Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos OBJETIVOS Realizar adecuadamente la cuantificacin de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la tcnica

descrita en la Norma Oficial Mexicana. Explicar el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin de Staphylococcus aureus en alimentos. GENERALIDADES Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no son mviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, as por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aerbicas, con la subsecuente liberacin de cido, principalmente cido actico con pequeas cantidades de bixido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentacin es el cido lctico. Las tres condiciones necesarias para su ptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30C y ausencia de microorganismos competitivos. Este ltimo punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lcteos, tambin se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sera el jamn; otro factor importante en los alimentos es el pH, as tenemos en el caso de la mayonesa, sta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxignico y finalmente c) tambin se puede localizar en personas y animales. Estos ltimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos. Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una contaminacin postproceso con tipos enterotoxignicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de conservacin inapropiadas; este problema se acenta por la ausencia de flora competitiva, que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo

El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina, que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. Como se mencion con anterioridad son 5 enterotoxinas: A, B, C, D y E, siendo la A la ms nociva La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1.0 microgramo), para causar intoxicacin, es de 106 UFC/g de alimento, de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana, sin embargo Jablonski et al, comentan que el FDA, establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patgeno, en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento, provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocccica por gramo de alimento, es suficiente para causar sntomas asociados con la intoxicacin antes mencionada. Tambin es importante observar, que en la mayora de los brotes de intoxicacin causados por este microorganismo, se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida, aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido an ms bajas, del orden de 0.01 microgramo, suficientes para provocar una intoxicacin en el hombre. Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias, no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia, sabor y olor, por lo que no se distinguen de los alimentos que no estn contaminados con este microorganismo, por esta razn el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto. Los alimentos sometidos a intensa manipulacin durante su preparacin y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7.2 C y por debajo de 60 C) despus de su preparacin, son los alimentos ms involucrados en la intoxicacin estafilocccica. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelera, como pasteles rellenos con crema, pies de crema, coberturas de chocolate, leche y sus derivados, rellenos para sndwiches y papas, son los ms comnmente asociados con intoxicaciones estafilocccicas. En los humanos, las cepas de Staphylococcus habitan en forma especfica en el tracto nasofarngeo, cabello y piel del 50% o ms de los individuos, sin causar dao aparente (portadores asintomticos), pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. La especie aureus, es la considerada patgena dentro del gnero Staphylococcus y est comnmente asociado a casos de artritis, osteomielitis, meningitis, neumona y en algunos casos puede llegar a ocasionar prdida del conocimiento. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas, son las ms importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias.El establecimiento de los sntomas de la intoxicacin, por lo general se presentan rpidamente y en muchos casos de forma aguda, aunque depende de: la susceptibilidad de la persona hacia la toxina, la cantidad consumida del alimento contaminado, la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. Los sntomas ms comunes de intoxicacin consisten en nusea, vmito, dolor o espasmos abdominales y postracin. Sin embargo, existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos sntomas asociados a la enfermedad. En

casos ms severos, se puede presentar dolor de cabeza, calambres musculares as como cambios intermitentes en la presin sangunea y pulso. La recuperacin parcial se alcanza a los 2 das, sin embargo la recuperacin completa puede durar ms das en casos muy severos. El trmino Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulacin del fibringeno sanguneo, utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del husped. Esta reaccin se utiliza in vitro para la identificacin de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas, mediante el uso de plasma. Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones. Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este microorganismo enterotoxignico. Demostrar la contaminacin postproceso, la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas. FUNDAMENTO La presente tcnica para la deteccin de Staphylococcus aureus, consiste en los siguientes pasos: 1. Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo slido, el cual inhibe el desarrollo de gneros diferentes al Staphylococcus, pero adems permite reconocer el desarrollo caracterstico del microorganismo buscado. 2. Recuperacin de la cepa, este paso permite restaurar las clulas daadas de Staphylococcus aureus. 3. Identificacin bioqumica, en este punto se identifica el gnero y especie de Staphylococcus aureus enterotoxignico. Estas pruebas bioqumicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. La caracterizacin bioqumica de Staphylococcus aureus toxignico en estas pruebas es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva Presencia de termonucleasa positiva La determinacin del Staphylococcus aureus mediante extensin del inculo en superficie, es adecuado para el anlisis de alimentos en los que se espere encontrar ms de 100 clulas de Staphylococcus aureus/g 10 clulas de Staphylococcus aureus/ mL de alimento.

El aspecto cuantitativo en la investigacin de Staphylococcus aureus es de suma importancia, no slo desde el punto de vista econmico, sino en el de salud pblica; la Norma establece un lmite mximo de 106 UFC/g de alimento para que ste pueda ser consumido. Desde este punto de vista y de acuerdo con la tcnica mencionada, la sensibilidad mnima de deteccin en el recuento en placa, utilizando el mtodo de extensin de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras slidas 10 UFC/mL para alimentos lquidos. NOTA La sensibilidad se podr aumentar a 10 UFC/g 1 UFC/mL, solamente si se coloca 1.0 mL de la primer dilucin del alimento, distribuido en tres placas de agar Baird Parker, esto representa una cantidad aproximada de inculo de 0.33 mL por caja. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 4 cajas de Petri con 20.0 mL de agar Baird Parkera. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo infusin cerebro corazn (BHI). 1 caja de Petri con 20.0 mL de agar DNA. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL cada uno de caldo manitol. (opcional) 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90.0 mL de agua peptonada al 0.1% o una solucin amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2. 3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9.0 mL de agua peptonada al 0.1% o una solucin amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2. MATERIAL Y EQUIPO Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn. (se debe utilizar una pipeta para cada dilucin) Pipetas Pasteur estriles. Pipetas graduadas estriles de 10 mL con tapn de algodn. (en caso que la muestra sea lquida. Propipeta. Varillas de vidrio de 3.5 mm de dimetro aproximadamente y 20 cm. de largo, dobladas en ngulo recto (forma de L), estriles (se debe utilizar una por dilucin). Utensilios estriles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas, tijeras, esptulas y separador de huevo. Vaso de licuadora estril o Bolsa para Stomacher.

Motor para licuadora o Stomacher. Asa bacteriolgica. Portaobjetos. Balanza granataria. Horno para esterilizar material de vidrio. Autoclave Bao de agua a ebullicin Incubadora a 35 2C

Homogenizar con 225 ml de diluyente

Pesar 25gr de muestra

PROCEDIMIENTO 1. Aislamiento selectivo. 1. Pesar 25.0 g de muestra en una caja de Petri estril. 2. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estril. 3. Adicionar 225.0 mL de agua peptonada estril al 0.1% o solucin amortiguadora de fosfatos 0.1M de pH 7.2. 4. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora a velocidad mnima. 5. Realizar diluciones decimales hasta 10-3(el nmero de diluciones est en funcin de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo diluyente. 6. Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 a cajas de Petri con agar Baird Parker. 7. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estril, en forma de L, iniciando a partir de la mayor dilucin (Mtodo de inoculacin por extensin en superficie). 8. Mantener las placas en su posicin hasta que el inculo sea absorbido por el agar, entre 5 y 10 minutos aproximadamente. 9. Invertir las placas e incubar a 35 1 C. durante 45 a 48 h. 10. Despus de incubar, observar las colonias caractersticas de este microorganismo en el agar Baird Parker (BP). stas se presentan como: colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas con dimetro de 1 a 2 mm, muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia. BIBLIOGRAFA. Jablonskin L.M. & Bohach G:A. 2001. Staphylococcus aureus In:Doyle M. Beuchat. L:R. & Montville T:J. (Eds.) Food Microbiology Fundamentals & Frontiers. ASM. USA: 411434. NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC.