U.C.O.

Anatomia Patolgica e Histopatologia, Hospital Universitario de Trieste, Italia

Eugenio LEONARDO, MD PhD

Aunque la inmunohistoqumica se considera una reciente metodologa aplicada en la patologa, en realidad naci en el ao 1941, por una brillante intuicin de Albert Coons.

l, ya unos aos antes, haba ligado una molcula de fluorescena a la albmina; estableci las bases para el desarrollo de la tcnica inmunohistoqumica, o sea, de la metodologa diagnstica que utiliza las propiedades de las reacciones inmunolgicas para identificar distintas molculas celulares (antgenos).

Albert Coons, al vincular una molcula de una sustancia fluorescente a un anticuerpo, pudo as visualizar el sitio donde iba a ubicarse la reaccin inmune e identificar un antgeno del neumococo.

Coons AH, et al.: Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med 47: 200, 1941

Sustancia fluorescente

Antgeno

Anticuerpo

La evolucin de las investigaciones de Coons llev a la creacin de la primera tcnica inmunohistoqumica: la INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA.

Corteza cerebral - Doble inmunofluorescencia directa anti-glutamato (rodamina) y anti-GFAP (FITC)

Este mtodo surgi al principio como tincin histolgica especial y se utiliz para investigaciones cientficas, pero rpidamente pudo transformarse a un procedimiento para investigaciones diagnsticas.

De hecho, a comienzos del ao 1948 aparecen en la literatura los trabajos de Fragraeus en los cuales se encuentran las descripciones del uso del mtodo de inmunofluorescencia directa para identificar clulas plasmticas y para identificar auto-anticuerpos.

Fragraeus A: Plasma cellular reaction and its relation to formation of antibodies in vitro. J Immunol 38: 1, 1948

Sustancia fluorescente

Sucesivamente, en el ao 1957 Friou y Holborrow realizaron y describieron por la primera vez el mtodo de INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA para diagnosticar enfermedades autoinmunes.

Anticuerpos segundarios Antgeno Anticuerpo primario

Friou GJ et al.: Nuclear localization of a factor from disseminated lupus serum. Fed Proc 16: 413, 1957

Holborrow EJ: A serum factor in lupus erythematosus with affinity for tissue nuclei. B Med J 2: 732, 1957

En el mismo ao (1957) Ortega y Mellors efectuaron tinciones por inmunofluorescencia en tejido congelado y no fijado, para investigar diferentes lesiones.

Ortega LG, Mellors RC: Cellular sites of formations of gamma globulin. J Exp Med 106: 627, 1957

Al final de los aos 50 surgi la necesidad de revelar las reacciones antgeno-anticuerpo en muestras de microscopa electrnica.

Lo que estimul a Singer en el ao 1959 a realizar la unin de una molcula metlica electrodensa a un anticuerpo.

Antgeno

Anticuerpo primario ligado a molculas electrodensas

Singer SJ: Preparation of an electron-dense antibody conjugate. Nature 183: 1523, 1959

Ms adelante fue posible identificar estructuras subcelulares a travs del uso de la inmunoultramicroscopa con anticuerpos vinculados con ferritina.

Insulina

A principios del ao 1962, Sainte-Marie us la inmunofluorescencia en cortes histolgicas de tejidos parafinados y fijados con alcohol; por lo que la reaccin inmunohistoqumica se transform en una tincin de rutina.

Actina en fibras musculares de corazn

Sainte-Marie G: A paraffin embedding technique for studies employing immunofluorescence. J Histochem Cytochem 10: 250, 1962

El ao 1966 represent el comienzo de la inmunohistoqumica enzimtica. En los laboratorios de Avrameas y Uriel y, en forma independiente, en los de Nakane y Pierce, se iniciaron las investigaciones para introducir un marcador enzimtico, ligado a un anticuerpo, para utilizarlos con la microscopa ptica tradicional.

Avrameas S, Uriel J: Mthode de marquage d'antignes et d'anticorps avec des enzymes et son application en immunodiffusion. C R Acad Sci 262: 2543, 1966

Nakane PK, Pierce GB Jr:: Enzyme-labelled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem 14: 929, 1966

En un inicio las enzimas (peroxidasa) se vinculaban directamente a los anticuerpos primarios. Pero las reacciones inmunohistoqumicas se presentaba con intensidad de tincin muy dbil.

Antgeno

Molculas enzimaticas ligada a un anticuerpo

Ms adelante los mismos Nakane y Pierce (1967), ligaron la peroxidasa con un anticuerpo secundario, y as se realiz el sistema indirecto.

Enzima Anticuerpo segundario Antgeno Enzima

Anticuerpo primario

En los aos siguientes (1969) la tcnica inmunoenzimtica se perfeccion, por mrito de Sternberger, Mason, Hammerling y Avrameas

Sternberger LA: Some new developments in immunocytochemistry. Mikroskopie 25: 346, 1969 Hammerling U et al.: New visual markers of antibody for electron microscopy. Nature 223: 1159, 1969 Avrameas S: Coupling of enzymes to proteins with glutaraldeyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibodies. Immunochemistry 6: 43, 1969

 hasta a llegar a la realizacin por Sternberger (1970) del mtodo con anticuerpo puente (PAP bridge method).

Complejo inmune peroxidasa anti-peroxidasa

Anticuerpo primario Antgeno Anticuerpo puente Sternberger LA, et al.: The unlabeled antibodyenzyme method of immunohistochemistry: Preparation and properties of soluble antigenantibody complex (horseradish peroxidaseanti-horseradish peroxidase) and its use in identification of spirochetes. J Histochem Cytochem 18: 315, 1970

Desde el inicio de los aos 70 la literatura cientfica se llen de trabajos de investigacin en los cuales, sobre todo Blum, Bosman, Bussolati, Pearse, ......

Bosman FT Some recent developments in immunocytochemistry. Histochem J 15: 189, 1983 Pearse AGE, Polak JM Endocrine tumours of neural crest origin Med Biol 52: 3, 1974 Bussolati G, Pearse AGE Immunofluorescent localization of the gastrin-secreting G cells in the pyloric antrum of the pig. 21: 1, 1970 Bussolati G et al.: Immunocytochemical detection of actin on fixed and embedded tissues its potential use in routine pathology. J Histochem Cytochem 28: 169, 1980

... Polak, Streefkirk y Taylor sugeran innovaciones tcnicas para mejorar los resultados de las reacciones inmunohistoqumicas.

Polak JM, Van Noordenj S: Immunocytochemistry: modern methods and applications. Wright Ed, Bristol, 1986 Strefkirk JG: Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. J Histochem Cytochem 20: 829, 1972 Taylor CR Immunoperoxidase techniques: Pratical and theoretical aspects. Arch Pathol Lab Med 102: 113, 1978

En la segunda mitad de la dcada de los aos 70 se comenz a usar la inmunohistoqumica en tejido fijado en formol y parafinado (Nakane, Taylor y Nayak, 1974).

Nakane PK, Kawaoi A: Peroxidase-labeled antibody: A new method of conjugation. J Histochem Cytochem 22: 1084, 1974 Nayak NC et al.: Localisation of -feto protein in human and rat fetal livers: an immunohistochemical method using horseradish peroxidase. J Histochem Cytochem 22: 414, 1974 Taylor CR, Burns J: The demonstration of plasma cells and other immunoglobulin containing cells in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue using peroxidase labelling antibody. J Clin Pathol 27:14, 1974

El ao 1975 representa un momento muy importante en la evolucin de la inmunohistoqumica, pues Kohler y Milstein idearon los anticuerpos monoclonales.

Kohler G, Milstein C: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity Nature 256:495, 1975 Kohler G, Milstein C: Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. Eur J Immunol 6: 511, 1976

Paralelamente se realizaron nuevos mtodos para hacer las inmunotinciones, como la tcnica de la protena A vinculada a una molcula fluorescente (Notani)

Molcula fluorescente

Anticuerpo primario

pA

Protena A

Antgeno

Notani GW et al.: Versatility of staphylococcous aureus protein A in immunohistochemistry. Use in unlabelled antibody enzyme system and fluorescent methods. J Histochem Cytochem 27: 1438, 1979

 o a una molcula de peroxidasa (Celio).

Molcula de peroxidasa

Anticuerpo primario

pA

Protena A

Antgeno

Celio MR et al.: Protein A in immunoperoxidase techniques. J Histochem Cytochem 27: 691, 1979

 y se perfeccion el sistema peroxidasa-anti-peroxidasa (PAP) efectuado por Bigbee (1977).

Al comienzo de los aos 80 Nadji puso las bases tcnicas para realizar las inmunotinciones en muestras citolgicas y luego apareci la inmunocitoqumica.

Nadji M: The potential value of immunoperoxidase techniques in diagnostic cytology. Acta Cytol 24:442, 1980.

En el ao 1981 Hsu introdujo las tcnicas que utilizaban el sistema de la avidina y de la biotina para vincular la enzima peroxidasa.

Avidina Biotina-peroxidasa Complejo (ABC)

Anticuerpo primario Antgeno

Anticuerpo segundario ligado con biotina

Hsu SM et al.: Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase technique: a comparison between ABC and unlabelled antibody (PAP) procedure. J Histochem Cytochem 29: 577, 1981.

En el mismo ao, Jasani estudi un mtodo inmunohistoqumico en el cual la enzima se ligaba a travs de una molcula de dinitrofenil (DNP).

Jasani B, et al.: Use of monoclonal anti-hapten antibodies for immunolocalization of tissue antigens. J Clin Pathol 34: 1000, 1981

En el ao siguiente se llevaron a cabo mtodos de inmunotinciones que utilizaban diferentes enzimas como la -galatosidasa (Bondi)

Adenocarcinoma de pulmn Inmuno--galatosidasa (anti-CEA)

Bondi A et al.: The use of -galactosidase as a tracer in immunocytochemistry. Histochemistry 76; 153, 1982

 y la glucosidasa (Clark).

Tumor mixto de glndula salival Inmuno-glucosidasa (anti-CK) Clark CA et al.: An unlabelled antibodies method using glucose oxidase antiglucose oxidase complex (GAC): a sensitive alternative to immunoperoxidase for the detection of tissue antigens. J Histochem Cytochem 30: 27, 1982

El ao1983 las investigaciones estaban dirigidas a perfeccionar los sistema para la microscopa electrnica (Holgate).

Holgate CS et al.: Immunogold silver stain: new method of immunostaining with enhanced sensitivity. J Histochem Cytochem 31: 938, 1983

El mismo sistema se aplic tambin a cortes histolgicas de tejidos parafinados y fijados con formol (Holgate).

Mtodo inmuno-oro potenciado con sal de plata (anti-CK)

Holgate CS et al.: Immunogold silver stain: new method of immunostaining with enhanced sensitivity. J Histochem Cytochem 31: 938, 1983

A principios de los aos 90 la inmunohistoqumica experiment un gran adelanto tecnolgico, pues se introdujeron los mtodos para reactivar los antgenos bloqueados por el formol...

Shi SR et al.: Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem 39: 741, 1991

Bankfalvi A Navabi H, Bier B Wet autoclave pretreatment for antigen retrieval in diagnostic immunohistochemistry. J Pathol 174: 223, 1994 Miller K, Auld J, Jessup E Antigen unmasking in formalin-fixed routinely processed paraffin wax-embedded sections by pressure cooking: a comparison with microwave oven heating and traditional methods. Adv Anat Pathol 2: 60, 1995

Baker-Cairns B et al. Immunohistochemical staining of fixed tissue using antigen retrieval and a thermal cycler. Biotechniques 20: 641, 1996. Beckstead JH Improved antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Appl Immunohistochem 2:274, 1994. Biddolph SC, Jones M Low-temperature, heat-mediated antigen retrieval (LTHMAR) on archival lymphoid sections. App Immunohistochem Mol morphol 7: 289, 1999. Taylor CR et al. Comparative study of antigen retrieval heating methods: microwave, microwave and pressure cooker, autoclave and steamer. Biotech Histochem 71: 263, 1996.

Tambin se introdujeron las tcnicas de inmunotinciones sin biotina, con anticuerpos y enzimas vinculados a cadenas polimricas.

Bisgaard K et al.: Polymeric conjugates for enhanced signal generation in enzyme immunoassay. Scandinavian Society for immunology, XXIVth Annual Meeting, Aarthus (Denmark), 1993 Shi S-R et al. Sensitivity and detection efficiency of a novel two-step detection system (PowerVision) for immunohistochemistry. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 7: 201, 1999

Adems, se empezaron a proyectar equipamientos para realizar las inmunotinciones contemporneamente en varias cortes histolgicas.

El progreso tecnolgico de las maquinas mecnicas puestas al servicio de la inmunohistoqumica permiti incrementar el numero de inmunotinciones y la velocidad de ejecucin de las reacciones con ahorro de tiempo.

A partir de esta etapa las investigaciones se dirigieron a examinar la presencia de los diferentes antgenos en distintas lesiones patolgicas: as comenz el uso diagnstico de las inmunotinciones, que representa el presente de la inmunohistoqumica.

Vimentina

CK

CD30

Actualmente, la mayora de las investigaciones cientficas se encaminan a ampliar el conocimiento del perfil inmunofenotpico de las diversas lesiones, o sea, a indagar la presencia, la distribucin y la ubicacin de los diferentes antgenos, con el objetivo de incrementar las posibilidades diagnsticas de la inmunohistoqumica y de la inmunocitoqumica.

Adems con el reconocimiento de que algunos marcadores pueden relacionarse con el comportamiento y la evolucin biolgica de una neoplasia empieza el uso pronstico de la inmunohistoqumica.

Ki67

p53

En los ltimos aos, con el desarrollo de las terapias antineoplsicas especificas con anticuerpos monoclonales, las inmunotinciones se utilizan tambin para determinar la respuesta a medicamentos especficos.
CD117

HER-2

sst-2R

ER

PgR

Timidilato sintasa

HER-2

mTOR

Paralelamente en los laboratorios de varias empresas bioqumicas se investigan y se producen anticuerpos monoclonales a partir de celulas plasmtica de conejo, que ofrecen una mejor afinidad con respecto a los obtenidos en el ratn.

!Yo pensaba estar tranquilo despus que pasaron a usar los monoclonales!!!

Adems, ya bastante desarrollado se presenta el estudio para la produccin de anticuerpos a travs de la tcnica de recombinacin gnica.
Raybould TJ, Takahashi M. Production of stable rabbit-mouse hybridomas that secrete rabbit mAb of defined specificity. Science 240: 1788, 1988. Breitling, F. and Dbel, S., Recombinant Antibodies, Wiley, New York, 1999.

Por lo tanto, la inmunohistoqumica, nacida solamente para fines cientficos, se transform rpidamente en una tcnica auxiliar para el diagnstico y el pronstico en Anatoma Patolgica. Actualmente, la inmunohistoqumica no debe considerarse como una tincin especial aplicada a muestras citolgicas e histolgicas, sino como un diagnstico de morfologa molecular que permite al diagnstico morfolgico tradicional llegar a ser ms completo.
Eugenio Leonardo

MORFOLOGIA MOLECOLARE
Principi generali e diagnostica sistematica.

El futuro de la morfologa molecular tiene diferentes y variados destinos. Por la parte tcnica desarrollo de sistemas para: - mejorar el desenmascaramiento del antgeno - realizar con rapidez las inmunotinciones - limitar los artefactos y las reacciones cruzadas

Por la parte cientfica las investigaciones se encaminan a: 1. comprender el significado de cada antgeno 2. entender la funcin del antgeno en las diversas cadenas bioqumicas celulares 3. encontrar anticuerpos para diferentes factores trascripcionales que habitualmente tienen una mayor especificidad diagnstica 4. construir anticuerpos dirigidos contra protenas quimricas, producida por efecto anomalas gnicas en celulas neoplsicas y luego utilizarlos en el diagnstico o en el pronstico 5. identificar nuevas molculas presentes en diferentes tipos de neoplasias que pueden convertirse en metas para terapias antineoplsicas especficas.