Produo de iogurte

Unidade Curricular: Bioqumica Microbiana Docentes: Olga Cristina Pastor Nunes Joana Sofia Vaz Mendes Teodsio

[Escolher a data]
Eduardo Silva ext12305 Victor Noronha ext12302 Mestrado Integrado em Bioengenharia

Dezembro 2012

ndice
Introduo ....................................................................................... 2 Materiais e mtodos ........................................................................ 5 Resultados e Discusso ................................................................ 10 Concluso ..................................................................................... 14 Referncias ................................................................................... 15

Produo de Iogurte

Introduo
Presente na dieta alimentar humana desde os tempos longnquos, o iogurte, produto da fermentao lctica realizada atravs de cultivos de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus, um alimento de elevado interesse nutricional, tanto por sua qualidade nutritiva, como pela presena de fermentos lcteos. Nesse sentido, so mltiplos os benefcios nutricionais do iogurte, pois, sendo este um derivado do leite herda tais vantagens, dentre as quais se cita: protenas de alto valor biolgico; minerais, dos quais se destaca o clcio; vitaminas, nomeadamente do complexo B [1]. Alm disso, esses produtos contm lactobacilos vivos e, muitas vezes, os chamados probiticos: que so alimentos especialmente destinados a regular melhor o sistema digestivo humano pela introduo de microrganismos benficos [2]. De acordo com a legislao portuguesa, diversos parmetros devem ser respeitados, desde teores de gordura, rotulagem, dentre outros, consoante o tipo de iogurte que se pretende produzir, sendo classificados por: slidos, batidos e lquidos. Essas trs classificaes podem ainda ser distinguidas, em que, por exemplo, os iogurtes naturais so ditos como isentos de qualquer adio, alm das culturas microbianas comuns. Enquanto isso, os chamados iogurtes de aromas, tm acrscimo de gneros alimentcios aromticos, como frutas e vegetais, e derivados dos mesmos, sementes ou parte de sementes comestveis, mel e especiarias, entre outros. No entanto, tal tipo de iogurte, em conformidade a lei, dever ter referncia ao respectivo aroma [3]. As condies timas para o desenvolvimento especfico dos

microrganismos envolvidos na produo do iogurte so: temperatura entre 37C e 38C e pH de 6,2 a 6,5 para o Streptococcus thermophilus; temperatura entre 44C e 45C e pH de aproximadamente 5,5 para o Lactobacillus bulgaricus [4]. Especificamente o que ocorre para a produo do iogurte que no princpio da fermentao, o desenvolvimento do Streptococcus thermophilus favorecido pelo pH do leite [5]. Em virtude do teor de cido lctico produzido a partir da lactose pelo Streptococcus thermophilus, ocorre ento a induo do crescimento dos Lactobacillus bulgaricus [6]. Este por sua vez, geralmente tem

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melhor crescimento aps refrigerao, e isto possibilita que o restante da lactose possa ser fermentado [6]. O L. bulgaricus, por ser mais resistente a acidez, aumenta em nmero e sobrepuja o S. thermophilus. Ao fim do

processo, tem-se uma maior concentrao de L. bulgaricus que de S. thermophilus, sendo que o primeiro, no incio, cresce mais devagar, mas permanece vivel por um tempo bem maior, enquanto o segundo, por sua vez, cresce mais rapidamente no incio do processo, mas, devido sensibilidade a acidez, sobrepujado pelo L. bulgaricus [7]. Assim pode-se dizer que existe uma relao das duas populaes de bactrias em relao ao tempo, como mostrado na Figura 1. Segundo outros autores, como os so

Lactobacillus microrganismos

bulgaricus

proteolticos,

obtm aminocidos a partir da casena (glicina, histidina, valina) e

Figura 1 - Curva de desenvolvimento simbitico da cultura ltica durante a fermentao do iogurte (F = fator de multiplicao do micro-organismo).

o crescimento dos estreptococos assim ativado, o que, por sua vez,

estimula o crescimento dos lactobacilos, em virtude da produo de cido frmico e gs carbnico [4, 6, 8]. De certo, o equilbrio adequado das bactrias deve ser sempre mantido, para que o produto permanea suficientemente cido e aromtico [6]. A acidez torna os iogurtes alimentos relativamente estveis, pois assim inibem o crescimento de bactrias Gram-negativas, por conta de o pH variar de 3,6 a 4,2 [9]. Dentre as bactrias Gram-negativas com potencial capacidade de contaminao do iogurte, a presena de Escherichia coli, em virtude de sua ocorrncia constante em leite e seus derivados, alm de sua natureza potencialmente patognica, deve ser avaliada durante o processo de produo atravs da utilizao de meio seletivos adequados [10]. Alm desses aspectos, durante a fermentao, a protena, os lipdios e a lactose do leite sofrem hidrlise parcial, tornando o produto facilmente digervel [6]. Por isso, o iogurte considerado agente regulador das funes digestivas

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[5, 6] e, com efeito, as glndulas salivares e as enzimas presentes nas mesmas so estimuladas pela acidez do produto [6]. No que tange a produo industrial tem-se primeiramente a

padronizao e homogeneizao do leite que ser utilizado no processo. De seguida, um tratamento trmico (90 95 C 30 min) realizado com o objetivo de promover a esterilizao. Promove-se ento a inoculao das culturas de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus preparadas em laboratrio, correspondendo a um volume de 3 a 5% do volume total [11]. O leite inoculado seguidamente colocado em embalagens individuais, que so levadas para cmaras de fermentao, onde so mantidas a 42 C de duas a trs horas. Enfim, o iogurte enviado para a cmara de armazenamento onde resfriado para aproximadamente 5C e ento distribudo para o comrcio [4]. preciso notar ainda que certas caractersticas do iogurte so benficas para indivduos com intolerncia lactose [12, 13] e tendncias hiperglicemia ps-prandial [14, 15]. Alm disso, outras propriedades tambm se relacionam aos iogurtes, como os efeitos anticolesterolmicos, anticarcinognicos, inibitrios de agentes patgenos, entre outros [16-18]. Por tal carter de importncia e por estar sujeito a alteraes microbiolgicas e fsico-qumicas, o iogurte deve ser submetido a anlises peridicas, de forma a estabelecer por qual perodo de tempo o produto pode ser mantido no comrcio em condies compatveis com o consumo humano [19]. Afinal, existem tambm vantagens econmicas na extenso da vida de prateleira do produto, todavia, durante o perodo de validade, o alimento deve atender s exigncias de qualidade determinadas pela legislao vigente [3, 19]. Tendo em mente o que foi descrito, bvia a importncia das prticas realizadas para a produo de iogurte no Laboratrio de Bioqumica Microbiana. Por isso, o objetivo deste relatrio explanar a metodologia utilizada e, principalmente, discutir os resultados encontrados de maneira a entender a bioqumica relacionada aos microrganismos envolvidos no processo, bem como outros aspectos relacionados produo e a qualidade deste produto de conhecido destaque na indstria mundial de alimentos.

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Materiais e mtodos
Todo o protocolo foi esquematizado da maneira representada no esquema abaixo, que detalhado posteriormente.

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Dia 01

Os meios de cultivo LB, ST e m-Endo-LES, seletivos para L. bulgaricus, S. thermophilus e E. coli, respectivamente, foram preparados [20-22]. Sendo que aps a pesagem dos diferentes componentes e insero dos mesmos nas garrafas, os meios foram aquecidos em agitador magntico com chapa aquecedora e em seguida arrefecidos para, ento, serem colocados nas diferentes placas que foram usadas durante todas as prticas laboratoriais que se seguiram. Dia 02

Com objetivo de caracterizar o iogurte natural e enumerar S. thermophilus realizaram-se diluies (por grama de iogurte) em soluo salina estril at 10-7 (UFC). Depois, 0,1 mL das diluies foram espalhadas entre 103

e 10-7 em meio ST. Em seguida, incubou-se a 37 C por 24 h. No caso do L. bulgaricus foram realizadas diluies (por grama de

iogurte) em soluo salina estril at 10-5. Espalhou-se, similarmente ao anterior, 0,1 mL das diluies entre 10-1 e 10-5 em meio LBA. Ento as placas foram incubadas a 37 C por 48 h. Posteriormente, as colnias nas culturas foram mantidas no frigorfico at a posterior contagem no dia seguinte do protocolo, para assim, calcular o n de UFC por grama de iogurte. O pH do iogurte foi aferido e 5 mL do produto foi pipetado e pesado em vidro de relgio, sendo que o mesmo foi anteriormente pesado, a fim de que no dia seguinte do protocolo o peso seco pudesse ser determinado.

Dia 03

A contagem das colnias nas placas de cultura para o iogurte comercial foi realizada e em seguida, uma das colnias presentes na das placas de ST ou LBA foram transferidos para lminas de vidro, adequadamente marcadas para os diferentes microrganismos do estudo. Depois, a amostra foi espalhada
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com a ajuda de uma ansa. Ento, aqueceu-se chama at secura, tendo em ateno no aquecer demasiado. E assim procedeu-se colorao de Gram. Ao ser confirmado a identificao dos microrganismos por visualizao em microscopia ptica, o isolamento foi realizado, propagando-se cada um dos microrganismos no mesmo meio (S. termophilus em meio ST e L. bulgaricus em meio LBA). Por fim foi determinado o peso seco do iogurte comercial, ao se pesar o vidro de relgio que tinha sido mantido em estufa. Dia 04

Aps a incubao (48 h, 37C), transferiu-se a biomassa de cada um dos organismos com a ajuda de uma ansa, para tubo estril. Em seguida, tal biomassa foi congelada a -80C. Ento, trocou-se a tampa do tubo por gaze esterilizada e os tubos foram transferidos para o liofilizador. Dia 05

Neste dia deu-se incio produo do iogurte. Para tal, inicialmente, foi realizado o teste da resazurina, com o objetivo de avaliar a qualidade do leite que foi utilizado para produzir o iogurte. Nesse sentido, adicionou-se 10 mL de leite num frasco de rosca estril, para em seguida adicionar 1 mL de resazurina a 0,05%. Depois, inverteu-se o frasco trs vezes para misturar o corante e o frasco foi colocado em banho maria a 37 C, durante 15 min. Aps este perodo, o frasco foi retirado do banho e avaliou-se a qualidade do leite segundo a tabela seguinte:
Tabela 1 - Avaliao da qualidade do leite pelo teste da resazurina

Cor Azul Roxo Lavanda Rosa Branco

Qualidade Excelente Bom Regular Mau Pssimo

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Alm disso, o pH do leite foi aferido a fim de compar-lo posteriormente com o pH do iogurte a ser produzido. Para preparar especificamente o iogurte, aqueceu-se o leite gordo num gobel 600 mL at perto da temperatura de fervura, mas sem deixar ferver. Em seguida o leite foi arrefecido at 42-45C, usando o termmetro para verificar a temperatura. Ento seis copos de iogurte foram cheios com cerca de 50 mL de leite e inoculados de acordo com o esquema abaixo:

Figura 2 Esquema de ensaios para produo de iogurte

Para cada um dos copos acima, o leite com o seu respectivo inculo foram bem misturados com a ajuda de uma pipeta estril. Ressaltando-se que as bactrias lcticas inoculadas encontravam-se liofilizadas. Em seguida, os copos foram cobertos com papel de alumnio. Todavia, antes disso, 5 mL do produto foi pipetado e pesado em vidro de relgio, no intuito de no dia seguinte do protocolo o peso seco de cada um dos ensaios acima pudesse ser determinado. Foi feito ento um espalhamento aps retirarem-se as amostras necessrias para realizar a diluio seriada, idntica ao que foi procedido para as diluies do Dia 2. As diluies foram as seguintes:
Tabela 2 - Diluies realizadas para o espalhamento em cada ensaio Diluies Espalhamento At 10 At 10 At 10 At 10 At 10
-1 -7 -5 -7 -7

Ensaio Leite

ST, LBA, m-Endo-LES (10 -10 ) ST (10 -10 ), LBA (10 -10 ) ST, LBA (10 -10 ), m-Endo-LES (10 -10 ) ST (10 -10 ), LBA (10 -10 ), m-Endo-LES (10 -10 ) ST (10 -10 ), LBA, m-Endo-LES (10 -10 )
-3 -7 -1 -5 -3 -7 -1 -5 0 -1 0 -1 -1 -5 -3 -7 -1 -5

-1

Leite+Iogurte comercial Leite+E. coli Leite+clulas liofilizadas Leite+Iogurte+E. coli

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Por fim incubaram-se as misturas na estufa a 42-45 C durante 3 a 6 horas (ou at mistura estar firme) e, em seguida, a mistura foi retirada da estufa e colocada no frigorfico. Dia 06

Primeiramente foi realizada a contagem das colnias nas placas de culturas a fim de posteriormente calcular o n de UFC no incio e no final da produo do iogurte. Seguidamente, um espalhamento de todos os iogurtes produzidos no dia 05 foi feito, conforme a mesma estrutura do Dia 06 (Tabela 2 e Figura 1). Foi ento determinado o peso seco de cada um dos ensaios. O pH do iogurte produzido foi, por sua vez, aferido e 5 mL do produto foi pipetado e pesado em vidro de relgio, para que no dia seguinte do protocolo o peso seco do iogurte produzido pudesse ser determinado. Dia 07

De incio realizou-se a contagem das colnias nas placas de culturas e por fim o peso seco do iogurte produzido foi determinado.

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Resultados e Discusso
De incio, preciso dizer que no existiu crescimento em nenhum dos tempos, inicial ou final, e tambm no foram observadas colnias em LBA, ST ou m-Endo-Les no grupo controlo (ensaio apenas Leite). Ademais, o pH inicial do Leite foi 7 e o pH do iogurte comercial foi entre 4 e 5. Atravs dos clculos mostrados abaixo alcanou-se os resultados apresentados nas Tabelas 3, 4, 5 e 6.

Tabela 4 - Resultados para o pH. pH Ensaio Tabela 3 - Parmetros de carga microbiana do iogurte comercial ST LBA UFC/mL UFC/g de iogurte 7,4 X 10 5,8 X 10
7 8

to 6~7 7 7 7 7 6~7

tf 4~5 6 5 6 6 4

Leite+5mL de iogurte Leite+ST+LB (1:1) Leite+ST+LB (2:1) Leite+ ST+LB (1:2) E.coli+Leite Leite+Iogurte+E.coli

8,8 X 10 7,0 X 10

6 7

to = tempo inicial e tf = tempo final. b (neste ensaio foram utilizados os dados da equipe de quarta-feira). Tabela 5 - UFC por mL de iogurte produzido no tempo inicial (to) e final (tf). UFC/mL Ensaios to Leite+Iogurte
b

ST tf
8 5 6 6

LBA to
8 6 8 6

m-ENDO-LES tf 0 to *
8

tf * 0 0 0
6 5 8 6

4 X 10

1,8 X 10 1,2 X 10 5,3 X 10

0 6,5 X 10 1,1 X 10 1,7 X 10 0

6 6 6

Leite+ST+LB (1:1) Leite+ST+LB (2:1) Leite+ ST+LB (1:2) E.coli+Leite Leite+Iogurte+E.coli

b

1,0 X 10 1,1 X 10 2,2 X 10 #

1,3 X 10 0 >3 X 10 0

0 0

>3,0 X 10 #

10

0 1,2 X 10

>3 X 10

7,5 X 10 1,8 X 10 0 0 4,3 X 10 1,6 X 10 * (diluio no foi realizada); # (contaminao); b (nestes ensaios foram utilizados os dados da equipe de quarta-feira).

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Tabela 6 Contagem de UFC por g de iogurte produzido no tempo inicial (t0) e final (tf) UFC/g de iogurte Ensaios to Leite+Iogurte
a, b a, b

ST tf
10 8

LBA to
10 10

m-ENDO-LES to *
7

tf 0

tf *
8

4,1 X 10

1,8 X 10

6,9 X 10 1,6 X 10 0 0 4,0 X 10 1,5 X 10 * (diluio no foi realizada); a (nesses ensaios foi inoculado iogurte inicialmente); b (nestes ensaios foram utilizados os dados da equipe de quarta-feira).

Leite+Iogurte+E.coli

No ensaio realizado a partir de Leite + Iogurte, observou-se uma diminuio da faixa pH de 6~7 para 4~5 (Tabela 4). Para os valores de UFC/mL de S. thermophilus (Tabela 5) pode-se verificar uma ligeira reduo da carga microbiana no decorrer do processo. Relativamente ao L. bulgaricus, constatou-se que no houve crescimento, conforme mostra a Tabela 5. Supese que estes microrganismos no estavam viveis para crescimento j que o esperado seria que os mesmos l estivessem e em quantidade superior ao S. thermophilus [7]. Em relao carga microbiana presente no iogurte produzido, tem-se que, o S. thermophilus, cresce melhor em pH prximo a neutralidade, metabolizando a lactose acido lctico, o que causa a diminuio do pH [7], como verificado no ensaio, at um ponto onde causaria a inviabilidade destes organismos. Por esta razo a ligeira reduo mostrada na Tabela 5 pde ser verificada. No ensaio realizado a partir de Leite + ST + LB (1:1) verificou-se variao de pH de 7 para 6, ao final do processo. Ademais, as cargas microbianas aumentam em ordem de grandeza de um para o S. thermophilus e de dois para o L. bulgaricus, no sendo verificada a presena de E. coli como contaminante do processo (Tabela 5). Embora a inculo tenha sido realizado na proporo de ST: LB 1:1, as contagens demonstram que tal proporo no foi verificada na prtica. Uma possibilidade seria a baixa carga de microrganismos coletados para o processo de liofilizao ou a baixa viabilidade das clulas coletadas. Relativamente variao de pH, com o menor crescimento de S. thermophilus, quando comparado com o Ensaio Leite + Iogurte, obteramos uma menor produo de cido lctico, resultando em um pH mais elevado, como mostrado na Tabela 4. Apesar dos resultados encontrados para o pH no terem sido os esperados, no tocante bioqumica

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do processo, o perfil final do desenvolvimento simbitico da cultura lctica seguiu o esperado [7]. No ensaio realizado a partir de Leite + ST + LB (2:1), verificou-se a diminuio do pH de 7 para 5. Relativamente carga microbiana, tem-se um aumento na concentrao de S. thermophilus e uma reduo da concentrao de L. bulgaricus ao valor nulo. Em virtude do crescimento acentuado do S. thermophilus tem-se uma maior produo de cido lctico, acarretando uma maior decrscimo no valor de pH. Nesta faixa de pH, esperar-se-ia a induo do crescimento do L. bulgaricus, porm, como mostrado na Tabela 5, tal no verificado. Tal valor nulo pode decorrer de possveis contaminaes durante o processo de coleta para liofilizao, no qual os contaminantes poderiam ter sido coletados. Assim, durante a produo do iogurte esses microrganismos competiriam, podendo at produzir substncias inibidoras ao L. bulgaricus, impedindo ento o crescimento dos mesmos. No ensaio realizado a partir de Leite + ST + LB (1:2), tem-se a reduo do pH de 7 para 6, o qual no seria esperado em virtude do elevado crescimento de ambas as bactrias lcticas, conforme mostrado na Tabela 5. O valor de pH esperado seria mais baixo do que o obtido [6, 8]. A variao da carga microbiana neste ensaio esteve dentro do perfil de crescimento simbitico esperado, em que, ao fim do processo, a concentrao de L. bulgaricus sobrepuja a concentrao de S. thermophilus [4, 7]. No ensaio realizado a partir de Leite + E. coli no ocorreu crescimento de L. bulgaricus, como esperado. O crescimento de S. thermophilus no pode ser avaliado em virtude das contaminaes presentes nas placas. O elevado

crescimento da E. coli (Tabela 5) confirma que esta bactria utilizou os substratos presentes no leite, principalmente a lactose. H ainda outros fatores relacionados a caractersticas intrnsecas do leite, como alta atividade de gua, pH prximo ao neutro e riqueza de outros nutrientes tornando-o excelente meio de cultura para o desenvolvimento desses microrganismos [23]. No ensaio realizado a partir de Leite + Iogurte + E. coli, verifica-se o crescimento de S. thermophilus, conforme seria esperado [5, 6], tanto para os valores de carga microbiana como para a diminuio do pH (Tabelas 4, 5 e 6). No foi verificado crescimento de L. bulgaricus, entretanto, tal microrganismo no foi detectado sequer no tempo inicial. Tal como explicado para o ensaio
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Leite + Iogurte, supe-se que estes microrganismos no estavam viveis para crescimento. Em relao ao crescimento observado para E. coli, ao compararmos o ensaio em questo em relao ao ensaio Leite + E. coli, podemos perceber que seu desenvolvimento atenuado em virtude da presena de bactrias lcticas, nomeadamente, neste caso, S. thermophilus, conforme descrito na literatura [9]. Apesar disto, sabido na literatura que diversas estirpes de E. coli apresentam elevada resistncia em ambientes com baixo pH [10]. importante ressaltar que uma gama de outros erros pode ter alterado a verossimilhana dos resultados. Dentre os quais, cita-se a contagem incorreta de microrganismos, avaliao incorreta do pH em virtude da subjetividade relaciona leitura da fita, contaminaes durante o processo e erros na execuo do experimento.

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Concluso
De maneira geral, pode-se dizer que o procedimento experimental para a produo de iogurte foi em grande parte afetada pelas contaminaes de leveduras e fungos, verificadas em todos os ensaios, produzindo resultados questionveis para uma adequada anlise do produto final. Apesar disso, pode concluir-se que, mesmo com tais incongruncias nos resultados, estes procedimentos permitiram visualizar alguns aspectos bioqumicos importantes. Alm disso, os erros de amostragem e experimentos durante todos os dias de procedimentos podem ter conduzido s incoerncias dos resultados alcanados, por isso de se concluir que necessrio um maior cuidado na execuo procedimento para a obteno de resultados mais coesos, a fim de promover a confiana nos iogurtes produzidos.

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