Validacin de los mtodos microbiolgicos PROTOCOLO DE VALIDACIN

Norma ISO 17025

Bqca. QM Alicia I. Cuesta, Consultora Internacional de la FAO

Objetivos a desarrollar Validacin de mtodos:

Intentamos contestar las siguientes preguntas: Qu es validar? Por qu valido? Para qu valido? Cundo valido? Cmo valido?

 Qu es en la prctica validar un mtodo? Es realizar un conjunto de pruebas de manera de: Comprobar varios aspectos del comportamiento del mtodo. Establecer que sirve para el fin previsto.

Todo esto debe ser documentado y archivado.

El laboratorio acuerda con el cliente el mtodo a usar para realizar un ensayo. El laboratorio debe usar los mtodos y procedimientos ms apropiados dentro de su alcance para todos los ensayos.

Caractersticas que se tienen en cuenta para seleccionar el mtodo de ensayo: Propiedades analticas: precisin, exactitud, especificidad, sensibilidad, el lmite de cuantificacin y/o de deteccin, los efectos matriciales Facilidad de uso o automatizacin. Rapidez de anlisis o respuesta. Costo. Mtodo normalizado

Definicin de mtodo alternativo:

Es un mtodo de anlisis que demuestra o estima un analito (un microorganismo, sus componentes o su producto), para una categora dada de productos, como lo hace su correspondiente mtodo de referencia. El mtodo alternativo exhibe atributos apropiados a las necesidades de los usuarios, por ejemplo: - la velocidad de anlisis y/o respuesta; - la facilidad de ejecucin y/o automatizacin; - las propiedades analticas (la precisin, exactitud, el lmite de deteccin, etc.); - la miniaturizacin; - el reduccin de costo.

Qu mtodos se validan?
LOS MTODOS NO NORMALIZADOS. LOS MTODOS QUE DISEA O DESARROLLA EL LABORATORIO. LOS MTODOS NORMALIZADOS EMPLEADOS FUERA DEL ALCANCE PREVISTO. Verifico USO MTODOS OFICIALES, MTODOS NORMALIZADOS O MTODOS DE ORGANISMOS NACIONALES O INTERNACIONALES RECONOCIDOS.

ES RECOMENDABLE LA UTILIZACIN DE MTODOS NORMALIZADOS O DE REFERENCIA, SIEMPRE Y CUANDO STOS ESTN DISPONIBLES Y SEAN APROPIADOS.

CUANDO HAY GRAN INFORMACIN SOBRE UNA METODOLOGA LOS ENSAYOS PARA VALIDAR SON RELATIVAMENTE SENCILLOS, SI LA EXPERIENCIA ES ESCASA LA VALIDACIN SER EXTENSA.

VALIDACION PRIMARIA
Validacin: Confirmacin, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplidos los requisitos para el uso pretendido o una aplicacin especfica. [ISO 9000: 2000]
Antes de realizar la validacin se deben especificar:

Alcance. Se deben declarar los CRITERIOS DE APTITUD PARA LOS FINES.

MTODOS NO NORMALIZADOS: Cuando sea necesario utilizarlos deben ser validados adecuadamente antes del uso. Bsqueda de informacin sobre datos de validacin previa. Deben incluir una especificacin clara de los requisitos del cliente y del objeto del ensayo.

MTODOS DESARROLLADOS POR EL LABORATORIO:

Debe ser : Una actividad planificada (PROCEDIMIENTO) Ser asignada a personal calificado Proveer los recursos necesarios. Los planes deben ser actualizados a medida que avanza el desarrollo y deben asegurar que la comunicacin sea eficaz entre todo el personal involucrado. En este caso, el proceso de validacin es mucho ms arduo, ya que se debe demostrar que cada paso elegido responde a lo esperado.

Para los mtodos de ensayo nuevos es conveniente elaborar procedimientos antes de la realizacin de los ensayos los que deben contener, como mnimo, la informacin siguiente:

a)Una identificacin apropiada de los mtodos de ensayo. b) El alcance.(intervalo de concentracin del analito) c) La descripcin del tipo de tem a ensayar. d) Los parmetros o las magnitudes; y los rangos a ser determinados. e) Los aparatos y equipos, incluidos los requisitos tcnicos de funcionamiento. f) Los patrones de referencia y los materiales de referencia requeridos. g) Las condiciones ambientales requeridas y cualquier periodo de estabilizacin que sea necesario

Para los mtodos de ensayo nuevos es conveniente elaborar procedimientos antes de la realizacin de los ensayos los que deben contener, como mnimo, la informacin siguiente (cont):

h) La descripcin del procedimiento incluida la siguiente informacin: -diagrama de flujo -marcas para identificacin durante la manipulacin, el transporte, el almacenamiento y la preparacin de los tems. - las verificaciones a realizar antes de comenzar el trabajo - la verificacin del correcto funcionamiento de equipos y, cuando corresponda, su calibracin y ajuste antes de cada uso; - el mtodo de registro de las observaciones y de los resultados; -las medidas de seguridad a ser observadas. i) Los criterios o requisitos para la aprobacin o rechazo. j) Los datos a ser registrados y el mtodo de anlisis. k) La incertidumbre o el procedimiento para estimar la incertidumbre.

LOS MTODOS NORMALIZADOS EMPLEADOS FUERA DEL ALCANCE PREVISTO

Mtodos normalizados aplicados a matrices que no se especifiquen en el procedimiento normalizado. Ampliaciones y modificaciones de los mtodos normalizados. Para demostrar que una versin modificada de un mtodo cumple las mismas especificaciones que el mtodo original, deben realizarse comparaciones utilizando replicados.

Sistemas de ensayo comerciales (kits)

Los laboratorios deben conservar los datos sobre la validacin de los sistemas de ensayo comerciales (kits) que utilicen. Estos datos pueden obtenerse de ejercicios de intercomparacin o de datos sobre validacin remitidos por los fabricantes y sujetos a la evaluacin de una tercera parte (p. ej., AOAC). wwwaoac.org Si no se dispone de datos sobre validacin o si stos no son plenamente aplicables, el laboratorio ser responsable de completar la validacin del mtodo.

VALIDACION SECUNDARIA (Verificacin) Demostracin por experimento que un mtodo establecido funciona de acuerdo con las especificaciones en las manos del usuario. Verificacin: Confirmacin, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplido los requisitos establecidos. [ISO 9000:2000]

MTODOS NORMALIZADOS:
Antes de analizar cualquier muestra, los laboratorios debern verificar su capacidad para cumplir de forma satisfactoria todos los requisitos establecidos en dichos mtodos. El laboratorio debe confirmar que puede operar correctamente los mtodos normalizados antes de introducir los ensayos. Se debe mantener actualizadas las normas. Si el mtodo normalizado cambia, se debe repetir la confirmacin.

MTODOS NORMALIZADOS:
Cuando sea necesario, la norma debe ser complementada con detalles adicionales para asegurar una aplicacin coherente. Ejemplo: La metodologa empleada para la leche UAT incluye una incubacin previa siete das a 37 C y luego se realiza el ensayo segn FIL-IDF 100B:1991. Esto debe ser especificado cuando se hace referencia a la metodologa en el informe de ensayo.

LA VALIDACIN DE LOS MTODOS DE ENSAYO DEBE:

REFLEJAR LAS CONDICIONES REALES DE ENSAYO. (USANDO PREFERENTEMENTE MATRICES NATURALMENTE CONTAMINADAS). LA EXTENSIN DE LA VALIDACIN NECESARIA DEPENDER DEL MTODO Y SU APLICACIN. LA DEBE REALIZAR PERSONAL CALIFICADO PARA ESA ACTIVIDAD. EN TODOS LOS CASOS UN PARMETRO PARA LA VALIDACIN DE ENSAYOS MICROBIOLGICOS ES LA DESCRIPCIN DEL MTODO DE ENSAYO.

Uso de muestras naturalmente contaminadas y preparacin de muestras artificialmente contaminadas en estudios de validacin Anexo C prEN ISO 16140:1999 1ra opcin: Muestras naturalmente contaminadas 2da opcin: Contaminacin por mezcla. 3ra opcin: Muestras inoculadas (el nivel de microflora debe
representar la contaminacin de las muestras naturalmente contaminadas).

4ta opcin: Materiales de referencia

Validar mtodos microbiolgicos requiere:

Comparar con un MTODO DE REFERENCIA REFERENCIA. Usar cepas de referencia y cepas de referencia certificadas.(Material de referencia). LA EVALUACIN SISTEMTICA DE FACTORES. Ensayos Interlaboratorios Interlaboratorios. La estimacin de la incertidumbre.

El PROTOCOLO INCLUYE: Primera FASE: Estudios precolaborativos o FASE: validacin interna (estudios comparativos):
Defino la aplicabilidad (concierne al analito de inters y a las categoras de alimentos a las que se aplica el mtodo). (TABLA: Clasificacin de categoras de alimentos para estudios de validacin Anexo A AOAC).

Segunda FASE: Estudios o ensayos colaborativos FASE:

Cuando la exigencia es de disponer de mtodos validados plenamente, se considera habitualmente que la validacin plena de un mtodo de anlisis comprende un examen de las caractersticas del mtodo en un estudio del funcionamiento del mtodo entre laboratorios .

Clasificacin de tipos de muestras para estudios de validacin Anexo B prEN ISO 16140:1999

Primera etapa de la validacin Ensayos selectivos se usan cepas en estudios de ( VALIDACION INTERNA): INCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos pertenecientes al grupo deben ser detectados por el mtodo.
SENSIBILIDAD

EXCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos que no pertenecen al grupo no deben ser detectados por el mtodo.
ESPECIFIDAD

Cepas para ensayos de selectividad: prEN ISO 16140:1999 ANEXO G

Categoras de Grupos Target: Eleccin de microorganismos qu cepas uso?

a) Un grupo Ejemplo Coliformes, Aquellas que dan reaccin tpica levaduras, bacterias acido-lcticas en el mtodo de referencia. b) De la Familia Ejemplo Enterobacteriaceae Incluir miembros representativos de todos los gnero pertenecientes a la familia

c) Gnero Ejemplo Salmonella spp Incluir miembros representativos si es posible de todas las especies pertenecientes al gnero. d) Especie Ejemplo Listeria monocytogenes e) Cepa Ejemplo Listeria monocytogenes 1a Rango de cepas pertenecientes a la especie Rango de fuentes de esta cepa

Cepas para ensayos de selectividad: prEN ISO 16140:1999 ANEXO G

Categoras de Grupos no Target : Target a) Un grupo no target Eleccin de microorganismos Aquellas que dan reaccin negativa (segn microorganismo target) Incluir cepas no pertenecientes a la familia. Incluir cepas no pertenecientes al gnero similar a la cepa target Incluir cepas no pertenecientes a la especie, incluidas en el gnero Incluir cepas no target, incluidas en la especie.

b) De la Familia c) Gnero d) Especie e) Cepa

Cepas para ensayos de selectividad: prEN ISO 16140:1999 ANEXO G

Validacin mtodo cualitativo

Descripcin detallada del mtodo de ensayo. LMITE DE DETECCIN SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD DESVIACIN POSITIVA Y DESVIACIN NEGATIVA EFECTO MATRICIAL Exactitud relativa repetibilidad y reproducibilidad

Diseo de un estudio de validacin mtodo cualitativo :

AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validacin interna (estudios comparativos). Compara el mtodo a validar con el mtodo de referencia. Los realiza slo el laboratorio organizador. 1.AMPLITUD MATRICES: Nmero de matrices a ensayar: teniendo en cuenta Categoras de alimentos a validar, analizar 20 o ms alimentos de cada categora. Obtencin de muestras artificialmente contaminadas: Inoculo una sola cepa (de inters) por matriz. Segn proceso al que se somete al alimento uso: -microoganismo estressado Alimentos procesados-microoganismo sin estress Alimentos no procesados-microoganismo liofilizado-productos en polvo.

Diseo de un estudio de validacin mtodo cualitativo :

AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validacin interna (estudio comparativos). NIVEL DE INOCULO:

Nivel bajo (lmite de deteccin) 1-5ufc/25g de muestra Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra

CONTROL: Para muestras artificialmente contaminadas.

Cada tipo de alimento se divide en dos, uno para control negativo y otro para obtener distintos niveles inculo.

CUANTIFICACIN DE LOS NIVELES DE CONTAMINACIN POR NMP: el mismo da que se analizan las muestras. Nmero de ensayos por nivel de analito: 20

Diseo de un estudio de validacin mtodo cualitativo :

AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validacin interna (cont). 2. ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo slo la cepa.(cultivo puro) Pruebo 50 o ms cepa target y 30 no target (mtodo a validar y mtodo de referencia).

Diseo de un estudio de validacin mtodo cualitativo :

AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios o ensayos colaborativos: IMPORTANTE! Los laboratorios participantes acuerdan y estudian minuciosamente el protocolo de ensayo. Nmero de laboratorios:10 laboratorios (con datos vlidos) por tipo de alimento. Los laboratorios participantes no conocen los valores de las muestras.(Muestras a ciegas) Nmero de matrices a ensayar: teniendo en cuenta Categoras de alimentos a validar.

Diseo de un estudio de validacin mtodo cualitativo :

AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios o ensayos colaborativos: PREPARACIN DE MUESTRAS: a) Cepas inoculadas: Uso un cultivo puro cepa target. b) Nivel bajo (lmite de deteccin) 1-5ufc/25g de muestra Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra CONTROL. (Para muestras artificialmente contaminadas) EL LABORATORIO QUE ORGANIZA DEBE ASEGURAR LA HOMOGENEIDAD DE LAS MUESTRAS.

Diseo de un estudio de validacin mtodo cualitativo :

AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios o ensayos colaborativos: CUANTIFICACIN DE LOS NIVELES DE CONTAMINACIN POR NMP: el mismo da que se analizan las muestras.(el laboratorio organizador) Nmero de ensayos por nivel de analito por cada tipo de alimento: 6 Nmero de ensayos por CONTROL NEGATIVO por cada tipo de alimento: 6

Diseo de un estudio de validacin mtodo cualitativo :

AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

ANALISIS DE LOS RESULTADOS: Aplicable a Estudios precolaborativos y ensayos colaborativos. A)ENSAYO PARA DETERMINAR DIFERENCIA SIGNIFICATIVA: La proporcin de positivos confirmados del mtodo evaluado no debe ser estadsticamente diferente a la proporcin positiva confirmada por el mtodo de referencia para cada tipo de alimento y cada nivel de inoculacin

TEST de Chi cuadrado.( para datos nominales)

Diseo de un estudio de validacin mtodo cualitativo :

AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

ANALISIS DE LOS RESULTADOS (cont): Aplicable a: Estudios precolaborativos ensayos colaborativos. B) INDICADORES DE APTITUD: Sensibilidad Especificidad FALSOS POSITIVOS para cada tipo de alimento y FALSOS NEGATIVOS cada nivel.

Validacin mtodo cuantitativo

Descripcin detallada del mtodo de ensayo. LMITE DE CUANTIFICACIN. REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD EXACTITUD Desviacin positiva y desviacin negativa sensibilidad especificidad

Diseo de un estudio de validacin mtodo cuantitativo :

AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validacin interna (estudios comparativos). Comparacin del mtodo a validar con el mtodo de referencia. Aplica lo visto anteriormente para mtodos cualitativos. (tener en cuenta los estudios de inclusividad y exclusividad slo para ensayos selectivos) NIVEL DE INOCULO de las matrices: se evalan 3 niveles de concentracin de microorganismo (bajo, medio y alto) que abarquen todo el intervalo a validar. Y un control sin inocular. Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminados para ensayos no selectivo (no realizo el control)

Diseo de un estudio de validacin mtodo cuantitativo :

AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validacin interna (estudios comparativos). ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo slo la cepa.(cultivo puro) Pruebo 30 o ms cepa target y 20 no target.(mtodo a validar y mtodo de referencia) ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS Estimacin de desviacin aleatorias y sistemticas del mtodo. Nmero de laboratorios: 8 laboratorios (con datos vlidos) por tipo de alimento.

Diseo de un estudio de validacin mtodo cuantitativo :

AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS: a)Recuento de microorganismos especficos: inoculacin del microorganismo especfico. SOLO PARA ENSAYOS SELECTIVOS b) NIVEL DE INOCULO de las matrices: se evalan 3 niveles de concentracin de microorganismo (bajo, medio y alto que abarquen todo el intervalo a bajo, alto) validar. Y un control sin inocular. Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminados para ensayos no selectivo (no realizo el control) Para cada tipo de alimento se analizan por duplicado (dos porciones) el mtodo a validar y el mtodo de referencia.

Diseo de un estudio de validacin mtodo cuantitativo :

AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS Se realizan test para eliminar los outliers. INDICADORES DE APTITUD: Anlisis de varianza y t por tipo de alimento y nivel de inculo. Sr, r, SR, R, RSDr y RSDR por tipo de alimento y nivel de inculo. RSD es la desviacin estndar relativa. Es independiente del valor del analito

INFORME DE VALIDACION El laboratorio debe registrar:

RESULTADOS OBTENIDOS. Establecer el rango de validacin (es la parte del intervalo de concentracin de un mtodo de anlisis que ha sido validado). PROCEDIMIENTOS USADOS. Declaracin que el mtodo es apropiado para el fin previsto. Toda la informacin referida a la validacin debe documentarse y archivarse.

Extensin de la validacin La extensin de la validacin necesaria depender del mtodo y su aplicacin. La validacin es siempre un equilibrio entre costos, riesgos y posibilidades tcnicas. Cada laboratorio establecer los requisitos que debe cumplir el mtodo, con objeto de demostrar que son adecuados para la finalidad establecida.

Incluso cuando se haya realizado la validacin, el laboratorio tendr que : Verificar peridicamente que se cumplen los parmetros documentados, utilizando, por ejemplo: muestras inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices ms representativas.

GRACIAS POR SU ATENCION!