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Binokulartubus

3

Objektivrevolver

4

Objekttisch

5

Hebel für Klapplinse des Kondensors

6

Kondensor

7

Zentrierschrauben

8

Hebel für Apertur- blende

9

Kondensorhöhen- verstellung

10 Fokussierung

11 Leuchtfeldblende

Bauteile des Mikroskops
Bauteile des Mikroskops

Strahlengang durch ein Lichtmikroskop

Vergrößertes Bild des Präparats auf der Netzhaut

Okular

Objektiv

Kondensor

des Präparats auf der Netzhaut Okular Objektiv Kondensor Vergrößerung Präparat Aperturblende Beleuchtung
des Präparats auf der Netzhaut Okular Objektiv Kondensor Vergrößerung Präparat Aperturblende Beleuchtung
des Präparats auf der Netzhaut Okular Objektiv Kondensor Vergrößerung Präparat Aperturblende Beleuchtung

Vergrößerung

Präparat

Aperturblende

Beleuchtung

Leuchtfeldblende

Lichtquelle

Vergrößerung:

2,5x, 10x, 40x

Tubuslänge:

z.B. 160

Dicke der zu verwendenden Deckgläschen z.B. 0,17mm

Objektiv

Vergrößerung: 2,5x, 10x, 40x Tubuslänge: z.B. 160 Dicke der zu verwendenden Deckgläschen z.B. 0,17mm Objektiv

Auflösungsvermögen des Mikroskops

Auflösung

kleinster auflösbarer Abstand zwischen zwei Strukturen, der eine getrennte form - und farbgetreue Wahrnehmung dieser Punkte erlaubt

D = λ/A =λ/n

sin α

Berechnung der Gesamtvergrößerung

Gesamtvergrößerung = Objektiv- x Okularvergrößerung

Auflösungsvermögen

Auflösungsvermögen des menschlichen Auges:

0,3 mm in 1 m Entfernung

Auflösungsvermögen eines Lichtmikroskops:

0,2 µm

Auflösungsvermögen eines Elektonenmikroskops:

max. 0,15 nm

Justieren des Mikroskops

1.

Licht am Stativfuß auf max. Helligkeit.

2.

Präparat bei kleinster Vergrößerung auf den Objektivtisch legen. Deckglas nach oben!!!

3.

Bild fokussieren.

4.

10 x Objektiv in den Strahlengang schieben und Bild fokussieren.

5.

Okularabstand an den Augenabstand anpassen.

6.

Schärfe der Okulare (für jedes Auge getrennt) einstellen.

7.

Kondensor einklappen (Verfahren nach Köhler) Leuchtfeldblende schließen. Das nun sichtbare Bild der Blende durch Höhenverstellung des Kondensors scharf stellen.

8.

Aperturblende 2/3 schließen.

9.

Blendenabbildung mittels Zentrierschrauben am Kondensor in die Gesichtsfeldmitte bringen.

10.

Leuchtfeldblende wieder öffnen.

Klassische histologische Techniken

• Gewinnung von Gewebe zur Diagnostik und Forschung

– Sektionsgewebe

– Operationsmaterial

– Tierisches Gewebe

• Aufbereitung von Gewebe

– Abstrichpräparate

– Ausstriche

– Schnittpräparate

• Fixierung von Gewebe

– Physikalische Fixierung

– Chemische Fixierung durch Immersion oder Perfusion

Schnitt-

Präparate-

Herstellung für die Lichtmikroskopie

Schnitt- Präparate- Herstellung für die Lichtmikroskopie

Beispiele histologischer Techniken

Abb. 1 Abb. 2 Abb. 3 Abb. 4 Abb. 5 Abb. 6 Abb. 7

Hämatoxylin-Eosin-Färbung Trichromfärbung Silberimprägnation PAS-Reaktion Toluidinblau -Färbung Transmissionselektronenmikrokopie Rasterelektronenmikroskopie

Abb. 1: Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Die Hämalaun-Eosin- (HE-) Färbung nach Mayer ist die gängigste Routinefärbung in der Histologie und Histopathologie. Der Farbstoff Hämalaun färbt basophile Sub- stanzen wie die Nukleinsäuren der Zell- kerne (1) intensiv blau-violett an, wenn der Schnitt nach der Färbung in alkalischem Leitungswasser „gebläut“ wird. Azidophile (eosinophile) Zytoplasmakomponenten (2) werden mit Eosin in einem Rotton gegen- gefärbt. Bindegewebe wird ebenfalls rötlich dargestellt. Die Abbildung der Leber zeigt im Zentrum eine Vene mit hellem Lumen (X). Die Leberzellen (Hepatozyten) bilden auf die Vene zuführend radiär verlaufenden Le- berzellbalken. Blau gefärbte runde Zell- kerne (1) liegen in der Mitte der Zellen, manche Zellen weisen zwei Zellkerne auf ( * ). Das Zytoplasma (2) ist himbeerrot gefärbt, hellere rosafarbene Bereiche kennzeichnen die bindegewebigen Areale zwischen den Zellbalken. Hier verlaufen die Leberkapillaren (Pfeile).

Leber, Paraffinschnitt, PräparateNr. 1 22 ** 11 XX 10 µm
Leber, Paraffinschnitt, PräparateNr. 1
22
**
11
XX
10 µm

AbbAbb 2:2: Trichromfärbung n. Goldner

Durch Trichromfärbungen lassen sich Gewebearten färberisch gut voneinander unterscheiden. Kollagenfaserreiches Bin- degewebe hebt sich durch eine grüne Färbung deutlich ab. Differenzierungs- schritte zwischen den Farbreaktionen verstärken das kontrastreiche Färbeer- gebnis. Da diese Technik aufwendiger ist als die HE-Färbung, eignet sie sich eher für die Herstellung von Unterrichtsprä- paraten als für die Routinediagnostik. Bei der Trichromfärbung nach Goldner werden zunächst die Zellkerne mit Eisenhämatoxylin dunkel gefärbt, das Zytoplasma mit Säurefuchsin-Ponceau rot und die Kollagenfasern mit Lichtgrün türkisgrün dargestellt. Die Abbildung der Leber zeigt eine Zentralvene mit Blutzellen im hellen Lumen (x). Grüngefärbte Kollagenfasern (3) umgeben das Lumen des Gefäßes. Die dunkelroten Leberzellkerne (1) heben sich vom zinoberroten Zytoplasma (2) deutlich ab. Leberkapillaren fallen durch ihr weißes Lumen auf (Pfeile).

Leber, Paraffinschnitt, PräparateNr. 2 22 33 xx 10 µm
Leber, Paraffinschnitt, PräparateNr. 2
22
33
xx
10 µm

Abb. 3:

Silberimprägnation

Durch Imprägnationen mit Metallsalzen können Bindegewebsfasern selektiv braunschwarz dargestellt werden. Biel- schowsky entwickelte seine Methode zur Darstellung von Nervenfasern durch Im- prägnation der Neurofibrillen. Da sich die retikulären Bindegewebsfasern, (eine Son- derform der Kollagenfasern), ebenfalls gut versilbern lassen, wurde die Silber- imprägnation nach Bielschowsky in der klassischen Histologie zu einem etab- lierten Verfahren, um den retikulären Aufbau von Organen wie Leber, Milz und Lymphknoten färberisch darzustellen. Zellen werden bei dieser Versilberung- methode nicht imprägniert. Das filigranartige Bindegewebe, das die Kapillaren der Leber netzartig umgibt, ist schwarz imprägniert. Aufgrund der Licht- brechung sind die Zellkerne (1) der Hepatozyten schemenhaft zwischen den schwarzen Fasern erkennbar. Im Bereich der Zentralvene (X) ist das retikuläre Netzwerk durch Kollagenfasern (Pfeile) verstärkt.

Leber, Paraffinschnitt, PräparateNr. 14 11 xx 10 µm
Leber, Paraffinschnitt, PräparateNr. 14
11
xx
10 µm

Abb. 4:

Perjod-Acid- Schiff- (PAS-) Reaktion

Die PAS - Reaktion eignet sich zur Dar- stellung von Glykogen im histologischen Schnittpräparat. Durch Oxydation mit Per- jodsäure werden Aldehydgruppen frei- gesetzt, die mit Schiffschem Reagenz nachgewiesen werden können. Die PAS- Reaktion stellt Glykoproteine und Glyko- lipide dar. Da Glykogen wasserlöslich ist, wird das Gewebe vor der Reaktion mit einer alkoholhaltigen Lösung fixiert. Das zytoplasmatische Glykogen wird in kör- niger Form ausgefällt. Die Reaktion fokus- siert sich auf die Zellseite, die dem Eindringen der Fixierlösung abgewandt ist. Somit ist die zytoplasmatische Glykogen- darstellung in dem rechts gelegenen Zytoplasmaanteil durchweg stärker ausge- prägt als auf der linken Zytoplasmaseite. Das Phänomen wurde auch als „Glykogen- flucht“ bezeichnet. Die Zellkerne sind zur Kontrastverstärkung mit Methylgrün zart gegengefärbt. Die Vene (x) enthält ungefärbte Erythrozyten.

Leber, Paraffinschnitt, PräparateNr. 4 xx
Leber, Paraffinschnitt, PräparateNr. 4
xx

Abb. 5: Toluidinblaufärbung

Semidünnschnitte bieten auf lichtmikrosko- pischer Ebene eine gute Auflösung und bilden somit eine Brücke zwischen dickeren Paraffin- und Gefrierschnitte und der Hochauflösung von Ultradünnschnittpräpa- raten. Semidünnschnitte werden mit Tolui- dinblau in unterschiedlichen Blautönen ge- färbt. Voraussetzung für die gute Struktur- erhaltung ist eine optimale Fixierung mit glutaraldehydhaltiger Lösung, die auf dem Gefäßweg durch das Gewebe gespült wird. Dadurch sind die Gefäße überwiegend frei von Blutzellen. Die Abbildung zeigt ein venöses Gefäß (x) eines bindegewebigen Zwickels zwischen den blaugefärbten Leberzellbalken. Die Le- bergefäße werden von einer dünnen Endo- thelschicht ausgekleidet. Die Zellkerne der Hepatozyten (1) weisen einen deutlichen Nukleolus auf. Das Zytoplasma (2) wirkt durch die unterschiedliche Organellen- und Glykogendarstellung gefeldert. Fetttropfen in leberspezifischen Fettspeicherzellen (Pfeile) färben sich grünlich an.

Leber, Semidünnschnitt, PräparateNr. 3 11 22 x 1010 µµmm
Leber, Semidünnschnitt, PräparateNr. 3
11
22
x
1010 µµmm

Abb. 6

elektronenmikrokopie

Das Transmissionselektronen- mikroskop arbeitet mit einem Elektronenstrahl in einer Hochva- kuumsäule. Das Durchdringungs- vermögen des Strahls ist gering, der mikroskopierte Kunstharz- schnitt muß „ultradünn“ sein. Zur Kontrastverstärkung werden die Schnitte mit einer schwermetall- haltigen Lösung behandelt. Da- durch wird der elektromagne-tische Strahl im Elektronenmikros-kop stark abgelenkt und liefert dem Betrachter ein kontrastreiches Bild. Der Ultradünnschnitt der Leber zeigt mehrere benachbarte Leber- zellen. Bei zwei Leberzellen ist der Zellkern (1) mit Nukleolus (1a) getroffen. Im Zytoplasma verteilt liegen viele rundliche Mitochon- drien (2). Zwischen den Leber- zellen sind winzige Gallenkapil- laren sichtbar (Pfeile). Sie sammeln als erste Anlaufstation die Gallenflüssigkeit, die in den Le- berzellen produziert wird. Im unte- ren Bildteil ist eine Endothelzelle (3) getroffen, die die Wand der Kapillaren (X) auskleidet.

Transmissions-

11 22 1a1a 33 XX
11
22
1a1a
33
XX

Ultradünnschnitt, ca. 100 nm

Abb. 7: Rasterelektronen- mikrokopie

Bei der Rasterelektronenmi- kroskopie werden die Ge- websblöcke durch Feuchtig- keitsentzug getrocknet und mit einer dünnen Metallschicht (z.B. Goldstaub) bedampft. Gewebsblöcke werden mit einem Elektronenstrahl im Vakuum systematisch abgeta- stet und liefern so eine digitale Abbildung der Oberflächen- struktur. Eröffnete Hohlräume und Zelloberflächen können räumlich erfaßt werden. Die Abbildung zeigt die Ober- fläche zweier benachbarter Le- berzellen mit den zwischen den

Leberzellen angesiedelten Gal- lenkapillaren (Pfeile). Im linken und unteren Bildbereich liegen die eröffneten blutführenden Lebersinusoide (x), deren ge- fensterte Endothelzellen Lü- cken aufweisen und mit einem

Gittergerüst

Aufnahme: M. v. Düring

ausgestattet sind.

xx xx Leber, Ratte, Aufnahme von Fr. Prof. v. Düring 1 µm
xx
xx
Leber, Ratte, Aufnahme von
Fr. Prof. v. Düring
1 µm