REVISIN DE TCNICAS DE BIOINGENIERA PARA LA RECUPERACIN DE PRODUCTOS BIOLGICOS

*Amador-Mendoza, A.
*Doctorado en Biotecnologa. Divisin de Estudios de Postgrado.Universidad del Papaloapan Campus Tuxtepec, Oaxaca, Mxico

RESUMEN Es evidente la creciente necesidad de establecer mtodos escalables y selectivos para la recuperacin y purificacin de productos biolgicos que puedan ser efectivamente integrados con las operaciones de fermentacin y/o produccin. Dichos mtodos son esenciales para

rpidamente obtener productos en un estado listo para su validacin, formulacin y operaciones finales. Actualmente, las compaas biotecnolgicas se enfocan en la produccin de compuestos de alto valor comercial que tendrn impacto en industrias de diferentes sectores tales como, salud, qumica, alimentos y otros. Sin embargo el establecimiento de procesos de recuperacin y purificacin de este tipo de compuesto no es una tarea trivial y los procesos resultantes estn caracterizados por diversas ineficiencias asociadas al excesivo nmero de etapas y la baja eficiencia de las mismas. Por lo tanto es necesaria la evaluacin de procesos de bioseparacin modernos y la consideracin de novedosas estrategias para atender las desventajas de los procesos de purificacin . En esta revisin se presenta un panorama general de los procesos de recuperacin y purificacin de productos biolgicos. Se consideran los aspectos que han limitado el desarrollo de este tipo de procesos. Se discutirn las estrategias de recuperacin primaria de productos biolgicos, la intensificacin e integracin de procesos, aspectos de recuperacin in situ. Se dar particular importancia a los retos que presenta la recuperacin y purificacin de productos base protena que han sido modificados (conjugados protenapolmero) y a las diversas estrategias que se proponen para supurificacin selectiva. Las conclusiones estarn orientadas a identificar las posibles tendencias de los procesos de bioseparacin. ABSTRAC Clearly, the growing need for scalable and selective methods for the recovery and purification of biological products can be effectively integrated with the operations of fermentation and / or production. Such methods are essential to quickly get products in a state ready for validation, formulation and finishing operations. Currently, a biotech company focused on the production of commercially valuable compounds that will impact industries from different sectors such as health, chemicals, food and others. However, the establishment of processes for recovery and purification of this type of compound is not a trivial task and the resulting processes are characterized by various inefficiencies associated with the excessive number of steps and low efficiency thereof. Therefore it is necessary to evaluate modern bioseparation processes and the consideration of

novel strategies to address the disadvantages of the purification process. This review presents an overview of the processes of recovery and purification of biological products. We consider the issues that have limited the development of this type of process. We will discuss the primary recovery strategies biologicals, intensification and integration of processes, in situ recovery aspects. It will pay particular attention to the challenges of recovery and purification of protein based products that have been modified (conjugated protenapolmero) and the various strategies proposed for selective supurificacin. The findings will be aimed at identifying possible trends bioseparation processes.

INTRODUCCION La comercializacin de nuevos productos obtenidos a travs del empleo de la biotecnologa requiere un coordinado acople de operaciones unitarias a fin de desarrollar un proceso eficiente. El objetivo general de este proceso es convertir materia prima relativamente de bajo costo en productos de mayor valor comercial. En este sentido la biotecnologa se puede definir como la coleccin de procesos industriales que involucran el uso de sistemas biolgicos. Un esquema general de un proceso biotecnolgico se muestra en la Figura 1. El punto central de este proceso es el biorreactor. En esta unidad de operacin se utilizan catalizadores biolgicos

(microorganismos, clulas vegetales animales, enzimas, virus, etc.) para la produccin de sustancias, alimentos, agentes teraputicos, etc. de inters. No obstante, el biorreactor no existe aislado, sino que la eficiencia y xito de la operacin depende de un adecuado upstream processing (procesado previo) que incluye desde el diseo del medio de cultivo hasta la esterilizacin del mismo. Por otro lado, la recuperacin del producto final requiere una serie de operaciones referidas colectivamente como downstream processing (SP). Estas operaciones comprenden todos los tratamientos que requiere el cultivo, una vez finalizado, para la obtencin del producto en las condiciones de pureza y actividad deseadas. Las diferentes etapas de purificacin se han monitorizado mediante SDS-PAGE y la pureza de BPE obtenida se ha corroborado mediante espectroscopas de absorcin y emisin y RP-HPLC. Los resultados muestran que el mtodo de CALE es una tecnologa escalable que permite obtener grandes cantidades de ficoeritrina manteniendo altos rendimientos proteicos y reduciendo tiempo y costes de procesado. Finalmente, el potencial del extracto de ficoeritrina como colorante, se ha demostrado adicionndolo a diferentes productos alimenticios y bebidas comerciales. Otro estudio de separacion donde se aplica la ruptura celular es el realizado por Falero, Alina; et al 2009. Ellos realizaron un aislamiento y caracterizacin preliminar de una forma recombinante de la protena RstB del fago CTX de Vibrio cholerae. El objetivo de esta investigacion fue se construy una versin recombinante de RstB fusionada a una cola de seis histidinas (RstB-His) clonada en un vector de expresin y se dise un protocolo de purificacin de esta por cromatografa de afinidad

a iones metlicos inmovilizados y se evalu la actividad de unin a ADNcs de la protena obtenida. Se obtuvo la protena RstB-His biolgicamente activa con un 80 % de pureza.
Figura 1 . Esquema general de un proceso biotecnolgico

Otra tecnica de saparacion muy utilizada en la biotecnologia es la Electroforesis, un ejemplo tal es el estudio realizado por Georgina-Urbn C., et al 2012 el cual consisti en separacion por electroforesis (page-sds) del caseinomacropptido liberado por quimosina sobre la k-caseina. efecto de proteolisis por bacterias psicrtrofas. Dciho estudio fue realizado por electroforesis (PAGE-SDS), la separacin del caseinomacropptido (CMP) liberado por la accin de la quimosina sobre la k-casena, presente en el suero de quesera. Se encontr que adiciones superiores al 2% de suero en polvo a leche fresca de rebaos puede ser detectadas. La metodologa propuesta puede ser aplicada igualmente en la deteccin de suero en polvo de quesera en leche en polvo, en niveles superiores al 2 % (m/m). El mtodo no presenta interferencias en la deteccin del caseinomacropptido liberado en el suero, por otros pptidos generados por protelisis de psicrtrofas (Pseudomonas) en leches enfriadas. Los productos que resultan de los proceso biotecnolgicos pueden ser muy variados. La variedad estar dada por: a. La naturaleza qumica del mismo: sustancias simples (alcoholes, cidos

orgnicos); protenas, sustancias con actividad teraputica (antibiticos, hormonas) etc. b. El volumen de produccin y la concentracin del producto en el caldo de fermentacin: los llamados commodities (etanol, cido ctrico, etc.) se obtienen de a cientos o miles de ton./ao y en altas concentraciones en la fermentacin. Mientras que los agentes teraputicos de ltima generacin (hormonas, factores de coagulacin, etc.) se producen slo algunos kg/ao y su concentracin en la produccin es baja. Esto determina la escala de produccin. c. Los requerimientos de pureza del producto final. Las molculas a ser utilizadas en salud humana requerirn una pureza final muy diferente a las enzimas a ser utilizadas en los polvos para lavar de un acidulante para alimentos. Con estos criterios podemos agrupar a los productos tal como se muestra en la Tabla 1. Por ejemplo Castellano-Becerrill. M. E. et al 1996. Investigaron La utilizacin de la ultrafiltracin en la produccin de las inmunoglobulinas. Ellos presentan las experiencias de sustitucin de la liofilizacin por ultradiafiltracin como etapa intermedia para la eliminacin del etanol, sales y contaminantes proteicos de peso molecular inferior alcut-offdel mdulo usado (100 kd), en la produccin de inmunoglobulinas obtenidas por el mtodo de fraccionamiento de alcohol en fro. Se evalan las ventajas del uso ultrafiltro desde el punto de vista econmico por el aumento de rendimientos, y la factibilidad de obtener un producto libre de polmeros, lo que aumenta la calidad del preparado. Se compara el sistema de membranas planas con los cartuchos de fibra hueca en cuanto a flujo de trabajo. Otra investigacion es la realizada por Elaine Daz Casaas et al 2012. Ellos investigaron la Separacin de fosfolpidos mediante la aplicacin de fuerzas centrfugas. La separacin centrfuga es muy utilizada para la obtencin de productos farmacuticos y biotecnolgicos. Es la separacin o concentracin de fosfolpidos o ambas una de estas aplicaciones. El Objetivo de esta investigacion fue el seleccionar y evaluar el uso de diferentes separadores centrfugos as como el establecimiento de sus condiciones de operacin, para la obtencin de un concentrado de una mezcla fosfolipdica tpica. Se realiz la caracterizacin fsica de la suspensin a tratar para seleccionar el tipo de centrfuga ms adecuada y se determinaron las condiciones de operacin de esta. Se evalu adems la composicin de las mezclas fosfolpidicas obtenidas en cada caso. Se obtuvo que tanto una centrifuga de discos como una tubular son competentes para lograr la concentracin de fosfolpidos, con una composicin que puede ser utilizada para la formulacin de liposomas, cosmticos y medicamentos.Teniendo en cuenta la competencia de ambas centrfugas para rendir una mezcla fosfolipdica especfica y los similares rendimientos en la separacin, la mejor eleccin es una centrfuga tubular vertical por ser ms econmica y sencilla en su operacin que la de discos. Cabe mencionar que las tecnicas de Separacin tambien estan presentes an el area de la biotecnologia Alimentaria, como lo menciona Rosane R. Souza et al 2008 en su analisis en cuanto a Eliminacin de Grasas del Suero de Queso para Obtener Protenas y Lactosa. Ellos e estudiaron procesos de pre-tratamiento para la eliminacin de grasas y sales minerales del suero de queso tipo cido, para el aprovechamiento del contenido de protenas y lactosa. Se analizaron procesos

de separacin tales como centrifugacin y precipitacin termo-clcica seguidos de una etapa de micro-filtracin. El proceso de centrifugacin combinado con micro-filtracin se mostr ms eficiente en lo que se refiere a la eliminacin de grasa, obtenindose un promedio de 90% de recuperacin de protenas y de lactosa.

En la Tabla 2 vemos los volmenes de produccin de ciertos productos. En la Tabla 3 vemos las concentraciones de productos en los caldos luego de la etapa de produccin. En la Fig. 2 vemos como tanto volumen (2.a) como concentracin (2.b) inciden en los precios finales de estos productos.
Tabla 1. Caractersticas de algunos productos biotecnolgicos

Tabla 2. Produccin mundial aproximada de algunos productos biotecnolgicos

Por supuesto la ubicacin de un producto en este grfico no es fija. El mejor ejemplo son los antibiticos. La concentracin de los mismos en los caldos fue incrementndose a medida que se conoca ms del producto, se mejoraba la productividad de las cepas, se desarrollaban nuevas metodologas de produccin y as fue aumentndose el volumen y bajando los precios. Lo mismo puede ocurrir con los agentes teraputicos de ltima generacin. Por ello hablar de SP en Biotecnologa no es referirnos a algo invariable.

Tabla 3. Concentraciones tpicas de algunos productos biotecnolgicos a la salida delbiorreactor

Las etapas y metodologas a emplear estn determinadas por todo lo dicho, pero de cualquier manera se puede trazar un esquema general que sea aplicable a cualquier proceso. Estrategias de diseo de procesos de SP Para todos aquellos productos de la Biotecnologa llamada tradicional hay un gran conocimiento tecnolgico y de las propiedades bsicas de las molculas a purificar tanto como del entorno en que se encuentran luego de la etapa de produccin. No ocurre lo mismo con los productos de ltima generacin ya que, por las necesidades comerciales para aprovechar la baja competencia, el elevado precio, y dada la baja escala actual de produccin, la estrategia es llegar rpido con el producto al mercado con la tecnologa de SP que se posea (por lo general la desarrollada a escala de laboratorio).
Figura 3 . Metodologas utilizadas en los procesos de SP

INESTIGACIONES REALIZADAS EN LA BIOTECNOLOGIA PARA LOS PROCESOS DE SEPARACION Stambouli y Talel Ben Bechir en el 2001. Estudiaron la evaluacin de las prdidas por evaporacin y arrastre y de los cambios microclimticos durante el riego por aspersin de alfalfa. Durante el riego por aspersin, una parte del agua emitida por el aspersor puede perderse por evaporacin y

arrastre por el viento (PEA). Estas prdidas causan la reduccin de la evapotranspiracin (ET) durante el riego as como unos cambios microclimticos y fisiolgicos. Esta reduccin de la ET puede ser beneficiosa para los cultivos sobre todo durante los riegos diurnos. En este trabajo se ha estudiado las prdidas por evaporacin y arrastre brutas (PEAb) durante el riego por aspersin en cobertura fija en dos subparcelas cultivadas de alfalfa ambas equipadas por lismetros de pesada. Las PEAb han sido ms altas durante los riegos diurnos que durante los diurnos con un promedio de 11.6% y 5%, respectivamente.. Se calcularon las perdidas por evaporacin y arrastre netas (PEAnetas) descontando a las PEAb la variacin de la evapotranspiracin de cultivo regado (ETMT) y no regado (ETDT). Los resultados muestran que durante el riego diurno, la ETDT es superior a ETMT con unos valores promedios de todos los ensayos evaluados de 0.73 mm h-1 y 0.43 mm h-1, respectivamente, lo que supone unas PEAnetas del 7.6%. Para los riegos nocturnos, esta contribucin es de 0.02 mm h-1 lo que supone el 0.6% del agua aplicada total. Estos valores arrojan unas PEAnetas en los riegos nocturnos de 4.4%. Las PEAb contribuyeron tambin a los cambi Un mtodo sencillo de extraccin y evaluacin de la fraccin aromtica en chiles frutalesos microclimticos y fisiolgicos con una disminucin de la temperatura del aire, del dficit de presin de vapor as como de la temperatura de la cubierta vegetal, ms pronunciadas durante los eventos de riego diurno. Estos cambios microclimticos y fisiolgicos se manifiestan hasta 2-3 horas despus del evento de riego. Centelles-Enric, et al en el 2000. En este estudio se presenta una metdica de extraccin sencilla. basada en mtodos convencionales (extraccin slido-lquido), que combinada con un anlisis por cromatografia de gases mediante el uso de columnas semicapilares, permite de forma rpida y fiable, evaluar diversos aspectos que conciernen a la fraccin aromtica de un chicle. En una primera fase del estudio se ha aplicado la metdica sobre un chicle formulado tal como un producto comercial, dosificando dos aromas de la familia de los frutales en una misma concentracin. En una segunda etapa se ha trabajado con el mismo sustrato, dosificando en este caso cuatro dosis de un nico aroma frutal: 0,25%, 0,30%, 0,35%, 0,45%. Los resultados obtenidos muestran que, tomando como referencia los porcentajes de recuperacin de algunos componentes aromticos, la metdica propuesta es capaz de diferenciar entre aromas muy similares, y semicuantificar la dosis de aromas que se haya aplicado. Jos Andrs De La Pea Y Rafaela Marfil et al en el 2003 la sedimentacion salina actual en las lagunas de la mancha. Ellos realizado experimentos de crecimiento de cristales en el laboratorio por evaporacin y descenso de la temperatura de una sal. muera original, tomada en una laguna en el momento de mxima dilucin. Los resultados, tanto en sus aspectos secuenciales como morfolgicos, son contrastados con los datos de campo con el objeto de tener una hiptesis explicativa de los mecanismos de crecimiento que dan origen a la costra salina natural Asimismo, se investiga el efecto que las salmueras intersticiales, de naturaleza sulfatada y ricas en Mg+ fundamentalmente, ejercen sobre los minerales arcillosos heredados de los entornos de las

lagunas. Se ha comprobado que la mineraloga de arcillas en el rea fuente est integrada por ilita y un interestratificado regular corrensita, mientras que, en la laguna en la que se ha realizado este estudio, la ilita sigue persistiendo, si bien con ciertos cambios, al tiempo que la corrensita ha perdido parte de sus iones Mg2 para transtormarse en una estructura a 14 A. Adems, se ha observado que los minerales de arcilla estn mucho ms degradados hacia el techo de la secuencia salina. Oscar Arango et al en el 2003. relizaron un estudio de las condiciones de extraccin por arrastre con vapor del aceite esencial de laurel de cera (morella pubescens). El laurel de cera (Morella pubescens) es un rbol que por sus caractersticas resulta muy apropiado para el control de la erosin, y cuyos frutos son utilizados por comunidades campesinas del sur de Colombia para la obtencin de una cera que se emplea en el proceso de elaboracin de la panela. En esta investigacin se estudi el proceso de extraccin del aceite esencial de las hojas del laurel de cera mediante la tcnica de arrastre con vapor, y su efecto sobre la composicin de los metabolitos secundarios voltiles presentes en dicho aceite. Los factores estudiados en el proceso de extraccin fueron el tamao de partcula y el tiempo de extraccin, y las variables de respuesta consideradas fueron el rea total del cromatograma (cuentas) como parmetro indicador de la concentracin del aceite y el porcentaje relativo del componente mayoritario. Se determin que tanto el tiempo como la interaccin tiempo - tamao de partcula tienen efectos significativos (valor de P< 0,05) sobre la concentracin del aceite esencial, y al incrementar el tiempo de extraccin se observ un aumento significativo en el rea del cromatograma para el componente mayoritario. Se realiz la identificacin de los metabolitos secundarios voltiles presentes en el aceite esencial mediante cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (GC-MS), encontrando como componentes mayoritarios trans-cariofileno (21,3%), -selineno (10,7%), -selineno (10,0%), xido de cariofileno (4,8%), selino-3,7(11)-dieno (3,3%) y -elemenona (2,6%). Las actividades biolgicas de estos compuestos permiten pensar que el aceite esencial del laurel de cera podra ser de inters para las industrias farmacutica y cosmtica. Oscar Arango Bedoya et al en el 2003, estudiaron la extraccin, cristalizacin y caracterizacin de inulina a partir de yacn (smallanthus sonchifolius (poepp. & endl.) para su utilizacin en la industria alimentaria y farmacutica. La tendencia hacia la adopcin de una alimentacin sana y balanceada que incluya elementos naturales y benficos es creciente. Se plantea el aprovechamiento del yacn (Smallanthus sonchifolius (Poepp. & Endl.)), planta silvestre de la regin andina de Nario, por su alto contenido de inulina, fructooligosacrido utilizado en la industria alimentaria y farmacutica para la elaboracin de edulcorantes para diabticos y como fibra en alimentos refinados. Este estudio reporta la optimizacin del proceso de extraccin slidolquido, con agua caliente, de inulina a partir de races de yacn. La cuantificacin de inulina presente en el extracto se hizo a travs de refractometra. Varias combinaciones de tiempo, temperatura y relacin solvente-materia prima fueron analizadas empleando un diseo

experimental compuesto 2 ms puntos estrella. Se alcanz un rendimiento ptimo de 20.7% de inulina bajo unas condiciones de extraccin de 23 min a 82.2C y relacin solvente-materia prima de 4.5 l/500 g. La tcnica para la separacin de los cristales a partir de la solucin rica en inulina tuvo un rendimiento del 17.3% con relacin al peso en fresco del material experimental. Los cristales fueron caracterizados bajo propiedades fsicas, qumicas y organolpticas. La Empresa Farmacutica "8 de marzo" realiz una investigacin sobre Gel de hidrxido de aluminio y anlisis comparativo de mtodos de separacin slido-lquido que se utilizan en su produccin. Se analiz de forma comparativa diferentes variantes de separacin slido-lquido para la obtencin del gel de hidrxido de aluminio como sedimentacin, filtracin al vaco (por lotes y continua), filtracin a presin y centrifugacin. Se presentan las ventajas y desventajas de cada variante incluyendo un anlisis tcnico-econmico de stas. Se concluye que el uso de un filtro rotatorio al vaco satisface los requerimientos establecidos. Vigueras-Carmona et al 2007. Estudiaron el Efecto del pretratamiento termo-alcalino en la digestin anaerobia mesoflica y termoflica de lodos residuales secundarios. En este trabajo se evalua el efecto del pretratamiento termo-alcalino sobre la velocidad de digestion anaerobia mesoflica y termoflica de lodos residuales secundarios (LRS), separando la hidrolisis de los solidos suspendidos (SS) de la de los solidos disueltos (SD). Para estudiar la hidrolisis de los SS se utilizo el modelo de superficie de Sanders, este modelo incluye una constante de velocidad de hidrolisis basada en la superficie (KS BK) y para la hidrolisis de los SD se utilizo el modelo de saturacion de Goel este incluye una constante de velocidad maxima de hidrolisis (kh) y una constante de saturacion (KX). El pretratamiento, al disminuir el tamao de los solidos, aumenta sensiblemente el area superficial disponible para la accion enzimatica. KS BK es mayor con el pretratamiento y en condiciones termoflicas. El efecto del tratamiento en la digestion de los SD en condiciones termoflicas resulta en una inhibicion competitiva sobre la velocidad de hidrolisis anaerobia, mientras que en condiciones mesoflicas, el tipo de inhibicion es no competitiva. Una simulacion matematica con reacciones consecutivas de SS a SD y a metano, muestra que con un aumento a 4% en la concentracion de solidos iniciales en los lodos tratados termo alcalinamente, disminuye la inhibicion de la hidrolisis de SD en la digestion anaerobia termoflica. Lara, Alvaro R. et al 2003. Estudiaron la Produccin de Protenas Recombinantes En Escherichia Coli La produccin de protenas recombinantes (PR) es una de las aportaciones ms importantes de la biotecnologa moderna. El hospedero bacteriano mas importante para la produccion de PR es Escherichia coli, aunque otros como Bacillus subtilis y Bacillus megaterium estan cobrando cada vez mas importancia. Debido a su impacto economico y en el sector de la salud humana, el presente trabajo se enfocara principalmente a la produccion de PR terapeuticas en E. coli. Se abordaran en general los aspectos de diseo del vector, la cepa, el cultivo y la purificacion de la

PR, con enfasis en las oportunidades que la ingeniera metabolica ofrece para mejorar la produccion de PR y las estrategias de cultivo.

CONCLUSION
Las estrategias de diseo de procesos de SP para los productos conocidos pueden resumirse en: Conocer las propiedades fsicas y qumicas bsicas del principio activo y caractersticas del producto final (por ejemplo definir pureza requerida). El uso determina la pureza. Para agentes teraputicos se requiere un alto grado de pureza del principio activo. Se tolera un mximo de 100 ppm de impurezas de 10 pg/dosis, adems de estar libre de pirgenos. Definir perfectamente el material de partida.. Por ejemplo, pueden existir componentes del medio de cultivo (por lo general subproductos como agua de hidrolizado de maz, extracto de malta, sueros animales, albmina otros) que posean sustancias muy similares al producto final que, por lo tanto, interfieren en la purificacin del mismo. En este caso se debe eliminar ese componente del medio de cultivo.Trazar diferentes esquemas tentativos de SP y llevarlos a etapas de laboratorio y piloto. Algunas reglas que se siguen para ello son: a. Elegir en etapas sucesivas procesos basados en diferentes propiedades fisicoqumicas. Por ejemplo si una primera etapa es cromatografa de intercambio inico (propiedad: carga) se puede seguir con una cromatografa de filtracin por geles (propiedad: tamao). b. Separar las impurezas que estn en mayor proporcin en las primeras etapas. Por esta causa la etapa de separacin siempre finaliza en una concentracin, ya que el agua es por lo general la impureza mayoritaria (mayor del 90% en cualquier proceso fermentativo). c. Luego de la concentracin usar en las primeras etapas de purificacin propiamente dicha un mtodo de alta resolucin (por ejemplo cromatografa de afinidad). Estos mtodos poseen un alto rendimiento aunque no brinden la mayor pureza. En cierta medida lo que se hace es seguir concentrando para reducir la cantidad de muestra a tratar en las etapas posteriores. d. Dejar el proceso ms complejo (y por lo general ms caro) para el final. Se usan estos mtodos cuando tenemos la sustancia a purificar concentrada y pre-purificada..

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