CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS

PEREIRA, C. D. MELO, B.

SUMRIO

1- Histrico; 2- Estrutura de um laboratrio de cultura de tecidos; 3- Equipamentos; 4- Meios nutritivos; 5- Componentes de meios nutritivos; 6- Preparao dos meios de cultura; 7- Esterilizao; 8- Tipos de cultivos e aplicaes da cultura de tecidos; 8.1- micropropagao; 8.2- Recuperao de plantas isentas de vrus (limpeza clonal); 8.3- Microenxertia; 8.4- Conservao in vitro de recursos genticos de plantas conservao de germoplasma; 8.5- Suspenso celular; 8.6- Polinizao e fertilizao in vitro; 8.7- Cultura de embries; 8.8- Cultura de ovrios; 8.9- Cultura de protoplastos; 8.10- Obteno de mutantes in vitro; 8.11- Embriognese somtica; 8.12- Produo de haplides e duplos haplides; 9- Cultura de tecidos vegetais x plantas transgnicas; 10- Bibliografia consultada.

11- Links na rea

HISTRICO A biotecnologia amplamente definida, inclui qualquer tcnica que usa organismo vivo ou parte dele para fazer ou modificar produtos, melhorar plantas e animais, ou desenvolver microorganismos para uso especfico. Neste contexto as tcnicas de cultura de clulas, tecidos e rgos vegetais compem um importante grupo da biotecnologia em plantas.

Os primeiros trabalhos com cultura de tecidos, foram iniciados em 1902, com o pai da cultura de tecidos Haberlandt. Estudando a regenerao de plantas originadas de uma nica clula, no obteve sucesso em seus experimentos, possivelmente, em virtude da falta de fitormnios( compostos at ento desconhecidos) no meio nutritivo, bem como em decorrncia da utilizao de espcies inadequadas, e da baixa densidade de inculo e explantes de tecidos maduros. No entanto seu trabalho contribui de forma decisiva para o desenvolvimento de pesquisas futuras nesta rea.

Hannig (1904) foi o primeiro a cultivar in vitro embries imaturos de crucferas (Raphanus sativus, R. landra, R. caudatus e Colchlearia danica). Ele observou a necessidade de suplementao do meio mineral com sacarose para germinao dos embries, bem como mostrou o efeito de diferentes fontes de nitrognio sobre a sua morfologia. Aiblach (1925) foi o primeiro a visualizar a aplicao da cultura de embries no melhoramento gentico, recuperando plantas hbridas de cruzamentos incompatveis entre Linum austriacum x L. perene.

White (1934) recebeu o mrito do estabelecimento do primeiro trabalho de cultura de tecidos, com a elaborao de um meio (lquido) capaz de manter o crescimento de pices radiculares de tomateiro (Lycopersicon esculentum) por um perodo ilimitado. Com esse trabalho mostrou a importncia de tiamina para o crescimento de razes in vitrom. Tambm elaborou a mistura orgnica que leva o seu nome, utilizada at hoje nas formulaes de meios nutritivos.

Outra importante descoberta foi a identificao do primeiro fitormnio, a auxina, cido indolactico (Kogh et al., 1934). Isso possibilitou o estabelecimento e manuteno indefinida de cultura de calo de cenoura. O interesse do grupo, liderado por Skoog no controle qumico da organognese, concretizou-se com a descoberta da cinetina (primeira citocinina) por Miller et al. (1955; 1956), dando uma grande contribuio rea de cultura de tecidos e ao estudo da fisiologia do crescimento e desenvolvimento de plantas.

No Brasil, os trabalhos pioneiros sobre cultura de tecidos surgiram com Dr. Agesilau Bitancourt, do Instituto Biolgico de So Paulo, na dcada de 50. Uma equipe de cultura de tecidos se estabeleceu

na ESALQ, Piracicaba, em 1971, sob a liderana do Dr. Willian Sharp e da Dra. Linda Caldas, onde iniciaram vrios trabalhos na rea.

ESTRUTURA DE UM LABORATRIO DE CULTURA DE TECIDOS Sala de limpeza

o local destinado ao descarte de meios de cultura utilizados e outros resduos, lavagem de vidraria, autocalvagem de gua, de meios de cultura e de utenslios diversos. Por estes procedimentos em si, esta sala constitui um local onde as condies de assepsia deixam a desejar.

Sala de preparo

Local destinado ao preparo de meios de cultura e de solues diversas, bem como de material vegetal destinado introduo in vitro.

Sala de transferncia

onde se manipula assepticamente o material vegetal, sendo um local exclusivo para a capela de fluxo laminar e as estantes para estocagem temporria dos meios de cultura j autoclavados, alm de outros materiais esterilizados destinados ao uso imediato. A circulao de pessoal nesta sala deve ser restrita.

Sala de cultura

a rea onde as culturas sero mantidas at o momento de serem retiradas dos frascos. Deve ser dotada de estantes iluminadas, com prateleiras de 50cm de largura e distanciadas entre si de 40-45cm. A temperatura desta sala deve ser mantida em torno de 27 oC, mediante o emprego de aparelhos de ar condicionado. O fotoperodo mantido, normalmente, em 16h e a intensidade luminosa variando de 5060mmol m-2. s-1.

EQUIPAMENTOS

Autoclave

Utilizada para esterilizao de meio de cultura, vidraria, gua e outros materiais.

Destilador e Deionizador

So aparelhos utilizados para eliminar sais minerais da gua.

Aparelho de banho-maria

til par aquecimento moderado de solues, meios d cultura e fuso de gar, quando necessrio.

Aquecedor de gua

Imprescindvel para a lavagem eficiente de frascos contendo meio de cultura semi-slido, dentre outras aplicaes.

Lavador de pipetas

Equipamento de baixo custo e essencial para simplificar o trabalho de lavar pipetas.

Refrigerador (geladeira)

Manuteno de solues estoque e reagentes diversos.

Freezer

Utilizado para estocagem de reagentes que exigem temperatura abaixo de 0 oC.

Balana

Necessria para a pesagem de macronutrientes e outros reagentes usados em maior quantidade.

Balana de preciso ou analtica

imprescindvel para a pesagem de quantidade mnimas de alguns reagentes como os reguladores de crescimento e alguns micronutrientes.

Medidor de pH

Necessrio para a determinao e ajuste do pH de meios de cultura, o qual influencia categoricamente no sucesso do cultivo.

Agitador magntico

Auxilia na dissoluo de reagentes e determinao de pH.

Dessecador

Utilizado na manuteno de frascos de certos reagentes muito higroscpios, em p aps abertos.

Capela de fluxo laminar

Imprescindvel para os trabalhos de manipulao assptica. Este equipamento fora a passagem de ar por meio de um filtro bacteriolgico, de modo que seja criado um ambiente estril com presso positiva, que evita a entrada de ar externo contaminado.

Microscpio estereoscpico

Utilizado na identificao e manipulao de pequenas estruturas vegetais (meristemas, plen etc) ou de estruturas desenvolvidas in vitro.

MEIOS NUTRITIVOS Os meios nutritivos utilizados para a cultura de clulas, tecidos e rgos de plantas fornecem as substncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padro de desenvolvimento in vitro. As mesmas vias bioqumicas e metablicas bsicas que funcionam nas plantas so conservadas nas clulas cultivadas, embora alguns processos, como fotossntese, possam ser inativados pelas condies de cultivo e pelo estado de diferenciao das clulas. Por isso, os meios nutritivos se baseiam nas exigncias das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificaes para atender s necessidades especficas in vitro. Complementando as substncias biossintetizadas pelas clulas, vrios compostos orgnicos so adicionados ao meio para suprirem as necessidades metablicos, energticos e estruturais das clulas.

Alguns dos primeiros meios apresentavam, entre os micronutrientes, metais exticos como nquel, titnio e berlio, alm dos mais comuns (ferro, mangans, zinco, cobre e boro). A lista dos minerais includos na maioria dos meios utilizados hoje foi definida por White (1943b; 1945). O meio de White continha, ainda, vitaminas e sacarose como suplementos orgnicos. Dos hormnios vegetais, ou reguladores de crescimento, apenas a auxina cido 3-indolactico era conhecida nas dcadas de trinta e quarenta.

Na tabela 1 so mostradas as concentraes dos diversos componentes de um dos principais meios nutritivos, Murashige e Skoog, utilizado na tcnica de cultura de tecidos vegetais.

Tabela 1- Composio do meio de cultura de Murashige & Skoog (1962).

CONSTITUINTES INORGNICOS NH4NO3 KNO3 CaCl2 2 H2O MgSO4 7 H2O KH2PO4 KI H3BO3 MnSO4 4 H2O ZnSO4 7 H2O Na2MoO4 2 H2O CuSO4 5 H2O CoCl2 6 H2O FeSO4 7 H2O Na2 EDTA 2 H2O ORGNICOS Inositol Tiamina Hl cido Nicotnico Piridoxina HCl Glicina Sacarose gar

QUANTIDADE em mg/L

1650 1900 440 370 170 0,83 6,2 22,3 8,6 0,25 0,025 0,025 27,8 37,3

100 0,1 0,5 0,5 2,0 30000 0,8%

COMPONENTES DE MEIOS NUTRITIVOS

No desenvolvimento dos meios nutritivos para a cultura de tecidos de plantas, houve desde o incio, uma procura de meios definidos de composio conhecida e controlada. Assim, torna-se possvel a reproduo dos resultados em qualquer poca ou lugar. Para evitar a contaminao dos meios por impurezas minerais, todos os sais utilizados na sua preparao devem ser de qualidade analtica (p.a.).

gua A gua o componente de maior quantidade no meio. uma fonte potencial de impurezas que podem afetar o crescimento de tecidos in vitro. A gua destilada e deionizada, ou bi-destilada, normalmente, suficiente pura para uso nos meios. No entanto, dependendo da fonte da gua de laboratrio (poo artesiano, por exemplo), podem ser encontrados contaminantes orgnicos volteis, que permanecem aps a destilao e inibem o crescimento das culturas.

Macronutrientes Os elementos exigidos em maiores quantidades para o crescimento de plantas inteiras so includos nos meios nutritivos na forma de sais inorgnicos, so eles o nitrognio, fsforo, potssio, clcio, magnsio e enxofre.

Micronutrientes Os micronutrientes incluem todos aqueles elementos minerais aceitos atualmente como essenciais para plantas clorofiladas (mangans, zinco, boro, cobre, cloro, Ferro e molibdnio), alm do cobalto e iodo.

Carboidratos As clulas, tecidos e plntulas cultivadas in vitro no encontram condies adequadas de iluminao e concentrao de CO2 e, s vezes, no apresentam teores de clorofila suficiente para realizar fotossntese que sustenta o crescimento. Portanto, a sacarose o carboidrato mais utilizado nos meios nutritivos, sendo que esse acar suporta as mais altas taxas de crescimento na maioria das espcies. A concentrao de sacarose tambm um fator importante para obter crescimento timo, dependendo do explante. Culturas de embries nos estgios iniciais de desenvolvimento necessitam de concentraes elevadas de sacarose (12-18%), e altas concentraes tambm estimulam a formao de embries em cultura de anteras de fumo (Sharp et al., 1971). A concentrao de sacarose mais usada 3%. Outros compostos orgnicos, alm de carboidratos, foram testados como fonte de carbono, normalmente com pouco sucesso.

Vitaminas

Os primeiros estudos com cultura de razes definiram a mistura bsica de vitaminas utilizadas at hoje. Essa mistura consiste de tiamina (vitamina B1), cido nicotnico (niacina) e piridoxina (vitamina B6), a qual normalmente se adiciona o aminocido glicina.

Mio-Inositol O mio-inositol um componente do meio MS e da maioria dos outros meios em uso atualmente. A concentrao mais usada de mio-inositol nos meios de 100 mg. l-1.

Reguladores de Crescimento ou Hormnios A composio e concentrao de hormnios no meio so fatores determinantes no crescimento e no padro de desenvolvimento na maioria dos sistemas de cultura de tecidos. As auxinas e as citocininas so as classes de reguladores de crescimento mais utilizadas na cultura de tecidos. A formao de raiz, parte area e calo em cultura de tecidos regulada pela disponibilidade e interao dessas duas classes de reguladores de crescimento.

Existem vrias substncias que pertencem a cada uma dessas classes de reguladores e que so usadas, de acordo com o objetivo do estudo, nos meios de cultura. As vrias auxinas (AIA - cido 3indolactico, AIB - cido indolbutrico e 2,4-D cido 2,4-diclorofenoxiactico, entre outras) do respostas diferentes in vitro. AIA considerada uma auxina instvel, que se degrada facilmente pela luz ou pela atividade microbiana que a transforma em triptofano.

Tambm existem diferenas entre as citocininas, sendo que o BAP 6-benzilaminopurina induz a formao de grandes nmeros de brotos e alta taxa de multiplicao em muitos sistemas de micropropagao. Poucas culturas in vitro mostram respostas s giberelinas.

gar e Semelhantes Os meios nutritivos podem ser lquidos ou slidos, sendo que a cultura em meio lquido normalmente exige algum tipo de suporte ou agitao para fornecer o oxignio necessrio para a respirao do explante. Os meios lquidos possuem a vantagem de preparo mais rpido (e mais barato) do que os slidos.

Os meios slidos ou semi-slidos, tradicionalmente, so solidificados com gar (polissacardeo extrado de algas marinhas) o qual dissolvido em gua fervente sendo responsvel pela consistncia do meio que depende de sua concentrao.

pH O pH dos meios nutritivos em culturas de clulas vegetais normalmente ajustado com HCl ou NaOH, depois de adicionar todo os componentes, para um valor ligeiramente cido (entre 5 e 6).

PREPARAO DOS MEIOS Em diferentes laboratrios, procedimentos diversos so utilizados para preparar os meios nutritivos. Normalmente, mantm-se solues-estoque dos sais minerais na geladeira em concetraes mais elevadas, a partir das quais, a preparao do meio efetuada.

Solues-estoque das vitaminas podem ser mantidas na geladeira ou no congelador; a sacarose e o mio-inositol, que so utilizados em quantidades elevadas, so pesados sempre que se prepara um meio nutritivo.

ESTERILIZAO Os meios so esterilizados aps serem distribudos nos frascos ou vasilhames de cultura, por autoclavagem a 121oC (1 kg.cm-2) por 15 20 minutos. Os explantes (tecido, orgo ou qualquer parte da planta a ser propagada) tambm so submetidos a desinfeco. Para isto existem muitas drogas, mas quase generalizado o emprego de etanol (70%) por 1-2 minutos. Os explantes so imersos nesta soluo e mantidos sob constante agitao. Em seguida, deve ser enxaguados com gua destilada e imersos em soluo de hipoclorito de sdio (2%) durante 15-20 minutos sob agitao e enxaguados com gua autoclavada, sendo este passo, feito em cmara de fluxo laminar, evitando a recontaminao do material.

TIPOS DE CULTIVOS E APLICAES DA CULTURA DE TECIDOS

1- MICROPROPAGAO

Uma das muitas aplicaes da micropropagao a propagao macia de plantas superiores. Muitas vezes a propagao convencional um processo lento durante o qual doenas e problemas com

patgenos podem diminuir a produo. A micropropagao oferece o potencial para produzir milhares, ou s vezes, bilhes de plantas, em relativo curto espao de tempo.

Multiplicao por meio de brotos apicais e axilares: ambos, os brotos apicais e axilares contm meristemas quiescentes ou ativos, dependendo do estado fisiolgico da planta. Estes brotos apicais cultivados em meio de cultura, sem reguladores de crescimentos, desenvolvem-se tipicamente em brotos semelhantes a plntulas, com forte dominncia apical. Quando colocados na presena de citocininas de uma forma geral, brotos axilares se desenvolvem prematuramente produzindo ramificaes (brotos secundrios e tercirios) que originam uma proliferao em massa resultando numa grande produo de plantas com alta identidade gentica.

Multiplicao por meio de cultura de calos: apesar da cultura de calo possibilitar a ocorrncia de aneuploidias e poliploidias, acarretando em perdas da identidade gentica do material propagado, o propagador pode distinguir claramente regenerantes aberrantes na primeira etapa do processo de multiplicao, eliminando as plantas indesejveis. Esta tcnica possibilita a obteno de uma grande quantidade de plantas a partir de um nico explante, sendo uma dos procedimentos mais eficientes na produo rpida de plantas in vitro. No entanto a propagao via calos deve ser evitada, principalmente, no caso de culturas economicamente importantes.

2- RECUPERAO DE PLANTAS ISENTAS DE VRUS (LIMPEZA CLONAL)

Utiliza-se principalmente pices caulinares para propagao de plantas isentas de vrus. Uma das vantagens deste sistema a manuteno da identidade do gentipo (planta) regenerado, que ocorre na maioria dos casos em virtude das clulas do meristema do pice caulinar serem mais estveis geneticamente. Alm disso, o pice uma estrutura organizada, que pode desenvolver-se diretamente em parte area, em meio de cultura adequado, sem passar pela fase de calo (crescimento desordenada de clulas), o que poderia levar alteraes genticas.

3- MICROENXERTIA

Essa tcnica consiste em microenxertar, em condies asspticas, um pice caulinar, contendo dois a trs primrdios foliares, excisado de uma planta matriz, sobre um porta-enxerto estabelecido (cultivado) in vitro. Decapita-se o porta-enxerto e faz-se uma exciso em T invertido no seu topo, onde introduzido o microenxerto. Com esta tcnica torna-se possvel a produo de matrizes de fruteiras e outras plantas arbreas, com alta qualidade fitossanitria e com caractersticas adultas, no se revertendo ao estado juvenil.

4- CONSERVAO GERMOPLASMA.

IN VITRO

DE RECURSOS

GENTICOS DE PLANTAS

CONSERVAO

DE

A conservao de recursos genticos vegetais de grande importncia , no s para a preservao de espcies, mas tambm para o melhoramento vegetal. A conservao in vitro feita utilizando-se estratgias tcnicas que possibilitam a preservao da identidade gentica e o retardamento do crescimento das culturas, tais como: reduo da temperatura de incubao, aplicao de retardantes osmticos e hormonais no meio nutritivo, submerso das culturas em leo minerais,

utilizao de suspenses celulares em meios lquidos sob agitao, armazenamento do material em baixas temperaturas (- 196oC) ou criopreservao.

5- SUSPENSO CELULAR

Este processo utilizado para a obteno e proliferao de clulas em meio lquido, sob condio de agitao contnua, para evitar possveis gradientes nutricionais e gasosos no meio de cultura. Alm de ser uma tcnica eficiente de multiplicao rpida, as suspenses celulares tem uma grande aplicao para o estudos de bioqumica, gentica, citologia, fisiologia vegetal e fitopatologia. Este tipo de cultivo tambm empregado na produo de metablitos secundrios ou material clonal em escala comercial pela utilizao de biorreatores.

Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imerso temporria ou permanente de clulas, gemas, embries ou qualquer tipo de propgulo que possa ser utilizado na micropropagao. O cultivo realizado utilizando-se meio de cultura lquido, permitindo a renovao do ar durante este processo, bem como o monitoramento de alguns parmetros essenciais ao crescimento do propgulo, tais como pH, oxignio dissolvido, temperatura, concentrao de ons, etc.

6- POLINIZAO E FERTILIZAO IN VITRO

A possibilidade de se obter novas combinaes no cruzamento de plantas, resultando em hbridos inter e entra-especficos, intergenricos ou entre espcies de famlias distintas, dificultada por barreiras que podem ocorrer antes da fertilizao. Esta tcnica permite, alm de estudar os processos de polinizao, transpor barreiras fertilizao, impostas pelo estigma, estilete ou ovrio e recuperar

hbridos interespecficos e intergenricos que no podem ser obtidos pelos mtodos convencionais in vivo.

7- CULTURA DE EMBRIES

Este tipo de cultivo tem sido usado para superar dormncia de sementes, em virtude da imaturidade do embrio ou da presena de substncias inibidoras no endosperma; estudar os aspectos nutricionais e fisiolgicos do desenvolvimento do embrio; testar a viabilidade de sementes; recuperar hbridos raros de cruzamentos incompatveis; e como fonte de explantes devido a elevada totipotncia.

8- CULTURAS DE OVRIOS

A cultura de ovrios fornece um sistema controlado para o estudo dos aspectos nutricionais e fisiolgicos do desenvolvimento de frutos e formao de sementes. Este mtodo tambm utilizado para a propagao de plantas, a induo de haplides partenognicos e a recuperao de hbridos interespecficos e intergenricos.

9- CULTURA DE PROTOPLASTOS

O cultivo de protoplastos (clulas vegetais desprovidas de parede celular) vem sendo utilizados no melhoramento de espcies de interesse agronmico, para obteno de plantas transgnicas, de hbridos somticos e de mutantes ou variantes somaclonais. Os protoplastos tambm constituem um sistema vegetal para o estudo da expresso de genes isolados e sua regulao.

10- OBTENO DE MUTANTES IN VITRO.

Por meio da utilizao de agentes mutagnicos fsicos (luz UV, raios X, raios gama etc) e qumicos (antibiticos, alquilantes, azidas etc), possvel obter mutantes induzidos apresentando mutaes gnicas, cromossmicas e extranucleares. Esta tcnica tem uma grande aplicao para os melhoristas por possibilitar a ampliao da variabilidade gentica.

11- EMBRIOGNESE SOMTICA

Embriognese somtica, adventcia ou assexual so termos usualmente empregados para designar o processo pelo qual clulas haplides ou somticas desenvolvem-se por meio de diferentes estdios embriognicos, dando origem a uma planta, sem que ocorra a fuso de gametas. A embriognese somtica um mtodo importante para propagao de plantas elite in vitro, em larga escala. Alm de servir de modelo para estudos bsicos relacionados com a fisiologia do desenvolvimento do embrio, esse sistema vem sendo utilizado para produo de plantas transgnicas e sementes sintticas.

12- PRODUO DE HAPLIDES E DUPLOS HAPLIDES

Para a produo de haplides so utilizados principalmente a cultura de anteras ou plen, obtendo uma planta haplide a qual passa por um tratamento especfico com antimitticos (ex.: colchicina) para a duplicao do cromossomos. J os duplo-haplides podem ser obtidos a partir da cultura in vitro de ovrios ou vulos no polinizados, ou aps cultura de embries resultantes de cruzamentos interespecficos ou intergenricos.

CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS X PLANTAS TRANSGNICAS

A aplicao dos princpios genticos na obteno de plantas com desempenho agrcola superior tem sido sistemtico e determinante para o aumento da produtividade e para a conquista de novas fronteiras agrcolas. Para isto o emprego de vrios mtodos de melhoramento e a utilizao de novas tecnologias, como a cultura in vitro de clulas e tecidos de plantas, tm sido determinantes. Estas tcnicas so empregadas de diferentes formas no desenvolvimento de cultivares superiores de plantas. Em geral, so utilizadas em uma ou outra etapa do melhoramento, no necessariamente, no desenvolvimento direto de novas cultivares.

Com o advento dos transgnicos, que do ponto de vista de um melhorista, no passa de uma tcnica avanada de melhoramento de ltima gerao, a cultura de tecidos vegetais tambm vem contribuindo para o sucesso da transformao gentica, dando suporte para a produo de transgnicos, sendo imprescindvel no incio (fornecendo clulas, protoplastos ou tecidos) e no fim do processo, regenerando e selecionando plantas geneticamente transformadas. Vale ressaltar que o primeiro grupo

de cultivares transgnicos comercializado em diversas partes do mundo, como as resistentes a herbicidas, insetos e patgenos, foi desenvolvido mediante uso de cultura de tecidos em combinao com mtodos de Biologia Molecular.

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