TCNICAS DE CONTROL MICROBIOLGICO PARA LA EVALUACIN DEL ESTADO DE CONTAMINACIN DEL VINO Y DE LAS BARRICAS POR BRETTANOMYCES

Antonio Toms Palacios Garca; Laboratorios Excell Ibrica, C/ Planillo N 12, Pabelln B, 26006 Logroo, La Rioja. Tel. 941 445106, apalacios@labexcell.com, www.labexcell.com. Introduccin: La viticultura y Enologa son ciencias muy desarrolladas que arrastran el peso de la tradicin como elemento positivo de valorizacin del producto, el vino. El vino surge desde el viedo gracias a las transformaciones microbianas acontecidas en la bodega, son los procesos de fermentacin alcohlica y malolctica. Pero estos no son los nicos pasos de la elaboracin del vino donde pueden participar microorganismos. Desde las etapas pre- fermentativas, durante la fase de latencia entre alcohlica y malolctica, hasta durante la crianza y envejecimiento, el vino est expuesto a la actividad de microorganismos, algunos de ellos deben ser considerados como contaminantes. Entre los ms habituales podemos encontrar: Levaduras Brettanomyces intermedius Produccin de fenoles voltiles (etil-fenoles) Zigosaccahromyces balli Refermentacin de azcares residuales por la presencia de antispticos Bacterias acticas Acetobacter sp., Gluconobacter sp. : Produccin de cido actico, acetato de etilo y cidos grasos voltiles. Bacterias lcticas Lactobacillus sp. Produccin de aminas bigenas Degradacin lctica de glicerol Pediococcus sp. Produccin de aminas bigenes Produccin de acetil-tetrahidropiridinas Produccin de acrolena Por esta razn, se hace necesario contar con herramientas analticas de microbiologa que permitan hacer un seguimiento de los procesos biolgicos a nivel preventivo y curativo. Exponemos a continuacin la amplia gama de tcnicas microbiolgicas disponibles en el campo de la enologa, empezando por las mas simples, que siempre pueden ser utilizadas en bodega, y terminando por las mas sofisticadas, ofrecidas normalmente por laboratorios especializados. Tcnicas microbiolgicas disponibles: 1-. Observacin al microscopio ptico: Se trata de un control muy inmediato que presenta tiempos muy rpidos de ejecucin del anlisis como principal ventaja, adems de su sencillez en el manejo y bajo coste. Es muy eficaz para la realizacin de conteos celulares. Como desventajas, podemos nombrar su baja sensibilidad, necesitamos poblaciones elevadas para poder determinar resultados fiables ( >100.000 clulas/mL), los errores de muestreo provocan distorsiones en la cuantificacin, ya que se utilizan extremados pequeos volmenes y la

variedad de morfologas que los microorganismos puede ofrecer en el vino, especialmente en el caso de Brattanomyces. 2-. Medios de cultivo: Los anlisis de microorganismos mediante el empleo de medios de cultivo selectivos es un mtodo muy empleado en la industria agroalimentaria y mdica. Es una tcnica que puede ser empleada en bodega como control de calidad primario. Lo ms importante es la utilizacin de medios especficos para el micro-organismo que se quiere estudiar o verificar su presencia. Existen algunos problemas especficos, como la dificultad para diferenciar bacterias lcticas en cultivos genricos. De esta forma , el control de Brettanomyces necesita un medio de cultivo muy especfico, por lo que normalmente se emplean inhibidores de crecimiento de levaduras y mohos, principalmente para evitar resultados llamados falsos positivos. Otro problema que podemos encontrarnos es el retraso en el crecimiento de los microorganismos dependiendo de los estados fisiolgicos en los que se encuentran en las condiciones estresantes del vino. En el caso de Brettanomyces puede ser muy largo (8-10 das). El ltimo aspecto a tener en cuenta es los posibles grmenes viables no cultivables en funcin de su estado fisiolgico en el momento del control. 3-. Microscopa de epifluorescencia: La tcnica de microscopa de epifluorescencia es realmente interesante y prctica. Necesita un microscopio capaz de emitir fluorescencia sobre la muestra a observar para poder diferenciar mediante marcaje selectivo estructuras biolgicas o microorganismos con un inters en particular. Es la tcnica conocida como FISH (Hibridacin Fluorescente In Situ) y en el caso de levaduras, utiliza una sonda PNA especfica con fluorocromo que se fija sobre el ADN ribosomal de las cepas de levaduras. La muestra en estudio se ilumina con luz de una determinada longitud de onda que es absorbida por el fluorforo, haciendo emitir luz de determinadas longitudes de onda (clulas verdes para Brettanomyces). No es muy especfico en el caso de Brettanomyces y presenta poca sensibilidad. Sin embargo es muy prctico a nivel cuantitativo y puede resultar un anlisis econmico y rpido en su realizacin. 4-. Citometra de flujo: La citometra de flujo es una tcnica de anlisis celular que implica medir las caractersticas de dispersin de luz y fluorescencia que poseen las clulas conforme se las hace pasar a travs de un rayo de luz. Para el anlisis por citometra de flujo, las clulas deben encontrarse individualmente en suspensin en un fluido. Al atravesar el rayo de luz, las clulas interaccionan con este causando dispersin de la luz, basndose en la difraccin de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamao de las clulas. Adems de la dispersin de la luz, si previamente a su anlisis se coloca a las clulas marcadores con molculas fluorescentes, se pueden evaluar que tipo de clulas poseen los marcadores para distinguirlas. El uso de molculas fluorescentes distintas (distintos colores de fluorescencia) permite analizar la presencia de varios marcadores de manera simultnea. En el caso de levaduras, se utilizan fluorocromos especficos de actividad esterasa. Esta tcnica permite obtener resultados

muy rpidos, de una gran especificidad segn microorganismo, aunque por el momento es inespecfico para las especies de levaduras. Pos una sensibilidad de deteccin de 200-1.000 cel./mL segn las condiciones de la muestra. Es una tcnica muy adaptada para el seguimiento de cintica fermentativa y del estado fisiolgico de la levaduras, como es el caso de deteccin prematura de paradas de fermentacin.

5-. PCR a tiempo real: Se trata de una PCR cuantitativa, siendo una variante de la reaccin en cadena de la polimerasa clsica (PCR). Utilizada para amplificar y simultneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificacin del DNA. Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, cebadores especficos, dNTPs, un tampn de reaccin adecuado y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluorforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluorforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generacin de uno o ms productos especfico. La PCR cuantitativa es la metodologa ms moderna para el estudio de la expresin gnica y para distinguir cepas de levadura y bacterias en vinos. Las principales ventajas son su alta sensibilidad y especificidad y la rapidez de ejecucin. Como ventajas adicionales podemos citar la posibilidad de deteccin a partir de cualquier muestra biolgica si necesidad de que esta sea pura, por lo tanto es posible la deteccin de un microorganismos en particular an en presencia de otros microorganismos ms abundantes. Su alta especificidad se basa en que para cada tipo de micro-organismo, existen secuencias de nucletidos extremadamente especficos que permiten su diferenciacin. Los pasos a seguir son el aislamiento, extraccin y Purificacin del DNA. El aislamiento y lisis de las clulas de microorganismos es el paso ms crtico. Despus se realiza la extraccin y purificacin de las molculas de ADN para finalmente amplificarlo para detectar las molculas especficas de ADN diana y su deteccin por sondas especficas marcadas. Para la interpretacin de resultados se elaboran curvas de calibracin que permiten determinar las poblaciones presentes en las muestras a analizar. La especificidad y la multiplicidad de fragmentos y de sondas fluorescentes utilizadas permite la deteccin simultnea de diferentes tipos de micro-organismos y gracias a una curva de calibracin efectuada para cada tipo de micro-organismo diana, es posible cuantificar precisamente la cantidad de clulas presentes en las muestras. Los resultados se obtienen muy rpidamente y los datos son observables mientras avanza el anlisis. Los resultados son adems fcilmente reproducible y la cuantificacin muy exacta. Para evitar falsos positivos y negativos, se emplean sondas muy especficas (falsos positivos) y un patrn interno (falsos negativos). No hay procesos post-PCR (geles ni ensayos de hibridacin). Los tubos empelados son sistemas muy cerrados preventivos de contaminacin ambiental. Como aplicaciones prcticas de PCR a tiempo real, encontramos la posibilidad de vigilar de forma estrecha el vino utilizado para el relleno de barricas, que debe ser continuamente vigilado para evitar la diseminacin de contaminantes en el vino destinado a barricas. La evaluacin del estado higinico de la madera de las barricas, estudiando la eficacia de los sistemas de limpieza de barricas usadas y su posible mejora, as como determinar de forma precisa los sistemas de filtracin del vino antes del embotellado. Comparacin de las distintas tcnicas microbiolgicas: Todas las tcnicas presentadas son tiles para evaluar el estado microbiolgico del vino, tanto a nivel de control de calidad como en el diagnstico de problemas. Los medios de cultivo y la observacin al microscopio son tcnicas sencillas que pueden ser empleadas directamente en bodega y que por su escaso coste pueden ser empleadas para barridos sistemticos muy amplios. Son herramientas que pueden funcionar a modo de alarma, para que otras tcnicas ms complejas y especficas, normalmente ofrecidas por laboratorios especializados, puedan determinar de forma precisa el tipo de problema y como solucionarlo. En el ejemplo que se muestra en la figura inferior, podemos comparar las diferentes tcnicas microbiolgicas y qumicas, incluyendo cata, segn sus grados de sensibilidad y cuando seran

capaces stas de detectar un problema de contaminacin de Brettanomyces en bodega y por lo tanto, cuando podramos tomar decisiones de respuestas tcnicas para solucionarlo.

LD: Cata

LC: Cromatografa LC: Medios cultivo LC: PCR tr

Das

invierno

primavera

verano

4-Etilfenol mg/L

Clulas viables

Leyenda: Lmite de deteccin por cata, Lmite de cuantificacin por cromatografa de gases, Lmite de cuantificacin por medidos de cultivo especficos y Lmite de cuantificacin por PCR a tiempo real. Barras: poblacin de Brettanomyces, Lnea punteada: evolucin del contenido en etilfenoles.

En la tabla inferior, mostramos los momentos oportunos para cada anlisis microbiolgico dependiendo de las distintas fases de elaboracin del vino.

Fases microbiolgicas del vino Fase prefermentativa

Fermentacin Alcohlica Fin FA Fase de latencia FA y FML

Citom.

CGSM

Medios

E.F.

PCR

* *
* * * * *

* *
* *

Fin FML Crianza Procesos limpieza y estabilizacin Filtracin

Embotellado

* *

* * * *

* * * * *

Leyenda: Citometra de flujo, Cromatografa de gases y espectrometra de masas, Medios de cultivo especficos, Microscopio de epiflourescencia y PCR a tiempo real.