UNI V E RS I D ADE F E DE R AL DO M AR AN H O P R- RE I T OR I A D E E X T E NS O CE NT RO D E CI NCI AS E X AT AS E T E CNO L OG I A DE P ART AM E NTO DE T E CNO L OG I A QU M IC A

CURSO DE ANLISES FSICO-QUMICAS E MICROBIOLGICAS DE MEL DE ABELHA

So Lus 2008

1 INTRODUO

O mel floral um produto obtido do nctar das flores, que processado por insetos sociais em especial as abelhas, que possuem toda a sua anatomia adaptada, onde sua anatomia interna utilizada para armazenar, transportar o nctar das flores, bem como transformar o nctar em mel e transportar a gua coletada no campo (ANEXO A). Segundo Guedes (2000), em artigo para o Almanaque Rural Apicultura, as abelhas ento produzem o mel com caractersticas que variam de acordo com o tipo floral visitado. (Figura 1).

Figura 1 - Abelha sem ferro no identificada. Para produzir 100 g de mel uma abelha deve visitar cerca de um milho de flores com ajuda de sua problocide (tromba), a abelha suga o nctar e o armazena em seu estmago de mel, voltando para a colmia. Uma abelha sem carga voa a 65 km/h, juntando-se a sua colheita, cujo peso pode alcanar 1/4 do peso do seu corpo, ela diminui a sua velocidade de vo para 30 km/h. Para obter 1 kg de mel, a abelha deve levar para colmia de 120.000 a 150.000 cargas de nctar. Se as flores, das quais as abelhas coletam a substncia adocicada, esto a 1,5 km da colmia, para transportar cada 963 cargas cada abelha ter que voar 3 km. Conseqentemente dever percorrer um total de 360.000 a 460.000 km, para produzir um quilo de mel. (FUENTES, 2004). Nos tempos antigos fazia-se abundante consumo de mel como alimento promovedor de sade e longevidade. A exemplo de Hipcrates, Pitgoras e tantos outros. Com a descoberta do acar de cana, e mais recentemente com os

adoantes qumicos artificiais, o consumo de mel como alimento infelizmente caiu em desuso. Essa substituio trouxe enormes prejuzos ao homem. Mel de abelhas o nico alimento que no apodrece. Os arquelogos encontraram mel nas tumbas egpcias com mais de 2.000 anos no estado cristalizado, em perfeito estado de conservao. Tanto que para validade do mel, apenas simblica, sendo concedido o prazo mximo de alimentos, que de dois anos, alm da observao de que melhor consumir at..., o que no quer dizer que aps aquela data o produto esteja estragado. Mel de abelhas ao mesmo tempo alimento e medicamento, j afirmava Hipcrates o pai da medicina. O mel faz bem ao: corao, fgado, intestino, pulmes, pele, boca, rins e praticamente a todo corpo humano, sem nenhuma contra indicao. Seu uso dirio, em substituio ao acar industrializado, s traz vantagens sade, principalmente preveno de cries e o desaparecimento de gorduras localizadas, comuns aos consumidores de acar. (NATIPE, 2002).

2 REVISO DE LITERATURA 2.1 Histria do surgimento das abelhas H evidncias de que as plantas eram polinizadas por abelhas desde o perodo tercirio. Entre 24 e 40 milhes de anos atrs, j havia abelhas Pebleia sp (Figura 2) e Proplebeia (Mirins), seus fsseis foram encontrados na atual Repblica Dominicana, no Caribe, perfeitamente conservados em mbar. Um fssil de Trigona sp (Figura 3) com 30 milhes de anos foi encontrado na Siclia e h outros de diferentes regies, datados em 40 milhes de anos. Essas relquias indicam que no perodo Eoceno j havia abelhas especializadas em determinadas plantas e que a maioria dos grupos conhecidos hoje j existia. Alguns estudiosos acreditam que a origem das abelhas tenha ocorrido no perodo Cretceo, devido descoberta de fssil de Meliponae em New Jersey, Amrica do Norte, sendo datada em 80 milhes de anos, idade que corresponde Era Cretcea. (GUEDES, 2000).

Figura 2 - Abelha Plebia sp.

Figura 3 - Trigona sp na flor de coroa-de-cristo.

2.1.1 Primeiros Apicultores Acredita-se que os primeiros apicultores da histria foram os egpcios, porque j criavam abelhas em potes de barro no ano 2.400 a.C. Prtica que foi imortalizada nas paredes de suas pirmides. No entanto, h registros que vinculam o pioneirismo a outro lugar. Os hindus j apreciavam mel em 6.000 a.C. e utilizavam prpolis como cicatrizante. O mel tambm fazia parte do cardpio dos Sumrios (Figura 4) em 5.000 a.C. e havia colmias na ilha de Creta por volta de 3.400 a.C. (GUEDES, 2000).

Tumba de Pa-bu-sa. Luxor. Egipto. Cueva de la Araa, em Bicorp (Valencia, Espana) Figura 4 - Pinturas Rupestre de aproximadamente 8.000 e 630 a.C. 2.1.2 Apicultura no Brasil 2.1.2.1 Meliponicultura At 1840 as abelhas criadas no Brasil eram as nativas dos gneros Lestrimellitini, Trigonini e Meliponini (Meliponae) (Figura 5), onde a sua maioria no mundo habita as regies tropicais e subtropicais do pas. Adaptadas ao meio ambiente so fundamentais para polinizao de algumas espcies vegetais, porm inmeras abelhas j foram extintas pelas queimas e desmatamentos provocados pelo homem. (GUEDES, 2000).

Figura 5 - Mandassaia (Melipona quadrifasciata)

Segundo o Dr. Paulo Nogueira Neto, estudioso das abelhas Meloponineos para o Museu Nacional, primeiro a ensaiar uma criao cientfica, as velas, de muitos lugares da Amrica Latina, so feitas de cera produzidas pelas abelhas. Segundo este estudioso provvel que a maior parte do mel e da cera usados nos trs primeiros sculos aps o descobrimento viesse da abelha Uruss, a mais vulgar e a mais abundante em todo o Brasil (NOGUEIRA NETO apud MEL E ABELHAS BRASILEIRAS, 2004). Entre 1850 e 1870 o brilhante farmacutico Theodoro Peckolt ocupou-se em classificar e estudar as Trigonildas, abelhas sociais do Brasil. As abelhas bem como as observaes biolgicas de Peckolt foram enviadas a Frederic Smith, do British Musseum em remessas sucessivas. O pesquisador britnico fez uma monografia sobre as abelhas sociais do Brasil. (MEL E ABELHAS BRASILEIRAS, 2004). Nos estudos qumicos realizados por Peckolt h a constatao de ausncia de sacarose em alguns mis indgenas. Essa constatao qumica serviu de pretexto para que Rodolfo no inclusse a produo das abelhas nativas na farmacopia brasileira (MEL E ABELHAS BRASILEIRAS, 2004). Os farmacuticos brasileiros passaram quase toda a dcada de 40 do sculo XX tentando revisar a farmacopia brasileira. Entre os quais estava o mel, tendo como grande defensor Elsior Coutinho que publicou suas idias na revista brasileira de farmcia em 1941. 2.1.2.2 Apicultura Em 1839, teve incio criao de abelhas que no eram de origem nativa do Brasil, aonde colmias vindas de Portugal para o Rio de Janeiro, a mando do Padre Antnio Carneiro Aureliano, ao fim de dois anos j haviam produzido mais de 200 colmias dessas abelhas na Quinta Imperial. (GUEDES, 2000). Outros imigrantes, de origem alem, em meados de 1845 iniciaram uma criao de abelhas Apis Nigra e Apis mellifera, para os estados do sul e sudoeste do pas. Em 1879, o apicultor Frederico Hanemann introduziu abelhas italianas (Apis mellifera lingustica) no Rio Grande do Sul, e uma colnia da mesma espcie chegou a Pernambuco em 1895, trazida pelo Padre Amato Van Emelen (GUEDES, 2000, P. 8).

A partir das descobertas do geneticista Warwick Estevan Kerr, na dcada de 40, aumentou o interesse comercial e cientfico na cultura das abelhas. Suas observaes a respeito dos hbitos e comportamentos das abelhas nativas e introduzidas no Brasil trouxeram um enorme desenvolvimento para a apicultura brasileira. (GUEDES, 2000). 2.2 Taxonomia A taxonomia das abelhas mostra as principais caractersticas fsicas e morfolgicas das abelhas, nativas sem ferro, daquelas que possuem ferro, das sugadoras e das lambedoras de nctar bem como daquelas que formam colnias e aquelas que so solitrias. (Figura 6).
Filo: Arthropoda

Classe: Insecta

Subclasse: Pterygota Ordem: Hymenoptera Subfamlia: Apoidea

Apinae (Abelhas com ferres)

Meliponinae (Abelhas sem ferres)

Apis

Bombus

Meliponini

Trigonini

Lestrimellitini

Figura 6 - Fluxograma - Taxonomia. A Tiba (Melipona compressipes fasciculata), abelha nativa sem ferro genuinamente maranhense, enquadra-se no filo Arthropoda, classe Insecta, subclasse Pterygota (possuem asas), ordem Hymenoptera (insetos com quatro asas membranosas), subfamlia Apoidea, famlia Apidae (abelhas sugadoras de lngua

longa), gnero Meliponinae, na subfamlia meliponae (abelhas com ferro atrofiado) dos gneros Meliponini. 2.3 Definio do mel de abelha A elaborao do mel resulta de duas modificaes principais (processos) sofridas pelo nctar, uma fsica pela desidratao (eliminao da gua), atravs da evaporao na colmia e absoro no papo, a outra reao qumica que atua sobre o nctar, transformando a sacarose, atravs da enzima invertase, em glicose e frutose. Ocorrem mais duas reaes, em escala menor, que consiste em transformar o amido do nctar, atravs da enzima amilase em maltose e a enzima glicoseoxidase transforma a glicose em cido glicnico e perxido de hidrognio, este ltimo, conhecido como gua oxigenada. (LENGLER, 2001). A fonte principal do mel o nctar das flores, acares dissolvidos secretados pelos nectrios e colhido pelas abelhas. (Figura 7).

Figura 7 - Abelha Uruu (Melipona scutelaris) Outra fonte, em pequena proporo o mel originado do orvalho, cuja secreo, de folhas de certas plantas, cochonilhas (muito freqente nos Alpes Europeus) e substncias doces diversas (bagao de cana-de-acar e frutas). (LENGLER, 2001). O mel basicamente uma mistura complexa de acares altamente concentrada. O mel de abelhas um produto muito apreciado, no entanto, de fcil adulterao com acares ou xaropes. Desta forma, necessrio que haja algumas anlises para a determinao da sua qualidade para que seja comercializado. Sua composio qumica foi objeto de revises bibliogrficas como a realizada por Campos e Serrano et al, apresentada em obra de Vilhena e Murandian,

(1999 apud EVANGELISTA-RODRIGUES; SILVA; BESERRA, 2000, p. 5-6), que sugeriram ser a composio do mel dependente de muitos fatores tais como: espcies colhidas, natureza do solo, raa de abelhas, estado fisiolgico da colnia, estado de maturao do mel, condies meteorolgicas, etc. O mel da abelha do gnero meliponae, abelhas nativas sem ferro, pouco se conhece a respeito de suas propriedades e caractersticas fsico-qumicas, tendo como base para estes estudos comparaes com dados j existentes em relao ao mel das abelhas africanizadas. Assim, se faz necessrio estudar esse produto, porque os hbitos das abelhas nativas se diferenciam das abelhas africanizadas, podendo alterar tambm a composio do produto (NOGUEIRA-NETO, 1997 apud EVANGELISTA-RODRIGUES; SILVA; BESERRA, p. 6). 2.4 Composio qumica do mel de abelha Sabe-se que o mel um produto que tem inmeros componentes e substncias em sua composio, desde acar at sais minerais, protenas e vitaminas, com valores e propores j determinados e que este mel o da abelha Apis mellifera. O mais analisado para se obter dados e padres a respeito dos valores e propores destes componentes e substncias presentes, como mostram as Tabelas 1 e 2 no item 2.4.1. 2.4.1 Composio qumica do mel em geral A Tabela 1 apresenta valores de algumas anlises fsico-qumicas realizadas com o mel de abelhas africanizadas (Apis mellifera).

Tabela 1 - Composio fsico-qumica do mel de flores e melato - instruo normativa n 11 de 20 de outubro de 2000.
Parmetros fsico-qumicos 1. Umidade mxima (%) 2. Acares redutores (mnimo) (%) 3. Sacarose (mximo) (%) 4. Cinzas (resduo mineral) (mximo) (%) 5. Hidroxi Metil Furfural (mximo) (mg/kg) 6. Acidez (mxima) (mg/kg) Mel de flores 20,0 65,0 6,0 0,6 60,0 50,0 Mel de melato 20,0 60,0 15,0 1,2 60,0 50,0

7. Atividade diastsica como mnimo 8 na escala Gthe (mis com baixo contedo enzimtico, mnimo 3 na escala Gthe, sempre que o contedo de Hidroxi Metil Furfural no exceda a 15 mg/kg) 8. Slidos insolveis em gua (mximo) 0,1%, exceto mel prensado se tolera 0,5%
Fonte: Lengler, 2001 Acares redutores = glicose e frutose

Quando o mel secado e aquecido, no resduo fica seu contedo em minerais. A Tabela 2 apresenta, em partes por milho (ppm) o contedo de minerais do mel. Tabela 2 - Minerais em mel claro e mel escuro. Minerais Mel claro (ppm) mg/kg 205 52 58 49 18 35 19 22 2,40 0,30 0,29 Mel escuro (ppm) mg/kg 1676 113 100 51 76 47 35 36 9,40 4,09 0,56

Potssio Cloro Enxofre Clcio Sdio Fsforo Magnsio Slica Ferro Mangans Cobre Fonte: Lengler, 2001

No mel podem ser encontradas as seguintes substncias: Vitaminas: Vitamina A, Vitamina B (Tiamina), Vitamina B2 (Riboflavina), Vitamina B5 (cido Pantatnico), Vitamina B6 (Piridoxina), Vitamina B (cido Flico), Vitamina C (cido Ascrbico), Vitamina H (Biotina), Vitamina PP (Niaciamina, niacina, cido nicotnico); Sais minerais: Clcio, fsforo, enxofre, potssio, cloro, ferro, mangans, cobre, slica, sdio; Enzimas: Invertase, diastase, lpase, inulase, glicose-oxidase, catalase e fosfatase cida; Protenas e aminocidos: Prolinas, lisina, cido glutmico, cido asprtico, arginina, cistina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, felilalanina, serina, treonina, triptofano e tirocina. Temos ainda na composio do mel: cetonas e aldedos e os cidos e seus teres. 2.4.2. Aspectos Microbiolgicos do Mel Alm do seu uso como alimento, o mel tem sido utilizado pelas suas propriedades medicamentosas. A sua eficcia, como auxiliar teraputico, tem sido demonstrada, embora, a explicao bioqumica desses efeitos ainda no seja conclusiva (MOLAN, 2001). Alguns dos compostos do mel so substncias conhecidas como tendo aes fisiolgicas que poderiam explicar tais efeitos. Sua capacidade de proteger a mucosa estomacal de ratos contra leses induzidas por etanol est relacionada com a alta osmolaridade que potencializada pelo aumento do fluido sem aumentar a acidez gstrica (GHARZOULI, 2001). Entre os diversos efeitos biolgicos produzidos pelo mel, tem sido observado que este apresenta propriedades antibacteriana, antifngica, imunolgica e antioxidante (MOLAN, 2001; MOREIRA et al., 2001). O mel, quanto a suas propriedades dividido em dois grandes grupos:

mis perxidos e mis no perxidos ambos com poder bactericida sob uma grande variedade de microrganismos. Os mis perxidos so os que tm como substncia ativa o perxido de hidrognio e os mis no perxidos tm seu efeito devido a outros compostos qumicos como: cidos orgnicos, destacando-se o ferlico e o cafico, outros compostos fenlicos, flavonides como: galangina, crisina e quercitina (TAORMINA et al., 2001). As aes antibacteriana e antifngica tm sido amplamente divulgadas, nos mais diferentes agentes etiolgicos de interesse mdico, como Escherichia coli, Salmonella thyphimurium, Shigella sonnei, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans, Helicobacter pylori e Candida albicans, entre outros (THEUNISSEN et al., 2001). Um aspecto importante da produo do mel em qualquer nvel a manuteno da qualidade do produto. A qualidade do mel utilizado como alimento est relacionada a pelo menos quatro fatores bsicos: 1) o tipo de frasco utilizado para o envaze; 2) s condies de estocagem do produto; 3) s condies higinicas da coleta e 4) s caractersticas higinicas das abelhas. As embalagens apresentam um papel fundamental na preservao dos alimentos, funcionam como uma barreira fsica entre o produto embalado e seu entorno, resguardando o produto da incidncia de luz e contato direto com a umidade atmosfrica. A deficincia de hermetismo entre a tampa e o corpo da embalagem permite a passagem de umidade para o interior o que pode comprometer consideravelmente a sua qualidade. A umidade pode favorecer a fermentao de acares causada por microrganismos osmoflicos presentes no mel que fazem parte da sua microbiota ou que foram veiculados durante o processo de manejo ou que ainda no foram totalmente eliminados ou controlados durante o processo de pasteurizao (RIEDEL, 1981). Segundo Lengler (2003), o armazenamento prolongado e em temperatura acima de 30C favorece a produo de hidroxi-metil-furfural (HMF) no mel, que deve ser avaliada em funo do tempo de armazenamento. As modificaes fsicoqumicas, como a produo de (HMF), que txico para as abelhas, serve de indicador de armazenamento inadequado e de adulterao do mel. Diferentes temperaturas de armazenamento podem favorecer granulao, fermentao e cristalizao no mel, porm, mel cristalizado sem indcios de fermentao, pode ser consumido. A coleta do mel de grande importncia para a qualidade do produto

destinado comercializao. Tem que ser levado em considerao a poca do ano com menor pluviosidade e umidade, alm do procedimento de coleta de forma higinica. Alguns produtores extraem o mel espremendo os favos com as mos, outros utilizam hastes de metal ou madeira para perfurar o favo, fazendo-o escorrer e depois o filtram. Existe ainda a coleta por meio da aspirao com auxlio de uma bomba e a coleta por centrifugao (KERR, 1996). A qualidade do mel no depende apenas das prticas higinicas do produtor, mas tambm est relacionada com os hbitos higinicos das abelhas. A maioria das meliponas costuma visitar excrementos humanos, de animais e guas poludas (NOGUEIRA NETO, 1997), ainda segundo este autor, com relao a esses hbitos, as abelhas so classificadas em: limpas, ocasionalmente limpas e sujas. Neste ltimo grupo h as abelhas com hbitos bem menos adequados a ponto de seu mel no ser recomendado para consumo humano. A abelha mais higinica a popular Jati, (Tetragonisca angustula). Outras com hbitos higinicos imprprios incluem: a Cupira, (Partamona cupira), Mandassaia (M. quadrifasciata), Jandara do Nordeste, (M. subnitida), Uru do Nordeste, (M. scutellaris), e (T. testaceicornis) j foram vistas coletando excrementos humanos, de animais e, a maioria, at mesmo barro para a construo de suas colmias. A Trigona necrofaga e outras espcies de trigonas so descritas como tendo o hbito de visitar carcaas de animais mortos para retirar deles sua fonte de protenas. Nogueira Neto (1997) alerta para o risco de o mel transmitir a hepatite A. Alm disso, existe ainda o risco de transmisso do botulismo infantil (NAKANO, H. & SAKAGUCHI, 1991) e da salmonelose, uma vez que o agente etiolgico desta ltima patologia permanece vivel por at 34 dias no mel de Apis. Este risco est relacionado com prticas higinicas inadequadas. No mel das meliponas a viabilidade da Salmonella ainda no conhecida (GROSSO et al., 2002). Para as abelhas do gnero Apis com caractersticas biolgicas, produtividade, tipo de colnias, caractersticas fsico-qumicas e hbitos higinicos diferentes das meliponas, existem normas estabelecidas para o fsico-qumico de qualidade do mel. O mesmo no acontece com o mel produzido por meliponas, pois no h, at o momento, normas que possam direcionar os procedimentos de anlise ou que permitam estabelecer critrios para o consumo, tempo de estocagem, critrios de aceitao ou rejeio do consumo deste. Os artigos que se referem ao mel de meliponas sempre traam paralelos com mis das abelhas do gnero Apis o

que inaceitvel (CORTOPASSI-LAURINO & GUELLI, 1991). 2.4.3. Mel de abelhas sem ferro O mel das abelhas sem ferro rico em acar, contendo sais minerais, vitaminas, protenas, podendo ser usado na complementao alimentar, como fonte desses nutrientes e at mesmo na preveno de algumas doenas e infeces. O mel das abelhas sem ferro armazenado em potes feito de cera para armazenamento, maturao e conservao sendo que assim que o mel estiver maduro os potes so abertos e servem para alimentar todas as abelhas da colmia, inclusive a rainha, sendo que, esta recebe uma quantidade maior de mel para poder se desenvolver (ANEXO B), diferentemente do que ocorre com as abelhas africanizadas que guardam o seu mel em favos organizados de uma maneira totalmente diferente a das abelhas nativas sem ferro e alimentam a sua rainha com gelia real. (Figura 8).

Figura 8 - Potes de mel e favos de cria da abelha nativa.

Outras caractersticas desse mel so suas propriedades organolpticas como cor, viscosidade, sendo mais fluido e mais claro que o mel da abelha Apis. Segundo Fuentes (2004, p. 2). (Figura 9).

Figura 9 - Mis de abelhas indgenas sem ferro corretamente colhidos e armazenados. 2.5 Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade do Mel de Abelha Considerando a necessidade de padronizar o processamento de produtos de origem animal, visando assegurar igualitrias e total transparncia da elaborao e comercializao deste produto, resolve segundo a instruo normativa n 11 de 20 de outubro de 2000 do Ministrio da Agricultura e do Abastecimento:

Art. 1 - Aprovar o Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade do Mel de Abelha; a) Art. 2 - Revogar a Portaria n 367, de 4 de setembro, que aprovou o Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade do Mel de Abelha. 2.5.1 Objetivo Estabelecer a identidade e os requisitos mnimos de qualidade que deve cumprir o mel destinado ao consumo humano direto. Este Regulamento no se aplica para mel industrial e mel utilizado como ingrediente em outros alimentos.

2.5.2. Definio Entende-se por mel, o produto alimentcio produzido pelas abelhas melferas, a partir do nctar das flores ou das secrees procedentes de partes vivas das plantas ou de excrees de insetos sugadores de plantas que ficam sobre partes vivas de plantas, que as abelhas recolhem, transformam, combinam com substncias especficas prprias, armazenam e deixam madurar nos favos da colmia. 2.5.3 Classificao 2.5.3.1 Por sua origem a) Mel floral - o mel obtido dos nctares das flores. Mel unifloral e ou monofloral quando o produto proceda e

principalmente da origem de flores de uma mesma famlia, gnero ou espcie possua caractersticas sensoriais, fsico-qumicas microscpicas prprias. Mel multifloral ou polifloral - o mel obtido a partir de diferentes origens florais. b) Melato ou Mel de Melato - o mel obtido principalmente a partir de secrees das partes vivas das plantas ou de excrees de insetos sugadores de plantas que se encontram sobre elas. 2.5.3.2 Segundo o procedimento de obteno de mel do favo a) Mel virgem - produto que flui espontaneamente dos favos, quando desoperculados; b) Mel centrifugado - obtido por processo de centrifugao; c) Mel prensado - obtido por compresso a frio; d) Mel em favos - mantido dentro dos prprios favos.

3. CONTROLE DE QUALIDADE FSICO-QUMICO DO MEL DE ABELHA 3.1 Equipamentos e acessrios Relacionam-se, aos equipamentos a serem usados nas anlises. 3.1.1 Balana digital Utiliza-se uma balana digital Automarte, modelo AL500, com carga mnima de 0,02 g e carga mxima de 500 g, para determinao das massas das amostras. 3.1.2 Forno Mufla Utiliza-se um forno mufla eltrico QUIMIS-TECNAL, com termostato variando sua temperatura de 100 a 1200 C, para calcinao do mel. 3.1.3 Estufa de secagem e esterilizao Utiliza-se uma estufa para a secagem modelo 315-SE, com circulao mecnica de ar e com variao de 0 a 110C. 3.1.4 Chapa de aquecimento Utiliza-se para aquecimento e secagem das amostras, chapa metlica de aquecimento marca FANEM, modelo 170/3, com variao de temperatura de 0 a 100 C. 3.1.5 pH-metro Para leitura de pH, utiliza-se um pH-metro, marca DIGMED, modelo Dmph/1, com preciso de 10-1 unidades.

3.1.6 Refratmetro Utiliza-se para medir a percentagem direta de slidos solveis das amostras. 3.1.7 Bomba a vcuo Utiliza-se para eliminar o excesso de gua por suco e ajudar em favor da filtrao na determinao de slidos insolveis em gua. 3.2 Materiais e vidrarias Materiais e vidrarias a serem utilizados: Cpsulas de porcelana; Cadinhos de porcelana; Garra metlica; Suporte universal; Bico de bunsen; Pra de suco; Tela de amianto; Papel de filtro; Pina; Esptula; Trip; Agitador magntico; Magneto; Pisseta; Provetas (normais e rolhas esmerilhadas); Buretas; Bolinhas de vidro; Erlenmeyers; Pipetas (graduadas e volumtricas); Bales volumtricos; Beckers; Basto de vidro; Dessecador; Tubos de ensaio; Bomba a vcuo.

3.3

Reagentes e solues

3.3.1 Reagentes Reagentes a serem utilizados: ter etlico; Resorcina; cido tnico; Hidrxido de sdio; Glicerina; 3.3.2 Solues Solues a serem utilizadas: Soluo de cido tnico 0,5%; Soluo clordrica de resorcina; Hidrxido de sdio 5 mol/L; Soluo de lugol; Azul de metileno 1%; 3.4 Anlises fsico-qumicas do mel de abelha As anlises sero realizadas segundo os mtodos fsico-qumicos para anlise de alimentos do Instituto Adolfo Lutz (2005). 3.4.1 Brix A percentagem de slidos solveis obtida pela leitura direta no refratmetro de cada amostra analisada. Utiliza-se a tabela do respectivo aparelho, onde nos deu a devida correo da temperatura em que foi lida. Soluo de Fehling A e B; Solues de mel; Soluo de hidrxido de sdio 0,05 N; cido clordrico 0,05 N. Sal de Rochelle (tartarato de sdio e potssio tetrahidratado) cido clordrico; Amido.

3.4.2 Umidade Umidade corresponde perda de peso pelo produto quando aquecido em condies em que a gua removida. Utiliza-se como referncia a Tabela de Chataway (ANEXO C), obtendo a umidade em percentagem, simplesmente, pelo valor de grau Brix obtido. Onde, fez-se a devida correo da temperatura de 30C para 20 com auxlio da Tabela do aparelho refratmetro. C 3.4.3 Acidez Na determinao da acidez de cada amostra pesa-se 10 g das mesmas em erlenmeyers de 250 mL onde se colocam 75 mL de gua livre de CO2 e agita-se. Titula-se com soluo de hidrxido de sdio 0,05 N at o pH chegar a 8,5; logo em seguida acrescenta-se 10 mL de NaOH 0,05 N imediatamente. Titula-se novamente, agora com soluo de cido clordrico 0,05 N at o pH chegar a 8,3. A determinao da acidez pode ser expressa pela Equao 3. Correes:
NaOH corrigido = volume gasto NaOH x fator do NaOH HCl corrigido = volume gasto do HCl x fator do HCl

Clculos:
Acidez livre = (NaOH gasto corrigido branco) x 50 / peso da amostra. Acidez lactnica = (10 vol. HCl gasto corrigido) x 50 / peso da amostra. Acidez total = Acidez livre + Acidez lactnica (meq/kg) (Eq. 1) (Eq. 2) (Eq. 3)

3.4.4 Cinzas Resduo mineral fixa ou cinzas o nome dado ao resduo obtido por aquecimento de um produto em temperatura prxima a 550 570C. Pesa-se 5,0 g de cada amostra em cadinhos de porcelana, previamente aquecida em forno mufla a 550 resfria-se em dessecador at temperatura C, ambiente e pesa-se. Calcina-se em temperatura baixa e incinera-se no forno mufla a

550 por quatro horas. Resfria-se em dessecador at temperatura ambiente e C, pesa-se. A determinao do teor de cinzas pode ser expressa pela Equao 4.

Cinzas (%) =

100 N P

(Eq. 4)

Onde: N = massa em gramas de cinzas; P = massa em gramas da amostra. 3.4.5 Acares redutores Determina a osmolaridade a qual est envolvida na eliminao e controle da fauna microbiana. Na determinao de acares redutores, pesa-se 2,0 g de cada amostra e em seguida completa-se o volume em um balo volumtrico de 100 mL. Em erlenmeyers junta-se 50 mL de gua destilada mais 10 mL da soluo de Fehling A e adiciona-se 10 mL da soluo de Fehling B, deixa-se ferver, marcase dois minutos e comea-se a titular com a soluo de mel diluda, sob agitao, usa-se como indicador 3 gotas de azul de metileno a 1% e titula-se at atingir colorao vermelho tijolo. A determinao dos acares redutores pode ser expressa pela Equao 5.

Acares redutores (%) =

100 100 x Fc PxV

(Eq. 5)

Onde: Fc = Fator de correo equivalente a 0,05; P = massa em gramas da amostra; V = volume em mL gasto na titulao.

3.4.6 Acares totais Determinam-se os acares de cada amostra tomando-se 50 mL da soluo restante de mel da anlise de acares redutores num balo de 100 mL, acrescentase 3 gotas de HCl concentrado e leva-se em banho-maria por 15 minutos, deixa-se esfriar em temperatura ambiente, neutraliza-se com NaOH 5 mol/L e completa-se o volume do balo. Titula-se da mesma forma que foi realizada para os acares redutores. Em seguida procede-se igual determinao de acares redutores sendo expressa pela Equao 6.

Acares totais (%) =

100 100 x Fc PxV

(Eq. 6)

Onde: Fc = Fator de correo equivalente a 0,05; P = massa em gramas da amostra; V = volume em mL gasto na titulao. 3.4.7 Acares no-redutores A determinao de acares no-redutores realizada pela subtrao dos valores dos acares totais menos os valores dos acares redutores em relao a cada amostra. A determinao dos acares no-redutores pode ser expressa pela Equao 7. % Acares no-redutores = % A.T. % A.R . Onde: A.T. = acares totais; A.R. = acares redutores. (Eq. 7)

3.4.8

Determinao de pH Representa as concentraes de ons de hidrognio em uma soluo que

influenciada por fatores alm da quantidade de cidos presentes, particularmente pelo contedo mineral. (WHITE, 1992 apud CARVALHO, 2001, p. 11). Pesa-se 10,0 g de mel dilui-se em 10 mL de gua destilada e mede-se o pH usando-se o pH-metro previamente calibrado e estabilizado. 3.4.9 Cor A cor um fator determinante para a aceitao do mel no mercado mundial, sendo os mis mais claros os preferidos pelos consumidores. A cor do mel est relacionada com a origem floral, o processamento e o armazenamento (SEEMANN e NEIRA, 1988), mas ainda depende dos fatores climticos durante o fluxo do nctar e da temperatura na qual o nctar transformado em mel no interior da colmia (SMITH, 1967). Para a determinao da cor seleciona-se o espectrofotmetro na faixa de 560 nm, deixa-se estabilizar, zera-se o equipamento, usando-se como branco de glicerina PA. Faz-se a leitura em absorbncia e usa-se como referncia a Escala de Pfund (ANEXO D), para a determinao da cor de acordo com a faixa. 3.4.10 Determinao de slidos insolveis em gua Pesa-se 25,0 g de cada amostra em beckers de 400 mL, adiciona-se 200 mL de gua quente e deixa-se em ebulio durante 20 minutos, substituindo a gua evaporada. Filtra-se em papel de filtro whatman n 4 ou equivalente (previamente lavado com gua quente, colocado em placa de petri e aquecido em estufa a 100110 durante 1 hora, resfriado em dessecador at a temperatura ambiente e C, pesado). Lava-se com 800 mL de gua quente, elimina-se o excesso de gua por suco, coloca-se o papel de filtro com o resduo na mesma placa de petri e aquecese em estufa a 100-110 resfria-se em dessecador e pesa-se. A determinao do C, teor de slidos insolveis em gua pode ser expressa pela Equao 8.

Slidos insolveis (%) =

100 N P

(Eq. 8)

Onde: N = massa em gramas do resduo; P = massa em gramas da amostra. 3.4.11 Lund Pesa-se 2,0 g de cada amostra. Transfere-se para uma proveta de 50 mL, com rolha esmerilhada, com auxlio de 20 mL de gua. Adiciona-se 5 mL da soluo de cido tnico a 0,5%. Adiciona-se gua at completar o volume de 40 mL. Agitase, deixa-se em repouso por 24 horas. O teste deve ser positivo formando-se um precipitado floculoso entre 0,6 a 3,0 mL, indicando que a amostra pura. Ausncia ou vestgio de precipitao indica a presena de glicose comercial. 3.4.12 Fiehe Pesa-se 5g de cada amostra em erlenmeyers de 250 mL. Adiciona-se 5 mL de ter e agita-se vigorosamente. Transfere-se a camada etrea para tubos de ensaio e deixa-se o ter evaporar temperatura ambiente. Adiciona-se ao resduo dos tubos 5 gotas de soluo clordrica de resorcina. O teste indica a presena de glicose comercial ou acar invertido tcnico, ou ainda um mel que sofreu superaquecimento. Adquirindo cor vermelha intensa, indica presena de glicose comercial ou acar, indica ainda a presena de hidrximetilfurfural (HMF), que reage com a resorcina em meio cido. Se a colorao for salmo, indica que o mel foi aquecido intensamente ou estocado prolongada mente em temperatura ambiente elevada. O teste dever ser negativo para o mel puro.

3.4.13

Lugol O teste indica a presena de amido e dextrinas ou acares comerciais. Pesa-se 10,0 g de cada amostra em beckers de 50 mL. Adiciona-se 10 mL

de gua. Agita-se, adiciona-se 1 mL de soluo de lugol em cada amostra. Caso o mel seja puro, o teste deve ser negativo, a colorao final prxima a do mel, caso contrrio, adquirindo cor vermelho-violeta a azul, indica a presena de amido e dextrina. 3.4.14 Determinao da atividade diastsica Atravs deste teste pode-se determinar a presena de fermentos diastsicos. Na determinao da atividade diastsica, em tubos de ensaio, mistura-se 5 mL de soluo de mel a 20% mais 5 mL de gua destilada e 1 mL de soluo de amido 1%. Incuba-se em banho-maria a 45 por 1 hora exatamente e, ento, C acrescenta-se 1 mL da soluo de lugol. O teste deve ser positivo formando-se uma colorao parda clara, indicando que o mel legtimo e que possui atividade diastsica. Caso contrrio, adquirindo cor azul, representa um mel sem atividade diastsica, mel artificial, no hidrolisa o amido. A Figura 10 apresenta de forma simplificada as etapas de coletas e anlises fsico-qumicas do mel de abelha Tiba (Melipona compressipes fasciculata).

COLETA DAS AMOSTRAS

T1

T2

ANLISES FSICO-QUMICAS

QUANTITATIVAS

QUALITATIVAS

Brix Umidade

Acares redutores

Fiehe Lugol Lund Atividade diastsica

Acares totais Acidez Cinzas pH Cor Slidos insolveis em gua Acares no - redutores

INTERPRETAO DOS RESULTADOS

Figura 10. Fluxograma referente s anlises fsico-qumicas do mel.

4. CONTROLE DA QUALIDADE MICROBIOLGICA DO MEL DE ABELHA 4.1. Equipamentos e acessrios 4.1.1 Materiais, vidrarias e equipamentos Materiais e vidrarias a serem utilizados: Tubos de ensaio; Placas de Petri; Bico de bunsen; Erlenmeyers; Pipetas (graduadas); Beckers; Basto de vidro; Swab Discos de papel de filtro Estufa Bacteriolgica (37C); Banho-maria (44,5C 0,5) 4.1.2 Meios de cultura e solues 4.1.2.1 Meios de cultura Meios de cultura a serem utilizados: Caldo Lauril Sulfato; Caldo Verde Brilhante e Bile 2%; Caldo E.C; Caldo Infuso Crebro Corao (BHI) Caldo Tetrationato; Caldo Rapapport; Agar Batata Dextrose; Agar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC); Agar Plate Count (PCA); Agar Mueller-Hinton; Agar Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS).

4.1.2.2 Solues Solues a serem utilizadas: Soluo salina 0,85% estril; Soluo de cido tartrico 10%; Soluo de lugol; Soluo de verde brilhante. 5. CONTROLE DA CONTAMINAO DOS ALIMENTOS Os microrganismos patognicos esto presentes no solo e,

conseqentemente, nas colheitas, nas aves e nos peixes, enfim em vrios alimentos. Portanto, inevitvel que os produtos in natura utilizados como ingredientes sejam veculos de contaminao patognica. Dessa forma, para evitar toxinfeces alimentares, os patgenos dos ingredientes devem ser identificados e controlados. Os programas de controle devem ser implantados, sendo monitorados quanto sua eficcia, alm de serem revisados e modificados, sempre que necessrio. 5.1 Microrganismos indicadores da qualidade higinico-sanitria dos alimentos e causadores de enfermidades de origem alimentar 5.1.1 Coliformes Totais Este grupo composto por bactrias da famlia Enterobacteriaceae, so capazes de fermentar a lactose com produo de gs, quando incubados a 35-37C por 24-48 horas. So bacilos gram negativos no esporulados. Fazem parte desse grupo s bactrias do gnero Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella, alm de serem encontrados nas fazes, tambm podem persistir longos perodos e se multiplicar em ambientes no fecais, como vegetais, solo. A presena de coliformes totais no alimento no indica, necessariamente, contaminao fecal recente. O ndice de coliformes totais utilizado para avaliar as condies higinicas, sendo que as altas contagens significam contaminao ps-

processamento,

limpezas

sanificaes

deficientes,

tratamentos

trmicos

ineficientes ou multiplicao durante o processamento ou estocagem. Coliformes a 45C e Escherichia coli as bactrias pertencentes a este grupo correspondem aos coliformes totais que apresentam a capacidade de continuar fermentando lactose com produo de gs, quando incubadas temperatura de 45C. Nessas condies, em torno de 90% das culturas de E. coli so positivas. O ndice de coliformes a 45C ou de E. coli nos alimentos empregado como indicador de contaminao fecal, ou seja, condies higinico-sanitrias, visto que se estima que a populao deste grupo constituda de uma alta proporo de E. coli, que tem seu habitat exclusivo no trato intestinal do homem e de outros animais. Assim, sua presena pode indicar a possibilidade de ocorrerem outros microrganismos entricos na amostra. Em alimentos processados, a presena de um nmero considervel de coliformes ou de enterobactrias pode indicar: processamento inadequado e/ou recontaminao ps-processamento, sendo as causas mais freqentes aquelas provenientes da matria-prima, equipamento sujo ou manipulao sem a devida higiene; proliferao microbiana que poderia permitir a multiplicao de microrganismos patognicos. 5.1.2. Diferenciao dos coliformes A enumerao dos coliformes pode ser efetuada utilizando mtodos convencionais e mtodos rpidos. O mtodo convencional ainda muito empregado o mtodo dos tubos mltiplos que pode ser utilizado para estimar o nmero de coliformes pela tcnica do Nmero Mais Provvel (NMP). Para diferenciao entre os coliformes fecais dos no-fecais so necessrios testes bioqumicos para identificao das espcies. Esses testes so coletivamente designados como reaes IMVic indol; vermelho de metila; reao de Voges-Proskauer e citrato de Simmons. Outros testes tambm so sugeridos como os carboidratos e aminocidos.

5.2. Escherichia coli Escherichia coli a espcie predominante entre os diversos microrganismos anaerbios facultativos que fazem parte da microbiota intestinal de animais de sangue quente. Pertence famlia Enterobacteriaceae e entre suas principais caractersticas destacam-se: bacilos gram negativos no esporulados, capazes de fermentar glicose com produo de cido e gs. A maioria fermenta tambm a lactose, com produo de cido e gs. As linhagens patognicas de E. coli so divididas de acordo com os sintomas clnicos nos seguintes grupos. E. coli enterotoxignica (ETEC) E. coli enteropatognica (EPEC) E. coli enterohemorrgica (EHEC) E. coli enterogregativa (EAggEC) E. coli enteroinvasora (EIEC) E. coli difusamente adesiva (DAEC) Est relacionada com casos de diarrias, principalmente infantil, com colites hemorrgicas, disenterias, infeces da bexiga, dos rins, infeces de feridas cirrgicas, septicemia, sndrome urmica hemoltica. Algumas destas enfermidades terminam em bitos. 5.3. Salmonella spp. O gnero Salmonella pertence famlia Enterobacteriaceae. So gram negativos, anaerbios facultativos, no formam esporos e tm forma de bastonetes curtos. A temperatura tima de crescimento de aproximadamente 38C e a temperatura mnima de 5C. Como no formam esporos, so relativamente termolbeis, podendo ser destrudos a 60C por 15 a 20 minutos. Existem mais de 2.5001 sorotipos de salmonelas, dentre os quais 1.478 pertencem subespcie I, incluindo Salmonella sorotipo Typhi. Mudanas significativas ocorrem na nomenclatura e taxonomia das salmonelas nos ltimos anos, baseadas, principalmente, nas suas caractersticas bioqumicas.

O gnero Salmonella est dividido em duas espcies Salmonella entrica e Salmonella bongori, sendo a primeira subdividida em seis subespcies. Essas enterobactrias so transmitidas ao homem, principalmente, por meio de consumo de alimentos contaminados por fezes de animais ou humanas. Os sintomas caractersticos de doenas de origem alimentar causadas por Salmonella so: diarria, nuseas, febre branda e calafrios, algumas vezes, vmitos, dor de cabea e fraqueza. O perodo de incubao antes da doena de cerca de 16 a 72 horas. A enfermidade , normalmente, auto-limitante e persiste durante 2 a 7 dias. A pessoa infectada excretar grandes quantidades de Salmonella pelas fezes durante o perodo da doena. A dose infecciosa varia de acordo com a idade e a sade da vtima, com o alimento e ainda com a linhagem da Salmonella. As doses infecciosas podem variar de 20 at 106 clulas. A contaminao do alimento ocorre devido ao controle inadequado de temperatura, de prticas de manipulao ou por contaminao cruzada de alimentos crus com alimentos processados. O microrganismo se multiplica no alimento at atingir a dose infecciosa. 5.3. Bolores e leveduras O crescimento de bolores e leveduras mais demorado do que o de bactrias em alimentos de baixa acidez e alta atividade de gua. Portanto, dificilmente sero responsveis pela deteriorao desses alimentos. Em alimentos cidos e de baixa atividade de gua, no entanto, o crescimento de fungos maior, provocando deteriorao com grande prejuzo econmico em frutas frescas, vegetais e cereais. So tambm responsveis pela deteriorao de sucos de frutas, queijos, alimentos congelados, desidratados e em conserva como picles, quando armazenados em condies inadequadas. A presena de fungos filamentosos (bolores) e leveduras em ndice elevado nos alimentos pode fornecer vrias informaes: condies higinicas deficientes de equipamentos; multiplicao no produto em decorrncia de falhas no processamento e/ou estocagem; matria-prima com contaminao excessiva.

A presena desses microrganismos pode tornar-se um perigo sade pblica devido produo de micotoxinas pelos bolores. Algumas medidas devem ser tomadas por manipuladores de alimentos suscetveis a essa contaminao, na tentativa de reduzir ou elimin-la: boas prticas de higiene levam reduo da carga de esporos; esses alimentos devem chegar o mais rapidamente possvel ao consumidor; o armazenamento de alimentos congelados deve ser a temperaturas inferiores a -12C; eliminar ou reduzir o contato com o ar atravs de embalagens, por exemplo; adicionar cidos ou conservadores qumicos como benzoatos ou sorbatos, para retardar o crescimento fngico. Baixas contagens de bolores e leveduras so normais em alimentos frescos e congelados, no sendo, portanto, significativas. Somente quando o crescimento de bolor for visvel ou o alimento apresentar um nmero elevado de leveduras, o consumidor ser capaz de reconhecer a deteriorao. Esta deteriorao por leveduras no prejudicial sade.

6. MTODOS DE ANLISES 6.1. Amostragem A obteno correta das amostras, seu transporte para o laboratrio e sua preparao para anlise so etapas fundamentais para o sucesso de uma anlise microbiolgica. Seguir as seguintes etapas: A amostra deve ser representativa, os produtos prontos para consumo devem ser coletados em suas embalagens originais fechadas, com especificaes de dados que o identifique como, n. do lote, data de fabricao, etc. Quando embalagens abertas precisam ser analisadas, importante que sejam

acondicionadas adequadamente para evitar contaminao com outros alimentos, manipuladores, e com o ambiente. Os produtos acondicionados em embalagens, de difcil transporte para o laboratrio podem ser amostrados in loco, com a mxima assepsia. Alimentos perecveis refrigerados devem ser mantidos entre 0 e 44C at o incio da anlise. Quando se tratar de alimentos congelados, as amostras devem ser descongeladas somente para a realizao da anlise. Como regra geral, toda amostra deve ser analisada at 36 horas aps sua obteno. Produtos perecveis que no puderem ser analisados nesse perodo podem ser refrigerados ou ainda congelados, dependendo do tipo de produto, objetivo da anlise e tipo de microrganismo a ser pesquisado. O nmero de unidades a serem coletadas para anlise e dos critrios adotados para aprovao ou reprovao de um produto definem um plano de amostragem. 6.2. Preparo da amostra para anlise microbiolgica 6.2.1 Coleta da amostra Tcnicas asspticas devem ser utilizadas em todas as etapas; Deve-se proceder limpeza e a desinfeco da embalagem do alimento a ser analisado com lcool a 70%; A quantidade analisada do alimento muitas vezes na faixa de 25g (ou mL) 50g A mostra precisa ser homogeneizada com diluente apropriado, a escolha do diluente depende do tipo do produto e dos microrganismos a serem pesquisados; A homogeneizao das amostras com o diluente pode ser feita em liquidificadores ou homogeneizadores de laboratrio, denominados stomacher. 6.2.2 Retirada da amostra A operao de retirada da amostra deve ser efetuada, preferencialmente, dentro de uma capela de fluxo laminar, ou prxima de um bico de Bunsen, com a chama a meia altura.

As embalagens devem ser desinfetadas antes de sua abertura que dever ocorrer de maneira assptica. Amostras de alimentos lquidos devem ser retiradas com pipeta estril, e os alimentos slidos ou semi-slidos devem ser pesados assepticamente. 6.2.3 Preparo das diluies No preparo das diluies sucessivas, podem ser utilizados diversos diluentes; soluo salina-peptonada, salina a 0,85% ou gua estril e outros. Para obteno da diluio inicia (1/10) procede-se do seguinte modo: a) Retirar assepticamente pores de 25g ou 25 mL da amostra, colocandose em homogeneizadores esterilizados ; b) Adicionar 225 mL do diluente; c) Homogeneizar por alguns minutos em velocidade reduzida, para no danificar as clulas microbianas. d) A partir da diluio inicial (1/10), proceder s diluies seguintes (1/100); (1/1000), etc. (Anexo E). 6.3. Estimativa da populao de coliformes totais, a 45C e Escherichia coli atravs do nmero mais provvel (NMP). Tradicionalmente, as bactrias do grupo coliformes tm sido consideradas como indicadoras de poluio fecal em alimentos e guas. So bastonetes gram negativas, no esporuladas, de metabolismo aerbio ou facultativo anaerbio, da famlia das Entenobacteriaceae. O grupo dos coliformes totais (CT) apresenta a caracterstica de fermentar a lactose com produo de gs dentro de 48 horas a 35C. Mais de 20 espcies de bactrias podem ser classificadas como coliformes, originrias tanto do trato gastrintestinal do homem e de animais, como tambm de outros ambientes. O grupo de coliformes a 45C formado pelos coliformes que fermentam lactose, com produo de gs dentro de 24-48 horas, em temperatura de 45C, normalmente em Caldo EC. Podem ser Citrobacter freundi, Enterobacter spp., (incluindo E. aerogenes e E. cloacae), Kleblsiella etc. Entretanto, Escherichia coli a nica espcie cujo habitat o trato gastrintestinal do homem e de animais.

Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter podem desenvolver-se fora do trato intestinal, tais como vegetais e solo. Quando se determina populao dos coliformes a 45C, 90% corresponde populao de Escherichia coli. A tcnica mais usada nos laboratrios para determinao de coliformes (totais e a 45C) a do nmero mais provvel (NMP) dos tubos mltiplos, onde se estima quantitativamente este grupo, utilizando-se a Tabela de Hoskins (Apndice F). Outras tcnicas so utilizadas para determinao de coliformes como membrana filtrante e simplate. 6.3.1 Mtodo Coliformes Totais Prova Presuntiva Visa detectar a presena de microrganismos fermentadores de lactose,

especialmente o grupo coliforme. Clulas estressadas por tratamentos trmicos, pelo congelamento ou outro motivo, podem ser recuperados nessa fase. Procedimento Selecionar trs diluies adequadas da amostra e inocular uma srie de trs tubos de ensaio contendo, em cada tubo, 10 mL de Caldo Lauril Sulfato e tubos de Durhan invertidos com cada uma das diluies decimais preparadas. Colocar, em cada tubo com o Caldo Lauril, 1,0 mL de do inoculo. Incubar em estufa de bacteriologia a 35-37C por 24 a 48 horas. Aps as 48 horas, retirar os tubos de ensaio da estufa. So considerados positivos aqueles que apresentarem turvao do meio e presena de gs (bolhas de ar) no interior dos tubos de Durhan. Em seguida contar o nmero de tubos positivos correspondentes a cada diluio (Apndice G). Prova Confirmatria (Coliformes totais) O meio utilizado, o Caldo Verde Brilhante Lactose Bile 2%, contm dois inibidores (Bile e Verde Brilhante) do crescimento da microbiota acompanhante, especialmente bactrias gram-positivas. Assim, a produo de gs nos tubos, nas condies do teste, indica que houve desenvolvimento ou bactrias gram-negativas que fermentaram lactose, caractersticas do grupo coliforme.

Procedimento Riscar os tubos de ensaio positivos no Caldo Lauril Sulfato para os tubos de Caldo Verde Brilhante a 35-37C por 24 a 48 horas. Os tubos positivos apresentam turvao e formao de bolhas de gs nos tubos de Durhan. Anotar os resultados de consulte a tabela para NMP (Nmero Mais Provvel) para coliformes totais por grama ou mL.

6.3.2. Coliformes a 45C Para a qualificao dos coliformes a 45C risque os tubos de ensaio positivos no Caldo Lauril Sulfato e/ou dos tubos positivo do Caldo Verde Brilhante para os tubos de Caldo EC e coloque no banho-maria por 24 ou 48 horas. Os tubos positivos apresentam positividade semelhante nos Caldo Lauril e Verde Brilhante. Anotar os resultados consultando a tabela do NMP para coliformes a 45C por grama ou mL. 6.3.2.1. Identificao de Escherichia coli A partir de cada tubo de ensaio positivo com Caldo EC riscar (estriar) placas de Petri para Agar EMB (Eosina Azul de Metileno) com auxilio de ala de nquel cromo e incubar a 35C por 18 a 24 horas. Ter o cuidado de, durante a inoculao, no colocar muito material da amostra, afim de no superlotar as placas, proporcionando s colnias crescimento isolado, transcorrido este tempo, verificar o crescimento de colnias com caractersticas de E. coli, ou seja, 2 a 3 cm de dimetro, com brilho metlico esverdeado ou com centro escuro (Apndice H). De cada placa correspondente a cada tubo, repicar de 2 a 3 colnias caractersticas para tubo com Agar Triptona de Soja (TSA) inclinado e incubar por 18-24 horas a 35-37C. Efetuar em cada cultura em TSA, as provas bioqumicas: IMViC -Indol, Vermelho de metila, Vogues-Proskauer e Citrato de Simmons). Considerar a cultura positiva para E.coli, quando forem obtidos os seguintes resultados para o IMViC (Tabela 1).

Tabela 1. IMViC.

OBS: 1- Outros testes bioqumicos podem ser adicionados, como os testes de carboidratos e aminocidos. 2- Tabela do NMP (Apndice B). 6.3.3. Pesquisa de Salmonella spp. Salmonella um gnero da famlia Enterobacteriaceae, gram negativo, no esporulado. Vrias espcies so patognicas ao homem e aos animais. Habitando o trato intestinal de animais, Salmonella eliminada pelas fezes. A possibilidade de contato dessas fezes contaminadas com guas, superfcies e manipuladores, torna iminente a sua veiculao por alimentos. Existem vrios mtodos para o isolamento de Salmonella, nenhum completamente satisfatrio para isolar todos os sorotipos presentes em qualquer alimento. Eles compreendem as seguintes etapas: pr-enriquecimento, enriquecimento seletivo, isolamento em agar seletivo e diferencial e seleo de colnias suspeitas, com as quais realizam-se provas bioqumicas, sorologia e fagotipagem, que definiro, finalmente, o sorotipo. Tcnica de Anlise

a) Pr-enriquecimento: Pesar 25 g ou medir 25 mL da amostra e adicionar 225mL de Caldo Lactosado ou gua Peptonada Tamponada. Incubar a 35-37C por 24 horas. b) Enriquecimento seletivo: Agitar o caldo pr-enriquecimento e inocular 0,1mL em 10mL do meio Rapapport e 1,0mL em 10mL do Caldo Tetrationato. Incubar os meios a 37C e 42C/24 horas.

c) Plaquemento em meio seletivo e diferencia l: Agitar os tubos de Caldo Rapapport e Tetrationato e estriar uma alada de cada cultura em placas nos seguintes meios de cultura: Agar Hektoen, Agar Rambac e Agar XLD, identificando a origem das culturas (Rapapport e tetrationato). Incubar as placas invertidas a 35C por 24 horas. d) Seleo de colnias suspeitas: Transcorrido o perodo de incubao do plaqueamento seletivo, observar as colnias suspeitas de Salmonella com auxlio de manuais especializados (Apndice I). e) Provas bioqumicas de triagem: Transferir duas ou mais colnias suspeitas de cada placa para tubos inclinados, contendo Agar TSI e LIA. Com auxlio de agulha de inoculao, tocar levemente o centro da colnia, estriar na superfcie inclinada (pice) do TSI e dar uma picada na base. Sem flambar a agulha, dar duas picadas na base do meio LIA e estriar na superfcie. Rotular os tubos, identificando a origem das culturas e incubar a 35C por 24 horas. Reaes tpicas de Salmonella nos tubos de TSI e LIA, so as seguintes: TSI pice alcalino (vermelho) e base cida (amarela), com ou sem produo de gs (bolha) e de H2S (escurecimento do meio). LIA base alcalina (prpura), a maioria produz H2S. Colorao vermelho-tijolo no pice do meio LIA no tipo de Salmonella. Submeter todas as culturas com reaes tpicas no meio LIA (base alcalina) e/ou no meio TSI (alcalina/cida) a testes bioqumicos e sorolgicos. Descartar apenas as culturas pice/base cidas no meio TSI e aquelas com base cida no meio LIA (Apndice J). Provas bioqumicas de confirmao Teste da urease: Inocular com ala, tubos de ensaio com Caldo Uria. Incubar a 35C por 24 horas. Reao positiva: alterao da cor do meio para rosa escuro, pela viragem alcalina do indicador. A maioria das cepas de Salmonella urease negativa (no altera a colorao do meio).

Para os testes posteriores, renovar as culturas urease negativas em meio TSI inclinado e incubar a 35C por 24 horas. Teste de fermentao do dulcitol: Inocular uma alada em tubos de ensaio com Caldo Prpura de Bromocresol com 0,5% de dulcitol. Incubar a 35C por 48 horas. Reao positiva: acidificao do meio (amarelo). Reao negativa: colorao prpura do meio. A maioria das cepas de Salmonella fermenta dulcitol. Teste de utilizao do malonato: Inocular cultura para tubos de ensaio com Caldo Malonato e incubar a 35C por 48 horas, mas examinar aps 24 horas. Incubar um tubo controle no inoculado. A maioria dos sorotipos de Salmonella malonato negativo (colorao verde). Malonato positivo (alterao de cor verde para azul). As culturas de Salmonella spp. apresentam o seguinte quadro: Teste Citrato de S immons Malonato Vermelho de metila Voges-P roskauer Indol Urease Lisina Acares; lactose Acares; glicose Acares; dulcitol Motilidade (m eio SIM) 6.3.4. Contagem de Bolores e Leveduras Os bolores so fungos com estruturas filamentosas. As leveduras so fungos unicelulares de forma esfrica, ovide, cilndrica. Os fungos so talvez a causa mais comum de deteriorao de alimentos estocados em ambientes domsticos, alm disso, alguns bolores produzem micotoxinas. Resultado + + _ + + + +

Tcnica de Anlise Retirar assepticamente 25g ou 25mL da amostra e preparar as diluies sucessivas (10-1 a 10-3). Pipetar alquotas de 1mL de cada diluio para placas de Petri, fazendo de cada diluio placas em duplicatas. Adicionar a cada placa 15mL do Agar batata dextrose, previamente fundido, resfriado a 45C e acidificado com o cido tartrico. Homogeneizar com movimentos em forma de oito. Deixar solidificar a temperatura ambiente. Incubar as placas a 25C por 3 a 5 dias. Para a contagem de bolores e leveduras em placas utilizando o Agar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) alquotas de 0,1 mL das diluies, sero inoculadas na superfcie das placas contendo o agar em duplicatas sendo espalhadas com basto em L. As placas inoculadas sero incubadas por 3 a 5 dias temperatura de 25 C . Resultados Aps o perodo de incubao, considerar para contagem somente as placas da mesma diluio que apresentarem de 30 a 300 colnias. Em seguida, multiplicar a mdia das duas placas pelo fator de diluio correspondente, expressando o resultado em Unidades Formadoras de Colnias por grama ou mililitros (UFC/g ou mL) (Apndice L). 6.3.5 Pesquisa de Clostrdos Sulfito Redutores As bactrias do gnero Clostridium esto amplamente distribudas na natureza, podendo ser encontradas no solo, ar, poeira, gua, alimentos e at no trato intestinal do homem e de animais. Estas bactrias tm sido freqentemente associadas a surtos de DTAs, quando uma populao de, no mnimo 1 milho de bactrias, contamina estes alimentos. A deteco de clostrdios sulfito redutores se faz por contagem em placas, em meio contendo sulfito de sdio e sais de ferro, alm de antibitico. A reduo de sulfito, produzindo sulfeto, detectada por sua reao com ferro, provocando o aparecimento de colnias negras, dentre aquelas redutoras de sulfito. Podem ser

utilizados dois meios seletivos, o Agar Seletivo Sulfito Polimixina Sulfadiazina (SPS) e o Agar Triptose Sulfito Cicloserina (TSC) com emulso de gema de ovo, usado para plaqueamento em profundidade. Uma outra bactria sulfito redutora de grande importncia . C. botulinum que, se presente, ser igualmente detectada. Muitos casos de surtos de toxinfeces relacionados a bactrias produtoras de toxinas de elevada potncia em conservas enlatadas tm sido relatados. A pesquisa de determinadas espcies, como C. perfringens ou C. botulinum, se faz a partir da estimativa em meio de cultura, pela amostragem de colnias suspeitas e pelas respectivas provas bioqumicas. Tcnica de Anlise Pesar assepticamente 25g ou medir 25mL da amostra e preparar diluies sucessivas. Pipetar alquotas de 1mL de dada diluio em placas com Agar (SPS) ou TSC, previamente fundido e resfriado a 50C. Aps a absoro do inoculo, adicionar uma sobrecamada cerca de 10mL do meio fundido e resfriado e permitir mais uma vez a sua solidificao. Incubar em jarra anaerbica a 46C por 24 horas permitir mais uma vez a sua solidificao. Contar o nmero total de colnias negras, observando o limite entre 20 e 200 colnias negras com ou sem halo por placa. Contar todas as colnias negras e calcular a mdia das duas placas (Apndice M). Confirmao das colnias tpicas de Clostridium sulfito redutor Selecionar vrias colnias tpicas e transferir para tubos de Caldo Infuso Crebro Corao (BHI), previamente desaerados. Incubar os tubos inoculados a 35C/24 horas, preparar um esfregao da cultura para colorao de gram e utilizar o caldo remanescente para teste de catalase. Teste de catalase Adicionar ao tubo de BHI 1,0mL de perxido de hidrognio 3% e observar se ocorre borbulhamento imediato (teste positivo) ou no (teste negativo). Os clostrdios sulfito redutores so bastonetes gram positivos, catalase negativos.

Clculo dos resultados Considerar como confirmadas todas as culturas de bastonetes gram positivos catalase negativos. Calcular o nmero de UFC/g ou mL em funo do nmero de colnias tpicas, diluio inoculada e percentual de colnias confirmadas. Por exemplo, para plaqueamento em profundidade, diluio 10-2, 25 colnias tpicas, 10 submetidas confirmao, 8 confirmadas (80%) 2,0 x 103. 6.3.6. Contagem Padro em Placas (CPP) de Microrganismos Aerbios Mesfilos Viveis O mtodo da Contagem Padro em Placas (CPP), estima o nmero de clulas viveis contidas em um alimento qualquer. Este mtodo, no diferencia tipos de bactrias, sendo utilizado para se obter informaes gerias sobre a qualidade de produtos, prticas de manufatura, matrias primas utilizadas, condies de processamento, manipulao e vida de prateleira. No um indicar de segurana, pois no estar diretamente relacionado presena de patgenos ou toxinas. Sua presena em grande nmero indica: a) Matrias-primas excessivamente contaminadas; b) Limpeza e desinfeco de superfcies inadequadas; c) Higiene inadequada na produo; d) Condies inadequadas de tempo/temperatura durante a produo ou a conservao dos alimentos ou uma combinao destas circunstncias. As tcnicas utilizadas para se quantificar as bactrias so: Pour Plate, Spread Plate. O mtodo CPP baseia-se na premissa de que cada clula vivel, isolada, homogeneizada em um meio slido (agar), dar origem a uma colnia uma vez que teoria biolgica que uma colnia provm de uma nica clula microbiana. UFC/g ou mL = 2,5 x 102 x 0,8 =

Tcnica de Anlise Retirar assepticamente 25g ou 25mL da amostra e preparar diluies sucessivas. Pipetar alquotas de 1mL de cada diluio para placa de Petri esterilizadas. Adicionar a cada placa 15-20mL de Agar Padro para Contagem, previamente fundido e resfriado a temperatura de 45C. Homogeneizar em movimentos suaves em forma de oito (cerca de dez vezes) e deixar a temperatura ambiente, at a completa solidificao do agar. Aps a solidificao, incubar as placas em posio invertida a 35-37C/48 horas (Apndice N). Resultados Transcorrido o tempo de incubao, considerar para contagem, somente as placas da mesma diluio que apresentarem de 30 a 300 colnias; o resultado deve ser expresso seguindo a formula: N de unidades formadoras de colnias/mL ou g = N de colnias x diluio. Sempre que quiser trabalhar com segurana, o mtodo CPP exige o uso de placas de Petri em duplicatas. Muitos erros podem ser cometidos na execuo do mtodo: erros de pesagem, erros da amostra, erros na medida dos volumes dos diluentes e nas alquotas a serem distribudas nas diluies, erros no espalhamento do inoculo, contaminao nas operaes e erros na homogeneizao das amostras. No resultado: Contagem de bactrias = 36; Diluio = 10-3; N UFC = 36 x 103 UFC/g ou mL ou 36000 = 3,6 x 104 UFC/g ou mL. 6.3.7. Atividade Antibacteriana do Mel pelo Mtodo de KIRBY-BAUER (1966) Este mtodo tem por objetivo verificar a ao de substncias antimicrobianas no crescimento de bactrias. A determinao da atividade antimicrobiana do mel ser realizada frente trs bactrias patognicas: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus mirabilis.

Procedimentos 1. Realizar o cultivo das cepas em caldo BHI (35 C/24h); 2. Semear alquotas de 0,1ml da cultura sobre a superfcie do Agar Mueller Hinton, espalhando o inculo com auxilio do swab (Figura 11). 3. Aps a semeadura, os discos impregnados com 0,75l do mel so colocados sobre a superfcie do agar inoculado e levemente pressionados com auxilio de uma pina (Figura 12). 4. Incubar as placas a 35 pelo mnimo de 18 horas e mximo de 48 horas. C Interpretao dos resultados 1. Observar as placas do antibiograma, verificando a presena ou ausncia de halos de inibio do crescimento em torno dos discos. 2. A zona clara de inibio (raio do halo de inibio) ao redor de cada disco medida em milmetros com auxlio de rgua (Figura 13).

Figura 11. Semeadura da bactria no Agar Muller Hinton

Figura 12. Deposio dos discos impregnados com o mel

Figura 13. Visualizao da placa do teste de antibiograma

7. REFERNCIAS ABELHAS SEM FERRO. Disponvel em: < www.apacame.org.br >. [acessado em 16 de julho de 2007]. AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA. Resolues: mel. So Paulo: ANVISA, 2000. Disponvel em: < www.anvisa.gov.br/regis/resol/12_/8_mel.htm >. [acessado em 26 de junho de 2007]. ALMEIDA, Daniela de. Espcies de abelhas (hymenoptera, Apoidea) e tipificao dos meios por elas produzidos em rea de cerrado do Municpio de Pirassununga, Estado de So Paulo. 2002. 103f. Dissertao (Mestrado em Cincia, rea de Concentrao: Entomologia) Escola Superior de Agricultura Luis de Queiroz, Piracicaba, SP, 2002. ASSOCIATION OF ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis. 15 th. Supl 2, Ed. 1990. BRASIL, Instruo normativa N 11 de outubro de 2000, Ministrio da Agricultura Abastecimento e Pecuria. BREYER, Ernesto Ullch. Abelhas e sade. 5. ed. [s.1: s.n], 1985. CAMARGO, J.M.F. Alimentao em Apis e Composio da Gelia-Real, Mel Plen, Manual de Apicultura, Editora Agronmica CERES, S.P., 1972, p. 128-130 CARVALHO, Lis de S. Verificao da pureza e anlise fsico-qumica do mel da abelha africanizada (Apis mellifera) e abelhas sem ferro (mellipona compressipes fasciculata) comercializada na cidade de So Lus MA. 2001. 47 f. Monografia (Graduao em Agronomia) Universidade Estadual do Maranho, So Lus, 2001. CHAVES, A. E. S. Anlises Fsico-Qumica do mel das abelhas africanizadas e
52 abelha nativa do Maranho: Apis mellifera e Tiba melipona compressipes

fasciculata. 66 f. Monografia (Graduao em Qumica Licenciatura) UFMA. 2004. CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION. Official methods of analysis. Vol. 3, supl 2, Ed 1990.

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ANEXOS

ANEXO A ANATOMIA INTERNA DA ABELHA

ANEXO B ABELHA NATIVA (Rainha)

ANEXO C TABELA DE CHATAWAY* - UMIDADE ndice de refrao a 20 C 1,4844 1,4849 1,4853 1,4858 1,4862 1,4866 1,4871 1,4876 1,4880 1,4885 1,4890 1,4895 1,4900 1,4905 1,4910 1,4915 1,4920 1,4925 1,4930 1,4935 1,4940 1,4945 1,4950 1,4955 1,4960 1,4965 1,4970 1,4975 1,4980 1,4985 1,4990 1,4995 1,5000 1,5005 1,5010 1,5015 1,5020 1,5025 1,5030 1,5035 1,5040 Slidos Solveis % 79,0 79,2 79,4 79,6 79,8 80,0 80,2 80,4 80,6 80,8 81,0 81,2 81,4 81,6 81,8 82,0 82,2 82,4 82,6 82,8 83,0 83,2 83,4 83,6 83,8 84,0 84,2 84,4 84,6 84,8 85,0 85,2 85,4 85,6 85,8 86,0 86,2 86,4 86,6 86,8 87,0 Peso especfico a 20 C 1,3966 1,3979 1,3992 1,4006 1,4020 1,4033 1,4046 1,4060 1,4074 1,4086 1,4101 1,4115 1,4129 1,4143 1,4156 1,4171 1,4182 1,4197 1,4212 1,4225 1,4239 1,4254 1,4267 1,4282 1,4295 1,4310 1,4324 1,4338 1,4352 1,4367 1,4381 1,4395 1,4409 1,4424 1,4438 1,4453 1,4466 1,4481 1,4495 1,4510 1,4525 Umidade % 21,0 20,8 20,6 20,4 20,2 20,0 19,8 19,6 19,4 19,2 19,0 18,8 18,6 18,4 18,2 18,0 17,8 17,6 17,4 17,2 17,0 16,8 16,6 16,4 16,2 16,0 15,8 15,6 15,4 15,2 15,0 14,8 14,6 14,4 14,2 14,0 13,8 13,6 13,4 13,2 13,0

ANEXO D TABELA DE CLASSIFICAO DA COR (ESCALA DE PFUND)

Cor Branco dgua Extra branco Branco Extra mbar claro mbar claro mbar mbar escuro

Escala de Pfund 1 a 8 mm mais de 8 a 17 mm mais de 17 a 34 mm mais de 34 a 50 mm mais de 50 a 85 mm mais de 85 a 114 mm mais de 114 mm

Faixa de cor 0,030 ou menos mais de 0,030 inc. 0,060 mais de 0,060 inc. 0,120 mais de 0,120 inc. 0,188 mais de 0,188 inc. 0,440 mais de 0440 inc. 0,945 mais de 0,945 inc. ...

Anexo E. Esquem a das diluies sucessivas. Alimento (25g)

225mL de H2O peptonada, 0,85% 10-1

1mL

Diluio

Homogeneizar 1mL 10-2 10-3

Anexo F. Tabela do Nmero Mais Provvel (NMP), para sries de trs tubos (NMP/g ou mL).
Nmero de tubos positivas nas diluies 10-1
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Nmero de tubos positivos nas diluies 10-1

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

10-2
0 1 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3

10-3
0 0 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

NMP
3 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29

10-2
0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3

10-3
0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

NMP
9.1 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 2400

Anexo G. Enumerao de coliformes totais e a 45C.

10-1

10-2

10-3

1ml

1ml

1ml Caldo Lauryl (CL)

ESTUFA 35C/24-48h

2 aladas Teste Confirmativo coliformes a 45C (Caldo E.C.)

2 aladas Teste Confirmativo coliformes totais (Caldo VB)

BANHO-MARIA 45C/24h

ESTUFA 35C/24-48h

Gs (+) Presena de coliformes a 45C

Gs (-) Ausncia de coliformes a 45C

Gs (+) Presena de coliformes totais

Gs (-) Ausncia de coliformes totais

TESTE BIOQUMICO Teste API-20E

Anexo H. Identificao de E scherichia coli.

Caldo E.C., presena de gs (+) para coliformes a 45C.

Agar Eosina Azul de Metileno (Agar EMB) com crescimento de E. coli.

Isolamento em Agar Tripcase Soja (Agar TSA)

Srie Bioqumica

INDOL

E. coli (+)

Anexo I. Pesquisa de S almonella spp.

ALIMENTO 25g ou 25ml

225ml de gua Peptonada Tamponada

ESTUFA A 35C/24 horas

1mL 10mL de Caldo Tetrationato

ENRIQUECIMENTO

0,1mL 10mL de Caldo Rapapport

ESTUFA A 35C/24 horas

Agar Hektoen

Estrias INCUBAO 35C/24H

Agar Rambach

Agar Tripcase Soja

Testes Bioqumicos

Anexo J. Identificao de S almonella spp.

Testes Preliminares ( 1 Etapa )

a

Agar TSI

Uria

Agar LIA

Testes Finais ( 2 a Etapa )

Vermelho de Metila

Indol

Vogues -Proskauer

Citrato de Simmons

Fermentao de Lactose

Fermentao de Sacarose

Caldo Malonato

Anexo L. Contagem de B olores e Leveduras.

10-1 ALIMENTOS 25g ou 25 ml 1ml

10-2 1ml

10-3 1ml

10-4 9 ml sol. salina

225ml soluo salina estril 1ml 1ml 1ml 1ml Agar Batata Dextrose adicionado cido Tartrico

ESTUFA B.O.D. 25C/ 5 dias

Contagem das placas que contenham entre 30 e 300 colnias (UFC/g ou ml)

Anexo M. Contagem de Clostridium spp.

10-1 ALIMENTO 25g ou 25ml 1ml

10-2 1ml

10-3 1ml

10-4 9 ml sol. salina

225ml soluo salina estril 1ml 1ml 1ml 1ml

ESTUFA 46C/48 horas (Em Anaerobiose)

Contagem das colnias tpicas de Clostridium spp. em Agar SPS

Isolamento em Agar Tripticase Soja (Agar TSA)

TESTES BIOQUMICOS

Anexo N. Esquem a da tcnica de anlise de Contagem Padro em Placas de bactrias mesfilas.

10-1

10-2 1mL 1mL

10-3 1mL

10-4 9 mL sol. salina 0,85% NaCl

Amostra (25g)

225mL soluo salina estril

Plate Count Agar (PCA)

1mL

1mL

1mL

1mL

Incubao 37C/48h

Contagem das placas contendo 30 a 300 colnias