Electrophorse sur gel dagarose

Principe :
Llectrophorse est lune des principales techniques utilises en biochimie ou biologie molculaire pour la sparation des protines ou celle des acides nucliques. Dans un milieu donn, la sparation des particules se fait en fonction de leur charge lectrique (dplacement dions sous effet dun champ lectrique) et pour des charges identiques, en fonction de leur taille. Les molcules anioniques (-) migrent vers l'anode (+) et les molcules cationiques (+) se dplacent vers la cathode (-). La molcule dADN est un polynuclotide. Chaque nuclotide est compos de 3 types de rsidus : le dsoxyribose, la base azote, le groupement phosphate H2PO4 qui peut sioniser en PO42-. En milieu basique, la molcule dADN se charge ngativement (H2PO4 2 H+ + PO42-). Sur les acides nucliques, les charges sont portes par les groupements phosphate du squelette. La molcule dADN place dans le tampon (TAE 1X, pH 8) et dans le champ lectrique cr dans la cuve lectrophorse va migrer vers lanode (+). On va donc effectuer les dpts cot cathode (-). La migration de lADN sous leffet du champ lectrique va se raliser dans lpaisseur du gel poreux dagarose dans lequel lADN a t dpos. Les pores de ce gel vont se comporter comme un tamis qui freine le dplacement des fragments dADN. La vitesse de migration des fragments sera dtermine par : - la rsistance du gel la migration des fragments proportionnelle leur taille, - la charge des fragments proportionnelle leur taille, - la concentration du gel en agarose Les fragments dADN vont donc se sparer en fonction de leur taille. Si le facteur le plus important est la rsistance du gel la migration de lADN, ce sont les plus petits fragments qui migreront le plus loin.

Prparation du gel agarose 2%

Lagarose est un polymre base d'agar purifi, il se prsente sous forme de poudre. On dtermine le poids dagarose utiliser, et le volume de tampon ncessaire pour la formation du gel, en fonction de la taille des fragments sparer :
Concentration d'agarose (% en M/V) 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2 Gamme de tailles idales (en kb) 5-60 1-20 0,8-10 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2

 Peser 1g dagarose et ajouter 50 ml TAE 1X (Tris/Actate 40mM - EDTA 1 mM - pH 8).

50 ml TAE 1X 1 g dagarose

Dissoudre lagarose au four micro-ondes (le surveiller pour ne pas que a dborde) Ajouter 5 l de SYBRSafe DNA gel stain (Invitrogen) et mlanger Le SYBR Safe est un agent intercalant des acides nucliques, moins mutagne que le bromure dthidium. Il met de la fluorescence lorsquil est intercal dans lADN double brin. Deux longueurs dondes dexcitation : 280 et 502 nm. Longueur donde dmission : 530 nm. Monter les joints de coulage et les peignes et couler le gel :

3. Verser le gel dagarose entre les 2 joints de coulage et laisser prendre le gel.

1. Placer les joints de coulage

Cuve lectrophorse 2. Placer les 2 peignes dans les supports prvus cet effet. Le peigne permet de marquer lempreinte des puits de dpt de lADN.

4. Une fois le gel pris, retirer les lments de montage et recouvrir le gel de TAE 1X 5. Dposer les chantillons et le marqueur de taille puis faire migrer