COMPARACIN DE TCNICAS ANALTICAS DE DETERMINACIN DE ALMIDN DE MAZ Nadia Z. Comba, Romina A. Beltrn Tutor: Dra. Mariana, Montenegro y Mg.

Fernando, Bonaterra Grupo de Investigacin en Simulacin para Ingeniera Qumica -GISIQ - F. R. Villa Mara de la UTN Av. Universidad 450, X5900HLR, Villa Mara, Crdoba, Argentina. combanadia@gmail.com Resumen El almidn es el componente ms importante en la produccin de etanol a partir de granos, como el maz, debido a que es el determinante del rendimiento del proceso. Por este motivo se investigaron tcnicas de cuantificacin de almidn, se ensayaron y se analizaron los resultados obtenidos. Se emplearon tcnicas oficiales de la Association of Official Analytical Chemists (AOAC), las cuales emplean hidrlisis cida y cuantificacin por gravimetra o titulacin, como as tambin un mtodo enzimtico con cuantificacin espectrofotomtrica. Los resultados as obtenidos fueron comparados con los generados por el mtodo de determinacin de almidn por la tcnica polarimtrica de Ewers modificada, norma IRAM15859, realizada por un laboratorio privado. Del anlisis de los resultados obtenidos en las actividades desarrolladas se concluye que el mtodo que menor error presenta es el de polarimetra, para el cual se necesita equipamiento no disponible en todos los laboratorios. El mtodo de hidrlisis cida de la AOAC utiliza materiales y reactivos simples, dando resultados confiables, pero tiene como desventaja la prolongada duracin del ensayo. La hidrlisis enzimtica es ms rpida, pero los reactivos son costosos y la repetibilidad de los resultados no est asegurada.
PALABRAS CLAVES: cuantificacin de almidn, hidrlisis cida, hidrlisis enzimtica, tcnica polarimtrica de Ewers modificada.

1. Introduccin 1.1. Maz La produccin de bioetanol ha tenido un crecimiento importante en los ltimos aos, siendo la principal materia prima el maz, y presenta buenas proyecciones a futuro. Esto se debe a su disponibilidad, como as tambin al elevado rendimiento que presenta frente a otros cereales (K.A. Jacques, 2003). El grano de maz tiene 3 componentes principales almidn, protena y aceite, los cuales estn contenidos en tres estructuras: el germen (embrin), el endospermo y el pericarpio (figura 1). Los componentes principales se encuentran distribuidos en cada estructura en diferentes proporciones, las cuales se muestran en la tabla 1, como as tambin la composicin del grano de maz entero, siendo el componente ms importante el almidn (Alvarez, 2006). Pericarpio Endospermo

Germen

Figura 1: Partes del grano de maz (Alvarez, 2006)

Tabla 1: Composicin de grano de maz dentado y de sus partes. % del grano entero en BS Germen Endospermo Pericarpio Grano Entero Rango Promedio Rango Promedio Rango Promedio Rango Promedio 10,5-13,1 11,5 80,30-83,5 82,3 4,4-6,2 5,3 100 Composicin de las partes del grano en BS (%) Almidn Grasa Protena 5,1-10,0 31,1-38,9 17,3-20,2 8,3 34,,4 18,5 89,9-88,9 0,7-1,1 6,7-11,1 86,6 0,86 8,6 3,5-10,4 0,7-1,2 2,9-3,9 7,3 0,98 3,5 67,8-74,0 3,98-5,8 8,1-11,8 72,4 4,7 9,6

FUENTE: (BeMiller & Whistler, 2009)

1.2. Almidn El almidn, por sus caractersticas nutricionales y sus mltiples aplicaciones en la industria, es el carbohidrato ms importante. Es un polisacrido vegetal que se encuentra presente principalmente en los granos de cereales, tubrculos, frutas y varias legumbres. Estn formados por dos tipos de molculas, amilosa y amilopectina, ambos son polmeros de unidades Dglucosa (Alvarez, 2006).

Figura 2: Estructura de amilosa (Tester R. F., 2004)

Figura 3: Estructura de amilopectina (Tester R. F., 2004)

Los mtodos utilizados para la determinacin cuantitativa de almidn consisten bsicamente de dos etapas, hidrlisis de almidn a glucosa y cuantificacin de la misma. Las tcnicas analticas oficiales de la AOAC constan de una hidrlisis cida y formacin de xido de cobre (I), medido luego por gravimetra o titulacin (AOAC, 1988). Otro mtodo analizado es el basado en el Kit Sigma-Aldrich que involucra las etapas de hidrlisis enzimtica y posterior cuantificacin por colorimetra. Los resultados obtenidos mediante las tcnicas antes mencionadas, fueron comparados con los generados por el mtodo de polarimetra, determinacin realizada en un laboratorio privado, el cual da resultados en base seca, por lo que fue necesario realizar determinaciones de humedad a las muestras analizadas. 2. Materiales y Mtodos 2.1. Reactivos Para las tcnicas de la AOAC se emplearon cido clorhdrico y tartrato de sodio y potasio grado ACS, Anedra Argentina, hidrxido de sodio, permanganato de potasio, sulfato frrico amonio, oxalato de sodio y o-fenantrolina grado ACS, Cicarelli Argentina, sulfato de cobre grado Pro-anlisis, Cicarelli Argentina, Celite Hyflo Super-Cel, Celite. Mientras que para el mtodo enzimtico se emplearon los reactivos incluidos en el kit de determinacin de almidn, -amilasa, almidn de maz, glucosa oxidasa/peroxidasa, o-dianisidina, glucosa, Sigma-Aldrich, Estados Unidos.

2.2. Muestras Se utilizaron muestras de maz dentado provenientes de la regin centro-sur de la provincia de Crdoba. 2.3. Equipos En las determinaciones se emplearon molino Arcano, agitador magntico, balanza Analtica OHAUS, bomba de vaco Arcano, filtros Gooch, bao termostatizado, Espectrofotmetro UV-Vis MetroLab 1700, estufa de secado con corriente de aire y desecador. 2.4. Tcnicas analticas de la AOAC Se utiliz la tcnica 920.44 para la hidrlisis cida del almidn y la 906.03 para la precipitacin y cuantificacin del xido de cobre (AOAC, 1988). Para la determinacin se emplearon 5 g de muestra molida. Se ensayaron los mtodos de hidrlisis cida indirecta (muestras con calcio) y directa (muestras sin calcio), cuya diferencia entre ambas es el tratamiento de la muestra con cido clorhdrico diluido o agua destilada, respectivamente, determinndose que el mtodo directo es el correcto para las muestras en anlisis. Posteriormente se filtr y lav la muestra tratada, recuperndose el residuo insoluble, al cual se le agreg 20 ml de cido clorhdrico, =1,125 g/ml, 200 ml de agua destilada y se calent durante 2,5 h en un baln provisto de condensador para evitar la evaporacin. A continuacin se enfri y neutraliz con hidrxido de sodio en perlas, se transfiri a un matraz de 250 ml, se enras con agua destilada y se filtr. A 25 ml del lquido obtenido se le agregaron iguales volmenes de tartrato alcalino, sulfato de cobre (preparados segn el mtodo 923.09, (AOAC, 1988)) y agua destilada, dando un volumen final de 100 ml. Se procedi a calentar cuidadosamente esta solucin durante 4 minutos, seguidos de 2 minutos de ebullicin, tiempos que debieron respetarse de manera rigurosa. En caliente se filtr mediante un filtro Gooch, previamente preparado con un lecho de diatomea, secado a estufa a 100C, hasta peso constante. Luego del filtrar la totalidad de la muestra se lav con agua, a 60C, y con alcohol etlico, para acelerar el proceso posterior de secado. Se sec en estufa a 100C hasta peso constante, luego se pes y el contenido de xido de cobre (I), se ley en la tabla contenida en el apartado 940.39 (AOAC, 1988), para convertirlo en glucosa y posteriormente en almidn. 2.5. Mtodo de hidrlisis enzimtica, Sigma El procedimiento fue realizado de acuerdo a lo indicado en el kit de determinacin de almidn STA20 de Sigma- Aldrich, Inc. (Sigma) La muestra debi ser finamente molida, lo cual se realiz con molino de laboratorio y luego con mortero, no llegando a obtenerse la granulometra indicada en el procedimiento. Se ensayaron los pre-tratamientos para muestras que contuviesen glucosa o maltodextrina y/o almidn resistente, concluyndose que los mismos no eran necesarios para las muestras en anlisis. Al no ser necesarios pre-tratamientos, el anlisis comenz con la digestin del almidn. Se pes 10 mg de muestra, a la cual se le agreg 0,2 ml de etanol 80%, se mezcl y agreg 3 ml de agua y 0,02 ml de -amilasa, se agit e incub 5 minutos en bao de agua hirviente. Luego se enfri a temperatura ambiente y se llev el volumen a 10 ml con agua destilada. Se tom 1 ml de esta solucin, a la cual se le agreg 1 ml de la solucin de almidn provista por el kit, se mezcl e incub 15 minutos en bao de agua a 60C con agitacin. Se tom 1 ml y se lo enraso a 10 ml con agua. La siguiente etapa fue la determinacin de la glucosa, para la cual se tom 1 ml de la solucin obtenida al final de la digestin del almidn, se le agreg 2 ml de reactivo de glucosa, se mezcl e incub exactamente 60 minutos (tiempo corregido de acuerdo a la granulometra de la muestra). La reaccin se fren con 2 ml de cido sulfrico 12N, se mezcl y midi la absorbancia a 540 nm. La tcnica requiere un blanco de reaccin, el cual consiste en un anlisis en paralelo sin muestra. La curva de calibracin se realiz analizando cantidades conocidas del almidn de maz de referencia, con el procedimiento descripto anteriormente, con la nica diferencia que aqu se incub 30 minutos, ya que la granulometra era ptima.

2.6. Mtodo polarimtrico Ewers Este ensayo fue realizado por un laboratorio privado, y corresponde a una determinacin oficial. El mtodo comprende una doble determinacin. En la primera, la muestra se trat en caliente mediante cido clorhdrico diluido. Previa evacuacin y filtracin, se midi mediante un polarmetro el poder rotatorio de la solucin. Esta etapa permiti determinar el contenido en almidn y sus productos de degradacin de alto peso molecular. En un segundo paso, la muestra se extrajo con etanol al 40%. Tras la acidificacin del filtrado con cido clorhdrico, evacuacin y filtracin, se midi el poder rotatorio en las mismas condiciones que en la primera determinacin. Mediante esta determinacin se eliminan los productos que interfieren en la primera lectura (FEDNA, 2000). 2.7. Humedad Se secaron cpsulas de vidrio a 130C hasta peso constante, en ellas se pesaron muestras de aproximadamente 1g, se llev el producto a 130C bajo presin atmosfrica normal, durante una hora y media, continuando el tratamiento hasta peso constante (Panreac Qumica S.A., 2006). La determinacin se realiz por duplicado. 2.8. Anlisis de datos

El anlisis de datos se llev a cabo utilizando el programa StatGraphics Centurion. 3. Resultados y Discusin Para la realizacin de las tcnicas seleccionadas, fueron necesarias algunas modificaciones y/o pruebas para asegurar la correcta eleccin. Los mtodos de la AOAC presentan diversas opciones para cuantificar el xido de cobre (I), de las cuales se probaron titulacin y gravimetra, resultando ms conveniente esta ltima. Para la titulacin era necesario disolver el precipitado de xido cobre (I), generndose en este paso prdida de muestra. Adems se remplaz el lecho filtrante dado en la tcnica, debido a su demostrada toxicidad. En relacin a la determinacin por hidrlisis enzimtica, se probaron los tratamientos sugeridos por el kit de determinacin de almidn de Sigma-Aldrich, para muestras con glucosa, maltodextrina y/o almidn resistente, determinndose que para los maces en anlisis no fueron necesarios. Debido a las dificultades para lograr la granulometra indicada en el procedimiento, se ensayaron tiempos de digestin mas prolongados, verificndose la necesidad de incubar la muestra durante 60 minutos, no 30 minutos cmo se especifica en el procedimiento. Para la interpretacin de los resultados debi elaborarse una curva de calibracin, analizando almidn de maz de referencia. Las determinaciones por el mtodo polarimtrico se encarg a un laboratorio privado y no presentaron mayores dificultades. Las comparaciones que a continuacin se analizan, fueron realizadas con los datos de almidn en base seca. Se analizaron 26 muestras mediante las tcnicas de la AOAC por duplicados, en algunos casos por el mismo analista y en otros por diferentes, razn por la cual se consider en primer lugar la influencia de estos en la obtencin de resultados, mediante el anlisis de muestras pareadas. Se concluy que los duplicados, realizados por el mismo analista o distintos, son estadsticamente iguales, pudiendo promediarse para ser comparados luego con los resultados de los dems mtodos. El mtodo enzimtico se realiz a 6 muestras por duplicados. De los datos obtenidos slo se analizaron aquellos cuya diferencia entre duplicados fue menor al 5%, descartndose 2 muestras con diferencias superiores al 14%. La comparacin entre mtodos fue realizada tomndolos de a dos, mediante el anlisis de muestras pareadas. La distribucin de las diferencias entre los resultados del mtodo de la AOAC con la polarimtrica es sesgada, mostrando una tendencia de este ltimo a dar valores superiores a los obtenidos por el mtodo analtico, con una mayor frecuencia la diferencia entre 1,8% y 2,1%.

Cuando se analizaron los resultados del equipo de polarimetra versus el mtodo enzimtico la curva de densidad de diferencias se mostr sesgada, significando que el mtodo enzimtico dio valores mayores para idnticas muestras. Mediante los ensayos realizados se comprob adems que este mtodo presenta tambin el inconveniente de la falta de repetibilidad de los resultados, siendo una de las probables causas la mnima cantidad de muestra con la que se trabaj, y los errores que esto conlleva. Cabe destacar que la cantidad de muestras analizadas con el kit Sigma es significativamente menor que con los otros mtodos. Al compararse los mtodos de hidrlisis cida e hidrlisis enzimtica, en este caso tambin se observa que los valores obtenidos mediante el ltimo mtodo son significativamente mayores. Finalmente se analizaron los tres mtodos simultneamente, obtenindose los valores estadsticos mostrados en la Tabla 2. Aqu puede observarse que la menor desviacin estndar y coeficiente de variacin los presenta el mtodo de polarimetra, teniendo la hidrlisis cida valores levemente superiores. Tabla 2: Resumen estadstico de los mtodos analizados Muestras Promedio Desviacin analizadas (%) Estndar Hidrlisis cida Polarimetra Hidrlisis enzimtica 26 26 4 68,73 71,01 72,95 Coeficiente Mnimo Mximo de (%) (%) Variacin 1,44 2,09% 66,10 71,44 1,24 3,54 1,75% 4,86% 66,60 68,49 72,60 77,13 Rango (%) 5,34 6,00 8,64

Al realizar la grfica de dispersin de los datos obtenidos mediante los tres mtodos (Figura 4), puede concluirse que el mtodo polarimtrico presenta la menor desviacin, siendo esta levemente superior para la hidrlisis cida. La diferencia entre los valores obtenidos mediante los mtodos antes mencionados es del -2,6%, tomando como referencia el mtodo polarimtrico, siendo esta variacin independiente del contenido de almidn. El mtodo de hidrlisis enzimtica presenta mayor desviacin, con tendencia a valores superiores.

Dispersin segn mtodo de anlisis 78

Contenido de almidn (%)

76 74 72 70 68 66 Hidrlisis cida Polarimetra Hidrlisis enzimtica

Figura 4: Grfico de dispersin segn el mtodo de anlisis.

4. Conclusiones La puesta a punto del mtodo de hidrlisis cida de la AOAC no fue simple. Se cambi el lecho filtrante, debiendo encontrarse uno que funcionara adecuadamente y no fuese nocivo para los analistas y/o el medio ambiente. Los materiales necesarios para el desarrollo de la tcnica son comunes y estn disponibles en la mayora de los laboratorios. Los reactivos necesarios tampoco llevaron mayores complicaciones. La cuantificacin de xido de cobre (I) puede realizarse de diversas maneras, se ensayaron titulacin y gravimetra, para determinar que esta ltima era menos laboriosa y ms precisa. Como cualquier tcnica analtica, los resultados dependen de la habilidad del analista, en algunos casos debieron realizarse ms de 2 ensayos para obtener datos confiables. Para completar esta tcnica, al igual que la hidrlisis enzimtica, fue necesaria la determinacin de la humedad de la muestra. La hidrlisis es un proceso que requiere mucho tiempo, ms an la cida, motivo por el cual la tcnica de la AOAC es prolongada y requiere muchos materiales. El mtodo enzimtico es ms rpido que la hidrlisis cida, requiere de espectrofotmetro, y los reactivos incluidos en el Kit de determinacin de almidn de Sigma, los cuales son costosos. Al utilizarse pequeas cantidades de muestra puede inferirse en importantes errores de muestreo y pesada principalmente. Si se comparan las medias obtenidas con el valor promedio de almidn en maz, 72,4% en base seca, la menor diferencia la presenta el mtodo de hidrlisis enzimtica, pero la desviacin estndar es elevada, razn por la cual se elige como mas preciso la determinacin polarimtrica. Si se cuenta con el polarmetro, esta tcnica es la recomendada, adems de ser oficial y estar certificada. En laboratorios que no cuenten con el equipo antes mencionado se recomienda utilizar la tcnica de hidrlisis cida, cuantificando por gravimetra, ya que la desviacin estndar y el error no son aceptables. 5. Agradecimientos A la SCyT de la FRVM de la UTN por el apoyo recibido para el desarrollo del presente trabajo y a la empresa PORTA Hnos S.A. por sus aportes de insumos, equipamientos y disponibilidad de informacin tcnica especfica que permitieron la realizacin de los ensayos experimentales. Los cuales fueron recibidos en el contexto del convenio de vinculacin tecnolgica existente. Al Mg. Jos Peralta dela FRVM por el apoyo en el anlisis e interpretacin de los datos estadsticos. 6. Referencias Alvarez, A. (2006). Aplicaciones del maz en la tecnologa alimentaria y otras industrias. ILSI Argentina. AOAC. (1988). Official methods of analysis of AOAC international. BeMiller, J., & Whistler, R. (2009). Starch, Chemistry and technology. Elsevier. FEDNA. (2000). Almidn. Mtodo polarimtrico (EWERS). Espaa. K.A. Jacques, T. L. (2003). The alcohol textbook. Panreac Qumica S.A. (2006). Mtodos analticos en alimentaria. Cereales, derivados de cereales y cerveza. Sigma. Kit de determinacin de almidn (mtodo amilasa/amiloglucosilasa). Producto STA20. USA. Tester R. F., K. J. (2004). Starchcomposition, fine structure and architecture. Journal of Cereal Science 39, 151-165.