se transfiere al -cetocido aceptor (-cetoglutarato, piruvato o oxalocetato) formando un nuevo aminocido y regenerando la enzima.

REACTIVOS: Arsenito de sodio 0,1 mol/L. Buffer fosfato pH = 7,4. Alanina 0,01 mol/L. Ninhidrina 0,2 % en etanol al 95 %. Glutamato de sodio 0,2 mol/L y 0,01 mol/L. Alfacetoglutarato 0,01 mol/L. Solucin semisaturada de 2,4 dinitrofenilhidracina en HCL 0,1 mol/L. Solvente para cromatografa de cetocidos: 7 ml de N-Butanol. 2 ml de NH4OH. 1 ml de Etanol. Solvente para cromatografa de aminocidos: Fenol-agua 80 %. MATERIALES: Tubos de ensayo Tubos de centrifuga Pipetas Vasos de 250 mL Placas para cromatografa Homogenizador potter Bao termostatado a 37 C Centrfuga

PROCEDIMIENTO: OBTENCIN DE LOS EXTRACTOS DE ENZIMA: 1- Prepare un extracto de hgado en la proporcin 1:5 en masa volumen con buffer fosfato pH 7,4. Utilice bao de hielo para realizar la operacin. 2- Centrifugue a 2500 rpm durante tres minutos o filtre a travs de una gasa doble o algodn. 3- Guarde el sobrenadante en un tubo sumergido en bao de hielo y rotrelo como extracto de hgado. 4- Tome la mitad del extracto y pselo a un tubo y colquelo en un bao de agua hirviendo durante 5 minutos. Rotrelo como extracto de hgado calentado.

DESARROLLO DE LA REACCION: Con los extractos anteriores prepare dos tubos de ensayo de la siguiente forma: Tubo 1 (mL) Tubo 2 (mL) Arsenito de sodio 0,1 mol/L Glutamato de sodio 0,2 mol/L Piruvato de sodio 0,2 mol/L Extracto de hgado (1). 0,2 0,15 0,15 0,5 0,2 0,15 0,15 -0,5

Extracto de hgado calentado (2). --

1. Incube los tubos a 37 grados durante 30 minutos para el transcurso de la reaccin. 2. Una vez transcurrido el tiempo adale 4 ml de etanol a cada tubo. 3. Centrifugue a 2500 rpm durante 3 minutos. Guarde el sobrenadante para su identificacin cromatogrfica. CROMATOGRAFIA DE AMINOACIDOS:

1. Prepare el papel cromatogrfico y aplique con un capilar las muestras del tubo 1 y 2 y los patrones de cido glutmico y alanina, identificando a cada una en el borde superior del papel. 2. Coloque el papel en la cmara cromatogrfica y deje correr la cromatografa hasta una altura de 5 cm como mnimo. 3. Extraiga el papel y squelo al aire. Rosee el mismo con ninhidrina y colquelo en la estufa hasta la aparicin de las manchas. 4. Calcule los Rf de las muestras y patrones y analice comparativamente los resultados de los tubos 1 y 2.

CROMATOGRAFIA DE CETOACIDOS: 1. Primeramente se formarn las dinitrofenilhidrazonas de los cetocidos y luego se realizar la cromatografa. Disolucin 2,4 dinitrofenilhidracina (mL) Sobrenadante del tubo 1 (mL) Sobrenadante del tubo 2 (mL) Piruvato 0,2 mol/L (mL) alfa-cetoglutarato 0,2 mol/L (mL) 1 2 3 4

0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 ----0,1 ----0,1 ----0,1

Deje en reposo 10 minutos para que transcurra la reaccin.

Aplique en el papel cromatogrfico los sobrenadantes de los cuatro tubos anteriores, identificndolos adecuadamente. Coloque el cromatograma en la cmara y djelo correr hasta una altura de 5 cm como mnimo. Extraiga el papel y squelo al aire. Calcule los Rf de las muestras y patrones y analice comparativamente los resultados

BIBLIOGRAFA: http://proteinas.org.es/aminoacidos http://www.alimentacionynutricion.org/es/index.php?mod=content_detail&id=78

http://www.monografias.com/trabajos19/laboratorio-bioquimica/laboratoriobioquimica.shtml#reacciiontransam