Manual preliminar de Microbiologa y Parasitologa

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

CENTRO INTERDISCIPLANARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD-UST

OPTOMTRIA

MANUAL DE PRCTICAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA

DEPARATAMENTO DE FORMACIN BSICA INTERDISCIPLINARIA

ELABOR: BIL. JOS LUIS MOLINA MENDOZA

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Prctica No. 2 Mtodos de cultivo y aislamiento de bacterias. Objetivo: conocer las diferentes tcnicas de obtencin de exudados para el aislamiento en medios de cultivo slido de cultivos puros de bacterias. Introduccin Las bacterias se deben sembrar en medios de cultivo de laboratorio para caracterizar su crecimiento, hacer su identificacin y determinar sus actividades metablicas. Un medio de cultivo es una solucin acuosa de diferentes compuestos que contiene todos los elementos indispensables que requieren los microorganismos para crecer, Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios lquidos (caldos) o solidificados con agar para su propagacin y/o conservacin, as como para estudiar sus caractersticas de crecimiento. Lla inoculacin de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre debelan realizarse en zona asptica (cerca del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes. El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por mtodos de dilucin, en medios slidos por estra en placa o en medios lquidos. En el primer caso se considera que cada clula bacteriana que se separa dar origen a una poblacin que formar una colonia caracterstica, visible a simple vista. La limitacin principal de estas tcnicas de dilucin, es que no es prctica para el aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo de inters se encuentra en pequeas cantidades, donde solamente se obtendrn las bacterias dominantes. Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, se aplican mtodos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que contienen nutrientes especiales, antibiticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento del microorganismo de inters y se conocen como selectivos o de enriquecimiento. En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros componentes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. para distinguir especies bacterianas diferentes por la forma en que metabolizan los sustratos que se manifiesta por cambios en la apariencia o modificacin del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterizacin e identificacin de especies bacterianas.

Materiales 3 cajas de petri con agar nutritivo 1 mechero 3 hisopos estriles

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Procedimiento Obtener diferentes muestras de exudado: bucofarngeo, nasal y ocular. con las que el alumno practicar la tcnica de aislamiento por estra cruzada. Tcnica de estra cruzada a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra de exudado con el hisopo e inocular la muestra haciendo 4-5 estras simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja (Figura 1). b) Flamear el asa de inoculacin y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estras recin hechas. c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estras y hacer un segundo grupo de estras en el segundo cuadrante como en el caso anterior. d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el ltimo cuadrante, no se deber flamear el asa de siembra y se har una estra ms abierta (simple)

Fig. 1 Aislamiento de bacterias por estra cruzada en placa

Condiciones de incubacin Incubar las cajas en forma invertida a 35C durante 24 horas.

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Prctica No. 3 Tincin diferencial de Gram Objetivo: determinar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la tincin de Gram. Introduccin La tincin propuesta por el mdico dans Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales ms utilizadas para clasificar los cultivos bacterianos en Gram positivas y Gram negativas. El mtodo se fundamenta en el hecho de que el colorante primario (cristal violeta) tie por igual a todas las bacterias, pero la combinacin con el colorante es ms permanente en los gram positivos. Para establecer la diferenciacin en estos dos grupos, se aplica un disolvente del colorante primario que no tiene efecto sobre el grupo de microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sera muy difcil su observacin por lo que es preciso tratarlos con otro colorante llamado secundario, como la safranina, el cual no modifica el color de los microorganismos que haban retenido el color primario, pero tie a los microorganismos decolorados. Estas diferencias de tincin de las bacterias se explican por cambios en la composicin qumica y estructura de las paredes celulares, bacterianas que facilitan la retencin o eliminacin del colorante primario despus del proceso de decoloracin. Otras tinciones que permiten obtener mayor informacin son la negativa y la selectiva. La tincin negativa facilita las observaciones de la morfologa y tamao de las bacterias sin alteracin por efecto del calor as como de estructuras especiales, como la cpsula de algunas especies bacterianas. La cpsula tambin llamada glicoclix es una estructura externa a la clula, formada de polisacridos o polipptidos, que confiere proteccin a las bacterias contra la desecacin y la fagocitosis. La extensin sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias con tinta china o nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales como son las cpsulas, que aparecen como una zona clara que rodea la clula bacteriana en unfondo obscuro. Las tinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como las endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y localizacin son importantes criterios de clasificacin taxonmica. Adems, debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies son microorganismos patgenos de gran toxicidad, su deteccin en microbiologa alimentaria y mdica adquiere gran inters.

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Materiales 1 Puente de tincin 1 Vaso de precipitados de 100 ml 1 Mechero 5 Portaobjetos 1 Piceta con agua destilada Cristal violeta Safranina Lugol Solucin de alcohol-acetona Procedimiento El alumno preparar frotis de cultivo slido de cada microorganismo y aplicar la tincin de Gram. Tincin diferencial de Gram a) Cubrir el frotis con 2 gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto b) Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante c) Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos. d) Lavar cuidadosamente el frotis con agua. e) Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya ms tintura. f) Inmediatamente lavar con agua. g) Aplicar 2 gotas de safranina durante 30 segundos. h) Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar secar al aire. Observaciones al microscopio 1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda. 2. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequea gota de aceite de inmersin sobre la preparacin. 3. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que daan a estos sistemas. Aceite de inmersin Microscopio compuesto

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Resultados a) Reportar las observaciones de forma, agrupacin y color de acuerdo a la tincin de Gram. b) Hacer los dibujos de la morfologa de cada uno de los microorganismos y colorearlos. c) Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.

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Prctica No. 4 Mtodos de cultivo y descripcin morfolgica de hongos microscpicos Objetivo: Conocer las tcnicas de cultivo y manipulacin de diferentes tipos de hongos microscpicos, as como. las principales caractersticas morfolgicas de dichos microorganismos.

Los hongos son organismos eucariticos y de mayor tamao que las bacterias, se distinguen de otros eucariontes como los animales por ser inmviles y de las algas y plantas por carecer de pigmentos fotosintticos. Son de nutricin hetertrofa, es decir dependen de nutrientes orgnicos que son solubilizados por sistemas enzimticos especficos y son absorbidos a travs de su pared celular y membrana plasmtica. Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multicelulares (filamentosos), sin embargo, tambin existen hongos dimrficos principalmente patgenos que se presentan en las dos formas alternativamente, dependiendo de condiciones ambientales como la temperatura. Las levaduras son clulas de forma esfrica u oval, ampliamente distribuidas en la naturaleza; frecuentemente se encuentran formando una cubierta polvosa fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reproducen asexualmente por gemacin, un proceso por el cul brota una protuberancia o yema de la clula madre que posteriormente se separa como clula individual. El cuerpo o estructura vegetativa caracterstica de los hongos filamentosos (mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifas ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los Zygomycetes las hifas no presentan estos septos y se les conoce como hifas cenocticas. El principal mecanismo de reproduccin de los hongos es asexual, por fragmentacin de hifas vegetativas o por la produccin de abundantes esporas en conidiforos y esporangiforos formados en hifas areas llamadas hifas reproductivas. Sin embargo, la descripcin de las estructuras de reproduccin sexual es el principal criterio de clasificacin, por el que pueden ser ubicados en tres subdivisiones o phylum: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota. Se estima que puede haber 1.5 millones de especies de hongos, de las cules se han descrito ms de 250 000 y de stas solo se conocen 150 especies patgenas para el hombre y otras tantas para plantas y animales.

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Materiales 4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA 1 Mechero de bunsen 5 Portaobjetos y cubreobjetos 1 Aguja de diseccin 1 Asa de siembra Microscopio ptico de campo claro Aceite de inmersin Procedimiento inocular los diferentes hongos desarrollados en los alimentos en descomposicin en cajas de Petri con medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA), que es un medio complejo. Siembra de hongos 1. Para sembrar los hongos filamentosos, se deber separar una parte de micelio de los tubos de cultivo con aguja de diseccin, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada. 2. Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDA. 3. Las levaduras se inocularn por estra cruzada sobre la superficie de las cajas, en forma similar a la inoculacin de bacterias. 4. Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plstico en forma invertida dentro de una incubadora a 28-30 C durante 3-5 das. Descripcin macroscpica de levaduras y mohos 1. Hacer la descripcin de la forma, tamao, aspecto, textura y color de las colonias de Saccharomyces sp. 2. En los cultivos de mohos describir la forma, tamao y el tipo de colonia, as como las caractersticas del micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, areo o pegado al medio) el color del micelio, el color de esporas, cambios en el medio de cultivo, etc. Descripcin microscpica de levaduras 1. De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teirlo con azul de metileno. 2. Hacer observaciones al microscopio con objetivo de 40X y 100X. Resultados Hacer los dibujos de las observaciones morfolgicas de cada uno de los microorganismos y colorearlos. Investigar en la literatura como se clasifican los hongos estudiados en la prctica. Autoclave Incubadora a 30 C Azul de lactofenol Azul de metileno Alimentos en descomposicin (pan, tortilla, entre otros) Pulque (levaduras).

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