Inmunoensayos enzimaticos 1.

-adicionar 100 micro litros de Ag (frmaco-protena acarreadora) a una concentracin de 10 microg/ml o 100 micro litros de regulador de carbonatos a un juego de pozos de poliestireno. Incubar la tira de pozos a 4 C durante 24 hrs para permitir la adsorcin en la fase solida. 2.- eliminar las soluciones por inversin de la tira de pozos y desechar el liquido remanente sacudiendo fuertemente la tira sobre papel absorbente. 3.- lavar los pozos con 100 micro litros de PBS-T. dejar los pozos con el amortiguador de lavado en reposo durante 3 min. Eliminar la solucin como en el paso 2. Repetir el proceso para eliminar el Ag que no se adsorbi. 4.- lavar los pozos con 100 micro litros de GG a todos los pozos e incubar a 37 C durante 30 min. Para que la gelatina pueda cubrir los citios que no se absorbi el Ag. 5.- preparar una mezcla volumen a volumen de suero de conejo antifrmaco al doble de la concentracin optima para el ensayo con: Diferentes concentraciones del frmaco que sern indicadas en la practica Suero problema Suero negativo PBS-G 6.-incubar las mezclas a 37 C durante 30 min. Par que se lleve acabo la reaccin Ag-Ac

7.-repetir el paso 2 con la tira de pozos 8.-adicionar 100 micro litros de cada mezcla a los pozos que contienen Ag y a los que no tienen, incubar a los pozos a 37 C durante 30 min. Para que se lleve acabo la reaccin Ag adsorbido a la fase solida y el Ac de conejo se quede sin reaccionar en las mezclas. 9.- repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exeso de Ac de la fase solida 10.- adicionar 100 micro litros de conjugado IgG diluido a 1:8,000 en PBSG a todos los pozos, incubar a 37 C durante 3 min. Para permitir que el conjugado reacciones con el Ac de conejo que se hayan unido al Ag en fase solida 11.- repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso conjugado que no haya reaccionado de

12.- adicionar 100 micro litros de una sol. Recin preparada del sustrato de la enzima 13.- incubar en la oscuridad para permitir la reaccin ezimatica y consecuente y el desarrollo de color 14.-detener la reaccin enzimtica adicionando una gota de H2SO4 8 N a cada pozo. 15.- determinar la absorbancia (As) de cada pozo a 492 nm en fotocolormetro (lector ELISA) usando un blanco de reactivos.

Inmunoelectrotransferencia Gel separador 1.- Lavar las placas de vidrio, enjuagar con agua bidestilada y sumergir en una solucin de metanol al 5 %, secar los vidrios en el aparato de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 2.- Colocar en matraz kitasato de 125 ml los siguientes reactivos en el orden inidcado 3.- Agitar cuidadosamente para que no se formen burbujas y verter la mezcla entre las placas de vidrio hasta aproximadamente 3.5 cm del borde superior 4.-Colocar inmediatamente alrededor de 1 mL de agua sobre la superficie de la poliacrilamida, dejndola resbalar suavemente sobre la pared de uno de los extremos. Este paso es muy importante para obtener una superficie plana del borde superior del gel. Cuando la gelificacion ocurre se observa una interface muy definida ente el agua y el gel. 5.-Inclinar las placas para remover el agua y lavar la superficie de los geles 3 veces con agua bidestilda Gel concentrado 1.- colocar en un matraz kitasato los siguientes reactivos en el orden indicado en el manual 2.- eliminar el lquido de la superficie del gel separador y escurrir bien

3.- agitar cuidadosamente y agregar la mezcla sobre el gel separador. Acomodar el peine de tal manera que no se formen bubujas en la interface de los geles. Preparacin de la muestra de Klebsiella pneumoniae 1.- cultivar Klebsiella pneumoniae en medio de E durante 5 horas, cosechar las bacterias y lavar 3 veces por centrifugacin con SS estril. Resuspender el paquete celular en SS y ajustar a una absorbancia de 0.8 a 540 nm. Tomar 5 mL de la suspensin, centrifugar, tirar el sobrenadante y Resuspender el paquete en 250 ml de regulador de una muestra 2X. hervir en bao maria durante 15 minutos 2.- quitar el peine cuidadosamente y enjuagar los canales con agua bidestilada 5 veces 3.- mostrar las placas en la unidad de electroforesis teniendo cuidado de que no haya fugas y llenar con regulador de corrimiento 4.- colocar las muestras utilizando una pipeta automtica 2.5 micro litros de los marcadores de peso molecular en la cmara chica . 5.- conectar la unidad a la fuente de poder, aplicar a 8 mA de corriente constante hasta que las muestras penetren el gel separador, entonces aumentar la corriente de 16 mA por gel en la cmara chica 6.- mantener el corrimiento hasta que el azul de bromo fenol llegue hasta unos 0.5 mm de ancho del lado donde no hay marcadores y teir con azul de coomassie

Tincin con azul de coomassie 1.- colocar el gel en un envase que contenga alrededor de 50 mL del colorante y dejar reposar una hora 2.- eliminar el colorante. Hacer tantos cambios como sea necesario hasta logra una nitidez adecuado de las bandas. Agregar la solucin conservadora para que el gel recobre su tamao original. Electrotransferencia

7.- desconectar el aparato al termino de la transferencia para extraer el casset y recuperar la membrana de NC. Tincin con tinta china 1.- lavar 4 veces la tira de la membrana de NC con 2 mL de PBS-T 2.- recubrir la solucin de tinta china y mantener la agitacin a temperatura ambiente hasta que aparezcan las bandas 3.- enjuagar con agua bidestilada durante 5 min.

1.- cortar un pedazo de 7 x 7 cm o de 15 x 15 cm de NC de 0.45 de poro utilizar guantes para manejar para no dejar huellas en el papel 2.- colocar el papel en un recipiente apropiado que contenga unos 200 mL de regulador de trasnferencia 3.- cortar 3 pedazos de papel filtro de igual tamao

Tincin con amido negro 1.- lavar 3 veces la membrana de NC con PBS-T y sumergirla en el amido negro durante 5 minutos con agitacin 2.- decolorar con solucin decolorante, lavar con agua y secar Tincin de rojo de ponceau

4.- tomar un cassette del equipo de Electrotransferencia y colocar sobre la fibra scotch brite humedecida en regulador de transferencia sobre el mismo.sobre la fibra colocar un pedazo de papel filtro humedecidos sobre entre el gel. 5.-colocar el cassette en la cmara de transferencia y conectar los electrodos de tal manera que el catodo negativo quede al lado del gel 6.- conectar un sistema a la fuente de poder la transferencia se puede hacer en 1 hora

1.- lavar 3 veces la membrana de NC con PBS-T y sumergirla en rojo de Ponceau durante 1 a 5 min. 2.- decolorar con agua y secar