PRUEBAS PARA EL DIAGNOSTICO DE MASTITIS Y CALIDAD DE LECHE

Cdigo Pgina

FLA-23 V. 00 1 de 1

1, Objetivo General: Conocer los fundamentos de las pruebas utilizadas para el diagnstico de mastitis bovina y calidad de la leche. 2. Objetivos Especficos: Desarrollar la prueba de la reductasa o reduccin del azul de metileno para la determinacin de la calidad de la leche Desarrollar y conocer el fundamento de la prueba de Californian Mastitis Test. Desarrollar la metodologa para el diagnstico microbiolgico de la mastitis bovina. Conocer otras pruebas diagnsticasutilizadas para la determinacin de la mastitis en bovinos.. 3. Marco Terico: Mastitis (del griego mastos = glndula mamaria y del sufijo itis = inflamacin). Se define como la inflamacin de la glndula mamaria que generalmente se presenta como una respuesta a la invasin por microorganismos y se caracteriza por daos en el epitelio glandular, seguido por una inflamacin clnica o subclnica, pudiendo presentarse con cambios patolgicos localizados o generalizados, dependiendo de la magnitud del dao La mastitis se clasifica en mastitis clnica, subclnica e infeccin latente, segn el grado de inflamacin. La inflamacin de la glndula mamaria se caracteriza por los signos cardinales de sta, los cuales son tumor, rubor, dolor, calor y disminucin de la funcin. Clnicamente la mastitis puede presentarse como: a) severamente aguda, b) suave que por la severidad inflamatoria se subdivide moderada y ligera, c) crnica y d) gangrenosa. La muestra de leche es obtenida para hacer diferentes pruebas relacionadas a mastitis: subclnica, clnica y composicin de la misma, por lo tanto, la muestra se toma durante el ordeo de la vaca, dependiendo el momento, segn el propsito perseguido con la muestra se pueden realizar las siguientes pruebas: Cloro en leche. En la leche la relacin lactosa- cloro es influenciada por: o Estado lactacional o Presentacin de mastitis En casos de mastitis el contenido de cloro en la leche tiende a incrementarse en proporcin a la lactosa, lo que ocasiona en la leche un sabor ligeramente salado. Un mtodo confiable para determinar el contenido de cloro en leche es el potencimetro, que consiste en cuantificar los iones cloro usando electrodos especficos. Determinacin de pH en leche. El pH identificado en calostro es de 6.4, en tanto que en la leche es de 6.5 -6.8, cantidad que a media lactacin es de 6.6 - 6.7, y al final es de 6.8 o mayor. Tambin se ha considerado que la leche que proviene de glndulas mamarias afectadas

por mastitis el pH es alcalino (6.9) lo que se atribuye a la disminucin de la lactosa e incremento de sales que pasan de sangre a la leche Para determinar el pH en la leche podemos emplear: o prpura de bromocresol o azul de bromotimol o potencimetros o escala de valoracin en papel indicador de pH Determinacin de albmina srica en leche. Uno de los primeros cambios en vacas con mastitis fue la presencia de albmina sangunea en leche, atribuida al aumento de permeabilidad capilar en el proceso inflamatorio. Garza, et al., (1974), encontraron que los valores de albmina srica en la leche fueron proporcionales a la gravedad de la inflamacin de la glndula mamaria. Para determinar la tasa de albmina srica en la leche se sugiere llenar con este lquido aproximadamente tres cuartas partes de un tubo de microhematocrito; enseguida se sella con fuego el lado del tubo que contiene leche y se centrifuga a 12000 x G durante 5 minutos (Yaez, 1980). A continuacin se rompe el tubo abajo de la separacin grasaleche y con la leche descremada se procede a la determinacin de albmina srica, empleando la tcnica descrita por Richterich, (1970). Se considera que la leche proviene de animales positivos a mastitis cuando contiene ms de 0.20 mg/ml. Conductividad elctrica. La secrecin lctea de una glndula mamaria con mastitis tiene una alta conductividad elctrica por el elevado contenido electroltico, especialmente en iones de sodio y cloro; lo que se presenta como uno de los primeros signos en la mastitis, siendo esto un elemento til en el diagnstico, considerando que niveles superiores a 6.9 m/cm2 entre 20-30C son anormales. Determinacin del nmero de clulas somticas. Esta prueba se puede realizar de una forma directa o indirecta: Examen microscpico y clculo del nmero de clulas Colocar laminilla con frotis sobre platina del microscopio, usando el objetivo calibrado. Enfocar el campo a estudiar, contando el nmero de clulas presentes y anotar el total de clulas observadas, repetir la actividad recorriendo los campos con un seguimiento al patrn dibujado por la sutura mattress (cenefa). Al alcanzar aproximadamente 50 clulas, es sugerible cambiar de zona de observacin. Calcular el nmero de clulas, lo que hacemos considerando todo campo estudiado y sacando el promedio de clulas por campo, resultado que se multiplica por el factor microscpico lo que resultar en el nmero de clulas por mililitro. Ejemplo: 35 campos estudiados, con 70 clulas 70/35= 2.0 clulas por campo 2.0 X 300 300 = 600,600/ml clulas Clulas/ml = 600,600 Prueba de California para Mastitis (CMT) En las infecciones por bacterias, de los vasos localizados en el rea afectada escapan leucocitos, siendo generalmente sta, una respuesta celular proporcional a la severidad de la infeccin. Cullen (1966), menciona que las cuentas de clulas somticas mayores a 500,000/ml indican mastitis subclnica. La prueba de CMT, identifica la presencia de cido desoxirribonuclico de la clulas somticas en la leche.

La prueba de reduccin de azul de metileno consiste en teir la leche con el colorante. Si la leche contiene alto contenido microbiano, se decolorar rpidamente, retomando su color blanco. Al contrario si existen pocos microorganismos el color azul se pierde lentamente. Esta prueba debe realizarse dentro de un lapso no mayor de 4 hrs desde la toma de la muestra. Si se toman muestras en un predio agrcola no debe exceder las 8 hrs. En ambos casos las muestras deben mantenerse hasta el inicio de la prueba en un bao de agua, a una temperatura entre 0-5c.4. Materiales, Equipos e Insumos. Muestra de leche Paleta para Californian Mastitis Test Tubos de ensayo Bao serolgico a 37 C Pipetas de 10 ml. Asas bactriologicas Agar Sangre Agar Mac Conckey Agar Muller Hinton 5. Reactivos Azul de metileno Purpura de Bromocresol Reactivo para Californian Mastitis Test 6. Procedimiento: Prueba de CMT Para hacer la prueba de CMT, se toma el instrumento (paleta para CMT) por el mango dirigido hacia la cola de la vaca, se descartan los dos primeros chorros de leche de cada pezn y seguidamente se colectan en cada una de las charolas de plstico (debiendo estar la superficie bien pulida y uniforme), 2 ml de leche de cada glndula y se anexan a cada uno de los compartimientos la misma cantidad del reactivo de California, cuidando que la proporcin de reactivo a leche sea de 1:1. De inmediato se mezclan la leche y el reactivo mediante un movimiento rotatorio suave, haciendo la lectura de la reaccin alrededor de los 7 segundos, momento en que alcanza el pico la reaccin Negativa Sin evidencia 0 a 200,000 T Traza Precipitacin leve 150,000 500,000 1 Positivo leve Sin formacin de gel, mezcla espesa 400,000-1,500,000 2 Positiva Mezcla espesa cierta formacin del gel 800,000-5,000,000 3 Positiva fuerteEl gel causa formacin de una superficie convexa > 5,000,000 + Leche alcalina Fuerte color morado Actividad secretora reducida ++ Leche cida Color amarillo pH 5.2, fermentacin de lactosa por bacterias Prueba de Acidez Tomar 9 ml de leche y agregar 1m del reactivo Purpura de bromocresol al 0.5%, llevar a Incubacin a 37 C por 24 horas , esta prueba puede hacerse c on otros indicadores tales

como Prueba de Reduccion del Azul de metileno ReductasaSe deben agregar aspticamente 10ml de leche cruda en 2 tubos de ensayo. Agregar 1ml de solucin de azul de metileno, tapar, agitar y llevar a incubadora a 36c ms menos 1c por 10 min. Pasado este tiempo invertir los tubos, para favorecer la mezcla. Registrar este momento como inicio de la incubacin. Se debe verificar el color a los 60 min. de iniciado el tiempo de incubacin. Si ha perdido color, registrar el TRAM a los 60 min. Verificar por segunda vez a las 3 hrs. de iniciada la incubacin. Si las muestras pierden el color registrar el TRAM menor que 3 hrs. Continuar registrando los resultados hasta la 5 hora desde el inicio de la incubacin Pruebas microbiolgicas Para esta prueba se utilizar inicialmente una caja de Agar sangre y una de Agar Mac Conckey. Con un hisopo esteril realice una siembra masiva en la mitad de la caja a partir de la muestra sospechosa, posteriormente con el asa curva realice un agotamiento en la otra mitad de la caja, marque apropiadamente y lleve a incubacin a 37 C x 24 horas 7. Nivel de Riesgo Bajo CUESTIONARIO. 1.Consulte, estudie y anexe un articulo referente a prevalencia de mastitis en explotaciones lecheras en nuestro pais. 2. Consulte un algoritmo de identificacin para Streptococcus y Staphylococcus. 3. Investigue acerca de las mastitis endgenas y iatrognicas 4. Cuales son los agntes etiolgicos que causan las mastitis clnicas de mayor gravedad.

8. Bibliografa http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n090907/090702.pdf http://kepler.uag.mx/uagwbt/microbiologia/ciencias/sesiones/tema3.2.1.pdf

Brooks, Geo F. Jawetz, Melnick, & Adelberg's medical microbiology / Geo F. Brooks, Janet S. Butel, Stephen A. Morse New York [etc.] : Lange, cop. 2001 Koneman [et. al.] Diagnstico microbiolgico : texto y atlas color / Elmer W Buenos Aires : Ed. mdica panamericana, 1992