ESTANDA RIZACION DE LA TCNICA DE INM UNOP EROXIDASA PARA EL DIAGNOSTICO DE Clostridium chauvoei EN TEJIDOS DE COBAYO ( Cavia porcellus)

LEONARDO LADINO ALFARO

UNIV ERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE M EDICINA VETERINARIA BOGOT D.C. 2006

ESTANDA RIZACION DE LA TCNICA DE INM UNOP EROXIDASA PARA EL DIAGNOSTICO DE Clostridium chauvoei EN TEJIDOS DE COBAYO ( Cavia porcellus)

LEONARDO LADINO ALFARO Cdigo: 14972055

Trabajo de grado para optar al t tulo de Mdico Veterinario

DIRECTOR Dr . DIEGO ORTIZ ORT EGA, MV, M Sc. CODIRECTORES: Dr . RUBEN DARIO TORO ORTIZ, M VZ, M Sc. Dr . JORG E HUM BERTO OSSA ARISTIZABAL, MV, M Sc.

UNIV ERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE M EDICINA VETERINARIA BOGOT D.C. 2006

DIRECTIV OS UNIV ERSIDAD DE LA SALLE

RECTOR.

Hno. Fabio Gallego A.

VICE- RECTOR.

Hno. Carlos Gm ez R.

VICE- RECTOR DE PROM OCIN Y DESARROLLO HUM ANO

Hno. Edgar Figueroa A.

VICE- RECTOR ADMINISTRATIV O

Hno. M auricio Fernndez F.

DECANO DE LA FACULTAD

Dr. Pedro Pablo Martnez M.

SECRETARIA ACADEMICA

Dra. Maria Teresa Uribe M .

DIRECTOR CLNICA V ETERINARIA

Dr. Humberto Vsquez R.

NOTA DE ACEPTACIN

_________________________________ Director. Dr. Diego Ortiz Ortega. M.V. M Sc.

_________________________________ Jurado. Dra. Iovana Castellanos. Esp.

_________________________________ Jurado. Dr. Rafael Neira. M Sc.

_________________________________ Secretaria Acadm ica. Dr a. Maria Teresa Uribe Mallarino.

COM PROM ISO

Los tr abajos de grado no deben contener ideas que sean c ontr arias a la doc trina de la iglesia catlica en asuntos de dogma y moral. Ni la univ ersidad, ni el ases or, ni el jurado c alificador son res ponsables de las ideas expues tas por el graduado.

AGRADECIMIENTOS

El autor expr es a sus agradec imientos a: Doc tor Diego Ortiz Ortega por su apoyo y c olaborac in y ayuda pers onal dur ante el des arrollo de la tes is. Doc tor Rubn Dar o Tor o por su confianz a, contina dedicac in e inc esante apoyo a lo largo del pr oyecto, por brindarnos conocimientos, s u amistad y su experiencia en el labor ator io. Doc tor Jorge Ossa Aris tiz abal por s u colabor acin y apoy o brindado a par tir de s us c onocimientos y experiencia personal. Doc tor a Fr ancy Janneth Montoy a por s u pac ienc ia, dedicac in, caris ma, amistad y ex traor dinaria as istenc ia en el laboratorio. Doc tor Juan Fer nando Gallego y todo el personal de CO RPOICA- CEISA quienes nos c olabor aron con s u trabajo y conocimiento. La Univers id ad de La Salle por per mitir el desarr ollo de este proy ecto y por su apoyo fin anciero. La empresa Colombiana de Productos Veterinarios VECOL S.A. por su apoyo financ iero y tcnico.

DEDICATORIA

A mis padres por s u amor, apoyo, paciencia, y por brindar me s iempr e lo mejor de ellos durante todo este tiempo, a mis her manos Camilo y Fabi n por su apoyo y respaldo en todo momento, a mis familiar es especialmente a mi ta Mar ia Sofa por su gr an apoyo y ay uda que s on muy importantes en mi vida y a mis amigos por estar s iempr e c onmigo. Leonar do Ladino Alfaro.

TABLA DE CONTENIDO Pg. INTRODUCCIN 1. 1.1. 1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.6. 1.2.7. 1.2.8. 1.2.8.1. 1.2.8.2. 1.2.9. 1.2.9.1. 1.2.9.2. 1.2.10. 1.2.10.1. 1.2.10.2. 1.2.10.3. 1.2.11. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.6.1. MARCO TERICO MORFOLOGA ESTRUCTURA BA CTERIA GRAMPOSITIVA Sntesis del peptidoglicano Pared bacteriana Pr otoplastos Espacio per iplsmico Membr ana citoplas mtic a Mesosomas Citoplas ma bacteriano Inclusiones bacterianas Grnulos de polis acridos Genoma bacteriano Elementos externos Flagelos Cps ula y capa mucosa Endosporas Estr uctur a de las endosporas For macin de la endospora Ger minacin del esporo Metabolismo bacteriano CRECIMIENTO PRO PIEDA DES BIOQ UIMICAS RESISTENCIA Clostridium chauvoei Tox inas de clos tridium chauvoei 19 24 24 28 29 31 31 32 34 34 35 35 35 36 36 39 40 41 42 43 45 47 47 48 49 49

1.6.1.1. 1.6.1.2. 1.6.1.3. 1.6.1.4. 1.7. 1.7.1. 1.7.2. 1.8. 1.9. 1.10. 1.11. 1.12. 1.13. 1.14. 1.15. 1.15.1. 1.15.2. 1.15.2.1. 1.15.2.2. 1.15.2.3. 1.15.2.4. 1.15.2.5. 1.15.2.6. 1.15.2.7. 1.15.2.8. 1.15.2.9. 1.15.2.10. 1.15.2.11. 1.15.2.12. 1.15.2.13. 1.15.2.14.

Tox ina alfa Tox ina beta Tox ina gamma Tox ina delta ECOLOGIA Res erv orio Epidemiologa PATOG ENIA HALLAZGOS CLINICOS HALLAZGOS DE NECROPSIA HISTOPATOLOGIA DIAGNOSTICO DE LABORA TORIO DIAGNOSTICO DIFERENCIAL TRA TAMIENTO Y PREV ENCI N INMUNOPEROXIDASA INDIRECTA Historia Bases inmunohistoqumicas Anticuer pos Inmunoglobulinas Inmunoglobulina G Inmunoglobulina M Anticuer pos Policlonales Anticuer pos Monoclonales Afinidad de anticuerpos Reactiv idad cr uzada de antic uer pos Tas a de reacc in de antic uerpos Estabilidad de anticuerpos Manejo de anticuer pos Inmunohistoqumica Tc nicas inmunohistoqumic as Marcadores vis uales

49 50 50 51 52 52 52 54 57 57 58 58 59 60 61 61 61 62 62 63 64 65 66 67 70 70 71 73 74 75 75

1.15.2.15. 2. 2.1. 2.2. 2.3 3. 3.1. 3.2. 3.3. 4. 5.

Mtodos inmunohistoqumic os MATERIALES Y METODOS A NIMALES MATERIALES PROTOCOLO TCNICA INMUNO PEROXIDASA RESULTADOS HISTOPATOLOGIA OBSERVA CIO N CON LA PRUEBA DE INMUNOPEROXIDA SA INDIRECTA DISCUS ION CONCL USIONES Y RECOMENDA CIO NES BIBLIOG RA FIA A NEXOS

76 78 78 79 81 84 86 88 95 97 99 103

OBSERVA CIO N MACROSCOPICA DE LESIONES 84

LISTA DE TABLAS Pg. TABLA 1. Las espec ies de Clostridium que ms afectan al ganado. 21 TABLA 2. Toxinas produc idas por el genero clostr idium. TABLA 3. Carac ter sticas de las exotox inas y de las endotox inas de las bac ter ias patgenas. TABLA 4. Resultados estads ticos de la calificacin de lesiones his topatolgic as en tejidos de cobayo Cavia porcellus inoculados con c epa patgena de Cl ostridi um c hauvoei. 86 22 46

LISTA DE FIGURAS

Pg. FIGURA 1 Morfologa de la bacteria gr ampos itiva. FIGURA 2 Estr uctura del peptidoglicano. FIGURA 3 Estr uctura de la pared bacteriana. FIGURA 4 Membrana c itoplas mtica de la bac ter ia grampositiv a. FIGURA 5 Funciones de los principales componentes de la clula. FIGURA 6 Estr uctura del flagelo de la bacteria gr ampos itiva. FIGURA 7 Acc in de los antibiticos sobr e las bac ter ias. FIGURA 8 Dibujo esquemtico de la for macin de es poras bacter ianas. FIGURA 9 Inmunoper oxidas a indirecta. FIGURA 10 Les iones en c obay o Cavi a Porcellus a las 18 horas de inoc ula dos con Cl ostridi um c hauvoei. FIGURA 11 Msculo estriado esqueltic o de cobayo Cavia porc ellus inoculado c on Cl. chauvoei a las 18 horas. 88 85 44 77 26 27 30 33 36 38 40

FIGURA 12 Msculo estriado esqueltic o de cobayo Cavia porc ellus. 89

FIGURA 13 Obs ervacin de las plac as de tejido musc ular es queltico de c obayo Cavia porcellus. 90

FIGURA 14 Colorac in con la tc nic a de in munoperox idasa en msculo estriado esqueltic o de c obay o Cavi a porc ellus. FIGURA 15 Tejidos de los cobay os inoc ula dos con difer entes c epas de Clos tridium. FIGURA 16 Tejidos coloreados c on la tcnica de Inmunoper ox idas a Indir ecta. 94 93 92

LISTA DE ANEX OS

Pg. ANEX O 1. Preparac in de soluc iones 103

RESUM EN

En el pres ente trabajo de inv estigacin se estandar iz una tc nica de inmunoperox idas a evaluando los tejidos de cobayos inoc ulados exper imentalmente con cepa patgena de Cl ostridium chauvoei. Dur ante el desarr ollo del proy ecto y con el objeto de demostrar la es pec ific idad de la tc nica se procedi a infec tar grupos de cobay os con cepas de C. chauvoei, C. septicum, C. novyi y C. s ordelli, que fueron sacr ificados 18 hor as pos t-inoculacin, siguiendo las nor mas de biotica de la legislac i n colombiana. Se realiz la necr opsia de los cobay os, se tomar on las corres pondientes mues tras de tejid o y se fijaron en for mol buferado al 10%. La identificacin del C. c hauvoei se realiz con el anticuerpo monoc lonal ( Cchex 1) . Como resultado el anticuerpo monoclonal ( Cchex 1) rec onoce el C. chauvoei en msculo estr iado esqueltic o y no reconoce ninguna otra cepa. Eso demuestr a que la prueba es altamente confiable y especfica y abr e la posibilidad de des arr ollar un mtodo diagnstic o, r pido y ex acto para el c arbn s in tomtic o en bovinos .

ABSTRACT

In the pr esent r es earc h a standar dized immunoper oxidase test w as evaluated us ing a guinea pigs tissue assay obtained from experimentally infected indiv iduals w ith a pathogenic str ain of Clostridi um chauvoei. Tec hniques specif ic ity w as als o deter minated in tissues of infected guinea pigs w ith Clos tridium s epticum, Clos tridium Novyi and Clostridium s or dellii strains and killed at 18 hours pos t infection follow ing bioethical proc edur es. Necr opsy w as carried out and tissues w ere placed in a 10% buffered formalin solution. The monoc lonal antibody Cchex1 w as used like primary antibody in the standar diz ed inmunoperoxidas e test employ in g skeletal muscle tissue, demonstrating no cr oss-r eac tivity w ith others Clostr idia used in this ass ay. Bes ides of observ ing peroxidase labelled C. chauvoei, the histopathology slides also s how ed typical injur ed tiss ues, which allow ed improving the disease diagnosis. The standardiz ed guinea pigs test demonstrated to be a r eliable and faster diagnosis appr oach for likely detec tion of black leg dis ease in cattle.

INTRODUCCION

Las enfer medades infecc iosas c aus adas por bacter ias son fenmenos que c ompr enden factor es biolgicos y se diferencian de otras enfermedades por s er pr ovoc adas por agentes vivos c aracterizados por su contagiosidad, exis tenc ia de un perodo de latencia y reacciones espec ficas del or ganis mo ante el agente etiolgico. Para que el pr oc eso infecc ioso tenga lugar y ev olucione, se r equier e de la pres encia de un microorganis mo patgeno, su intr oducc in en un animal susceptible y deter minadas car acter s tic as del medio en el que tiene lugar la inter accin (Cedeo, 1996) . Se s abe de la importancia clnica de las bacter ias anaerobias

par ticular mente de los Clostr idium histotx icos, como por ejemplo Clostri dium chauvoei; s in embar go, el conocimiento de estas bacterias y el papel que juegan en humanos y animales es bien limitado. Exis ten muchas es pecies de este gner o y gran nmero de ellas s on patgenas par a el hombr e y animales . Las bacterias del gner o Clostri dium s e caracterizan por s er anaerobias estr ictas. Par a sobr eviv ir en el medio ambiente tienen que protegerse del ox geno, y lo hacen esporulando; dur ante v arios aos . El objetiv o del pr esente tr abajo de inv estigac in fue la evaluac i n his topatolgic a mediante la tcnica de inmunoper oxidasa en tejidos de cobay o inoc ulados ex per imentalmente con c epa patgena de C. chauvoei, utilizando como anticuerpo primario el antic uer po monoclonal Cchex 1 especific o par a C. chauvoei. de es ta manera pueden sobrevivir

El car bn sintomtico es una enfermedad mundial. En Colombia es importante en todos los pisos tr mic os; por lo tanto es prior itario inv estigar s obr e su agente c aus al, par a establecer estr ategias de identificac in espec fic a y determinar planes efectivos de v acunacin. La liter atur a reporta tr atamiento c on penic ilinas pero no r egistra gran efectividad, el c ontrol se realiz a por medio de vacunacin anual que proporciona pr otecc in antitxica y antibacteriana. Este tr abajo se realiz en el Centro de Investigacin en P oduccin y r Salud Animal ( CEISA) de la Corporacin Colombiana de Inves tigac in Agropecuaria (CORPO ICA) , el anlisis estadstico, los protoc olos y las fotograf as us adas en este tr abajo de investigacin, son de autor a del Doc tor Diego Ortiz Ortega y Doctor Rubn Dar o Toro Ortiz; con apoy o de la Univ ersidad De La Salle y de la Empresa Colombiana de Productos Veterinarios (VECOL S.A.).

1. M ARCO TEORICO

Los clostr idios s on bacilos grampositiv os, es por genos, gener almente mviles y anaerobios ; las especies patgenas pr oduc en una o ms exotox inas que explican s u patogenicidad; existen dos gr upos: uno de ellos, que inc luye las especies C. botulinum y C. tetani, no es inv asor y coloniz a a individuos de for ma muy limitada, y pr oduc e enfermedades idnticas en personas y animales . Los representantes del s egundo, gr upo de la gangr ena gas eosa , se dis eminan a par tir de la puerta de entr ada de la infeccin y produc en manif estaciones loc ales y sistmicas. Las enfermedades impor tantes de los animales , atr ibuibles a los clostr idios de este grupo s on las enter otoxemias, las cuales, con pocas exc epciones, tienen importanc ia sec undaria en medicina humana. En los animales se pres entan infecc iones de her idas por clostridios, que s e par ecen a la gangrena gaseos a del hombr e, de las apr oximadamente 80 es pecies de Clostri dium, tal vez 10 de ellas tienen importancia en medicina veter inar ia. Los c lostr idios s e pueden clas ificar o agrupar de ac uer do al tipo de enfermedad que oc asionan en los animales y el hombre en: Enterotoxem ias (Afecciones que se loc aliz an princ ipalmente en el sistema digestiv o), estn generalmente asoc iadas a los C. perfringens, aunque algunas veces C. septicum caus a infeccin gstr ica en las ovejas. Esta incluye la dis entera de los c order os y la enfer medad de r in pulpos o en ovejas ( Gyles and Thoen, 1993). Infecciones tisulares (Afectan distintos tejidos), las cuales c aus an una gran v ariedad de s ndromes en animales domsticos , agrupados bajo el nombr e de Carbones, los que incluy en la gangr ena gaseosa (mionecrosis con evolucin de gas y toxemia), la pierna negra y edema maligno en div ers as especies animales, particular mente afectando a los bovinos.

Las es pec ies de clostridios gener almente inv olucr adas s on C. chauvoei, C. septicum, C. novyi, C. haemolityc um y C. sor dellii. Generalmente las bac ter ias que pueden s er habitantes nor males de los tejidos o introducidas de modo tr aumtico, se multiplican y producen tox inas en el tejido tr aumatizado, las cuales crean una lesin loc al y son abs or bidas al torr ente sanguneo causando tox emia ( Gy les , 1986, c itado por Ortiz y Benav ides, 2002) . Ne urotoxicosis (Afectan las func iones nerviosas), causan lesiones originadas en el organis mo por las neur otox inas pr oducidas por C. tetani y C. botulinum (Quinn and Mar key, 2003). Estas toxinas pueden ingerirs e prefor madas como oc urr e en la mayora de los cas os de botulis mo ( Hathew ay, 1988, citado por Ortiz y Benavides, 2002) ser el res ultado del cr ecimiento de las bacter ias en alguna par te del cuer po, tal como ocurre en el c aso del ttano ( Bizzini, 1986, citado por Ortiz y Benavides, 2002). Se cree que la(s) toxina(s), en especial la toxina alfa necr osante, per o pos iblemente tambin el factor de edema, la hialur onidasa (gamma), la ADN- asa (beta), la hemolisina oxigeno- l bil ( delta) y la neuranimidasa, son res pons ables de las lesiones iniciales. Es posible que contr ibuy a a producirlas el metabolis mo bac ter iano, que produce gas por fer mentacin. Las toxinas necrotiz antes provoc an la muerte mas iva del tejido y son par ticular mente importantes en las mios itis ( pier na negr a y edema maligno) ( Quinn and Markey, 2003). Las tox inas letales tienen una gran capacidad par a destruir las clulas, lo cual se demuestra al inocular animales de laboratorio, prov ocando la muerte en tan solo unas pocas horas (Smith & Holdeman, 1968).

Tabla 1. Especies de Clos tridium que ms afectan al ganado Germ en C. Septicum C. Chauvoei C. Sordellii C. Novyi C. haem olitycum Enferm edad que produce Edema maligno Pier na negra Mios it is necrtica Hepatitis y miositis necr ticas Hepatitis, hemoglobinuria Enterotox emia necr tic a. y mios itis mios it is y

C. perfringens

Fuente. (www .saludanimal.com).

Todas las espec ies de c los tridios producen una serie de toxinas que causan severas les iones en los tejid os, estas toxinas prov oc an una rpida muerte c elular masiva, dando como resultado, lesiones necrticas extens as que provoc an la muerte del animal en for ma aguda. Las tox inas producidas y s us efectos s e muestran en el siguie nte c uadro:

Tabla 2. Toxinas producidas por el gner o Clostri dium TOXINA C. C. GERM EN C. sordellii +++ +++ ? ? C. novyi +++ +++ + +++ C. per fringens +++ +++ + +++ +++ +++

septicum chauvoei Letal Necrotizante Hialur onidasa Lec itinasa +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ -

Des ox irribonucleasa +++ Colagenas a -

Fuente. Biberstein, 1994. Las lec itinasas destr uyen las membranas c elulares de cualquier clula por donde van pasando, prov ocando la muerte. Esto es partic ular mente importante en el tejido nervios o. Las hialur onidas as destruyen el cemento intercelular, despegando a las clulas unas de otras , permitiendo la difusin de los gr menes y sus tox inas. Las toxinas desoxiribonuc les as, destr uyen el ADN, matando las c lulas. La c olagenas a destruy e el colgeno, que da forma y sostn a los tejidos, alter ando la morfologa del msc ulo y favoreciendo tambin la difusin de gr menes y toxinas. Clnicamente, ex iste fiebre, anor exia y abatimiento. Es nor mal que ex ista cojera. Las lesiones superficiales pr oduc en tumefacc iones evidentes, que crepit an al manipular las. Algunos animales muer en de for ma sbita, mientr as que otros muer en en un plaz o de 1-2 das.

En los bvidos , la enfer medad probablemente vay a pr ecedida de la infecc in de los tejidos, es pec ialmente de los msculos esqueltic os, con espor as proc edentes del intestino. Los factor es que favorec en la ger minac in de las espor as, la multiplic acin de las bacterias y la produccin de toxinas, prov oc an lesiones que s e car acteriz an por edema, hemorr agia, y necr osis de las miofibr ill as. La parte central de las lesiones se sec a, s e oscur ec e y se convierte en enfisematosa como c onsec uencia de la fermentac in bacter iana, mientr as que su periferia es edematosa y hemorr gica. Microscpic amente, se encuentran cambios degenerativos en las fibras muscular es rotas por el edema, enfisema y hemorragia. La infiltrac in de leucocitos es poc o importante (www .saludanimal.c om) . Las enfer medades pr oducidas por bacterias del gnero Clostri dium ocasionan un sin nmero de muer tes de bovinos y ov in os generando grandes pr didas a los produc tor es rur ales de diferentes partes del mundo. Las enfer medades ms impor tantes y s us agentes s on las siguie ntes: C. chauvoei: Gangr ena enfis ematos a ( pier na negr a) en ovinos y bovinos. C. botulinum: Botulismo en difer entes especies de animales y el hombre C. t etani: Ttanos en diferentes especies animales y el hombre C. novyi tipo A: Cabez a gr ande en carner os. Gangr ena gaseosa en ovinos C. novyi tipo B: Hepatitis necr tica (enfermedad negr a) en ovinos C. novyi tipo C: Osteomielitis del bfalo domstic o. C. novyi tipo D ( C. haemolitycum): Hemoglobinur ia bac ilar en bovinos C. septicum: Gangrena gas eos a (edema maligno) en bovinos, ovinos, cerdos y ocasionalmente otr as es pec ies, infeccin del abomaso en ovinos. (Smith, B. 2002) C. perfringens tipo A: Celulitis anaerbica y gangr ena gaseosa en humanos . C. perfringens tipo B: Disentera de los cor deros .

C. perfringens tipo C: Enterotox emia hemorr gic a en terneros, potros y corder os. C. perfringens tipo D: Enfer medad del rin pulposo en cor der os, cabras y ter neros . C. perfringens tipo E: Patogenicidad en ovejas y v ac as poc o conoc id a (Biberstein 1994) . 1.1 MORFOLOGIA Los clostridios miden de 0,2 a 0,4 micr as (m) de ancho por 20 m de lar go, son formas bac ilar es, mviles relativ amente grandes segn la espec ie; pueden obs erv arse, rectos, curvos, delgados , con ex tremos 1994) . No todos los c lostr idios son intensamente romos , redondos, afilados y en oc asiones hasta en espir ales o enrollados (Biberstein, grampositivos, los mviles poseen flagelos per itr ic os. De las es pecies patgenas, nic amente C. perfringens posee cpsula. Los clostr idios patgenos s e pueden pres entar en for ma ais lada, en c adenas c ortas o como filamentos lar gos y las endos por as pueden tener posicin c entral, subter minal o ter minal ( Finegold, 1989). 1.2 ESTRUCTURA BACTERIA GRAMPOSITIVA En el gnero Clostr idium se pueden comparar los diferentes mecanis mos de los que disponen es tas bac ter ias patgenas como son: la presencia de substancias en sus c ubiertas c elulares (c ps ula o par ed celular) que dific ultan la actividad de las c lulas fagoc ticas pr otectoras del animal o bien, que despus de s er fagocitados les c onfier en res istencia a ser degradados, la pres enc ia de toda clas e de adhesinas como fimbrias o compuestos de sus par edes celular es como los c idos lipoteicoicos , la pres encia de endotox inas pr opias de bacter ias Gr am negativas o la excrec in de exotox inas tanto por bacterias Gram positivas c omo Gr am negativas , la excrec in de enzimas ex trac elulares, entr e otros , que les

per mitir n invadir y establec erse por or ganotr opismo en las princ ipales espec ies animales , prov ocndoles cuadr os clnicos de difer ente naturalez a y la mayora de las vec es causndoles la muerte; afectando la produccin pecuaria nacional (www.mis ionr g.c om). Las bacter ias se dividen en dos gr andes gr upos s egn el color c on que se tian por el mtodo de Gr am: grampositivas (tien de color azul-v ioleta) y gramnegativas (adquieren un c olor de r os a a r ojo). Esta difer ente respuesta de las bacterias a la tincin de Gr am radic a en la naturalez a de la par ed celular (Vadillo, et al. 2003). La pared c elular bacteriana es una estr uctura que rodea a la c lula como si fuer a una bolsa membranosa. Con excepcin de las bacterias inc luidas en el orden Mollicutes ( mic oplasmas) y algunas arqueobacterias, la mayor a de las bacterias poseen una pared fuerte la cual les da r igidez y for ma, con lo cual evitan su lis is osmtic a. La par ed c elular de la bacteria grampositiva es de una sola c apa y es muc ho ms anc ha que la de una gramnegativa. La pared s e separa de la membrana citoplsmica por el espac io peripls mic o ( Fig. 1).

Figura 1. Morfologa de la bac ter ia grampositiv a

Fuente. V adillo, 2003. Aunque existen diferenc ias gr amnegativas entr e las y las par edes de las bacterias

grampositivas,

denominadas

cido-alc ohol

resistentes, todas ellas poseen un c omponente c omn el cual forma el verdader o es queleto de la pared celular (r esponsable de la rigidez y, por tanto, de la forma), denominado peptidoglicano o tambin gluc opptido, murena, muc opptido o mucocomplejo de Park. Sus c omponentes son dos aminoaz car es situados de for ma alternativa y unidos por enlaces beta ( 1,4): la n-ac etil-glucos amina ( NA G) y el cido n-ac etil- muramic o ( NA M) (Fig. 2).

Figura 2. Estr uctura del peptidoglic ano

Fuente. V adillo, 2003. Cada cadena de NA M y NAG permanece unida a las adyacentes mediante un tetr apptid o, que s e une por su aminoc ido inicial, generalmente la L-alanina, al grupo c arbox lico del NA M. La sec uencia de aminocidos en las gr ampositivas es L-alanina ( L-Ala)- acido D -glutmic o (D-Glu)- L- lisina (L-Lys)- D- alanina (D -Ala). La unin de es tos aminoc idos se llev a a cabo por un pentapptido de glicina ( Gly), que en el ltimo aminocido de un tetr apptido ( D-A la) con el penltimo aminoc ido del tetr apptido suby acente (L- Lys).

1.2.1 Sntesi s del peptidoglicano La s ntes is del peptidoglicano se div ide en distintas fases que suceden en difer entes lugar es anatmicos de las bacter ias . El proc eso comienz a en el citoplas ma c on la c onv ers in de la fruc tos a 6-fosfato en gluc osamina 6fosfato; a esta se le une una molcula de acetato y s e tr ansfor ma en una molc ula de 6-fosfato de N -ac etil- gluc os amina ( NA G) . A partir de la NA G y del trifosfato de ur idina (UTP) , se for ma el complejo difosfato de uridina ( UDP)- NA G. Este complejo se transfor ma, pos ter iormente, en UDP-N acetil- muramico ( NA M). A esta molc ula se le unen de forma sec uencial, los tr es pr imeros aminoc idos componentes de la cadena later al. Por ultimo, se unen dos
D -Ala

terminales par a formar el complejo UDP-N -

acetil- murmico-pentapptido. Una vez formado este c omplejo debe abandonar el citoplasma bacteriano (Vadillo, et al. 2003) . Para ello r ecurre a la molc ula trans portador a bac topr enol o undecapr enol (lpido for mado por onc e unid ades de isopr eno, con un total de 55 tomos de car bono) que se encuentra anc lada en la me mbrana c itoplas mtica. El nuevo complejo sirv e de cadena principal en la que suceden una serie de hec hos, el pr imero es la incorpor acin al c omplejo de una molcula del NA G que s e une al NAM por medio de enlac es glucos dicos ( 1,4). En el caso de las gr ampos itivas , se inc orpor a al pentapptido, for mando la cadena later al, otro pentapptido de glicina, or iginndos e una cadena de diez aminoc idos. El tr ansportador ( bactoprenol) lleva al c omplejo gluc opeptdico a un punto de crecimiento en la pared o punto terminal del peptidoglic ano. Ter minada su funcin el tr ansportador se regener a par a comenzar de nuev o el pr oc eso. Si es te no se pudier a r egenerar se detendr a la s ntesis de la par ed celular ya que c ar ece de transportador dis ponible para ac eptar nuev as unidades de NAM-NAG. Algunos antimicrobianos bloquean la s ntesis de la pared c elular al interferir con la molc ula trans por tadora; entre los cuales es tn: vancomic ina, la ristocetina y la bac itr acina. Una v ez que el c omplejo disacr ido s e

enc uentra en el extr emo del peptidoglic ano s e unir a otr os complejos dis acridos, mediante enlaces gluc os dicos (1,4) , formando una cadena. Las dis tintas c adenas se unen directamente a tr av s del pentapptido de glic ina que for ma par te del decapptido del NA M. Estos pasos finales de la formac in del peptidoglic ano estn catalizados por la accin de unas enzimas, con funcin trans peptidasa y carbox ipeptidasa, denominadas protenas fijador as de penic il inas (PB P). Las PB P son los pr inc ipales objetiv os de los antibiticos betalactmicos (penicilinas, cefalospor inas, etc). La liberacin del peptidoglicano durante la infecc in no influye

sustanc ialmente sobre el poder patgeno de la bacter ia . Los residuos de NA M de algunas bacterias estn o- acetil ados en el gr upo C- 6 hidroxilo. Estos res iduos son res istentes a la accin hidr olitca de la lisoz ima y las gluc osidasas pr oduc idas por las clulas fagoc itar as, lo que permite que estas bacter ias hagan frente a la lis is enz imtica. Los res iduos de NAM o-acetilados tienen la c apacidad de estimular la formacin de interleuc in a 1 en el hospedador (Vadillo, et al. 2003). 1.2.2 Pared bact eriana En las bacterias gr ampositivas el 90% de la pared esta c onstituida por el peptidoglic ano, el resto esta formado por otr os componentes como c idos teicoic os y c idos lipoteicoicos (Fig. 3). Las bacter ias gr ampos itivas pres entan a menudo polis acridos c idos unidos a la pared celular, denominados cidos teicoic os (Junqueira y Cor neir o, 1997) . Son c adenas de 30 fosfatos de glic er ol o r ibitol entrelazados por enlaces fosfodies tric os. Los gr upos alcohol de los cidos teic oicos es tn sustit uidos por azuc ar es, c olina o alanina, lo que hac e que estas molc ulas s ean muy antignicas. Los c idos teicoicos estn ubic ados en la per ed celular y se c omunican con el ambiente

externo. Algunos c idos que c ontienen glic erol estn unidos a los lpidos de la membr ana citoplasmtica ( llamados c idos lipoteic oicos), atr aviesan la par ed celular y se ponen en c ontacto con el exterior los c uales ac tan como determinantes antignic os en las bacterias. Figura 3. Estr uctura de la par ed bacteriana

Fuente. V adillo, 2003. Las pr inc ipales func iones de es tos c id os son: 1) fav or ecer la

superv ivencia de la bacter ia al actuar como adhesinas, 2) al producirse una sepsis (distr ibuc in de un gran numer o de bacter ias y s us productos por el torr ente s anguneo) , prov ocan en las clulas del hos pedador la liberac in de mediador es de la inflamacin, como monoc in as y citocinas; 3) regular la actividad de amilasas y gluc osidas as que par tic ipan en la sntes is de la pared celular c omo autolisinas; 4) influir en la competencia de algunas bacterias (c apacidad para admitir fragmentos de A DN exgeno); 5) resistir la lis is frente a las lisoz imas; 6)r egular el paso de

determinados iones ( magnesio) a trav s de la par ed c elular (Vadillo, et al. 2003). 1.2.3 Protoplast os Cuando las bac ter ias gr ampos itivas s on s ometidas a la accin de sustanc ias que destr uyen el peptidoglic ano, como la lisozima, que rompe las uniones (1,4) del NA M y la NA G, estas quedan despr ov istas de la par ed celular y s e c onv ierten en pr otoplastos, que pueden multiplicarse nor mal mente si se mantiene en medio isotnico, aunque no tengan pared celular . Los protoplas tos son os mticamente sensibles, en consecuenc ia captarn gran c antidad de agua, s e hincharn y ter minar por pr oduc irse la lisis celular . Solo la adicin de una concentr acin adecuada de soluto al medio, pr oduc ir un estado de equilibr io entre la c onc entracin de soluto en el exter ior y en el interior de la clula, lo que ev itar s u destr uccin. 1.2.4 Espacio periplsmico Se trata de un espacio ocupado por un gel, ms que por un lquido, que aparece c on mayor frec uencia en las bacter ias gr amnegativ as que en las grampositivas, debido a que aquellas poseen una presin os mtic a inter na menor. Est s ituado entr e la pared c elular y la me mbr ana citoplas mtic a, s u as pec to y contenido son var iables dependiendo del tipo de bacter ia y del es tado metablic o en que se enc uentre. Este es pacio se puede considerar el zagun del c itoplas ma bacter iano; en l, los precurs or es nutr icionales y biosinttic os, as como los antibiticos y otr as sus tanc ias tx icas s on pr ocesadas de alguna manera antes de ingr esar en el citoplasma (Vadillo, et al. 2003).

1.2.5 M embrana citoplasmtica Es una estructur a que rodea c ompletamente a la clula, esta membr ana vital es la barrera cr tica que separ a el interior de la clula de su medio ambiente ( Fig.4). Se conecta con la pared celu lar a tr avs del espacio per iplsmico, en ella se ubican r eceptor es y protenas relacionadas con el transporte tr ans membr ana (Junqueir a y Cor neir o, 1997) . Su contenido en protenas es del 60 - 70%, algo s uperior al que presentan las membr anas de clulas de los mamferos; pos ee, igualmente, lpidos (20- 30%) y pequeas c antidades de hidratos de c arbono ( 10%); si bien las proporciones de estos constituyentes varan ampliamente de unas bac ter ias a otras , los lpidos de la membr ana, al igual que oc urre en las clulas eucar io tas, son fosfolpidos . Los esfingolpidos solo se han enc ontr ado en algunas especies del gener o bacter oides. Molc ulas par ecidas a los esteroles, denominadas hopanoides s e encuentr an en cier tas bacter ias y es posible que desempeen un papel parecido a los esteroles de las me mbranas de los eucar iotas.

Figura 4. Membr ana citoplasmtica de la bac ter ia grampositiv a

Fuente. V adillo, 2003. Los hopanoides se sintetiz an a par tir de los mismos pr ecurs or es que los esteroides , probablemente estabilizan la membr ana bacter ia na. Con la ayuda del micr oscopio electrnico, s e aprecian dos lneas plidas separ adas por una zona ms osc ura. Esta estructura, que mide de 5 a 10 nm de gr osor, s e denomina me mbrana unitar ia, me mbr ana elemental o unidad de me mbrana. En ella los fosfolpidos se agr upan for mando una doble c apa, de tal manera que los gr upos hidr fobos de estos s e asoc ian entre s i por un lado, mientras que los gr upos hidrfilos se as oc ian por otr o. Las molculas de agua se congr egan alr ededor de la par te ex terna de la bic apa lipdic a (con los gr upos hidrfilos) . Adems , cationes como el Ca2+ y Mg2+ tambin contr ibuy en a estabil iz ar la me mbr ana a travs de las inter acciones inic as con los gr upos hidr filos pr esentes en los fosfolpidos. Tambin ex isten en la membrana citoplas mtica dos tipos de protenas: 1) las protenas per ifricas, que estn debidamente conectadas

a ella y pueden eliminarse fc ilmente, y que repres entan del 20 al 30% del total de las protenas de la membrana; 2) las pr otenas integr ales, que constituyen del 70 al 80%. Estas, al igual que los lpid os de membr ana, son anfiptic as; sus regiones hidrfobas estn inmersas en la fracc in lipdica, mientras que las porc iones hidr filas s obr es alen de la superficie de la me mbrana, algunas atr aviesan toda la bicapa li pdica. A menudo, exis ten hidratos de c ar bono unidos a la s uperfic ie externa de las pr otenas de la membrana citoplas mtic a (V adillo, et al. 2003). 1.2.6 M esosoma s Son inv aginaciones de la membrana citoplasmtica, algunos son de tipo vesicular , mientras que otr os son de tipo concntric o, for mados por tor bellinos laminar es que incluso pueden tener for ma de tbulos. Aparec en tanto en las bac terias grampositiv as c omo gramnegativas. Los mesosomas situados en el s epto o tabique que divide a las bacterias intervienen durante la divisin en la for macin de la par ed c elular y en la replicac in del A DN. Pueden tener funciones s ecretor as, y en este s entido hay que sealar la c apacidad que tienen de sintetizar exoenzimas del tipo de las - lactamas as (V adillo, et al. 2003). 1.2.7 Citoplasma ba cteriano Es la s ustancia englobada por la me mbrana citoplasmtic a. Contiene una solucin acuosa de sales (casi el 70% de la masa bacter ina es agua), hidr atos de car bono, aminoc id os, vitaminas , c oenz imas y una amplia variedad de otr as sustanc ias solubles. Contiene, adems de los mesos omas y el genoma bac ter iano, los ribosomas y las inclus iones. No pos ee ni mitoc ondr ias ni cloroplastos.

1.2.8 Inclus iones bact erianas 1.2.8.1 Grnul os de polisac ridos Estn for mados por gluc geno o almidn, pueden demostrarse al tr atar la clula con y odo. Los gr nulos de gluc geno, al impregnar los con y odo, aparecen de color marrn rojiz o y los de almidn de color az ul. Son materiales de r eserv a de las bac ter ias. En los c lostr idios se ha descrito una sustancia parec ida al almidn denominada gr anulosa o y geno. 1.2.8.2 Genoma bacteriano El material gentico esta constit uido por ac ido desox irribonucleico (ADN), el c ual dir ige la bios ntesis de todo el material de la bacter ia. Este A DN tambin s e llama genforo, cr omosoma bac ter iano o nucleoide ( Fig.5).

Figura 5. Func iones de los pr incipales c omponentes de la clula

Fuente. Junqueir a y Corneiro, 1997. 1.2.9 Elementos ext ernos 1.2.9.1 Fl agelos Muchas bac terias son mviles y esta capacidad de desplazarse por s i mis mas s e debe habitualmente a la pres encia de unos r ganos espec iales: los flagelos (del latn flagellum: ltigo). Son apndices largos (3-20 m) y delgados (120-250 A o) , libres por un extremo y unidos a la clula por otro. En el flagelo se pueden distinguir tres partes: una estr uctura basal o corpsculo bas al (ubicado en la par ed celular y me mbr ana c itoplas mtic a), el gancho ( un s egmento curv ado y corto que une el filamento al cor psculo basal) y el filamento, situado fuer a de la clula ( Fig.6) .

Las bacter ias gr amnegativas tie nen un cor psculo bas al constituido por cuatro anillos. El par externo de anillos est asoc iado c on el lipopolisac rido (anillo L) y el peptid oglic ano ( anillo P). El par interno esta loc aliz ado en la me mbr ana citoplas mtica (anillos S y M) (Vadil lo, et al. 2003). Las bacter ias gr ampos itiv as, al no pos eer la capa de lipopolisacrido, nic amente presentan los anillos S y M. Se sabe que el flagelo es una estr uctura semirr gida que no se flex iona, s ino que se mueve por rotacin, como una hlice. El mov imiento de rotac in del flagelo esta prov oc ado por el c orpsc ulo basal, que acta como un motor . Alr ededor del par de anillos internos, y ancladas en la membr ana c itoplas mtica, ex iste un par de pr otenas denominadas Mot. Estas gobier nan el motor flagelar, prov oc ando la r otacin del filamento. Junto a ellas se enc uentra un conjunto de protenas denominadas Fli, que actan c omo un c onmutador del motor, invirtiendo la r otacin del fla gelo en r espuesta a s eales intracelulares . El filamento del flagelo esta c ons tituido por subunidades de una pr otena denominada Flagelina. El ganc ho, liger amente ms ancho que el filamento, est for mado por subunidades de pr otenas dif erentes. El filamento es un c ilindro rgido y huec o. El flagelo no crec e sobr e la base, como lo hace el pelo de un animal, s ino por la punta. La flagelina formada en la clula bacteriana se tr aslada a tr av s del hueco del cilindro y se agr ega al extremo ter minal. La sntesis de un fla gelo a partir de las molc ulas de flagelina recibe el nombre de autoens amblaje. A lgunas bac ter ias tienen una vaina rodeando los flagelos, esta s ntesis del flagelo bac ter iano puede ser inhibida por s ustanc ias como el clor am enic ol y la f fluor ofenilalanina (Junqueir a y Corneiro, 1997). La dispos icin de los flagelos permite clas ificar las bac ter ias en: tricas (sin flagelos) , montricas ( pos een un flagelo en un ex tremo), anftricas

(presentan uno o mas flagelos en ambos extremos) y per tric as ( mues tran flagelos en toda la superficie c elular) ( Hamilton and Chandler, 1975). Figura 6. Estr uctura del flagelo de la bac ter ia grampositiv a

Fuente. V adillo, 2003. Antignic amente, la flagelina es diferente de otr os componentes

bac ter ianos. A es ta pr otena s e le conoce como antgeno H (del alemn Hauch, pelcula delgada). Induce la for macin de anticuerpos especficos que per miten la s erotipificac in de una bacteria mvil (Vadillo, et al. 2003).

1.2.9.2 Cps ula y capa mucos a Algunas bacterias estn r odeadas por una sustancia viscosa que for ma una c ubierta o env oltura alrededor de la c lula. Cuando el mater ial esta dis pues to de un modo compacto alrededor de la superficie celular se denomina cpsula, mientras que s i es laxo, de modo que for ma una c apa difusa, se denomina capa mucos a o s lime. Estn for madas por polis acridos, polipptidos o c omplejos de

polisac r idos y protenas, s i bien la c ompos icin es caracterstica de cada especie bacteriana. Habitualmente contienen potentes antigenos, confir iendo a la bacter ia propiedades inmunolgicas muy definidas ; de ah que al antgeno capsular se le denomine antgeno K. A pes ar que la pres encia de la cps ula no siempr e esta relac ionada con la capac idad de la bacteria para agr edir al hospedador ( Junqueira y Corneiro, 1997) . No exis te duda que esta estructur a confier e a las bac ter ias patgenas protecc in c ontra la fagoc itos is, tambin impide la fijac in de bac ter ifagos a la c lula bacter iana y dific ulta el pas o de los

antimicrobianos al inter ior de esta (Vadillo, et al. 2003) (fig.7).

Figura 7. Accin de los antibiticos sobr e las bacter ias

Fuente. Junqueir a y Corneiro, 1997. 1.2.10 Endosporas Cuando las bacterias s e encuentr an en ambientes advers os, son c apaces de transformars e en clulas es peciales de alta resistenc ia, llamadas endospor as o espor os. Estas for mas soportan los efec tos bacter ic idas del calor, falta de agua, r adiaciones , congelacin y c ier tos qumicos txicos como los des infectantes. Pueden permanecer en estado latente dur ante lar gos per iodos de tiempo y se encuentran nor mal mente en el s uelo (Junqueir a y Corneiro, 1997).

Des de el punto de vista clnic o hay dos gner os bac ter ianos pr oductores de endos por as: Cl ostridi um y Bacillus, los dos contienen es pecies patgenas para animales y humanos . Algunas infecciones s olo s e originan cuando los es por os de estas bacter ias se intr oducen en un lugar donde puedan germinar , por ejemplo, una herida. 1.2.10.1 Estr uctura de l as endospor as La estruc tura de los es por os s e puede obs erv ar a tr avs del micr osc opio electr nic o, su as pecto es muy difer ente al de las for mas v egetativ as, ya que es tn rodeadas por var ias capas grues as que les per miten res istir las inc lemenc ias ambientales. El citoplasma del esporo se denomina parte inter na o nc leo, c ontiene una copia del cromos oma, carec e de ARNm, tiene poc o ARNt y pos ee algunas enz imas. Los aminocidos se almac enan como pr otenas citoplas mticas de bajo peso molecular y se llaman pr otenas pequeas solubles en cido ( SASP) . Algunas SASP contr ibuyen a incr ementar la c apacidad de la endos por a par a resistir las radiaciones ultr av ioleta y, quiz el calor, ya que aumentan de for ma estable la actividad negativ a de la super hlice del cr omosoma. No se pr esenta actividad metablica continua en el espor o maduro y la energa se almac ena c omo 3-fosfoglicerato, sustancia ms estable que el ATP. Tambin c ontiene cido dipic olnico, que se combina con iones calc io par a for mar dipic olinato clcico; este supone el 15% del peso seco del es poro, y hasta ahor a s e pensaba que er a el r espons able direc to de la resistenc ia al calor por par te de la endospor a, per o r ecientemente se han ais lado mutantes termores istentes que carec en de esta sustancia. El nc leo se enc uentr a parcialmente deshidratado, pos ee del 10 al 30% del contenido de agua de la clula vegetativ a (V adillo , et al. 2003). Esta des hidr atacin incrementa la termor esistenc ia de la endospora, le confier e resistencia a diversos pr oductos qumicos e inac tiv a enzimas del

nc leo. El pH de la parte inter na es apr oximadamente una unidad inferior al de la clula vegetativa. El ncleo del esporo se encuentr a rodeado, primer o, por una membr ana citoplas mtica y una delgada pared celular, y des pus por una capa concntric a llamada c orteza o c rtex. La cor teza esta constituid a por peptidoglicano modificado y contiene c id o dipicolnico, generalmente en for ma de dipic olinato clcico. Rodeando a la corteza apar ece la cubierta del esporo compuesta por var ias capas de protenas. La capa ms ex ter na, el exospor iu m, es una delgada cubierta de naturaleza proteic a. Los es por os pueden estar s ituados en el centr o, c erca de un extremo (subter minal) o netamente en el extr emo (terminal) . El esporo posee capac idad in mungena, y algunos de sus antigenos s on diferentes a los de la clula v egetativ a, per o es pec ficos y c omunes a todas las biov ariedades de la mis ma espec ie. Dada la alta res istencia de las endos por as a las condiciones ambientales y la implic ac in de determinadas es pecies productor as de las mis mas en proc es os infecc ios os de los animales y del ser humano, se hace nec es ario emplear pr ocedimientos es pec iales par a eliminar todos los espor os bacterianos . En los instr umentos y mater iales clnicos s e utiliz a la esterilizac in en autoc lave utilizando una temper atura de 121C dur ante 20 a 30 minutos . 1.2.10.2 formaci n de l a endospor a Las bacter ias es porulan par a s obr evivir a las c ondiciones ambientales adv ers as. La espor ulac in o espor ognes is s e inic ia cuando concurren tres circunstanc ias: 1) la bacteria tiene que estar v ida de nutrientes importantes; 2) debe ex istir una alta densidad bac ter iana para per mitir la secrec in y r ec onocimiento del factor 1 de diferenciacin ex tr acelular ( EDF- 1), fac tor que al parecer es un pptido pequeo que s e enlaza con

la bacteria v ida de nutr ie ntes y le indic a que es el momento de iniciar la espor ulac in; 3) es necesar io que la bacter ia se encuentr e en fase estacionar ia (Vadillo, et al. 2003). 1.2.10.3 G erminacin del espor o El proces o de espor ulacin dur a de 6 a 8 horas, s e necesitan s olo 90 minutos para que s e llev e a cabo la ger minacin. El pr oc eso se realiz a en tres etapas. 1) ac tiv acin, s e produc e c uando el c alor o alguna sustancia qumic a activ a un receptor de la L-alanina, que tambin es una pr oteasa. 2) inic iacin o germinacin, s e lleva a c abo c uando la c lula activada se expone a la L-alanina, a otros aminoc idos o a la glucosa. La proteas a activada pone en marcha una enzima ltica de la c orteza, es pec f ic a par a la ger minacin y la tr ansfor ma en su for ma activ a. Esta degr ada la c or teza y permite la entr ada en la endos por a de agua y nutr ientes . A lo largo de esta fase el esporo pierde su resis tenc ia y refrac tar iedad y recuper a su actividad metablic a. 3) crecimiento, s e inicia cuando la germinacin es ya irr eversible. A lo largo de es ta fase, la bacteria recupera su for ma vegetativa. (Fig. 8). En las dos primer as fases se emplean mater iales prefor mados , y en la tercera etapa s e or igina una nueva sntes is pr oteica

Figura 8. Dibujo esquemtico de la for mac in de espor as bacterianas. 1) Fas e inicial, c uando se bosqueja la septac in. 2) La me mbr ana plas mtica s e inv agina, comienza a ais lar el nucleoide. 3-4) Fas e avanz ada de la for mac in de la espor a, el nucleoid e es ta aislado por la me mbr ana. 5 y 6) for macin de la cubier ta de la espor a.

Fuente. Junqueir a y Corneiro, 1997.

1.2.11 M etabolismo bact eriano No ex iste ningn grupo de seres v iv os que tenga un metabolismo ms div ers ificado que el de las bacterias. Gr acias a esta car acterstica es pos ible encontrar las en las ms variadas condic iones ec olgicas . Algunas bac ter ias viv en a bajas temper aturas, mientras que otras, es tn adaptadas a temperatur as c onsideradas como inc ompatibles con la vida. Des de el punto de v ista metablico, las bac ter ias pueden ser divididas en fototrficas ( photos, luz y trophe, nutr icin), c uando utiliz an la luz s olar como fuente de ener ga, y quimiotrficas, cuando utilizan la ener ga pres ente en compuestos qumicos. En el s egundo gr upo, s i el compues to donador de ener ga es inor gnico, las bac ter ias son quim iolit otrficas. Cuando el compuesto es or gnico, la bacter ia es llamada quimiorganotrfica. Estas ltimas ox idan o fer mentan compues tos orgnic os, obteniendo de ellos la energa para sus proc es os v it ales. Todas las bacter ias par s itas son quimior ganotr fic as, y las ms exigentes requieren, adems de hidr atos de c arbono, aminoc idos y cier tas vitaminas par a su cr ecimiento. Es as bac ter ias obtienen la ener ga nec es aria par a su v ida a trav s de la oxidacin de hidratos de c arbono, lpidos y pr otenas. A lgunas , sin embar go, obtienen energa de la descomposic in anaer bic a (fer mentac in) de los hidr atos de c arbono. Otras especies solamente crecen en la aus encia del ox igeno (bacterias anaerbicas). La capacidad de metaboliz ar determinados tipos de azc ar es, unida a la morfologa y afinidad de las bacterias a los color antes , es un cr iterio muy usado par a su identific acin y clasificac in. Componentes de los flagelos, de la cpsula y de la par ed constituyen numerosos antgenos, proporcionando las bases par a un anlis is inmunolgico, tambin

importante para la identific acin de las bac terias y pas o tr asc endente par a orientar el tratamiento de las infecciones . Varios tipos de bacter ias c ontienen c omo c omponentes de s u estr uctura, o liber an hac ia el medio de cultivo, sustanc ias tox icas, que r eciben el nombr e de endotoxinas y exotoxi nas bacterianas (tabla 3) . E tas tox inas s son, en parte, r es ponsables por la agr esin de las bacterias a los organis mos que parasitan. Dos de las toxinas ms potentes que se conoc en s on pr oduc idas por el Clostridium tetani y Clos tridium botulinum, causantes del ttano y del botulis mo r es pec tivamente. Tabla 3. Caractersticas de las exotoxinas y de las endotoxinas de las bac ter ias patgenas.
EXOTOXI NAS Sec retadas por las bact erias; alcanzan altas c onc entraciones en el medio de cultiv o. Producidas por bact erias gram pos itivas y gramnegativ as. Son polipptidos con pes o molecular de 10000 a 900000 dalt ons. Altamente txic as Inestables, la toxic idad es anulada al elev ar la tem peratura s obre los 60C. Se unen a rec eptores de la membrana celular. Generalmente no c ausan f iebre. Generalmente c aus an f iebre. No se ha observado la unin a rec eptores. ENDOTOXIN AS Parte integral de la pared de las bacterias gramnegativas, liberadas cuando m uere la bacteria. Enc ontradas Son exclusiv amente de la en las pared bacterias gram negativ as. lipopolisacridos bacteriana. Toxicidad moderada. Mas est ables; resisten el calentamiento.

Fuente. Junqueir a y Corneiro, 1997.

1.3 CRECIM IENTO El rigor de las exigenc ias anaer bic as es distinto en c ada una de las espec ies de clostr idios y se puede ex pr esar como potencial de ox idoreducc in o potencial r edox en miliv oltios . A efectos pr cticos los indicadores de potencial redox (por ej., el azul de metileno, la resazur ina) son medidas apr opiadas de las condiciones de cult ivo de los anaerobios patgenos. Los c lostridios prefier en una atmsfer a con un 2- 10% de CO2 . Estas c ondic iones s e pueden producir en un frasc o en el que el oxgeno es r educido cataliticamente por hidr ogeno generado junto c on dix ido de carbono mediante un dispos itivo que se puede adquirir en el c omercio (GasPack ). La mayor a de los clostr idios patgenos neces itan medios de cultivo complejos que inc luy en aminocidos, hidratos de c arbono y vitaminas. La sangr e o el suer o favor ec en s u cr ecimiento. Un pH pr ximo a la neutr alidad y la temperatur a de 37C s on ptimos. El crecimiento gener almente s e puede obs ervar en un plazo de 1- 2 das. Con frecuenc ia las colonias tienen una for ma y un c ontor no irr egular es. Varios clos tridios pululan a tr avs de medios de agar sin for mar c olonias. La may or a de los clostr idios s on hemolticos ( Biberstein, 1994). En los medios lquidos, los clostr idios cr ecen en pr esenc ia de aire con tal de que ex ista un agente r educ tor (trozos de carne cocida, tioglicolato). El crecimiento nicamente tiene lugar en r educ idas porciones del medio. 1.4 PROPIEDADES BIOQ UIM ICAS El des prendimiento de olores desagradables debidos a productos del catabolismo de los pptidos, que constituy e una for ma corriente de produccin de ener ga, es tpico de los c ultivos de clostr idios. La may ora de los clostr idios atacan a los hidratos de c arbono, a las pr otenas, a los

lpidos, o a los cidos nucleicos. Las reacciones bioqumic as y sus productos finales proporcionan la bas e de la identificac in de es pec ies. 1.5 RESISTENCIA Lo mis mo que las dems bacter ias, las formas vegetativas de los clos tridios son s ensibles a las condiciones adversas del medio y a los des infectantes . Las endos poras s on r esistentes a la des ecacin, al calor, a las r adiaciones y a los des infectantes. Par a des truir las es por as del gnero clos tridium s on neces arios 30 minutos de ebullic in; la temper atur a de 121 C dur ante 20 minutos las des truy e. Son resistentes al fenol, al alcohol y a los des infectantes de amonio c uater nario. La leja y el for mol son medianamente espor icidas ( Biberstein, 1994).

1.6 Clostridium chauvoei

Clostri dium chauvoei es el agente causal de pierna negra y edema maligno, en v ac as, ovejas, cabras y otr as especies animales ( Smith, and Holdeman, 1968); se tr ata de una mios it is enfisematos a necr osante, s u agente caus al, Clostridi um chauvoei (Carter, 1989). Es clos tridium tpic o que posee esporas s ubter minales o s ubc entr ales El antgeno de s u espor a presenta reacc in cruz ada c on el de C. s epticum. Produce cuatr o tox inas empar entadas c on las de C. septicum, un factor de edema y, con frecuencia una neur oaminidasa. 1.6.1. Toxina s de C. chauvoei:

1.6.1.1 Tox ina alfa. Es una sustancia le tal y necrotizante, es pr obablemente r esponsable de la actividad leuc oc dica y puede s er idntic a c on la hemolisina oxgeno estable ( Smith, and Holdeman, 1968). V er poorte et al ( 1966) r epor t que la -toxina de C. chauvoei tie ne una masa molec ular de 27 kDa, es

sintetiz ada c omo parte de un complejo de 53.5 kDa, el cual es r efer ido como el componente soluble inmuniz ante ( Smith, 1984). C. chauvoei no pr oduc e ttulos de -toxina tan altos c omo C. s epticum. Se ha enc ontr ado que el antis uero de C. septicum neutr aliza la actividad letal de ambos organismos, pero el antisuer o de C. chauvoei neutr aliz a la letalid ad de organis mos homlogos solamente. El mis mo autor postul que C. septic um pr oduce dos -tox inas, alfa 1 y alfa 2, mientras que C. chauvoei pr oduc e s olamente alf a 1 ( Hathew ay, 1990).

1.6.1.2 Tox ina beta. Es una pr otena ter moestable con activ idad Desox irr ibonucleas a ( DNasa). ( P inc ew ill and Oakley, 1976) encontr aron que las toxinas de ambas r espec ies s on similar es con r especto a estabilidad al calor, activ acin o inhibic in por iones metlicos , inhibicin por agentes quelantes y prec ipitac in con sulfato de amonio. Ellas son es tables al c alor, pier den cerca del 10% de actividad a 56C por 60 minutos y 50% despus de calentarlas a 100 C por 80 minutos. La actividad enz imtica es intens ificada agregando iones de bar io o magnes io e inhibida por cobre, hierro, mercur io, zinc o iones de plata. La ac tiv idad no es afectada por concentraciones de calcio, cobalto, magnes io, potasio o iones s odio entr e 10-1 y 10- 6 molar (M), la estimacin molecular de su mas a es de 45 kDa.

1.6.1.3 Tox ina gamma. Es una hialur onidasa, hidroliza enlaces glicosdicos entr e N acetilgluc osamina y residuos de c ido glucur nico y cido hialur nico. Esta enz ima es c ompletamente inactivada por tr atamiento con c alor ( P inc ew ill and Oakley, 1976) encontr aron que la gamma tox ina de C. r septicum fue mucho ms sensible al c alor que la de C. c hauvoei. Se enc uentra en var ios tejidos de los animales y el hombr e, c omo el tejido conectivo lax o, lquido s inovial y humor vtr eo, facilitando la dis eminac in de la infeccin. Es ta hialuronidasa al destr uir el cido hialurnico de los tejidos reduc e la viscos idad y per mite may or difusin de las s ustancias en los espac ios tis ular es. Es inac tivada por el c alor y su ac tiv idad se ve afectada por iones metlic os c omo cobr e, hierr o, merc ur io, z inc y plata.

1.6.1.4 Tox ina delta. E una hemolisina ox geno lbil, ser olgicamente relacionada per o no s idntica a las hemolis inas ox geno lbiles producidas por C. tetani, C. per fringens, C. novyi, C. histolyticum , los neumoc ocos y algunos de los estr eptoc ocos. La potencia hemoltica de las tox inas es inactivada por

agentes oxidantes tales como per x ido de hidr geno, el yodo y tambin por la antiestr eptolis ina O del suer o humano y por el suero nor mal de varios animales c omo conejos, cobayos y c aballos (Moussa, l958). Puede ser activada por agentes reductores como tioglic olato de s odio y sulfur o de hidrgeno ( Ballar d et al, 1993). Las c lu las vegetativ as de C. c hauvoei poseen dos aglutingenos conoc idos, un antgeno s omtic o O estable al calor comn a todas las cepas, y un antgeno flagelar H termolbil , del cual se c onoc en dos tipos. El flagelo de C. c hauvoei es un organelo el cual ay uda a induc ir mecanismos de r es istenc ia inmune siendo el mayor antgeno pr otec tivo del organismo la protena flagelar. Estudios pr evios sugier en que el flagelo de C. chauvoei es importante c omo un factor de vir ulencia en la patognes is de infecc in causada por es te organis mo ( Tamura et al, 1995). C. chauvoei necesita condiciones de anaer obiosis estr ictas y medios ricos en cis tena y en vitaminas hidr osolubles. Sus colonias s on r edondas con contor no liso y en 2 das alcanzan un tamao de inc luso 4m. La hemlis is es v ariable , C chauvoei s e par ece a C. septicum y con frecuencia se asla junto con l. A difer enc ia de C. s epticum, fermenta la sacar osa, pero no la salicina y no cr ece a 44C. (Biberstein, 1994).

1.7 ECOLOG IA 1.7.1 Reservorio C. chauvoei s e enc uentra ampliamente distribuido en la natur alez a per o par ece tener dos hbitats principales: en el s uelo y en el tr acto intestinal de los animales y el hombr e. Exis ten indic ios de que el s uelo tr ans mite la pier na negra, se s upone que la puerta de entr ada es la muc osa del

aparato digestivo, despus de la ingestin de alimentos contaminados o por dientes en erupcin o a tr avs de her idas. Las bacter ias pueden loc aliz ars e en bazo, hgado y tubo diges tivo de animales sanos, y la contaminacin del suelo y el pasto puede producirse a partir de heces infectadas o por la desc ompos icin de los cadver es de animales que han muerto de esta enfer medad ( Rodostits, et al. 2002) . 1.7.2 Epidemiologa La pierna negra se pr esenta en todas las la titudes, con una frec uencia variable tanto dentr o de una mis ma z ona geogr fic a c omo en distintas zonas geogr fic as, c irc uns tanc ia que indic a que el s uelo es el res erv orio del agente c aus al o que exis ten factores climtic os o estacinales que has ta ahor a no han sido definidos . Los bv idos jvenes ( < 3 aos) y bien alimentados s on los pr eferentemente afectados. El c arbn sintomtico registra el may or nmero de casos durante los meses clidos del ao (en la Orinoqua colombiana de agosto a octubr e y de dic iembr e a marz o). Algunos brotes de esta enfermedad se han enc ontr ado des pus de excavar el suelo, lo que sugier e que estas maniobras pueden poner en actividad esporas latentes que han quedado expuestas. Se sos pecha que los esfuerzos, los golpes en los msc ulos y las indigestiones agudas des encadenan los problemas (Smith and Jones, 1962). En los ov inos y en algunas otr as especies, es tpica de C. s epticum la produccin de infecc iones en las heridas que par ecen edema malig no o gangrena gaseos a ( Hagemos er, 1980) . Tambin es posible que en las her idas s e enc uentren otros clostr idios ( C. septic um, C. novyi y C. sordellii). En los bvidos, esta enfer medad normalmente s e produce sin antecedentes de un tr aumatis mo, pero en las ovejas c asi siempr e esta originada por una infecc in o heridas (Rodostits, et al. 2002).

El c ar bn sintomtic o es c aus a de grandes pr didas econmic as par a los ganaderos que cran ganado bovino en muchas partes del mundo. La mayor parte de los br otes se previene mediante vac unacin, cuando surge la enfer medad s uele afectar a varios animales en pocos das. Se trata de un padec imiento enzotic o en ciertas zonas , especialmente, aquellas ex pues tas a inundac io nes; el tamao de estas reas contaminadas puede v ariar desde un gr upo de gr anjas has ta un campo individual; se presenta en todas las latitudes con ms frecuencia en las zonas templadas, la mor talidad del car bunc o sintomtico cas i llega al 100% (Valder, 2002). Factor es de ries go factor es ambientales El c arbn sintomtico o pierna negr a es tpico en los bv idos, tienen una inc idencia es tac ional, presentndos e la may ora de los c as os en los meses c lidos del ao. La mayor incidenc ia puede variar desde la primav era al otoo, dependiendo pr obablemente del mo mento en que los ter ner os alcancen la edad s usceptible. En algunas reas ex iste mayor prev alenc a dur ante los mes es de intens as lluv ias. Se han produc ido brotes de car bn sintomtico en los animales despus de la exc avac i n del suelo, indic ando que las alterac iones del suelo pueden exponer y activar las es por as latentes . Factor es animales El c ar bn sintomtico s e considera habitualmente una enfer medad bov ina y, ocas ionalmente, ovina, per o se han descr ito br otes de es ta enfer medad en ciervos y tambin en c aballos. En los bv idos, esta enfermedad est limitada pr incipalmente a los animales jvenes, entr e 6 meses y 2 aos de edad, aunque tambin se pr oduc e ocas ionalmente en los animales mas jv enes y en los adultos de hasta 3 aos . En el campo, los factores de

ries go incluy en el crecimiento rpido del ganado y una dieta muy energtic a. Importanc ia El c arbn sintomtico es una causa de pr didas econmicas importantes par a los ganader os en muchas partes del mundo. En la may ora de los casos , los br otes se pr evienen mediante la v acunac in, aunque todava se pr oduc en brotes en hatos v acunados o en animales v ac unados en for ma inc ompleta (Rodostits , et al. 2002). 1.8 PATOGENIA Esta enfer medad s e ha descr ito en v ac unos y ovinos, s e han reportado 2 casos de pier na negra pr opiamente dicha en porcinos. En el c aso de los vacunos, la bacteria puede ser endgena y puede prov oc ar la enfer medad de esta manera pero en los ovinos la infeccin s iempre es ex gena y la espor a es llevada al organismo por iny eccin o infeccin de una her ida prev ia. La eliminacin de la bacter ia en for ma espor ular es constante por la va digestiva de animales infectados y sta, por ser un anaer obio estr icto espor ula par a mantenerse v iv a en el medio ambiente, se queda en la tierra y el suelo pudiendo infectar el agua de los bebeder os y el pasto. No se tiene muy clara la patogenia de esta bacteria per o se piens a que ingr esa por lo gener al por v a oral, al c onsumir agua o pastos contaminados c on esporas, una vez dentro del organis mo, esta es por a llega a la muc osa digestiva en fas e vegetativa y por v a hematgena llega hac ia difer entes rganos y tejidos del organismo o tambin v iaja dentr o de un macrfago. Tambin puede llegar a la s angr e a tr avs de algunas her idas pr edis pues tas en la muc osa de los animales por eje mplo en la poca de la dentic in de los terneros y de all diseminars e por va

hematgena

distintos

tejidos

del

cuerpo.

Las

esporas

van

principalmente a las porciones musc ular es del cuerpo generalmente en el cuello y miembros pos ter iores, aunque tambin se han visto lesiones solamente en el inter ior del cuerpo, en msculos muy profundos c omo en el diafragma, la base de la lengua y el miocardio ( Smith & Jones , 1962). Para que se produzca la enfer medad tiene que existir un ambiente propicio para el des arr ollo de la bacter ia en el or ganismo, este ambiente propicio s e da por magulladura del msculo, ejercicio exces ivo, indigestin aguda o cualquier proc es o que desv it alice al tejido. La bacteria nec es ita de un medio r ico en gluc geno como fuente de su energa, esto con una pr evia gluclisis anaer bica pr oduc ida en el msculo. Esto adems tiene que estar acompaado de anaerobiosis y pH ligeramente alc ali no; este ambiente perfecto par a el des arr ollo de la bacteria determina pr imariamente la for ma vegetativ a de este microorganis mo donde por actuacin de tox inas que y a se estn produciendo, propician el des arr ollo de la enfer medad y sus consecuenc ias ( Smith, 2002). Una vez que el ambiente es adecuado para el desarrollo de la bacteria, comienzan a pr oducir sus toxinas y enz imas, cada una con un fin espec ifico. Estas tox inas pr ovocan una reaccin tisular y se des enc adena una inflamac in del msculo c omprometido, hemorragia y edema gaseos o que es til para hacer el diagnstico de esta enfer medad ya que al tacto es crepitante, finalmente ocasiona necr os is del msculo comprometido, adems durante este pr oceso ex iste la apar icin de fiebr e alr ededor de 40 C, por que las tox inas liber adas por las bacter ias son inductor as de liberac in de linfoquinas que elev an la temperatur a. Las les iones se hac en evidentes 24 hor as des pus de la germinac in de la fas e vegetativ a en los msculos y se puede notar un edema cr epitante en la z ona. Finalmente hay una bacter emia que se da nicamente en la fase final de la enfermedad y que c onllev a a la muer te del animal por infecc in s istmica. La muerte se da 1-3 das desde que aparecen los signos clnicos. En ocas iones s e pres enta muer te sbita.

En ov inos, la espor a ingres a conjuntamente con otros Cl ostridi um en her idas abiertas, es to lleva a una necros is del tejido afectado pr oduciendo el c uadro de gangr ena enfis ematosa. A la necrops ia se encuentr a el animal en pos ic in dec bito later al c on el miembr o afectado extendido y rgido, se pr oduc e putrefaccin y meteor ismo post mortem r pidamente y se puede ver un exudado es pumos o que s ale del ano y la nar iz, los msculos afectados se ven edematosos y con el centro ennegr ec ido por la destr uccin y degenerac in del tejido. En las c avidades se encuentr a siempr e abundante lquido que coagula con facilidad por la gr an pr esencia de fibrina, adems se nota un olor rancio como de c ido butric o y se puede notar la pr oduccin de gas en el hgado. Cuando un feto es afectado se puede notar la distens in del abdomen de la madr e pos iblemente por la edematizacin del feto, es te puede o no pr esentar las les iones tpic as de la infecc in (V ald er, 2002).

1.9 HALLAZGO S CLINICO S Al observ ar al animal antes de su muerte, ste pr esenta una cojer a gr ave, nor mal mente con inflamac in pr onunc iada de la par te s uper ior de la extr emidad afec tada. Al ex aminar atentamente al animal s e obs erv ar que esta muy deprimido, tiene anor exia completa, stasis ruminal y una temper atur a y frecuencia de pulso altas ( 41C y 100- 120 l/m, respectivamente). No en todos los casos se obs erv a fiebr e. En las fases iniciales , la hinc haz n es ta c aliente y dolor osa a la

palpac in, pero pronto s e v uelv e fr a e indolora, pudiendo palparse edema y enfisema. La pie l toma un color diferente y muy pronto se sec a y s e cuar tea. A unque las lesiones normal mente estn limitadas a la parte super ior de una extr emidad, se han observ ado c asos oc as ionales en los que se producen les iones en otras partes del c uer po, como la bas e de la

lengua, el msc ulo car diaco, los msc ulos del diafragma y psoas y la ubr e. A menudo existen lesiones en ms de un lugar en un mis mo animal. Esta enfermedad avanza rpidamente y el animal muere entr e 12 y 36 horas des pus de la aparicin de los s ignos. La mayor a de los animales mueren s in que s e obs erven los s ignos c lnicos . 1.10 HALLAZG OS DE NECROPSIA Los bovinos encontrados muer tos por c arbn sintomtico a menudo pres entan una posic in car acters tica: permanecen en decbito lateral con la extremidad afectada lev antada r gidamente. El meteorismo y la de la s angr e es putrefacc in s e producen rpidamente, y los or ificios nas ales y el ano exudan una espuma sanguinolenta y la coagulacin rpida. La inc isin de las mas as musc ulares afectadas rev ela un color r ojo oscur o a negro, hinchaz n tisular con el desprendimiento de un olor ranc io y un lquido sanguinolento claro que contiene bur bujas de gas. Las superficies rec in c ortadas a menudo estn sec as y pueden tener un br illo metlic o. Hay que ex aminar el cor azn y todos los msc ulos es queltic os, inc luyendo los de la lengua, el diafragma y la r egin lumbar, pues la les in puede ser pequea y pasar desaperc ibida dur ante un ex amen pr ec ipitado. La cav idad torc ica y el saco per icrdic o pueden contener una gran cantidad de lquido sanguinolento con cantidades v ariables de fibrina. Esta s erositis a menudo s e pasa por alto o s e inter pr eta errneamente como un c omponente de la pleur oneumona. Los pulmones nor malmente estn congestionados y pueden pr esentar atelectas ia debida al timpanismo abdominal ( Rodostits , et al. 2002) 1.11 HISTOPATOLOG IA Los casos de carbn sintomtico se c aracter iz an por mionecros is, edema, enfisema e infiltr ac in moder ada de neutrfilos . Los micr oor ganis mos

pueden ser poco numer osos per o se pueden obs ervar en cortes tis ular es. Es esenc ial que los tejidos s e examinen tan pronto c omo s ea pos ible des pus de la muerte y que s ean conservados en for mol par a s u posterior estudio en el laboratorio. 1.12 DIAGNSTICO DE LABORATORIO En los frotis de teji dos infectados se pueden identificar los bac ilos grampositivos es por ulados (Biberstein, 1994). Las prdidas ec onmic as que pr oducen estos micr oorganismos en los animales y la falta de c lasific acin para un diagnstic o s eguro, ha hecho nec es ario realizar estudios s obre c ada uno de ellos a partir de pr uebas div ers as ( Car aballo , et al. 1980). El dia gns tic o pr esuntiv o tanto de pier na negr a como edema maligno se hac e por s ignos clnicos y patolgicos , la c onfirmac in de estas enfermedades se hace r utinar iamente por la identific acin de los microor ganis mos , aislamiento micr obiolgico, mtodos de car acter iz acin, mtodos inmunolgicos como in munofluoresc encia e inmunoc itometr a y por reacc in en c adena de la polimer asa (PCR) (kojima, et al, 2001) . 1.13 DIAGNSTICO DIFERENCIAL Para definir un diagnstico cuando se encuentr an var ios animales muertos en un grupo que no se ha observ ado constantemente y la descomposic in post- mortem es ta tan av anz ada que se puede obtener poc a infor macin, el mdico v eter in ario depende de sus propios conoc imientos ac erc a de la incidenc ia de las enfer medades loc ales , la estacin del ao, la edad del grupo afectado y las condic iones del suelo y el examen detenido del entor no en el que han per manec ido los animales muertos.

Es pr ecis o instaurar una vigilancia ms cercana para poder ex aminar los animales enfermos o r ealizar un estudio de los c adveres rec ientes . El edema maligno y los c asos tpic os de c arbn sintomtic o en bv idos se puede realiz ar un diagnstico definitiv o segn los s ignos clnicos y los hallaz gos de necr ops ia. La identificac in definitiva de C. chauvoei s e r ealiza por la tinc in de anticuerpos monoclonales mediante la tcnica de inmunoperox idasa y de anticuerpos fluoresc entes. El diagnstico difer encial bas ado en las obs erv aciones macr oscpicas post- mortem r especto a otr as causas de miositis por clostr idios es arriesgado y puede deriv ar en r ecomendaciones inadec uadas de c ontrol ( kojima, et al, 2001). 1.14 TRATAM IENTO Y P REVENCI N La liter atur a reporta tratamiento a base de penic ilinas a altas dos is per o no r egistr a gran efec tiv idad, el contr ol s e realiz a por medio de v acunac in anual que proporciona protecc in antitxica y antibacteriana. En el mercado c olombiano ex isten diec iocho formulac iones diferentes de vacunas (bacterinas, toxoides, mezcla de bacter inas y tox oid es) par a el control de las Clostr idiosis y dos productos par a la pr oteccin del ganado contra el ntr ax (APROVET, 2002). La vacuna actualmente empleada para los bovinos es un cultivo de C. chauvoei for molado y precipitado por alumbr e y ady uvado en hidrx id o de aluminio. En algunas regiones, donde frecuentemente se observan infecc iones de las her idas c ausadas por C. s epticum, se utiliza una bac ter ina- tox oid e bivalente par a pr oteccin c ontra ambas infecciones. Tanto exper imentalmente como en la pr ctica se ha demostrado que los agentes inmuniz adores pr eparados para el us o en los vacunos son eficac es par a los lanar es y que, si bie n exis te c ierta diferencia

inmunolgica entre las cepas de fuentes ovinas y bov in as, no es nec es ario pr epar ar la vacuna con cepas ov inas . Se rec omienda la aplic acin de la v acuna a animales entr e 3 mes es y 2 aos; s e debe ac ostumbrar la vacunacin anual c ontra la enfer medad, de tal maner a que los animales rec iban por lo menos dos dos is en su vida. Una vez s e obs erva un brote, debe evitars e la mov ilizac i n de animales hac ia otros potr eros y el lote or iginal debe conservarse con los mis mos bov inos ( enfermos y apar entemente sanos) ( Car ta Fedegan Edic in No. 75) .

1.15 INM UNOPEROXIDASA INDIRECTA

1.15.1 Historia Una de las primer as tcnic as des arrollada y usada fue la

inmunofluorec enc ia, per o esta tc nic a present complic aciones como su alto costo de desarrollo y los antic uer pos fluorescentes usados no contrastaban c on la c olorac in usada para la ev aluacin histolgic a. Esto llev a que no se poda realiz ar la evaluacin de las lesiones histolgic as y la c olorac in inmunohistoquimica simult neamente. Esta serie de problemas llevo a los inv estigadores a des arrollar mtodos alternativos que per mitieran la ev aluacin de los teji dos y la coloracin de los mis mos simultneamente par a us arlos como herr amienta prctica de diagns tic o directo en la identificacin de enfer medades en los animales. Uno de los mtodos desarr ollado fue la marcac i n de anticuerpos usando enz imas o sustratos que depos itar an cromgenos en los tejidos en los sitios de unin antgeno-anticuerpo los cuales v an a ser vis ib les al utilizar el micr oscopio de luz y que van a produc ir una colorac in per manente, en contraste con la tcnica de antic uer po flu orescente; la enzima mas comnmente utilizada para esta tcnica es la peroxidas a ( Nakene, and Pearse, 1967). 1.15.2 Bas es inm unohistoqumicas La bas e de la in munohistoqumica (IHC) es principalmente la identificac in de antgenos, c onfor mados y a sea por pr otenas, c arbohidr atos, lpidos, cidos nucleic os o por otr os compuestos; los cuales estn pr esentes en tejidos generalmente fijados en formol los cuales ser n identificados por anticuerpos monoclonales o polic lonales altamente sensibles dando como resultado una reacc in de color en el tejido que nos indica la pr esencia de agentes infecc ios os ( Boenisch, 2001).

1.15.2.1 Anticuer pos El reactivo c omn para todas las tcnicas inmunohistoqumicas es el anticuerpo, la habilidad antisuero, fracciones de inmunoglobulinas y anticuerpos monoclonales que incrementan el uso c ln ico de los tejidos antignicos para ampliar la cantidad y calidad de los reportes inmunohistolgicos. Par a la mejor comprensin de los mtodos de c adenas inmunohistoqumicas como de sus problemas, es neces ario tener un conocimiento bsico de anticuerpos, sus potencias y limitaciones. 1.15.2.2 Inmunoglobulinas Los antic uer pos pertenecen a un grupo de protenas llamadas

inmunoglobulinas ( Ig). Enumeradas en orden decr eciente por su c antidad enc ontr ada en el plas ma y suero, las inmunoglobulinas comprenden 5 grandes c las es: in munoglobulina G (IgG), IgA, IgM, IgD y IgE. Cada inmunoglobulina esta compuesta por 2 cadenas pesadas idnticas ( H) y 2 cadenas liger as idnticas (L). Las cadenas H difier en en antgenos y propiedades estruc tur ales que determinan la clase y subclase de la molcula. Las 2 cadenas L son tambin de tipo Kappa o lambda. La distr ib ucin de las c adenas kappa y lambda difieren en todas las clases de Ig, tambin entr e las diferentes es pecies . El enlace covalente entr e cadenas es la unin dis ulfur o que une L- H o H- H. Por participar en una estr uctur a terc iar ia ellas confier en una gran estabilidad a la molcula de Ig. De las 5 clases de Inmunoglobulinas IgG e IgM son los antic uer pos mas usados en la inmunohistoqumica.

1.15.2.3 Inmunoglobulina G Tiene una fr mula general de gamma 2, kappa2 , o gamma 2, lambda2, la cual describe la molcula de IgG ( MW = 150 kD). Est c ompuesta por 2 cadenas pes adas gamma, y 2 cadenas ligeras kappa o lambda. La estr uctura de la molc ula de Ig ha sido determinada, en parte por digestin proteoltica y una r educcin disociativa de la molcula. Los resultados de la diges tin en espacio de su unin susc eptible en la ter minal- N de la intercadena pesada en las uniones disulfuro. Esta pr oduccin de 2 fragmentos monov alentes antgeno- unin ( Fab) y un fragmento cr istalino ( Fc), las uniones de pepsina en las cadenas gamma en el s itio ter minal C de la intercadena pes ada en los puentes dis ulfuro; resultando en un antgeno bivalente antgeno-fragmento unin F(ab)2. En este caso el fragmento Fc es destruido. La reduccin disociativa de una IgG rompe el puente disulf uro, s i el grupo sulfhdric o es bloqueado el resultado es la formacin de 2 cadenas H (con un pes o molecular de 50 kD c ada uno) y dos cadenas L (25 kD cada uno). La IgG puede ser dividida y llamada dominio, por la v ariable dominante (V) y el dominio constante ( C). Cada dominio de 110- 120 aminoc idos y una unin disulfur o entr e cadenas. En el dominio var iable de la cadena ligera (VL) y el dominio var iable de la cadena pesada (VH ) son encerrados los aminocidos ter minales de la molcula de inmunoglobulina. VL y V H juntos for man el sitio antgeno-unin. Muc has regiones interactivas HV son enc erradas dentro de los dominios V L y V H del anticuerpo ( Boenisch, 1999) . Dur ante es ta reaccin c on antigenos , las regiones HV del anticuerpo estn apr oximadamente a 0,2-0,3 nm. En esta regin estructuras especificas nicas lla madas determinantes idiotipicos son encerradas . Cada clon de un anticuerpo es nuestro idiotipo; cada cadena L tambin tiene un dominio constante (CL) en adicin con el dominio c ons tante V L. La cadena H tambin tiene 3 dominios c onstantes (CH 1, CH 2 Y CH 3) y lleva la porc in

ter minal car box ilo de la inmunoglobulina. Encerr ado en el dominio constante CH 2 esta el carbohidr ato de la molcula de IgG y muchos aminocidos aromticos neutr os hidrfobos fuertes. Las regiones bis agr a estn enc erradas entre los dominios CH 1 y CH 2 de la cadena H. Menores diferencias entre estas regiones bisagra contr ibuyen a la es pec ificidad de las subclas es de la IgG. Los mis mos estn designados por subtipos como IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4. En humanos se pr esenta una relacin de kappa y lambda de 2:1, en las subclases IgG2 e IgG4 una r elacin 1:1 y 8:1 respec tivamente. Los ratones tienen aprox imadamente un 95% de cadenas kappa y una mayora de anticuerpos monoclonales IgG. El nmero de enlaces dis ulfuro de las cadenas pesadas tambin var a por la cantidad de subclases de IgG. IgG1 e IgG4 cada una tie ne 2, mientras que IgG2 e IgG3 tienen 4 o 5 respectivamente. A c aus a de la flexibilidad de la regin bisagra el ngulo de los fragmentos Fab var ia en dis tancia c on los deter minantes antignicos idntic os (Boenisch, 1999). 1.15.2.4 Inmunoglobulina M Es un pentmer o (MW apr oximadamente 900 kD) compuesto de 5 unidades de aproximadamente 180 kD cada una. La for mula general puede ser expres ada como (mu2 kappa2)5 o (mu 2 lambda 2)5. Cada subunidad esta unida por un pptido-sulfhdr ico, la cadena J ( 15kD), y consiste en 2 cadenas pes adas (mu) y 2 c adenas liger as de tipo kappa o lambda. Las c adenas J contribuyen a la integridad y es tabilidad del pentmero; como con IgG, las subunidades de IgM pueden ser fragmentadas por cambios r eductivos o enz imticos en F(ab)2 porciones Fab y FC , como tambin en cadenas pesadas y ligeras respectivamente. El fragmento FC de la IgM es un pentmer o cclico (340 kD). El tratamiento con IgM con 0,1% de mercaptoetanol c on uniones de dis ulfuro entr e s us subunidades de los 5

monmer os nos da s ubc las es de IgM1 e IgM2 las cuales han s ido reportadas . La inmunoglobulina M es el anticuerpo mas abundante en el hus ped hiperinmunizado, en el animal recin inmunizado, la IgM es el primer anticuerpo humoral detectado. La for macin primaria de anticuerpos proc ede en muc hos de los es tados a la primer a inyeccin o inoculac i n de inmungeno alto, el equilibr io entr e los espacios extra e intr avascular, luego el c atabolismo forma pequeos fragmentos y finalmente es eliminado del espacio intravasc ular para la nueva for macin de anticuerpos. El per iodo des de la introduccin del inmungeno hasta la primera aparic in de anticuerpos humor ales de IgM es llamado periodo latente y dur a apr oximadamente 1 semana. Dentro de 2 semanas o en res puesta a una segunda inyeccin o inoculac in IgG usualmente predomina, c omo todas las pr otenas estn sujetas al catabolis mo los antic uer pos de tipo IgM tienen una r elativa vida media cor ta de solo 4- 6 das; IgG sobreviv e apr oximadamente de 3 semanas. 1.15.2.5 Anticuer pos policlonales Los anticuerpos policlnales son pr oducidos por muchas clulas, y en consecuencia s on dif erentes inmunologicamente; ellos reacc ionan con varios epitopes en el antgeno. El animal mas frecuentemente usado par a la produccin de antic uer pos policlnales es el conejo, seguido por la cabr a, cerdo, ov eja, y caballo. La popularidad del conejo para estas pruebas se bas a en el fcil manejo; adems los antic uer pos de conejo prec ip itan las pr otenas humanas. Dependiendo de la inmunogenicidad del antgeno, dosis desde 10g-200g son tr adicionalmente administradas para generar una res puesta inmune en los animales. El antgeno es inoculado de for ma intradrmica o subcutnea; per o la inoc ulac in en msc ulo o en cavidad per itoneal son tambi n usados.

En conejos volmenes de 0,1- 0,5 ml son usualmente dados intradr mic os y distr ib uidos en muchos sitios; el antgeno es s uspendido en un v olumen igual de adyuvante. La pr ueba de booster se r epite una vez al mes o cuando los ttulos dis minuy en. La sangre es tomada de la oreja del conejo, de la v ena yugular o del coraz n cuando se s acrifica el animal. Despus de remover las clulas de la sangre, los antic uerpos policlnales pueden ser obtenidos estabilizando el suero o en fracciones purificadas de inmunoglobulinas. La precipitacin por s ales, seguido de una cromatogr afa inica s irven par a r emover el resto de otras protenas ser icas. La afinidad por la cromatografa puede ser usada par a aislar el antg eno- especifico del anticuerpo (Boenisc h, 1999) . 1.15.2.6 Anticuer pos monoclonales Los anticuerpos monoclonales son el produc to un clon individual de clulas plas mticas. Probablemente por razones ec onmic as el ratn es exclusivo par a la produccin de antic uerpos monoc lonales. Des pus que una respuesta inmune ha sido descrita, los linfocitos B del baz o o ndulos linfoides son unidos con c lulas de mieloma de ratn no secretoras. Bajo condiciones especific as los li nfocitos B se unen a clulas hibridas o hibr id omas las c uales son inmortales en medios de cultivo. Las clulas B no r eactivas y las de mieloma son desc argadas y la producc in de antic uer pos hbridos son cultivados y probados par a reactivos. La produccin puede sacarse del medio de cultivo o por trasplantacin de hibridomas dentro de la cavidad peritoneal de los ratones. En la inmunohistoqumic a hay c iertas v entajas en los anticuerpos monoclonales sobre los policlonales; esto incluye alt a homogenicidad, aus enc ia de antic uer pos no especificos y fcil c aracterizacin. Los mtodos par a la seleccin de clones tiles y para el control de calidad deben identificars e los mtodos a us arse. Tambin los anticuerpos monoclonales son car acteriz ados usando tejidos c ongela dos o tejidos fijados en for mol;

par a esto el eptope debe sobrevivir a la fijac in, en algunos casos los antigenos sobreviv en a la fijac in en for maldehdo para el uso de anticuerpos mono o policlnales. La r eac tividad similar del eptope despus de una optima fijac in no asegura nec esariamente que esta sobreviva, luego un nuev o y mejorado antgeno comienza. El eptope r eportado tambin es nico para dar un antgeno, la especificidad, uno de los gr andes beneficios de los anticuerpos monoclonales, se pierde si el antic uer po es dir igido contra un eptope por 2 o mas antgenos diferentes. Mientras la r eac tividad cr uzada de un anticuerpo policlonal puede usualmente ser r emovido por absorc in (Boenisch, 1999). 1.15.2.7 Afinidad de anticuerpos Anticuerpos de animales hiper inmunizados no s olo difieren en el

reconocimiento de antgenos multivalentes, sino en las difer enc ias de sus afinidades. El trmino afinidad ha sido usado para descr ibir ambos intr nseco y funcional. La afinidad intr nseca de un antic uer po radic a en la r egin HV y es determinada por la mis ma sec uencia de aminocidos que determinan la especificidad. Interacciones inicas, hidrgeno y las fuerzas de Van Der Walls son los mayor es contribuyentes para la afinidad intrnsec a entr e el par atope en el anticuerpo y el eptope en el antgeno. La hidr ifobilidad aparec e al tener un efecto estable en la formacin del complejo inmune y puede c ontribuir a s u prec ip itac in. Los enlaces covalentes entr e al anticuerpo y el antgeno no ocurr en, la asociac in constante ( Ka) de la unin entre un anticuerpo y su antgeno deter minante es una medida de afinidad de anticuerpos. Puede ir de 103 a 1010 litr os/mol, lo cual es rec proco de concentracin en moles por litro. La mayor afinidad de un anticuer po, la menor c oncentrac in de un antgeno libre necesita de s itios de unin de un antic uer po par a

volv erse saturado ( equilibrio ric o). Solo la cantidad (ttulos) de un anticuerpo se incrementa con el tiempo de la inmunizacin, eso es calidad (afinidad); lo c ual ha sido llamado afinidad de madurac in. Las dos is bajas de inmungeno incrementan la tasa de afinidad de maduracin, per o resulta en bajos ttulos de antic uer pos y viceversa. En in munohistoquimic a la afinidad funcional de un antic uer po o un antisuero puede ser definido como el tiempo r equer ido par a el equil ibrio rico con un tejido antgeno. Si las alc uotas iguales de 2 antic uer pos o antisueros de idntic os ttulos son incubados incrementando periodos de tiempo con el antgeno en el teji do, el anticuerpo que da un efecto plateau de mx ima intens id ad de unin primero es la mayor afinidad funcional. El tr mino av id ez ha s ido us ado c omo s innimo para describir la afinidad funcio nal, pero tambin es usada para denotar la tensin entre las cadenas, entr e los antic uer pos y sus antigenos. Frecuentemente el trmino av idez ha sido us ado para describir la suma total de todas afinidades intr nsecas enc ontr adas en una poblac in de anticuerpos polic lonales . Las reacciones antgeno-anticuerpo s on rev ersibles, los complejos inmunes simples formados en el teji do pueden dis ociarse durante los cic los de lav ado us ados en la inmunohistoquimica. La facilidad y el gr ado de dis ociacin varia en anticuerpo-anticuerpo y las conc entraciones bajas de sal, as como la temper atura tambin se pueden reduc ir lo que for mar a el complejo inmune. La alta afinidad de los anticuerpos tiene una ventaja dur ante el lavado, la disociacin puede ocurr ir en anticuer pos de baja afinidad c omo se menc ion antes, una poblacin de anticuerpos policlonales contiene ms o menos un espectro continuo de baja-alta afinidad contra muchos eptopes, dadas por los antgenos. A dems, des pus de la incubacin con los anticuerpos pr imar ios de este tipo, el excesiv o lavado es una apreciable causa de prdida de color acin. Por otro lado los anticuerpos monoclonales son de afinidad unif or me y si la afinidad es baja, nos da la prdida de c adenas por disoc iac in de los epitopes.

Estos antic uer pos monoclonales de alta afinidad pueden ser s eleccionados de ser posible; altas temperatur as y muy bajo pH pueden pr esentarse dur ante el lavado de los tejidos. En el manejo de laboratorio de los anticuerpos s e ha demostr ado en inmunohistoquimic a que el lavado con sustancias buffer y una buena inc ubacin es mas segur o y evita el rompimiento de las uniones antgeno-antic uer po mejorando la colorac i n de la tcnica. Generalmente la mayor afinidad de un anticuer po, es la tendencia a formar un prec ipitado. La precipitacin procede a travs de un rpido estado el cual for ma un complejo solu ble antgeno-anticuerpo, seguido de una lenta agregacin y eventualmente prec ipitacin. Los anticuerpos no precipitados son gener almente de baja afinidad y son inc apaces de for mar el cerc o requerido par a que ocurra una pr ecipitacin. Los anticuerpos monoc lonales con respecto a la temperatur a son de alta o de baja afinidad, no pueden formar cerco con antgenos que solo r ara vez for man prec ipit ados insolubles. Adems en la inmunohistoquimica, la capacidad de un anticuerpo pr imar io par a for mar un complejo inmune prec ip itado es de menor importancia por que la reacc in con el tejido antgeno c aptura anticuerpos dentro del tejido. 1.15.2.8 Reactividad cruzada de anticuer pos El tr mino reactividad cruzada denota una actividad inmunohis toquimica que ocurr e entre un anticuerpo y 2 o mas antigenos o v icevers a, cuando un antgeno r eacciona con muc hos antic uer pos diferentes . Ejemplos tpicos son cuando anti- L(or- k) cadena de anticuer pos interactan con todas las 5 clases de Ig o cuando el antgeno carcinoembrionico (CEA) reaccionan c on anticuerpos contr a CEA, grupos de antigenos sanguneos y protenas de tejido nor mal respectivamente. El c omn denominador en cada caso es la porc in del menor eptope c omn entr e muchos antgenos. Otr o uso vlido del tr mino reactividad cruzada denota cambios in duc idos experimental o accidentalmente en uno o muchos eptopes a tr avs de un

antgeno; el trmino reactiv idad cruz ada tambin describe la inter accin de un antic uer po con un eptope similar o diferente. Este fenmeno es frecuentemente una propiedad de anticuerpos de baja afinidad y estn usualmente sujetos al c ambio de madur acin durante la inmunizac in. La reactiv idad cruz ada de antic uer pos de antigenos humanos con antigenos idnticos o similares de otr as especies pueden ser de in ters al v eter inario por la esc asez de antic uer pos especificos animales. 1.15.2.9 Tasa de reaccin de anticuerpos Generalmente la talla y la for ma de una molcula de anticuerpos y estos complejos o conjugaciones parecen ser de menor consec uencia inmunohistoquimica. Insuficiente penetr acin de tejido, incluso en la colorac in intr anuclear o antgeno citoplasmtico, no han s ido obs ervadas. En cuanto a los anticuerpos primarios de c lase IgM ( 900 kD) , complejos lar gos como P P ( 400-430 kD) o APAA PC ( 560 kD) o c adenas de A dextranos han s ido usadas. Es razonable asumir que la sobr efij acion de tejidos puede mostrar una penetr acin ms difcil para los anticuer pos y sus complejos. Bajo condiciones ideales , anticuerpos reaccionan c on sus ligandos (antgenos) muy rpidamente, en inmunohistoquimica las condic iones son raramente ideales. Dependie ndo del tejido de fijacin, c oncentracin de anticuerpos, temperatur a ambiente y otras var ia bles. El tiempo de inc ubacin de anticuerpos pr imar ios es super ior a 48 hor as para una reactividad mxima. El equili brio entre el antgeno y los anticuerpos libres son raramente reportados ; por esto un per iodo largo de incubacin mas una pr eparac in de anticuerpos diluidos son usados en los periodos cortos de incubacin, con mas prepar acin de antic uer pos c oncentrados es tablecen un equilibrio mas rpido, enlaces no espec ificos resultan de estas condiciones, la

inc ubacin de anticuerpos primarios ha s ido hecha ex per imentalmente des pus de su pr imera aspiracin de una secc in con algunos anticuerpos (Boenisch, 2001). 1.15.2.10 Estabilidad de anticuerpos Anticuerpos policlonales cuando s e recolectan no c ongelados y se usan subsecuentemente en inmunohistoquimica, son menos estables en su porc i n de inmunoglobulina comparados con aquellos de antis uer o completo. Esta r educcin de estabilidad depende del mtodo de aplicac in. La expos icin de antic uer pos a pH extremos, al igual que a altas y bajas concentraciones de sal durante la purificac in tiende a dis minuir su estabilidad mas que si se expone a c ondiciones medias como intercambio inico por cromatogr afa. La for mac i n de agregados solubles y subsecuentemente polmeros prec ip itados son el cambio ms frecuentemente notado. Estos cambios son probablemente el resultado de reacc iones hidr ofbicas entre molculas de IgG en la soluc in. Mientr as que la pres enc ia de agregados solubles pueden prec ipitar anticuerpos, su incr emento hidrofbico ha sido demostrado como causa del incr emento de los enlaces no especificos en inmunohistoquimica. La remocin de estos agregados y polmeros de fracciones de IgG es importante en la aplicacin de inmunohistoquimica. Solo con el almac enamiento de anticuerpos purificados puede subir la hidrofobia con la agregacin y polimeriz acin, tambin la conjugacin de otras molculas. La conjugacin con glutar aldehido envuelve los gr upos eps ilonamino de lisina y gr upos alfa-amino del aminocido ter minal N resultando una unin cruzada debido a que hay muchos s itios reactivos de glutaraldehid o en la molc ula de IgG, la hidr ofobia de los anticuerpos conjugados s e incr ementa signif icativamente, resultando una atracc i n de sitios hidrofbicos en el tejido.

Anticuerpos monoclonales un 42% ha sido investig ado por Underw ood y Bean mos trando cambios en especificidad, afinidad y reactividad cruzada. Anticuerpos de clase IgM y subc lase IgG2b fuer on espec ficamente sensibles. La estabilidad de anticuerpos en los productos comerciales esta determinada en tiempo real, temperatura real; hechos por cada casa comercial. Aunque dicho tiempo real debe ser ajustado a determinados tipos de anticuerpos y necesitan un tiempo r eal diferente para reaccionar y no perder su actividad ( Boenisc h, 2001). 1.15.2.11 Manejo de anticuerpos Es imperativ o observar c ier tas reglas bs icas del manejo y

almacenamiento. Las recomendaciones van dadas por el fabricante en volantes especiales par a ser seguidas por el us uar io. Recepcin muchos comerc iales de inmunoquimicos gar antizan la estabilidad por muchos aos. Antic uer pos pr ediluidos tienen una vida media corta; los inmunoquimic os pueden s er almacenados de acuer do a las recomendaciones de la manufactura y deben incorporars e datos tiles par a el uso y pos ibles r eclamos c omo la fecha de expiracin y la fecha de prepar acin. Almacenaje hay 2 cons id eraciones importantes para el almacenaje, tales como los r ecipie ntes y la temperatura. Containers de almacenaje; se prefier en mater iales de almacenaje de soluciones pr oteic as que no tengan absorcin proteic a como polipropileno, policarbonato o borosilicato son los vidrios recomendados. Soluciones que contengan bajas concentr aciones de protenas ( menos de 10-100g/ml), gener almente 0,1% a 1.0% de albmina sr ica bov in a es usada par a reducir la polimer izac in y abs orcin dentro del c ontainer.

Temperatura de almacenaje monitoreo en refrigeradores y congeladores s e usan en el almac enaje de inmunoquimic os con alar ma de temperatur a y sistemas de emer gencia de temper atura. Las casas comerciales presentan paquetes de anticuerpos listos par a usar s us conjugados y anticuerpos monoclonales en soluciones de 2- 8C por que al congelarlos no garantiz an su efecto y accin. Us o y cui dado de esto depende la probabilidad de c ontaminacin, calor o excesiv o exposicin a la luz. La contaminacin puede ev itars e con el uso de pip etas y kits limpios (Boenisch, 2001). 1.15.2.12 Inm unohistoquimica El protocolo estandarizado compr ende, la rec oleccin de las muestras lo cual es muy importante en los res ult ados que vamos a obtener en la inmunohistoquimica, los tejidos v an fijados en formol, la cantidad de for mol usado en el trabajo es for mol bufferado neutr o al 10%, en el tejid o va de 10:1. El tiempo entre la muerte del animal y la rec oleccin de la muestr a debe ser lo mas corto pos ible, es te tiempo no debe s obr epasar las cuatr o hor as pos t mortem y a que la descompos icin que empieza a sufrir el tejido nos puede causar falsos positiv os o falsos negativos . Exis ten otr os factores que influyen en la calidad de las muestr as como el tipo de tejido y tejid os ricos en enzimas como el intestino y el pncreas, los cuales se autolis an muy rpido; tambin el tipo de antgeno (los pr otozoos y hongos son mas res istentes a autolis arse que los virus) , y la distribuc in del antgeno. Des afortunadamente, los antgenos no s e encuentran distribuidos siempr e por todo el rgano o la les in, par a propsitos eficientes y prcticos, se deben c olocar las muestras rpidamente en el for mol y tomar tanto de la parte afectada como de la parte s ana del tejid o. Los frascos usados para la recoleccin del tejido deben estar estriles y debidamente rotulados con la mayor infor mac in posible acerca del animal y de la explotacin ( Ramos, et al. 1997).

La fijacin de los tejidos en formol preserv a la antigenicidad de las protenas y la morfologa del tejido, per o el tiempo de fij acin debe ser limitado y no sobrepas ar de 2 das, ya que las protenas de unin cruz ada del for mol pueden causar falsos negativ os aun en pres enc ia de grandes cantid ades de antgeno. Pero si no es posible reducir el tiempo de fijac i n en los tejidos, los la boratorios usan v arias tcnic as para desenmascarar los antigenos y r ecuperar la expr esin antignica como las enz imas o el c alor (Haines, and Chelac k, 1991) . 1.15.2.13 Tc nicas inm unohistoqumicas Las tc nic as en inmunohostoqumica s e desarrollan para desenmascarar los antigenos que estn en los tejidos fijados en for mol para ser reconocidos por el antis uer o, esto con el fin de r educir las reacciones no especificas o (bac kgr ound) antes de comenzar la r eacc in inmunohistoquimica, para evitar esto se han desarr ollado varias tcnicas a niv el de labor ator io y as rec uper ar antigenos, estas tcnicas o s istemas son: Detergentes (Saponinas, tw een 20 y nonidet p40) y sustancias caotr picas ( guanidina y tiocianato de sodio). Digestin enzimtica ( Trips in a, pr oteinas a K y pr onas a E). c uando se usan es tos bloqueadores de mtodos la es neces ario utilizar agentes enzimtic a endgena que como actividad

per oxidas a, fosfatas a alcalina, etc . Recuperacin inducida por el calor, esta tcnic a prov ee la energa nec esaria par a romper las uniones del antgeno c on los hidrox ilos for m adas al estar los tejidos fijados en for mol, liberando algunos antigenos; adems rompe las uniones del tejido con los iones de calcio que se encar gan de unir mas al fijador. El calor da mayor sensibilidad a algunos mtodos, lo c ual nos per mit e una may or y mejor dilucin del anticuerpo.

1.15.2.14 Marcadores visuales La vis ualizac in del sitio de reaccin del antgeno- anticuerpo depende de un s istema de gener acin de marcadores vis uales el c ual es conjugado con el anticuerpo u otr as molculas como la avidit a. Exis ten tres tipos de sistemas de marcadores vis uales : Metales , or o coloidal. La reaccin antgeno- anticuerpo es detectada por un indicador que contiene un agente reductor (la hidr oquinona) y una soluc in de plata (ac etato de plata). La sensibilidad de este mtodo es similar o mayor a las enzimas o mtodos enzimticos . Enz imas c omo la per oxidas a de rbano es la ms comn, fosfatasa alc alina, glucosa ox idada y la beta galac tos idasa. Con sus s ustratos histoqumicos es pec ificos y su variedad para capturar cromgenos, los marc adores enzimticos pueden produc ir difer entes color es, usualmente c af cuando s e utiliza diaminobenz idina, y azul c uando se utiliza fosfatasa alcalina, o rojo que son visibles en el micr oscopio de luz. Fluorocromos que s on visualiz ados por excitacin de la luz de una longit ud de onda apr opiada como el isotioc inato de fluoroseina, rodamina y r ojo Texas. Estos ele mentos son muy usados en tejidos que estn congelados (Beesley, 1993). 1.15.2.15 Mtodos inmunohistoqumicos Exis ten var ios mtodos inmunohistoqumicos des arroll ados par a

incr ementar la sensibilidad de las reacciones, dependientes de si la enzima (per oxidas a) se conjuga con antic uer pos (tcnica dir ecta e indirec ta), o si no se c onjuga ( mtodo del puente enzimtico y antiper oxidas a) ( Rose, and Fiedman, 1994) . de peroxidasa-

Mtodo directo es el mas simple y consta de un solo paso, donde un anticuerpo primar io marcado s e une con el antgeno por el fragmento var ia ble; este es un mtodo rpido de diagnstico para el examen de secciones de tejidos congelados y cortados con un micrtomo de congelac in y marc ados c on inmunofluor escencia.

Mtodo indir ecto que s e basa en la adic in de un segundo anticuerpo marc ado que se une directamente al antic uerpo primario que es especifico contra el antgeno que se v a a detec tar. El fragmento variable del s egundo anticuerpo s e une al anticuerpo primar io por su fragmento constante. Este mtodo es ms sensible que el dir ecto, pero es muc ho ms labor ios o (Fig. 9).

Mtodo puente enzimtico donde incluyen los mtodos per oxidasaantiper oxidas a ( PAP) y el complejo adivina biotina (ABC), son las mas utiliz adas en los laboratorios para los tejidos fijados en for mol (Ramos, et al. 1997).

Figura 9. Inmunoper oxidas a indirecta.

Fuente. Pr ogr ama nacional de inv estigac in en salud animal PNISA.

2 . M ATERIA LE S Y M ETO DO S

2. 1 Anim ales Los cobay os (Cavia porcellus) son el modelo biolgico ms utilizado en el mundo para trabajar c on microorganis mos anaer obios es pec ficamente del gnero Clos tridium Spp. El cr it erio de selecc in de los animales fue definido c omo animales de buena condic in cor poral, adultos que no pres entaran cuadros febriles o alter aciones c lnic o patolgicas. Se selecc ionaron 24 c obayos, los cuales se distribuyer on al az ar en seis grupos de tr es animales ( inoculados todos con la c epa de Clostri dium chauvoei 4408, cepa s uministr ada por el labor ator io VECOL S. A) y tres grupos de dos animales (se inocular on 2 c obay os con Clostri dium septicum, 2 c on Clostridium novyi y 2 con Clostri dium Sordelli). Utilizando los mis mos cr it er ios de inoculac in que s e descr iben a continuacin, la difer encia r adico en que se sacr ificaron a las 18 horas post inoc ulac in. Los animales se inocularon v a intramusc ular con 0,5 milili tros de una solucin de clor ur o de c alcio ( CaCl2) al 5% conteniendo 100 dosis infectantes de Cl ostridi um chauvoei; se sacrificar on cada tr es hor as. En cada grupo se dej un animal c omo testigo el c ual fue inoc ulado con CaCl2. La eutanasia de los animales se realiz de ac uer do a los protoc olos de biotica vigentes en la legis lac in colombiana, utilizando anestsicos v oltiles para evitar el dolor. Una vez se sacr ificar on los animales se les realiz la necr ops ia y se tomar on tejidos de los diferentes rganos los cuales se fijaron en solucin de formaldehdo tamponado al 3.7% par a histopatologa y fueron pr ocesados en el labor ator io del Centr o de Investigacin en Salud Animal, CEISA, en la ciudad de Bogot. 2.2 Materiales Los reactiv os us ados en la estandarizacin de la tcnica de inmunoperox idas a fuer on:

Re activos Agua destilada Agua ultr apur a Xilol Alcoholes ( etanol absoluto, etanol 90% y etanol 80%) Perx ido de hidr geno al 3% PBS Suero fetal bovino al 5% Anticuerpo monoclonal primar io Cchex1 Anticuerpo secundar io (conjugado anti IgG ratn- perox idasa) Kit DA B-s igma Hematoxilina de Harris Beakers Er lenmeyer Pr obetas 50, 100, 1000ml Laminillas cubreobjetos Lminas portaobjetos Pipetas 1, 2, 5,10, 25ml Pipetas pasteur

Vidrieria

Materiales varios Agitadores Algodn Falcn 50 Tubos Ependorf Guantes Papel aluminio Papel filtr o Pinz as

Tijer as Toallas absor bentes Gr adillas

Equipos Agitador automtic o Balanza analtica Cmar a de flujo laminar Congelador es Inc ubador a Microscopio Never a Pipeteador Potenc imetro Vortex

2.3 Protocolo tcnica de inmunoperoxidasa Descr ipcin de la tc nica de inmunoper oxidasa indirecta: Tc nic a 1. Corte de los bloques de tejidos embebidos en parafina 3-4 micras. 2. Despar afinacin de las lminas a 60C por 1 hora. 3. Aclaramiento de tejidos en xilol puro 2 vec es a temperatur a ambiente por 25 minutos. 4. Hidr atacin de los tejidos introducindolos etanol abs oluto por 10 minutos, etanol al 90% por 5 minutos y etanol al 80% por 5 minutos. Esta par te s e finaliza con 3 lavados en agua destilada 5 minutos cada uno a temper atur a ambiente. 5. Cubr imiento de las laminas con perx ido de hidrgeno H2O2 al 3% en metanol absoluto dur ante 10 minutos a temper atur a ambiente. 6. Lav ado de las laminas 3 vec es con PBS a temper atura ambiente 3 minutos c ada uno. 7. Bloqueo con SFB al 5% en PBS por 45 minutos a 37C en cmar a hmeda. 8. Lavado con PBS 3 v eces a temper atura ambiente por 3 minutos cada uno y adicin del anticuerpo monoclonal pr imar io Cchex1 (0.25mg/ml) en PBS a 37C por 2 horas en cmara hmeda.

9. Lavado nuev amente c on PBS 3 v eces a temper atura ambiente 3 minutos c ada lav ado.

10. Adic in del anticuer po secundario (c onjugado anti IgG ratnper oxidas a) en diluc in de 1:2500 en PBS a 37C dur ante 1 hor a. 11. Lav ado c on PBS 3 vec es a temper atur a ambiente durante 3 minutos y aplic acin de la solucin de revelado kit DAB-sigma por 20 minutos en cmar a humada. 12. Coloracin con Hematoxilina de Harr is dur ante 5 minutos. 13. Lavado con H2O destilada y finalmente montaje de la lmina cubr eobjeto. 14. Lectura de las lminas en microscopio ptico binoc ular con obje tivos de 10X, 40X y 100X. Las les io nes de los diferentes tejidos fuer on calificadas utiliz ando una escala subjetiva del grado de la lesin, dependiendo de la sever idad de la mis ma. La esc ala inc luy o: A) valor 0; sin cambios patol gicos aparentes, el tejido es normal. B) valor 1; lesiones lev es: lesiones liger as que incluy en c ambios congestivos, hemorr gic os, deplecin linfoidea, edema liger o. C) v alor 2; lesiones moder adas, linfoidea, inc luyen cambios edema congestiv os, infiltr ados

hemorr gicos, inflamatorios.

deplecin

moder ado,

D) valor 3; lesiones sev er as: inc luyen daos tisulares c omo necr osis de coagulacin, infiltrado inflamator io polimorfonuclear y mononuclear, zonas de hemorragia y congestin c on edema abundante.

Los gr upos contr ol,

inyectados solamente c on clorur o de c alcio

pres entaron un liger o edema, el c ual se evidenc i por la separac in de las fibras musculares, las lesiones se valorar on entre 0 y 1. Los resultados de la ev aluacin subjetiv a de las les io nes de los gr upos de cobay os inoculados c on cepa patgena de Clostridi um chauvoei y teniendo en cuenta la escala de los tems anter iormente descr it os y obs erv ados dur ante los per odos de tiempo de 3 a 18 hor as se enc uentran en la (tabla 4 en los resultados).

3. RESULTADOS

Los resultados obtenid os en la inv estigac i n se div idieron en varios pasos par a definir lesiones en los c obay os y a su vez el res ultado de la prueba inmunoperox idas a. El ex amen macroscpic o de las lesiones en los cobay os se r ealiz dur ante la necropsia y s e hiz o el estudio his topatologc o de los tejidos afectados. 3.1 Observa cin macroscpica de lesi ones Los cobay os fueron in oculados c on la c epa patgena e inmediatamente sometidos a obs ervacin continua en la que s e pudo deter minar que la zona del inc ulo a partir de seis hor as c omenz a pres entar tumefaccin y calor la cual fue progres iva hacia la parte superior de la pierna, les in que no se pres ent en los animales tes tigos. Des pus de 9 horas s e increment la tumefaccin del miembr o posterior con cr epitac in a la palpac i n e hinc haz n moder ada, lo que produjo en los animales una cojer a inicial y a las 15 horas se obs ervo postr acin por la sev eridad de las les iones; uno de los animales inoculados muri entr e las 15 y 18 horas con lesiones mas s ev eras en el msc ulo afectado y en la regin inguinal. Los hallazgos en la necropsia permitier on obs ervar que en las pr imeras hor as s e pres entar on c ambios discretos como son ligero edema en la zona de inoculacin; en los animales sacrific ados a las 6 hor as post inoc ulacin es ta lesin c omenz a s er mas notor ia, con pr esencia de reas osc uras (r ojo- negruzco) y de un lquido ser osanguinolento que pas o de liger o a s ever o despus de las 15 hor as y continu hasta las 18 horas pos t-inoculacin, pr es entndose en estos ltimos casos un aspecto

mucoide, que se distribuy por todo el miembr o y el tejido s ubc utneo del abdomen en s u r egin inguinal. En general, s e observ congestin liger a desde las 3 hor as de inoculac in en r ganos como pulmn, cer ebro, bazo, hgado y r in, pasando a moder ado despus de las 6 hor as y s ev era a partir de las 15 hor as, cuando el animal presentaba las lesiones v asc ular es mas sev eras. La cr epitacin y la presencia de gas fuer on notorias a partir de las 12 hor as en todos los animales inoc ulados. Las les iones principales en los animales de 18 hor as fueron tumefacciones crepitantes en la musc ulatur a estr iada esqueltica, tejidos de color rojo a marr n oscuro c on estr as negras; algunas reas apar ec an hmedas y despr endan ex udado oscur o mezclado con gases que le daban un par tic ular olor dulz n ( Fig. 10). Figura 10. Les iones en cobay o Cavia Porcellus a las 18 hor as de inoc ulados con Clostri dium c hauvoei. A. Tumef acciones crepitantes en musculatura estr iada esqueltica, tejidos de c olor rojo a marr n oscur o con es tras negr as. B. tumefacciones en mayor tamao.

3.2 Hi stopatologa Tabla 4. Res ultados es tads ticos de la calific acin de lesiones

his topatolgic as en tejidos de c obayo Cavia porcellus inoculados con cepa patgena de Clos tridium chauvoei.
Inoc ulacin 01/ 01/ 04 01/ 02/ 04 01/ 03/04c 02/ 01/ 04 02/ 02/ 04 02/ 03/04c 03/ 01/ 04 03/ 02/ 04 03/ 03/04c 04/ 01/ 04 04/ 02/ 04 04/ 03/04c 05/ 01/ 04 05/ 02/ 04 05/ 03/04c 06/ 01/ 04 06/ 02/ 04 06/ 03/04c 06/ 04/ 04 07/ 01/ 04 Horas sacrificio 3 3 3 6 6 6 9 9 9 12 12 12 15 15 15 18 18 18 18 18 1 1 1 1 0 1 3 1 1 1 0 1 1 1 1 2 2 1 1 2 0,0 806 0 0 0 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 0 2 2 0 1 3 0,1 249 1ab 1ab 1
a

Bazo

MEC

MEE

Duod eno 0 0 0 2 2 0 2 0 1 1 1 1 1 1 1 2 1 0 2 1 0,0 821

Hg ado 0 0 0 1 1 2 2 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 2 2 0,0 806

Pncre as 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,2429

Pulmn 2 2 1 2 1 1 3 2 1 3 2 3 2 2 2 2 2 1 2 2 0,8 513

Rin 1 0 0 2 1 1 1 1 2 1 3 0 2 1 1 2 1 1 1 2 0,2 342

cerebro 1 0 0 2 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 0,0 632

adrenal 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2,2 429

1abc 2abc 1
a

2abc 2abc 1
a

2bc 3bc 1
a

2abc 2abc 0a 3c 3c 1
a

3c 3c 0,0 001

MEC: msculo estr iado car diac o; MEE: msculo estr iado es queltico. C= grupos control inoculados c on clor uro de calcio. = nivel s ignific anc ia.

En la tabla 4 se muestra que las les iones mas importantes ocurrieron en el msculo estr iado esqueltic o ( MEE), nica v ariable que r esulto signif icativ a ( = 0,0001) demostr ando que hay difer enc ia marc ada entr e los gr upos ex perimentales.

Los cobay os des pus de 3 a 15 hor as de la inoculacin c on C. chauvoei y luego s acr ificados mostrar on lesiones leves a moder adas c omo s igue: a par tir de las 3 hor as se encontr una liger a necr osis c oagulativ a e infiltrado de neutr filos polimorfonuc lear es y ligero edema; despus de las 6 hor as s e hiz o notor ia la conges tin c on hemorr agias li geras y se pres ent una var iacin moder ada; a las 9 y 12 hor as se obs erv necrosis de coagulac in. La necros is y el infiltr ado polimorfonuclear fuer on ms sever os a las 18 horas , al ig ual que la pr esencia de for mas bacilares en cantidades abundantes. El grupo que demostr los c ambios mas s everos fue el grupo experimental de 18 hor as de inoculados y no fue nec es ario sacrif ic ar alg unos cobayos , sino que mur ieron por s i s olos. Las les io nes pr incipales fueron gangrena gas eos a c on marcada necrosis de coagulacin y de licuefacc in c on olor ftido. Se encontr una marc ada infiltrac in polimorfonuc lear de tipo neutr filo (fig. 11B) . En r ganos como el baz o se obs erv deplecin linfoide desde las 3 primer as horas de inoculac in en todos los cobayos, al igual que congestin desde las 9 horas s in tener una tendenc ia especfic a; sin embar go en el cobayo que mur i repentinamente, pres ento sever a congestin y hemorragias. Se obs erv aron c ambios v asculares c omo c ongestin en: pulmn, hgado, msculo estriado, msc ulo car diaco y rin (c orteza y mdula), des de las 3 horas de inoculac in c on C. chauvoei. En el cobayo que mur i entr e las 15 y 18 horas se obs erv hemorr agia muy s ever a. Figura 11. Msculo estriado es queltico de cobayo Cavia porc ellus inoc ulado con Clos tridium c hauvoei a las 18 horas. Se observa infiltrac in

polimorfonuclear y necrosis de coagulac in. A. 100X y B. 400X. A B

3.3 Observa cin con la prueba de inmunoperoxida s indirecta a Los res ultados c on la pr ueba de inmunohis toquimica indicar on la afinidad que tiene el Clos tridium c hauvoei por el msculo estr iado esqueltico, ya que se observ la pres enc ia solo en este tipo de tejido. En tejidos de: baz o, duodeno, hgado, pncreas, pulmn, msculo estr iado cardiaco, ri n, c erebr o y adr enales, c on esta pr ueba no s e obs erv o C. chauvoei (Fig. 12).

Figura 12. Msculo estriado esqueltic o de c obayo Cavia porcellus . A Colorac in de hematox ilina y eos ina; s e observa la pres enc ia de bac ilos en el endomis io ( 400x). B Coloracin con la tc nic a de inmunoperoxidasa; demostrando la pos itiv idad al detectar los bacilos de Clostri dium chauvoei (1000x).

Figura 13. Observac in de las plac as de tejido muscular esqueltico de cobay o Cavia porc ellus inoc ula dos con cepa patgena de Clostri dium chauvoei a las difer entes horas de s acrificio. A y B 3 horas de sacrificio; no se observ an cambios en el tejido muscular; C y D 6 horas liger o edema y necr osis c oagulativ a e infiltrado de neutrofilos polimorfonuc lear es; E y F 9 y 12 horas presencia de bacilos e infiltrac in polimorfonuc lear.

G y H 15 horas necros is de c oagulac i n y bacilos; I, J, K, L, 18 horas se obs erv a infiltracin polimorfonuclear, necros is de c oagulac in y la pres encia de bac ilos .

Figura 14. Color acin con la tc nic a de inmunoperoxidas a en Msc ulo estr iado esqueltic o de cobay o (Cavia porc ellus) demostrando la pos itiv idad de la pr ueba al detectar los bacilos de Clos tridium chauvoei con el antic uer po Monoc lonal Cc hex 1 (A) y con el antic uerpo Policlonal anti extr acto (control positivo) (B) y la negativ idad del anticuerpo

Monoc lonal c ontra Leptos pira (c ontrol negativo) ( C) y el Control del conjugado (D) .

Figura 15. Tejidos de los cobayos (Cavi a porc ellus) inoc ula dos con cepas de Cl ostridium Novyi, Septicum y Sordelli; observ ados con la tinc in de hematoxilina eos in a; s e obs erv a la necrosis en los tejidos, edema e infiltrac in polimorfonuclear, pero no se observa la pres encia de bac ilos de Cl ostridium c hauvoei; c on la inmunoper oxidasa indirec ta se demuestr a

la positividad y especific id ad de la pr ueba inmunohistoquimica al detectar los bac ilos de C. chauvoei.

Hematox ilina eos in a

C. septicum

C. novyi

C. s ordelli

Figura 16. La pr ueba de inmunoper oxidasa indir ecta demues tra la pres encia de bacilos en el tejido muscular esqueltico de cobayo; demostrando la especificidad del anticuerpo monoclonal el c ual identifica solo el C. chauvoei.

Inmunoper ox idas a indirecta

C. septicum

C. sor delli

C. novyi

C. chauvoei

4. DISCUSIN

El diagnstico de carbn s intomtic o s e confir ma en este tr abajo con la tc nic a de inmunohistoquimic a estandar izada, dado que se tr abaj con los anticuer pos especific os para garantiz ar la deter minac in de Clostri dium c hauvoei; estos resultados estn de acuerdo con Jones and Hunt ( 1990); sin embargo, es neces ar io plantear otro trabajo par a determinar la pr esencia de la bac ter ia en bovinos. Los c ambios patolgic os mas importantes s e obs ervaron en msc ulo estr iado esqueltico, y se encontr ar on alt erac iones par tir de las 3 horas pos t inoculacin que incluyen desde ligero edema hasta la gangr ena gas eosa sev era que se pr oduc e despus de las 15 horas , por la acc i n de las tox inas alfa y gamma, necr otizante e hidrolizante r espectivamente que des truy en la matr iz del tejido conectivo, res ultados que c onc uerdan con lo enc ontr ado por Hathew ay (1990) y Titball et al. (2003) . Esto indica que el tejido muscular es triado es queltic o r esulta ser el adecuado para el diagnstic o de carbn sintomtico, es te res ultado concuerda con Ass is et al (2005) quienes adems lo rec omiendan par a el diagnstic o del edema maligno; estos mismos autores que realiz aron trabajos con cobayos sugier en que posiblemente par a otras es pecies como bov inos, ovinos y capr inos se pudier an utilizar otros tejidos como ri n e hgado. La fijacin del tejido en for maldehdo per miti s u uso pos ter ior a la toma de la muestr a, sin pres entar cambios que alteren el diagnstic o; lo que le permitir a al ganader o tomar muestr as en los animales muertos para su anlisis posterior en los laborator ios, utilizando la tc nica de inclusin en parafina y la tc nic a de inmunoper oxidasa indirec ta tal como lo indica Haines and Chelac k (1991), de la mis ma maner a per mitir des arrollar inv estigac iones que ayudar an a realizar estudios de prev alenc ia de esta enfer medad en regio nes de Colombia donde no existen labor ator ios .

De ac uer do con los r esultados obtenidos, la tcnic a de hematoxilina y eos ina per mite observar lesiones anatomopatolgicas generales que nos hac en pensar en una c los tridios is, per o no per miten confir mar el tipo de Clostr idium involucrado tal como lo indic aron Ortiz y Benavides (2002). La tc nica de inmunoperoxidasa in direc ta es tandar iz ada en este trabajo per miti no solo dar c laridad de las les iones anatomopatolgicas producidas por C. chauvoei, sino que es una tc nica c onfirmator ia que identifica espec fic amente la bacteria por medio de un anticuerpo monoc lonal de acuerdo con Haines and Clarck (1991) . El uso de este anticuerpo monoclonal permiti r ealizar la tc nica c on per io dos de inc ubac in r elativamente cortos (1 hor a), lo que per miti que se pres entara muy baja colorac in de fondo ( Bac kgr ound), as mis mo el utilizar un antic uer po monoclonal c omo anticuerpo primario le da la espec ificidad a la pr ueba y a que solamente fue positiva par a C. chauvoei y no pres ent reacc iones cr uz adas c on otros c lostridium. El des arr ollo de esta tcnica utilizando el anticuerpo monoclonal

espec fico es un buen comienzo para una ser ie de tr abajos de inv estigac in en el rea de las clostridios is que nos per mitir tener una idea de la situac in de estas enfer medades en nuestr o pas, par a toma de dec isiones que ayuden al contr ol de las mis mas.

5. CO NCLUSIONES Y RECO MENDACIONES

Este trabajo per mite concluir que la tcnica de inmunoperox idas a indir ecta es la ideal para el diagnstic o del C. c hauvoei debido a que s e demostr su alta sensibili dad, confia bilidad y rapidez; es r ecomendable para futuras inv estigac iones y par a s u util iz acin c on tejidos de bov in os infectados. Los c ambios patolgic os mas importantes s e obs ervar on en msc ulo estr iado es queltico, y se encontr ar on alter aciones a partir de las 3 horas pos t inoculacin que incluy en desde ligero edema has ta gangr ena gas eosa sev era que se pr oduc e despus de las 15 horas , por la acc i n de las tox inas alfa y gamma, necr otizante e hidrolizante r espectivamente que des truy en la matriz del tejido c onectiv o. Esta tcnica de inmunoper oxidasa indir ecta adems de ser confiable, es rpida y no es c ostosa, a dif er enc ia de otr as tcnicas para el diagns tic o de C. c hauvoei c omo la inmunofluor esc enc ia dir ecta y PCR. La utiliz ac in de tejidos fijados en for mol bufferado al 10%, es una buena opc in ya que s e pueden env iar muestras des de r eas r emotas del pas y tambin estas muestras pueden ser almacenadas por el tiempo nec es ario sin alterar los res ultados de la tcnic a. De ac uer do con los r esultados obtenidos, la tcnic a de hematoxilina y eos ina per mite observar lesiones anatomopatolgicas generales que nos hac en pensar en una c los tridios is, per o no per miten confir mar el tipo de Clostr idium inv olucr ado; La tcnic a de inmunoper oxidasa indir ecta estandariz ada en es te tr abajo per miti no solo dar clar id ad de las lesiones anatomopatolgicas pr oduc idas por C. c hauvoei, sino que es una tc nic a

confir matoria que identific a es pec ficamente la bacter ia por medio de un anticuerpo monoc lonal. Este tr abajo es importante como s oporte para nuevos es tudios en el rea de bacter ias anaerobias en Colombia.

BIBLIOGRAFIA

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ANEX O No. 1 PREPARACIN DE SOLUCIONES BUFFER FOSFATO SALINO ( PBS) 0,01 M pH 7,2 Dis olver una pas tilla de PBS agua des tilada 2 gotas NaoH 1 nor mal x c ada 100ml. Ajus tar el pH a 7,2 Completar a volumen final de 100 ml ICN ( CA T 2810305) en 100 ml de

PEROXIDO DE HIDRO GENO AL 3% 3 ml de H2O2 30% + 27 ml metanol

SUERO FETAL BOVINO 47.5 ml H2O ultr apura + 0.05 gr albmina sr ica bovina + 2.5 ml suer o fetal bovino.