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LABORATORIO DE ANLISIS DE ALIMENTOS PRCTICA # 8 TCNICAS ANALTICAS PARA LA CUANTIFICACIN DE COMPONENTES QUMICOS DE FRUTAS Y HORTALIZAS DETERMINACIN DE AZCARES INTRODUCCIN En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas. Los azcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos de calidad los carbohidratos desempean un papel relevante, por ejemplo, el sabor est dado bsicamente por un balance entre azcares y cidos orgnicos. El sabor caracterstico de y diferente de las frutas se debe a la gran variacin en composicin y concentracin de los azcares; el color atractivo se debe principalmente a los glucsidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza est determinada por los polisacridos estructurales. Es importante sealar que las proporciones de los diversos carbohidratos existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia de la actividad metablica, ya que durante la maduracin se producen cambios intensos en donde los azcares son los sustratos preferidos para la biosntesis y suministro de energa pues son oxidados (va gluclisis) hasta cido pirvico, el cual a su vez, por descarboxilacin oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se metaboliza, va ciclo de Krebs, dando lugar a la formacin de CO2, H2O y ENERGA la cual queda disponible para la biosntesis de otros componentes (otros azcares, cidos orgnicos, cido ascrbico, protenas, nucletidos azucarados, glucsidos, etc.). Durante todo este proceso, el contenido de

azcares

aumenta

casi

invariablemente

bsicamente

por

hidrlisis

que

experimentan los polisacridos, aunque algunos azcares sean utilizados como sustratos para la actividad respiratoria. Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios mtodos para su determinacin: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio: Todos los azcares con un grupo aldehdo libre o un grupo cetnico se clasifican como azcares reductores y se transforman fcilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fcilmente en presencia de oxgeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azcares en solucin alcalina rpidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los azcares se oxidan formando mezclas complejas de cidos. Esta accin reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas. Una de las tcnicas analticas ms potentes consiste en determinar la cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiacin absorbida por la misma. Esta tcnica se llama Espectrofotometra. Se puede utilizar el espectrofotmetro para determinar la longitud de onda de la radiacin necesaria para las determinaciones de la cantidad de azcar en las muestras bajo estudio, comparndola despus con la radiacin absorbida por un blanco. La regla especfica que relaciona la cantidad de radiacin absorbida por una substancia con la concentracin de esa misma substancia se llama Ley de Beer y se puede establecer como sigue: Log Io = abc I En donde: Io = Radiacin incidente o radiacin transmitida por el blanco. I = Radiacin transmitida por la muestra. Log Io = absorbancia de la muestra I

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En donde: a = coeficiente de absorbancia (absortividad) las unidades dependen de las unidades utilizadas para la determinacin de la concentracin. b = longitud de la celda usualmente en centmetros. c = concentracin de la muestra en las unidades apropiadas. I En esta prctica se emplear la tcnica colorimtrica de Nelson y Ting para determinar glucosa, fructosa y sacarosa. OBJETIVOS El estudiante explicar por escrito el fundamento del mtodo empleado para la determinacin de azcares en las muestras de frutas que se le asignarn. El estudiante relacionar los contenidos de azcares determinados en las muestras de diversos frutos. El estudiante se concientizar del concepto y los instrumentos de medicin utilizados en la espectrofotometra, y de la aplicacin de curvas estndar utilizando el mtodo de Nelson y Ting. MATERIAL 6 matraces volumtricos de 100 ml con tapn. 2 matraces volumtricos de 500 ml con tapn. 2 matraces volumtricos de 250 ml con tapn. 1 embudo de vidrio. 2 matraces Erlenmeyer de 125 ml. 6 pipetas de 10 ml. 2 pipetas de 1 ml. 2 pipetas de 5 ml. 2 vasos de precipitados de 250 ml. 1 bao Mara simple. 5 celdas de espectrofotmetro. 1 gradilla. 2 crculos de 10 cm de dimetro de papel filtro Whatman # 1. Papel sanitario blanco (proporcionado por el estudiante). Algodn o gasa . 1 cuchillo de cocina (proporcionado por el estudiante). 1 tabla para cortar la fruta (proporcionada por el estudiante). Fruta: 3 ejemplares por especie por equipo. En el caso del meln con 1 ejemplar basta (proporcionados por el estudiante).

EQUIPO: 1 extractor de jugos. 1 licuadora o mortero. 1 potencimetro. 1 bao Mara con control de temperatura y agitacin. 1 espectrofotmetro Spectronic 20' a 515 nm. REACTIVOS Solucin alcalina de Ferricianuro. Solucin de Arsenomolibdato (25 g). H2SO4 2N. NaOH 10N, 1N y 0.1N. HCl 1:1 (Vol/Vol). Na2CO3 anhidro. (12.5 g) Na2CO3 monohidratado. (14.3 g). Tartrato de potasio (12.3 g). NaHCO3 (10 g). Na2SO4 anhidro disuelto en 35 ml de agua destilada. CuSO4 5H2O disuelto en 50 ml. de H2O. Glucosa (300 g/ml). MTODO PREPARACIN DE REACTIVOS Reactivo de Nelson A.- Disuelva 12.5 g Na2CO3 anhidro ( 14.3 g Na2CO3 H2O), 12.3 g de tartrato de potasio, 10 g de NaHCO3 y 100 g de Na2SO4 anhidro en 350 ml de H2O y afore a 500 ml. Reactivo de Nelson B.- Disuelva 7.5 g de CuSO4 5H2O en 50 ml. de H2O y aada una gota de H2SO4. Reactivo Alcalino de Nelson.- Mezcle 25 ml del reactivo de Nelson A + 1.0 ml. del reactivo de Nelson B. Curva de la Glucosa.- Elaborar una solucin stock de glucosa en agua que contenga 300 g/ml. Preparar una serie de diluciones desde 300 hasta 30 g/ml.

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Reactivo de Arsenomolibdato.- Disuelva 25 g de (NH4)6Mo7O24 4H2O (molibdato de amonio tetrahidratado) en 450 ml. de agua destilada.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES TOTALES Prepare una serie de diluciones a partir de la solucin stock de glucosa. Las concentraciones debern ser de 300, 150, 75 y 30 g/ml. Utilice matraces volumtricos aforados con tapn y mrquelos con la concentracin correspondiente. 1. Pipetee 1 ml. de cada solucin estndar de glucosa y agua destilada como blanco en tubos de ensayo con capacidad de 25 ml. aforados. 2. Aada 1 ml. de reactivo alcalino de Nelson. 3. Mezcle. Colque los tubos en un bao de agua hirviendo durante 20 minutos y enfrelos al chorro de agua fra. 4. Aada 1 ml. de arsenomolibdato. 5. Mezcle bien por un perodode 5 min. (para disolver el Cu 2O para reducir el aresnomolibdato). 6. Afore a 25 ml. con agua destilada y mezcle. 7. Lea la absorbancia a 520 nm. Grafque la absorbancia contra la concentracin (g/g). Utilice esta curva estndar para determinar la concentracin de glucosa en las muestras de frutas. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS PARA LA DETERMINACIN DE AZCARES REDUCORES TOTALES 1.- Extraiga el jugo de la fruta asignada mediante un extractor de jugos. 2.- Diluya el jugo de la muestra con agua destilada (1:49). 3.- Colque 5 ml. del jugo diluido en un matraz volumtrico de 250 ml. y afore con agua destilada. DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES TOTALES 1.- Transfiera 1 ml. del jugo diluido a un matraz volumtrico aforado de 100ml. y aada 5 ml. de reactivo de ferricianuro. 2.- Colque los matraces en un bao de agua hirviendo por 10 minutos. 3.- Enfre los matraces inmediatamente bajo el chorro de agua fra. 4.- Neutralice el contenido de los matraces con 10 ml. de solucin de cido sulfrico 2N. 5.- Mezcle los contenidos de los matraces suavemente hasta que no emanen ms gases. 6.- Aada 4 ml. de arsenomolibdato. 7.- Mezcle una vez ms el contenido de los matraces. 8.- Afore a 100 ml. con agua destilada.

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9.- Tome una celda del espectrofotmetro y transfiera ah el contenido de cada matraz (uno por celda). 10.- Efecte la lectura en el espectrofotmetro a 520 nm. El blanco constar de todos los reactivos antes mencionados, excepto la muestra de jugo de fruta bajo estudio. No olvide ajustar el espectrofotmetro con agua destilada al principio. CLCULOS: A partir de la curva estndar se calcula el valor k para la determinacin de azcares reductores totales mediante la siguiente frmula: k = c/a En donde: k = El factor por unidad de absorbancia o pendiente de la curva. c = Concentracin de azcares reductores en gramos/100 ml. a = Absorbancia de la solucin a esa concentracin. Los valores k a diferentes concentraciones de azcar se promedian y se designan como K. El contenido total de azcares reductores, S, de la muestra se calcula de la frmula: S = K.A.D. En donde: S = Concentracin total de azcares reductores de la muestra en gramos/100 ml de jugo. K = Pendiente promedio de la curva. D = Factor de dilucin. DETERMINACIN DE FRUCTOSA NOTA: Esta determinacin no se realizar en esta sesin de laboratorio). Al calentar una mezcla de glucosa y fructosa a cierta temperatura - eg., 55C - con el reactivo alcalino de ferricianuro, la velocidad de oxidacin de la glucosa es considerablemente menor que la de fructosa. El resultado obtenido es conocido como fructosa aparente. sta es ligeramente ms alta que el contenido real de fructosa en la muestra, la cual puede ser calculada usando las frmulas adecuadas. El procedimiento para la determinacin de esta fructosa aparente es el mismo que para el clculo de los azcares reductores totales, excepto que se cambia la temperatura y el perodo de calentamiento a 55C por 30 minutos. Los valores de Kf y Kg de fructosa y glucosa respectivamente, oxidados a 55C se obtienen a partir de las curvas estndar de estos dos azcares, de la forma descrita para K. La proporcin de Kg a Kf Q se utiliza para el clculo real de glucosa y fructosa de la muestra con las siguientes ecuaciones simultneas:

G+F=S G/Q + F = L En donde: G = Porcentaje de glucosa en la muestra. F = Porcentaje de fructosa en la muestra. S = Porcentaje de azcares reductores totales (Suma de G y F). L = Porcentaje aparente de fructosa. Q = Proporcin entre Kg y Kf (Kg/Kf) En una mezcla de glucosa y fructosa se asume que ambos azcares presentes son fructosa. La fructosa aparente L se calcula a partir de la frmula S = K.A.D., sustituyendo L por S y Kf por K. Se obtiene la siguiente frmula para el porcentaje de glucosa en la muestra: G = (S - L) X Q Q-1 El cociente q/(Q-1), se utiliza como una constante en los clculos del valor real de la glucosa. El valor real de la fructosa se obtiene por diferencia. DETERMINACIN DE AZCARES TOTALES Y SACAROSA Nota: Esta determinacin no se llevar a cabo en esta sesin de laboratorio) La sacarosa de la muestra es invertida con el cido clorhdrico. procedimiento se describe a continuacin: El

1.- Se colocan 50ml. del jugo diluido en un vaso de precipitados de 150 ml. y se aaden 10 ml. de cido clorhdrico (1:1). 2.- Se deja reposar esta mezcla durante 18 horas a temperatura ambiental. 3.- Se aaden 5 ml. de solucin de hidrxido de sodio 10N y los contenidos se ajustan a un pH de entre 5 y 7 con una solucin de hidrxido de sodio 1N mediante el uso de un potencimetro. 4.- Los contenidos se transfieren a un matraz volumtrico aforado de 100ml y se afora con agua destilada. 5.- Se toma una alcuota de 1 ml de esta solucin y se pipetea en un matraz volumtrico de 100 ml. y se sigue el procedimiento descrito para la determinacin de azcares reductores totales. 6.- Se calcula la cantidad de sacarosa de la diferencia entre el contenido de azcares reductores antes y despus de la inversin, multiplicada por el factor de 0.95.

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Elabore un reporte comparando los diversos valores obtenidos para cada especie de futas estudiadas en la sesin de laboratorio. CUESTIONARIO: 1.- Por qu la sacarosa no se considera como un azcar reductor? 2.- Para qu se utiliza el cobre en el reactivo de Nelson? BIBLIOGRAFIA: A.O.A.C. Official Methods of Analysis. 1980. Washington, U.S.A. Horwitz W. (ed). Ed. 13th.

Ting, S.V. 1956. Rapid Colorimetric Methods for Simultaneous Determination of Total Reducing Sugars and Fructose in Citrus Juices. Agric. Food Chem. Vol. 4(3) 263-266.

4.1. Determinacin de Fibra por Detergente Acido.

Este mtodo permite tener una aproximacin del grado de digestibilidad de las fibras en el alimento. La muestra es digerida por medio de cetil-trimetil-amonio en cido sulfrico y el residuo es considerado como la fibra no digerible. Reactivos

Solucin de detergente cido al 1 % p/v. A un litro de agua agregar poco a poco 56 ml de cido sulfrico concentrado, lleve la solucin a un volumen final de 2 1 con agua y agregue 20g de Cetil-trimetil-amonio. Antiespumante Dekalin (decahidronaftaleno). Acetona.

Materiales y Equipo

Horno Matraces erlenmayer de 500 ml.

Mantilla de calentamiento. Condensador de dedo fro.

Crisoles de filtracin, porosidad 1.

Procedimiento 1. Muela la muestra en un molino de martillos para que pase la malla de 1 mm. 2. Tome una submuestra y squela durante la noche en un horno a 105C. 3. Enfre la muestra en un desecador. 4. Pese con aproximacin de miligramos un gramo de la muestra seca y colquela en un matraz erlenmayer de 500 ml. 5. Adicione 100 ml de la solucin de detergente cido y 2 ml del antiespumante. 6. Coloque el matraz en la mantilla con el condensador instalado. 7. Lleve rpidamente a ebullicin (3 a 5 minutos) y contine el calentamiento por 2 horas. 8. Filtre el contenido del matraz por gravedad en un crisol previamente pesado. 9. Enjuague el matraz con agua destilada caliente y filtre. 10. Enjuague el contenido del crisol con 300 ml de agua destilada caliente. Use succin dbil (por vaco). 11. Enjuague el residuo con acetona y seque. 12. Coloque el crisol en el horno a 105C durante 12 horas. 13. Enfre dentro de un desecador la muestra e inmediatamente despus determine el peso. Clculos Contenido de Fibra (%) = 100 (W2/W1) Donde W1 = Peso de muestra (g). W2 = Peso del residuo (g).

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FIGURA 7

Determinacin del contenido de fibra por el mtodo de detergente cido.

4.2. Determinacin de Fibra por Detergente Neutro.

Este mtodo es til para la determinacin de fibras vegetales en alimentos. Aparentemente tiene la capacidad de separar los componentes nutricionales solubles de aquellos que no son totalmente aprovechables o que dependen de la fermentacin biolgica para su aprovechamiento. El mtodo tiene limitaciones en su precisin cuando los valores de protena son muy altos y los valores de fibra son bajos. Reactivos

Solucin detergente neutra. Agregue a un litro de agua destilada 30 mg de sulfato lauril sdico USP, 18.61 g de etilendiamino tetra acetato disdico dihidrogenado dehidratado, 6.81 g de borato de sodio decahidrato y 4.56 g del reactivo fosfato cido disdico anhidro. Agtese hasta disolver y mantenga el pH entre 6.9 y 7.1. Amilasa (Sigma A 1278) 2g en 90ml H2O mas 10 ml de etilenglicol. Acetona grado reactivo. Sulfito de sodio anhdro. Se usa nicamente en anlisis de subproductos animales.

Materiales y Equipo

Equipo de reflujo. Cualquier equipo estndar adecuado para el anlisis de fibra. Crisoles de filtracin en vidrio. Use crisoles de tipo alto, con porosidad gruesa y placa de filtracin de 40mm de dimetro con capacidad para 40 50 ml de lquido. Cuando los crisoles se obstruyen despus de un uso continuo se prepara una solucin limpiadora de 20% KOH, 5% de Na3PO4 y 0.5% de EDTA de sodio que se hace pasar caliente en en sentidi opuesto a travs del crisol. Se debe de evitar el uso continuo de la solucin pues tiende a erosionar el vidrio.

Procedimiento 1. Pese aproximadamente 1 g de muestra molida para pasar el tamiz de 1 mm y depostela en un matraz de fondo redondo para iniciar el reflujo. 2. Agregue en orden 100 ml de detergente neutro a temperatura ambiente y 2 ml de amilasa por muestra. 3. Caliente para que la solucin hierva en 5 a 10 minutos; en el momento de iniciar la ebullicin reduzca la temperatura para evitar la formacin de espuma. Ajuste la temperatura para que la solucin hierva suavemente y mantenga en reflujo por 60 minutos a partir del instante en que empieza a hervir. 4. Agite el matraz para suspender y decante la muestra en un crisol previamente pesado y preparado para succin al vaco. Use poco vaco al principio

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incrementndolo a medida que lo vaya requiriendo. Pase toda la muestra al crisol utilizando un mnimo de agua caliente (80C) para el lavado del matraz. Elimine el vaco, afloje con cuidado la capa de muestra en el fondo del crisol sin removerla y agregue agua caliente, repitiendo el lavado varias veces. Finalmente lave dos veces con acetona sin remover la muestra del filtro y seque con vaco. 5. Seque los crisoles a 105C durante 12 h y pselos en caliente (esta operacin no debe durar ms de 30 seg). Si no se puede pesar de inmediato, enfre los crisoles en un desecador que contenga como desecante pentxido de fsforo (P2O5). 6. El residuo de fibra recuperado se registra en trminos de paredes celulares. 7. Calcule el contenido celular (material soluble) substrayendo este valor de 100. NOTA: En el caso de granos y subproductos de molinos es posible que se forme un material gelatinoso derivado de los almidones y la protena, el cual obstruye el filtro e impide el lavado. Para mejorar la filtracin haga pasar aire en sentido inverso en el crisol. As mismo al evite que la muestra se adhiera al fondo del matraz durante el inicio del calentamiento hasta la ebullicin, calentando rpidamente con agitacin constante. Clculos a. Paredes celulares (%) en base seca o como se ofrece. 100(((peso del crisol + paredes celulares) - (peso del crisol))/peso de la muestra. b. El porciento del contenido celular se calcula substrayendo de 100 el % de paredes celulares. % contenido celular = 100 - % paredes celulares. Van Soest, P.J. and R.H. Wine, 1967, J. Assoc. Official Anal. Chem., 50:50.

FIGURA 8

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Determinacin del contendido de fibra por el mtodo de detergente neutro

4.3. Ceniza insoluble en Acido Clorhdrico

Este mtodo determina el contenido de substancias minerales insolubles en cido clorhdrico contenidos en los alimentos; de acuerdo con el contenido mineral de la muestra se aplica ya sea el mtodo A, para alimentos con alto contenido de materia orgnica, o el mtodo B, recomendable para alimentos con un alto contenido de minerales, incluyndose aquellos cuyo contenido de ceniza insoluble es mayor a 1 % al evaluarse previamente con el mtodo A. Reactivos

Solucin HCI 3N. Solucin A de cido tricloroactico al 20%, 20 g en 100 ml. Solucin B de cido tricloroactico al 1 %, 1 g en 100 ml.

Materiales y Equipo

Placa de calentamiento. Mufla elctrica con termostato. Crisoles de calcinacin: Platino o aleacin de platino y oro (10% Pt, 90% Au); Rectangulares (60 40 25 mm) o circulares (6075 mm de dimetro con 20 25 mm de alto).

Mtodo A Calcine la muestra siguiendo el mtodo de determinacin de ceniza. Transfiera el residuo a un vaso de precipitado de 250 400 ml usando 75 ml de cido clorhdrico 3N y evapore a sequedad, contine calentando durante una hora ms para deshidratar cualquier slice presente. Enfre y agregue 75 ml de solucin de HCI 3N y caliente a ebullicin suavemente por 15 minutos. Filtre la solucin en caliente a travs de un papel filtro libre de ceniza y lave el residuo con agua caliente hasta que el filtrado deje de ser cido. Seque el papel filtro conteniendo el residuo y calcine a 550700C en un crisol de platino prepesado, enfre en un desecador y posteriormente pese.

FIGURA 9

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Determinacin de ceniza insoluble en cido clorhdrico. Mtodo A. Mtodo B Pese alrededor de 5 g de muestra con una aproximacin de 0.001 g y transfirala a un vaso de precipitado de 250 400 ml. Adicione 25 ml de agua destilada y 25 ml de solucin de cido clorhdrico 3N. Mezcle con cuidado y espere hasta que ya no se liberen gases. Agregue otros 50 ml de cido clorhdrico y espere hasta que cese la liberacin de gases y coloque el vaso en un bao mara a ebullicin durante 30 minutos, con el fin de hidrolizar los almidones presentes. Filtre la solucin cuando todava este caliente con papel filtro libre de cenizas, posteriormente lave el filtro con 50 ml de agua tibia hasta que el filtrado deje de ser cido (ver nota). Coloque el papel filtro conteniendo el residuo en un crisol de platino previamente pesado, seque y calcine la muestra a 550 700C. Transfiera las cenizas a un vaso de precipitado usando 75 ml de cido clorhdrico 3N y contine el anlisis como en el mtodo anterior a partir de la etapa en la que se calienta la muestra suavemente por 15 minutos. NOTA: Si se hace difcil filtrar, repita el anlisis reemplazando los 50 ml de cido clorhdrico 3N con 50 ml de la solucin A de cido tricloroactico y enjuague el filtro con una solucin tibia de la solucin B de cido tricloroactico. Clculos Calcule el peso de residuo y exprese el resultado como porciento (%) de la muestra.

FIGURA 10

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Determinacin de ceniza insoluble en cido clorhdrico. Mtodo B.

4.4. Carbohidratos Totales Disponibles (CleggAnthrone).

Este mtodo determina la cantidad de carbohidratos totales, basndose en su contenido de almidones hidrolizables y azcares solubles. Reactivos

Solucin de cido perclrico al 52 %. 279ml de cido perclorico (grado especfico 1.70) en 100 ml de agua destilada; deje enfriar antes de usar. Solucin de cido sulfrico. 760ml de H2SO4 (grado especfico 1.84) en 330ml de agua destilada; deje enfriar antes de usar. Reactivo Anthrone. Prepare suficiente reactivo Anthrone preparando una solucin de cido sulfrico al 0.1 % con el fin de usarla el mismo da. Solucin estndar de glucosa. Disuelva 100mg de glucosa en 100ml de agua. Solucin estndar de glucosa diluida. Diluya 10ml del estndar de glucosa a 100 ml de agua destilada (1ml = 0.1mg de glucosa).

Materiales y Equipo

Espectrofotmetro. Papel filtro Wathman no. 542 o Schleicher y Schill no. 150.

Procedimiento Extraccin: 1. Pese con aproximacin de 0.001g 1.0g de muestra seca 2.5g de muestra hmeda conteniendo aproximadamente de 60 a 300 mg de carbohidratos totales disponibles. 2. Transfiera cuantitativamente a una probeta graduada de 100 ml con tapn. 3. Adicione 10 ml de agua y agite con una varilla de vidrio para dispersar la muestra. 4. Adicione 13 ml de la solucin de cido perclrico. Agite constantemente con la varilla de vidrio durante 20 minutos. 5. Enjuague la varilla con agua destilada y lleve el volumen a 100 ml. Mezcle y filtre a un matraz volumtrico de 250 ml. 6. Enjuague la probeta graduada con agua destilada y adicione al matraz volumtrico. Afore el matraz con agua destilada y agite. Determinacin:

1. Diluya 10 ml del extracto a 100 ml con agua destilada. Con una pipeta pase a un tubo de ensaye 1 ml del filtrado diluido. 2. Tome con la pipeta dos muestras de 1 ml de agua destilada que servirn como blancos por duplicado y coloque cada uno de ellos en un tubo de ensaye. 3. Tome dos blancos duplicados de 1 ml usando la solucin de glucosa diluida. 4. Agregue rpidamente a todos los tubos 5ml de reactivo de anthrone recin preparado. Tape los tubos y mezcle vigorosamente. Colquelos en un bao mara y caliente durante 12 minutos. 5. Enfre rpidamente a temperatura ambiente. Transfiera la solucin a celdas para espectrofotmetro de 1 cm. El color verde es estable slo por 2 horas. 8. Lea la absorvancia a 630 nm contra el blanco. Clculos Carbohidratos totales disponibles (% de glucosa) = (25 b)/(a W) Donde W = Peso en g de la muestra. a = Absorvancia del estndar diluido1. b = Absorvancia de la muestra diluida. El grfico es una lnea recta n el rango de 0 0.15 mg de glucosa (manual) 0.0 1.5 mg de glucosa (automtico).
1

Clegg, K.M. (1956). J.Sci. Food Agric. 7, 40.

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FIGURA 11 Determinacin de carbohidratos totales disponibles en alimentos.

4.5. Nitrgeno Proteico y No Proteico

Esta tcnica permite reconocer la porcin de nitrgeno de origen proteico y no proteico de los materiales analizados. Puede aplicarse a todo tipo de materiales.

Reactivos

Acetato de cobre monohidratado en solucin al 3 % p/v. Sulfato de aluminio y potasio (2 H2O) en solucin al 10% p/v. Antiespumante de silicona.

Materiales y Equipo

Matraces kjeldhal de 800 ml. Embudos buchner de 12 cm de dimetro. Matraces kitazato. Papel filtro Whatman no. 541 Schleicher y Schill no. 1505, de 18 cm.

Procedimiento Pese 2 g de muestra con ms de 25% de protena cruda, lg para rangos de 25 50% de protena y 0.5g para materiales con ms de 50% de protena cruda. Transfierala a un matraz kjeldahl y agregue aproximadamente 50 ml de agua destilada, unos pocos grnulos de antiebullente y una o dos gotas del antiespumante. Caliente a ebullicin durante 30 minutos (teniendo cuidado de que no se seque). Cuando la muestra est todava caliente agregue 2 ml de la solucin de sulfato de aluminio y potasio, mezcle perfectamente y caliente a ebullicin, adicione 50 ml de la solucin de acetato de cobre mezclando perfectamente bien y deje enfriar. Filtre usando vaco. Lave el matraz y el precipitado con 50 ml de agua destilada fra. Para evaluar el nitrgeno proteico analice el residuo por medio de la marcha de nitrgeno total de kjeldahl. El nitrgeno no proteico se analiza por medio de la misma tcnica a partir del lquido filtrado. Los resultados respectivos de los slidos y lquidos por medio de kjeldahl ofrecern directamente los datos de nitrgeno proteico (NP) y no proteico (NNP) respectivamente.

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FIGURA 12 Determinacin del contenido de nitrgeno proteico y no proteico en alimentos.

4.6. Determinacin de Protenas por el Mtodo de Lowry.

El mtodo ms preciso para la determinacin de concentraciones proteicas es probablemente el mtodo de hidrlisis cida. La mayor parte de los otros mtodos son sensibles a la composicin de aminocidos de las protenas y no pueden ser obtenidas

concentraciones absolutas. El procedimiento de Lowry no es la excepcin, pero es sensiblemente constante de protena a protena, lo cual ha hecho que sea ampliamente usado y que las determinaciones sean una alternativa completamente aceptable con un rigor absoluto en todas las determinaciones en casi todas las circunstancias en donde se involucren mezclas de protenas o extractos crudos. Reactivos

Reactivo de formacin compleja. Preprese inmediatamente antes de usarse, mezclando las soluciones A, B y C en proporcin 100:1:1 respectivamente. Solucin A: 2% (P/V) Na2CO3 en agua destilada. Solucin B: 1% (P/V) CuSO4.5H2O en agua destilada. Solucin C: 2% (P/V) Tartrato de Sodio y Potasio en agua destilada. Solucin de Hidrxido de sodio 2N. Reactivo de Foln (disponible comercialmente): sese en concentracin 21N. Estndares: Use una solucin madre de protena estndar (por ejem. fraccin V de albmina de suero bovino) conteniendo 4 mg/ml de protena en agua destilada, almacenada a -20C. Prepare los estndares diluyendo la solucin madre con agua destilada tal como se indica en la siguiente tabla: PREPARACION DE ESTANDARES DE PROTEINA

Solucin madre (l) Agua (l)

1.25 2.50 6.25 12.50 25.00 62.50 125.0 250.0 475 200 438 500 475 250

500 499 498 494 488 10 20 50 100

Concentracin de protena (g/ml) 0 Procedimiento

1000 2000

1. A 0.1 ml de muestra o sol. estndar, adicinele 0.1 ml de sol. NaOH 2N. Caliente a 100C durante 10 min a bao mara hirviendo para hidrolizar la muestra. 2. Deje enfriar a temperatura ambiente y agrguele 1 ml del reactivo de formacin de complejo recin preparado y deje reposar a temperatura ambiente por 10 min. 3. Adicione 0.1 ml de reactivo de Foln, agite con un mezclador de vrtice y deje reposar a temperatura ambiente durante 3060 min (no exceda este tiempo). 4. Lea la absorvancia a 750 nm si la concentracin de la protena fuera menor a 500 g/ml, 550 nm si fuese entre 100 y 2000 g/ml. 5. Trace una curva estndar de absorvancia como funcin de concentracin inicial de protena y sela para determinar el contenido de protena en la muestra.

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NOTA a. Si la muestra se encuentra como precipitado, disulvalo en NaOH 2N e hidrolice como en el paso 1. Use alcuotas de 0.2 ml del hidrolizado para el paso 2. b. Todas las clulas u otras muestras complejas pueden requerir un pretratamiento como el descrito por Burton (1984) para DNA. c. Mezcle rpidamente en cuanto el reactivo de Foln sea adicionado; esto es importante para obtener una adecuada reproductibilidad. d. Se requiere un grupo de estndares para cada ensayo, preferentemente por triplicado o duplicado.

FIGURA 13 Determinacin de protena en alimentos por el mtodo de Lowry

4.7. Determinacin de Urea

Este mtodo permite cuantificar el contenido de urea en ingredientes alimenticios. Reactivos

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Carbn activado Solucin Carrez I: disuelva 21.9 g de acetato de zinc dehidratado en agua, agregue 3 ml de cido actico glacial y diluya a 100 ml con agua destilada. Solucin Carrez II: disuelva 10.6 g de ferrocanuro de potasio en 100 ml de agua destilada. Acido clorhdrico 0.02N. Solucin de acetato de sodio: disuelva 136 g de acetato de sodio trihidratado en 1000 ml de agua. Solucin de 4-dimetilaminobenzaldehdo: disuelva 1.6 g de 4dimetilaminozenzaldehdo (4-DMAB) en 100 ml de etanol al 96% y adicione 10 ml de cido clorhdrico (d=1.18 g/ml). Solucin estndar de urea: disuelva 0.1 g de urea en 100 ml de agua.

Materiales y Equipo

Agitador rotatorio Espectrofotmetro con celdas de 10 mm.

Procedimiento Pese aproximadamente 2 g de muestra con una precisin de 0.001 g, o una cantidad que se espera contenga de 50 a 200 mg de urea y colquela en un matraz volumtrico de 500 ml. Agregue 150 ml de cido clorhdrico 0.02N, agite por 30 min y adicione 10 ml de la solucin de acetato de sodio y mezcle. Agregue 1 g de carbn activado, agite perfectamente bien y deje reposar la mezcla por 15 min. Adicione 5 ml de la solucin Carrez I, seguido por 5 ml de la solucin Carrez II, mezclando perfectamente bien entre las adiciones. Afore con agua destilada y mezcle bien. Filtre una parte con un papel filtro seco en un vaso de precipitado de 250 ml limpio y seco. Determinacin Transfiera 10 ml del filtrado a un tubo de ensaye con tapn esmerilado, adicione 10 ml de la solucin 4-DMAB, mezcle y deje reposar por 15 min. Mida la absorvancia de la solucin a 435 nm en una celda de 10 mm, contra una solucin de referencia preparada con los reactivos. Curva de Calibracin Diluya 5, 10, 20, 30 y 40 ml de solucin de urea a 100 ml de agua. Transfiera 10 ml de cada solucin a tubos de ensaye con tapn esmerilado y adicione 10 ml de la solucin 4-DMAB a cada uno. Mezcle y deje reposar por 15 minutos, mida la absorvancia como se seal anteriormente contra una solucin de referencia preparada con 10 ml de solucin 4-DMAB y 10 ml de agua, haga una grfica relacionando las absorvancias con la cantidad de urea presente.

Expresin de Resultados Determine la cantidad de urea en la muestra por referencia con la curva de calibracin elaborada. Exprese los resultados como por ciento de la muestra. % Urea 0.4665 = % N urea. NOTA: Si la muestra est muy coloreada, la cantidad de carbn activado deber ser incrementada arriba de 5 g. La solucin final despus del filtrado deber ser incolora.

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FIGURA 14 Determinacin del contenido de urea en ingredientes alimenticios.

4.8. Acido Urico.

A travs de este mtodo es posible determinar el contenido de cido rico y sus sales tanto en gallinaza como en alimentos e ingredientes que los constituyen.

Reactivos

Solucin de hidrxido de sodio. Disuelva 50 g de NaOH en 50 ml de agua, mezcle bien y almacene la solucin en un envase de plstico. Solucin neutra de formaldehido.

a. Verifique la concentracin de la solucin disponible, para lo cual mezcle 30 ml de sta con 50ml de solucin de NaOH IN y 25ml de solucin de Perxido de hidrgeno (20 volmenes). Caliente en bao de vapor hasta que no haya ms efervescencia. Enfre y titule con NaCl IN usando indicador de fenoftalena. Realice una titulacin de blanco usando 3 ml de agua en lugar del formaldehdo y calcule la concentracin como sigue: 1ml de la solucin de NaOH IN = 0.0300 g de formaldehdo. Conc. de formaldehdo (g/100 ml) = ((B-T) ((0.0300 100)/3) Donde B = Titulacin del blanco. T = Titulacin de la muestra. b. Prepare una solucin neutra que contenga 17.5g de formaldehdo con 250ml de agua y 500ml de etanol. Ajuste el pH a 7.0 con una solucin de NaOH 0.1N. Diluya a 1000ml con agua, mezcle y ajuste nuevamente el pH de ser necesario.

Solucin buffer de succinato. Disuelva con calentamiento 29.5g de cido succnico en 750ml de agua y 20ml de la solucin de NaOH. Deje enfriar y adicione una cantidad adecuada de solucin de formol que contenga 17.5g de formaldehdo, mezcle bien y ajuste el pH a 6.0 con la solucin de NaOH. Diluya a 1000ml con agua destilada, mezcle y ajuste el pH si es necesario. Solucin de tiosulfato de sodio. Disuelva 25g de Na2S2O3.5H2O en 1000ml de agua destilada. Solucin de lactato de plata. Disuelva con calentamiento 3g de lactato de plata en 50ml de agua destilada y 1ml de cido lctico. Diluya a 100ml con agua, filtre y almacene en un frasco obscuro. No lo exponga a la luz directa. Solucin de magnesio amoniacal. Disuelva 8.75g de MgSO4.7H2O y 17.5g de NH4CL en 50ml de agua. Agregue 30ml de NH4OH (d = 0.88g/ml), mezcle bien y diluya a 100ml con agua. Reactivo de Benedict y Hitchcock. Mezcle 35ml de solucin de lactato de plata con 15ml de solucin de magnesio amoniacal. Adicione 50ml de hidrxido de amonio (d = 0.88 g/ml) mzclese bien. Preprese inmediatamente antes de usarse. Solucin estndar de cido rico. Pese 250mg de cido rico con una precisin de 0.1mg y transfiralo a un matraz de fondo redondo acoplado a un condensador de

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reflujo. Adicione 100ml de la solucin de formaldehdo etlico y caliente a reflujo en un bao de vapor por 30min agitando frecuentemente. Enfre y transfiera a un matraz volumtrico de 250ml, lavando el matraz redondo con sol. de formaldehdo etlico, afore con esta solucin y mezcle. 1 ml contiene 1 mg de cido rico.

Eter de petrleo, punto de ebullicin 40 60C.

Materiales y Equipo

Epectrofotmetro con celdas de cuarzo de 10 mm. Tubos de cristal para percolacin, con aproximadamente 240 mm de longitud, 18 mm de dimetro interno, y en la parte inferior aproximadamente 120mm de longitud y 8 mm de dimetro interno.

Extraccin del cido rico: 1. De la gallinaza: Pese con una aproximacin de 0.001 g cerca de 0.4g de gallinaza seca y colquela en un matraz de fondo redondo de 150ml. Adicione 60ml de solucin neutra de formaldehdo, conecte a un condensador de reflujo y caliente en bao de vapor por una hora. Enfre y filtre a travs de un crisol (Porosidad 4) a un matraz volumtrico de 100ml. Enjuague el matraz 3 veces consecutivas con porciones de 10ml de solucin de formaldehdo etlico, pasando cada porcin por el crisol de filtracin al matraz volumtrico. Afore con la misma solucin y agite. 2. De los alimentos: Pese 4 a 5g de muestra con una aproximacin de 0.001 g y desengrasela por extraccin con ter de petrleo. Transfiera cuantitativamente la muestra desengrasada a un matraz de fondo redondo y remueva el solvente residual con una corriente suave de aire. Contine el anlisis como previamente se seal, iniciando con la adicin de 60 ml de solucin de formaldehdo etlico. Determinacin Transfiera con una pipeta de 20 ml de extracto de la muestra prepesado, segn los mtodos descritos, a un tubo de centrfuga de 50 ml. Adicione 10 ml del reactivo de Benedict y Hitchcock, mezcle bien y djelos reposar en la oscuridad por una hora. Centrifuge a 2000 rpm por 15 min. Retire el sobrenadante y deje escurrir por 10 min. Cuidadosamente limpie cualquier lquido remanente sin perturbar el precipitado y adicione 20 ml de solucin de tiosulfato de sodio. Disuelva el precipitado, agitando con una varilla de vidrio delgada. Con una pipeta transfiera 5 ml de esta solucin a un matraz volumtrico de 200 ml conteniendo 40 ml de solucin buffer de succinato, afore con agua destilada y mezcle bien. Mida la absorvancia de la solucin a 294 nm en celdas de slice de 10 mm comparada contra una solucin preparada mezclando 5 ml de solucin de tiosulfato de sodio con 40 ml de solucin buffer de succinato aforada a 200 ml con agua destilada. Determine la cantidad de cido rico mediante una curva de calibracin. Curva de Calibracin: En una serie de tubos de centrfuga de 50 ml de capacidad transfiera con una pipeta 2, 4, 6, 8, 10 y 12 ml de solucin estndar de cido rico (equivalentes a una cantidad similar de

cido rico en mg) y llvelos a 20 ml con la solucin de formaldehdo etlico. Adicione a cada tubo 10 ml de reactivo de Benedict y Hitchcock, mezcle bien y djelo reposar en la oscuridad por una hora. Contine el mtodo como en la determinacin a partir del centrifugado. Mida la absorvancia de la solucin y trace la curva de calibracin graficando absorvancia (y) contra la cantidad correspondiente de cido rico en mg (x). Expresin de Resultados El contenido de N del cido rico como % de la muestra est dado por la frmula: % N = A/(6 W) Donde A = mg de cido rico (en la alicuota del extracto de la muestra) determinado por la medicin fotomtrica. W = peso de la muestra en g.

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FIGURA 15 Determinacin de cido rico en gallinaza e ingredientes alimenticios

4.9. Ceniza Soluble e Insoluble en Acido.

Este mtodo proporciona una estimacin de la disponibilidad de minerales en base a su digestibilidad en cido.

Reactivos, Materiales y Equipo

Acido clorhdrico (12.5 % v/v) Papel filtro libre de ceniza Crisoles de porcelana

Procedimiento Use el residuo obtenido de la determinacin de ceniza. Caliente 25 ml de cido clorhdrico con cuidado para evitar salpicar y filtre en el papel y enjuague con agua caliente hasta que quede libre del cido. Coloque el papel filtro y el residuo en un crisol de porcelana prepesado seco y colquelo en la mufla a 600 C durante 2 horas o hasta que quede libre de carbn. Clculos Ceniza insoluble (%) = 100(Peso de la ceniza tratada con cido/Peso de la muestra)

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FIGURA 16

Determinacin de ceniza soluble e insoluble en cido clorhdrico

4.10. Determinacin de Calcio en el Alimento.

La evaluacin de calcio en la dieta reviste una gran importancia ya que un desbalance con el fsforo u otros minerales generar un bajo crecimiento. Reactivos

Acido clorhdrico (1 3 %) Acido ntrico 70% Hidrxido de amonio (1:1 v/v) Indicador de rojo de metilo (1 g en 200 ml de etanol) Solucin de oxalato de amonio 4.2 %

Acido sulfrico 98 % Solucin estndar de permanganato de potasio 0.05N

Materiales y Equipo

crisoles de porcelana matraces volumtricos de 250 ml vasos de precipitado de 250 ml Papel filtro para anlisis cuantitativos libre de cenizas

Procedimiento Calcine en crisol de porcelana 2.5g de muestra finamente molida. Adicione 40ml de HCI y unas gotas de HNO3 al residuo, caliente el crisol hasta ebullicin, enfre y transfiera a un matraz volumtrico de 250ml, afore y mezcle. Pase a un vaso de precipitado 100ml de sol. para cereales o alimentos con cereales 25ml para alimentos con minerales. Diluya a 100ml y adicione 2 gotas de rojo de metilo. Adicione NH4OH gota a gota hasta que vire a pardo anaranjado, luego adicione 2 gotas de HCl para dar un color rosa. Diluya con 50ml de agua, hierva y adicione con agitacin 10ml de sol 4.2% de oxalato de amonio. Ajuste el pH con cido para regresar al color rosa si es necesario. Dje reposar, filtre y lave el precipitado con la solucin de NH4OH (1.5%). Coloque el papel filtro con el precipitado en un vaso, adicione una mezcla de 125ml de agua y 5ml de H2SO4, caliente a 70C y titule con la solucin de permanganato y calcule: Ca (%)= 0.1((ml Sol. Permanganato/Peso de la Muestra) (Alicuota usada en ml/250)

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FIGURA 17 Determinacin de calcio en alimento e ingredientes alimenticios.

4.11. Determinacin de Fsforo

Al igual que el calcio, este mineral es indispensable para el buen desarrollo de los organismos cultivados, debiendo estar presente en las dietas en cantidades suficientes para satisfacer las necesidades metablicas de los organismos. Este elemento en protenas de origen vegetal puede estar formando parte de fitatos, por lo cual su disponibilidad puede estar limitada, por lo que se recomienda una determinacin de cido ftico previa al uso de tales materiales. Reactivos

Reactivo de Molibdato. Disuelva 40 g de molibdato de amonio 4.H2O en 400 ml de agua caliente y enfre. Disuelva 2 g de metavanadato de amonio en 250 ml de agua caliente, enfre y adicione 450 ml de cido perclrico al 70%. Gradualmente adicione la sol. de molibdato a la sol. de vanadato con agitacin y diluya a 2 1. Estndar de Fsforo. Prepare una solucin stock disolviendo 8.788 g de Ortofosfato dihidrgeno potasio en agua y llvelo a 1 1. Prepare la solucin de trabajo

diluyendo la sol. stock 1 en 20 (Conc. de trabajo 0.1 mg P//ml). Materiales y Equipo

Espectrofotmetro para leer a 400 nm Matraces graduados de 100 ml

Procedimiento 1. Pase una alicuota como en la determinacin de Ca a un matraz de 100 ml y adicione 20 ml del reactivo de molibdovanato. Aforelo, mezcle y deje reposar por 10 min. 2. Transfiera alicuotas del estndar de trabajo conteniendo 0.5, 0.8, 1.0 y 1.5 mg de P en matraces de 100 ml y trtelos como al anterior. 3. Lea la muestra a 400 nm ajustando el estndar de 0.5 mg a 100% de transmisin. 4. Determine mg de fsforo en la muestra usando una curva estndar.

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FIGURA 18

Determinacin de fsoforo en dietas e ingredientes alimenticios.

4.12. Determinacin de Cloruro de Sodio

Este mtodo permite determinar la cantidad de sal presente en harina de pescado y otros ingredientes. Reactivos

Solucin estndar 0.1N de Nitrato de Plata Solucin estndar 0.1N de Tiocianato de Amonio Indicador Frrico - Solucin acuosa saturada Solucin de Permanganato de Potasio 6 % p/v Solucin de Urea 5 % p/v Acetona grado analtico Acido Ntrico concentrado

Procedimiento 1. Pese 2 g de muestra en un matraz erlenmayer de 250 ml, humedezca la muestra con 20 ml de agua, adicione con pipeta 15 ml de la solucin de nitrato de plata y mezcle bien. 2. Adicione 20 ml de Acido Ntrico concentrado y 10 ml de la solucin de Permanganato de Potasio y mezcle. Caliente continuamente la mezcla hasta que el lquido se aclare y desaparezca los vapores nitrosos, enfre. 3. Adicione 10 ml de Solucin de Urea y deje reposar por 10 min. 4. Adicione 10 ml de acetona y 5 ml de indicador frrico y titule el exceso de nitrato de plata con la solucin de Tiocianato hasta el punto final rojo-caf. Clculos Calcule resultados como NaCl %NaCI= (15.00 - ml 0.1N NH4CNS 0.585)/g de muestra

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FIGURA 19 Determinacin de cloruro de sodio en harina de pescado y otros ingredientes

4.13. Determinacin de Potasio

Reactivos

Acido Clorhdrico concentrado.

Solucin estndar de Potasio: Para preparar solucin stock (500 ppm), disuelva 0.477 g de Cloruro de Potasio y llvelo a 500 ml con agua destilada. Para preparar el estndar de trabajo (10 ppm), diluya 1:50. Aceite de oliva (puro)

Materiales y Equipo

Crisoles de Slice. Fotmetro de flama Mufla

Procedimiento 1. Seque 2 g de muestra en un crisol de slice a 100C para eliminar la humedad. Adicione unas cuantas gotas de aceite de oliva y caliente sobre la flama hasta que deje de producir flama. 2. Calcine a 500C en la mufla por 24 h, enfre y adicione 2 ml de HCI concentrado para disolver el residuo. 3. Llvelo a 100 ml con agua destilada, tome 1 ml de la solucin y haga una nueva dilucin a 100 ml con agua destilada. 4. Ajuste el fotmetro de flama para que de una lectura de 100 con el estndar de 10 ppm y lea la solucin muestra. 5. Si la lectura no se encuentra entre 50 y 100 haga una dilucin al momento para dar una lectura apropiada.

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FIGURA 20

Determinacin del contenido de potasio en ingredientes alimenticios.

4.14. Cuantificacin de xido de cromo en heces y alimentos (Furukawa y Tsukahara, 1966)

El xido de cromo es el marcador ms ampliamente utilizado durante la evaluacin de la digestibilidad en dietas experimentales para peces. El mtodo aqu presentado es una modificacin del propuesto por Furukawa y Tsukahara, a fin de manejar micromuestras durante la determinacin del contenido de xido de cromo en dietas y heces. Reactivos

Acido ntrico concentrado, gr. Acido perclrico, g.r.

Materiales y equipo

Espectrofotmetro Digestor kjeldahl para tubos de 100 ml Matraces kjeldahl de 100 ml Matraces volumtricos de 25 ml

Procedimiento Muela finamente el alimento y las heces, a las cuales se les habr eliminado previamente escamas y cualquier otra materia extraa; mantngalos a sequedad. Pese con precisin de 0.0001g de 50 a 100mg de muestra, colquela en un matraz kjeldahl de 100 ml y pese nuevamente la charolilla para ajustar peso de la muestra. Adicione 5ml de HNO3 y ponga a digerir en ebullicin suave por un mnimo de 30 min hasta que desaparezcan los vapores amarillentos. En caso de que disminuya notablemente la cantidad de lquido y contine habiendo vapores nitrosos, adicione otros 5ml de cido ntrico y siga digiriendo. Al trmino la solucin debe ser clara, de color verdoso y no debe desprender vapores ocres. Deje enfriar. Ya fra la solucin, agregar cuidadosamente resbalando por las paredes del matraz 3ml de cido perclrico. Realizar la adicin dentro de una campana de extraccin y con mucho cuidado, ya que en caso de una digestin incompleta se puede presentar una reaccin explosiva. Coloque nuevamente el matraz en el digestor y contine la ebullicin hasta que la solucin vire de verde a amarillo limn; apague el digestor y deje enfriar. Ya fro se debe formar un anillo rojizo en el borde del lquido; en caso de no formarse o si el lquido se torna verde nuevamente, volver a digerir hasta que el cambio sea permanente. Pase el lquido fro a un matraz volumtrico de 25 ml, enjuagando el matraz kjeldahl varias veces con agua destilada y afore. Ajuste a O el espectrofotmetro con un blanco de reactivos y leer a 350 mm. El blanco se prepara simultneo a la muestras usando solamente

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los cidos y agua destilada. Clculos a) Calcule la cantidad de xido de cromo (mg) presente en la muestra: X = ((Y - 0.0032)/0.2089)/4 Donde Y = absorvancia 0.0032 y 0.2089 son constantes b) Calcule el % de xido de cromo en la muestra: O.C.% = 100(X/A) Donde X = peso del xido de cromo A = peso de la muestra

FIGURA 21

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Determinacin de xido de cromo en alimentos y heces.

4.15. Mtodo de Carpenter para la determinacin de Lisina Disponible (Tejada, 1985)

El mtodo permite determinar la cantidad de lisina libre que reacciona con el lfluorodinitro benceno. Reactivos

Solucin madre de Mono E N dinitrofenil - lisina HCI (p. m. 366.77, 39.85 % lisina) Disolver 314 mg en 250 ml de HCl concentrado. Se disuelve lentamente, de manera que hay que iniciar su preparacin un da antes. Solucin estndar diluida de DPN-lisina. Diluya 10 ml de la solucin madre en 100 ml de agua destilada para formar el estndar. Hecho lo anterior, 2 ml de la solucin contienen alrededor de 0.1 mg de lisina y disuelto a 100 ml da una absorcin neta de alrededor de 04 a 435 nm en celdilla de 1 cm. Solucin de 1 - fluoro 2,4 dinitrobenceno (FDNB). Manjese con guantes de plstico desechables. S el FDNB est slido colquese en balo de agua caliente para que se funda, tome con una pipeta automtica aproximadamente 0.4 ml y disuelva en 15 ml de alcohol etlico por muestra. Debe prepararse diariamente. Cloruro de metoxicarbonil (cloroformato de metilo). El MCC es inestable por lo que se debe almacenar en refrigeracin. Manjese con cuidado. Solucin de bicarbonato de sodio al 8% en agua destilada. Eter etlico libre de perxidos. Solucin de fenoftalena, 500 mg/l de alcohol etlico al 60%. Solucin de hidrxido de sodio al 12%. Se usa para incrementar el pH a 8.5 durante la reaccin del MCC. Debe almacenarse en frasco de plstico. Tener a la mano un gotero con HCI 1M para corregir cualquier exceso. Buffer de bicarbonato de sodio - carbonato, pH 8.5. Disuelva 19.5g de NaHCO3 y 1g de Na2CO3 en 250 ml de agua destilada; ajuste el pH si es necesario. Almacenar en un frasco bien lleno y bien cerrado para evitar prdida de CO2 Acido clorhdrico concentrado

Materiales y Equipo

Tamiz de 0.5 mm Matraces de fondo redondo Matraz volumtrico de 250 ml

Bao mara Rotoevaporador Aparato de reflujo Papel filtro Whatman 541 Tubos de ensaye con tapn Perlas de vidrio Espectrofotmetro

Procedimiento Muela la muestra para que pase el tamiz de 0.5 mm. La cantidad de muestra a utilizar deber contener alrededor de 12mg de lisina disponible, lo que equivale a 0.3 2g de la muestra. Pasela a un matraz de fondo redondo. Agregue 23 perlas de vidrio y 10ml de NaHCO3, agitar suavemente para que la muestra no se adhiera a las paredes. Adicione 15 ml de FDNB y agite suavemente durante 2 horas. No permita que la muestra se quede en las paredes. Evapore el etanol pero no el agua; en un bao de agua hirviendo el matraz debe perder aproximadamente 12.5g. Enfre y adicione 30ml de HCI 8.1M para neutralizar al NaHCO3. Sumando el agua presente, se tendr un volumen de 40ml y una concentracin de cido de 6M. Reflujar suavemente durante 16 horas. Desconecte el matraz y lave el refrigerante con un poco de agua. Filtre en caliente a un matraz volumtrico de 250 ml. Enjuague el matraz y el filtro varias veces con agua destilada y colecte en el matraz volumtrico; afore en fro con agua destilada. En ocasiones se forma un precipitado de dinitrofenol que se puede extraer con pipeta una vez precipitado, o se elimina con el ter. Colocar 2 ml del filtrado en dos tubos con tapn, etiquetndolos A y B. Agregar al tubo B 5 ml de ter y agita. Extraiga el ter (capa superior) con una pipeta automtica. Coloque el tubo en un bao a 90C hasta que se elimine todo el ter y enfre. Agregue una gota de fenoftalena al tubo, adicione gota a gota la solucin de NaOH hasta que aparezca un ligero color rosado; aada 2ml de buffer de carbonato y agregue dentro de una campana 0.5 ml de metilcloroformato. Tapar el tubo y agitar vigorosamente, liberando la presin con cuidado. Despus de 5 10 min, adicione gota a gota 0.75 ml de HCI concentrado agitando para evitar la formacin de espuma. Se extrae cuatro veces la solucin con ter como se describi anteriormente. Elimine el ter residual en bao mara, enfre y lleve el volumen 10 ml con agua destilada. Durante las pausas de las manipulaciones del tubo B, extraiga tres veces con ter el tubo A; elimine el ter residual y lleve a 10 ml con HCl. Lea la absorvancia de ambos tubos a 435 nm en el espectrofotmetro contra agua destilada. La lectura del tubo menos la del tubo B

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(blanco) es la absorvancia atribuible al DNP - lisina. Absorvancia del estndar DPN - Lisina Coloque 2 ml de DNP-L diluido en dos tubos A y B siguiendo el procedimiento ya indicado-Practicar hasta que se tenga confianza en las manipulaciones. La absorvancia neta se usar para calcular las muestras problema. El blanco B tiene generalmente una absorvancia de 0.01; si el valor es mucho mayor revisar el procedimiento, especialmente el frasco de servicio, el pH del buffer de carbonato, la longitud de onda a que se est leyendo y el ter libre de perxidos. Precauciones con alimentos de origen vegetal. En alimentos de origen vegetal en ocasiones no se logra una hidrlisis total a las 16 horas y como un tiempo ms largo se descompone el DNP-L, debe hacerse una segunda digestin con materiales desconocidos. Para lograr esto, despus de la digestin se filtra, se lava y se procesa el filtrado como se seal. El residuo se coloca en un matraz de fondo redondo con HCI 6 M y algunas perlas de vidrio (se pueden juntar los residuos de las rplicas); el volumen del cido clorhdrico debe ser menor a 30 ml. Se deja en reflujo por 16 horas, se filtra en caliente y se lleva a 100 ml segn el procedimiento ya descrito. Si el resultado es muy pequeo se elimina, o de lo contrario, se hacen las correcciones necesarias para el material. Para determinar la prdida de DNP-L se debe calcular un factor de correccin, el cual vara con el material. Para su clculo, consultar a: Makade, M.L. y Liener, I.E., 1969. Anal. Biochem., 27:271. Clculos C = (Ws Au V 100 100)/Wu As a (cp) Donde C= g de lisina/16g de N Ws= Peso del estndar expresado como mg de Lis en 2 ml; 0.1 s se prepara como se indica. Wu= Peso de la muestra en mg As= Absorcin neta del estndar Au= Absorcin neta del desconocido V= Volumen del hidrolizado filtrado. Se recomienda 250 ml (menos por la segunda digestin). a= Alcuota del filtrado. Se recomiendan 2 ml. CP= Protena cruda, 6.25 g N/100g material. Para expresar el resultado como g lisina/Kg de PC, cambiar un 100 por 10 en la frmula. NOTA: El material de vidrio puede tomar un tinte amarillento debido al dinitrofenol. Los hidrolizados y soluciones de DNP-Lisina deben protegerse de la luz especialmente a pH

alcalino.

FIGURA 22 Determinacin de lisina disponible en ingredientes alimenticios.

4.16. Anlisis de Melazas

Los peces, segn su especie, presentan una capacidad diferencial para utilizar carbohidratos en su dieta, por lo cual se considera importante contar con un mtodo rpido para la determinacin de azcares totales disponibles. Reactivos:

Solucin de Fehling (modificada por Soxhlet):

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a. Disuelva 34.639g de Sulfato de Cobre 5H2O en agua destilada, afore a 500ml, filtre. b. Disuelva 173 g de tartrato de sodio y potasio 4.H2O y 50 g de Hidrxido de Sodio en agua destilada, diluya a 500 ml, deje reposar por 2 das y filtre a travs de asbesto preparado.

Estndar de Azcar invertida. Prepare una solucin stock adicionando 5ml de HCL (Sp. g 1.18) a 9.5g de sacarosa en solucin y diluya a 100ml con agua destilada. Despus de almacenar por 2 das a temperatura ambiente, afore a 1000 ml con agua destilada. Prepare soluciones de trabajo que contengan 5mg/ml, para lo cual mida con una pipeta volumtrica una alcuota de 100 ml de la solucin stock. Vace a un matraz volumtrico de 200 ml y neutralice con una solucin de NaOH al 20%, usando fenoftalena como indicador, lleve a volumen y mezcle. Acido Clorhdrico concentrado (Sp.g 1.18). Acido Clorhdrico (0.5N). Hidrxido de Sodio, Solucin 20%. Indicador de Fenoftalena (1% en etanol). Indicador de azul de metileno (1% en agua).

Materiales y Equipo

Calentador elctrico Matraces erlenmayer de 500 ml

Procedimiento Disuelva 8g de melaza y llvela a 500ml con agua destilada (filtre). Hidrolice 100 ml del filtrado con 5ml de HCI (Sp. g 1.18) y deje reposar por 24 h. Neutralice con NaOH al 20% usando fenoftalena como indicador y diluya a 200 ml. Estandarizacin de la Solucin Soxhlet: Mida 10ml de la solucin Soxhlet (a) y (b) con una pipeta volumtrica y vace a un matraz erlenmayer, mezcle y agregue 30ml de agua. Adicione con una bureta un volumen de estndar de trabajo casi suficiente para reducir el Cobre en la solucin Soxhlet. Llvelo a ebullicin y djelo hervir por 2 min., adicione 4 gotas de azul de metileno y rpidamente complete la titulacin mientras est hirviendo, hasta que se obtenga un color naranja brillante. Repita varias veces y determine el volumen de solucin requerido para reducir completamente 20 ml de solucin Soxhlet. Titulacin de Muestra: Primero realice una titulacin aproximada; pase a un matraz 10ml de las soluciones (a) y (b), adicione alcuotas de 10ml de la solucin muestra. Aada 40 ml de agua y llvelo a ebullicin. Si persiste el color azul, titule con una solucin estndar de trabajo y calcule el contenido aproximado de azcar en la muestra. Para determinar con precisin el contenido de azcar, pase a un matraz 10 ml de las soluciones Soxhlet (a) y (b);

adicione una alcuota de la solucin muestra. El volumen de muestra usado depender del contenido de azcar en la muestra. Adicione agua como se indica en la tabla, mezcle y hierva. Durante la ebullicin, agregue estndar de trabajo con una bureta hasta que la titulacin sea casi completa. Aada azul de metileno y complete la titulacin. VOLUMEN DE MUESTRA USADO EN LA TITULACION SOXHLET (AOAC, 1970) ml de H2O ml de muestra g de muestra en alcuota 40 35 30 25 20 10 15 20 25 30 0.08 0.12 0.16 0.20 0.24 Total como azcar invertida (%) 73 82-58 61-41 49-35 49-29

Calcule el % de azcar (como invertida) = (F - M) I 100/w Donde: F= Volumen de estndar necesario para reducir 20 ml de Solucin Soxhlet. M= Volumen de solucin estndar de azcar requerido para completar la titulacin I= Peso de la azcar invertida en 1 ml de Standard de trabajo. W= Peso de la muestra en la alcuota usada.

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