CROMATOGRAFA EN COLUMNA La cromatografa se puede dividir de acuerdo a muchos criterios en diferentes clasificaciones.

Puede ser de acuerdo a su naturaleza de la fase mvil, sin embargo es en la clasificacin por tcnica donde entra la cromatografa en columna. La cromatografa en columna consiste en la aplicacin de una muestra compleja de una sustancia a una columna de cristal en la que se ha situado una matriz slida porosa que est inmersa en el solvente. A continuacin se bombea una gran cantidad de solvente a travs de la columna. Los diferentes componentes se van retrasando de manera distinta segn sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que son eludidas por el fondo de la columna. Segn la matriz escogida, los componentes se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamao o su capacidad de unirse a grupos qumicos particulares. La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida en caso de que los componentes sean protenas, por ejemplo. la cromatografa en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte slido adsorbente (fase estacionaria: los ms utilizados son gel de slice (SiO2) y almina (Al2O3)). as cromatografas son un grupo de tcnicas de separacin selectiva de molculas, en las que los componentes de una mezcla compleja de componentes pueden ser identificados y/o purificados. Existen varios tipos de cromatografas, segn los criterios que se usan para hacer los anlisis, pero todan consisten de una fase estacionaria y una mvil. En la cromatografa de columna las molculas de una mezcla son separadas en base a la afinidad de las molculas por la fase estacionaria o por la fase mvil. Si una molcula A tiene ms afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajar ms rpido que A. Existen muchos tipos de cromatografa de columna. En el laboartorio de hoy veremos tres tipos de ellas. A. Filtracin en gel: En esta las molculas son separadas por su tamao. El gel consiste de una cama de esferas con poros de un tamao dado. El gel se conoce como sefadex, el cual viene con poros de distintos tamaos. Las molculas de igual o menor tamao que el poro entran a las esferas mientras que las molculas ms grandes pasan rpidamente por la columna. Las molculas de tamao intermedio pueden entrar las esferas pero pasan menos tiempo en ellas. Las molculas salen en orden de tamao por el eludo. Aunque para efectos de este laboratorio las muestras que usaremos estn coloreadas, al hacer esta cromatografa en la vida real hay que usar otras pruebas para determinar qu fracciones contienen las muestras de inters, las cuales suelen ser protenas. Estas pruebas pueden ser mediciones fotomtricas, SDS-PAGE o ensayos enzimticos. Una vez tenemos identificadas las fracciones con las muestras,podemos hacer un "profile" de elucin con concentracin en con concentracin en Y y el volumen de elucin en X. El volumen inicial es el "void volume" de la columna. Lo que contiene es en amortiguador que estaba dentro de la columna al empezar. Las molculas ms grandes salen inmediatamente despus. El material que se escoja para la fase estacionaria depender del tipo de muestra que estemos corriendo. Cada tipo de gel presenta poros de distinto tamao. En nuestro caso usaremos Sephadex G-75, que separa molculas entre 3,000 y 70,000 daltons. Moleculas mayores de 70,000 no estrarn a los poros de las esferas. B. Intercambio inico: Se usa para purificar protenas. Separa molculas en base a su carga inica. La fase estacionaria presenta una matriz con carga. Al eluir una muestra, las molculas de igual carga salen con el amortiguador. Las molculas de carga opuesta se adhieren al material de empaque con distintos grados de afinidad. Para desprender las protenas adheridas se usa una solucin alta en cloruro de potasio o de sodio. Esto puede hacerse usando soluciones con incrementos moderados de salinidad, o de un solo paso, echando la solucin de mayor concentracin de sal primero. Al subir la concentracin poco a poco podemos recolectar las muestras desde las que menos afinidad por la columna

tiene hasta las de mayor afinidad. Durante la elucin, la sal va compitiendo con la protena por las cargas de la matriz de la columna, hasta que la desprende. La columna puede ser de matriz negativa (intercambio catinico) o positiva (intercambio aninico). El tipo de empaque depender de qu queremos aislar. En este tipo de columna el pH es importante porque puede alterar la carga de la columna. En nuestro caso usaremos una mezcla de dos protenas en una columna de intercambio catinico y la eluiremos en un solo paso, con 1M KCl. C. Fase inversa: Esta es una cromatografa de interaccin en la que la fase estacionaria, con molculas hidrofbicas, interacta con molculas hidrofbicas en la muestra. La matriz conciste de fibras de silicato con cadenas de hidrocarburos. Estas atraern a las molculas hidrofbicas de la muestra mientras que las hidroflicas salen con el amortiguador. Las molculas son eludas de la columna lavando con soluciones de distinta concentracin de alcohol o cualquier otro solvente no polar.Nosotros usaremos unos cartuchos con C18 e isopropanol como solvente de elucin.

La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase mvil) que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a travs de la columna. Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecer interacciones diferentes con la fase estacionaria y la mvil, sern transportados a diferentes velocidades y se conseguir su separacin. As, de manera similar a otros tipos de cromatografa, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a travs del medio slido se corresponden con diferencias en los tiempos de elucin por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la muestra original, que se recogern en fracciones diferentes. La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares compiten ms eficientemente con las molculas polares de una mezcla por los lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazar las molculas, incluyendo las ms polares, rpidamente a travs de la columna. Si el disolvente es muy polar la elucin ser muy rpida y generalmente habr poca separacin de los componentes de la mezcla. Si por el contrario el disolvente es muy apolar, no eluirn los compuestos de la columna. Por lo tanto, la eleccin del eluyente es crucial para el xito de la cromatografa en columna. A menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elucin. La CCF se utiliza para determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada separacin. En 1978 se introdujo una versin modificada denominada cromatografa en columna rpida. La diferencia con la cromatografa en columna tradicional es que en la tcnica rpida el disolvente se hace atravesar la fase estacionaria aplicando una presin positiva. Esto hace que las separaciones mejoren en resolucin y se pueda disminuir el tiempo de elucin, por lo cual constituye un mtodo de eleccin. Se observo en esta practica que por medio de la cromatografa es posible identificar de que sustancias esta compuesta una mezcla. Como la polaridad del solventes utilizados para la cromatografa determinan la el resultado mostrndonos sus diferentes compuestos.Se observo como las diferentes caractersticas de la mezcla A se vean en la placa promedio de sus diferentes manchas.Como ciertos factores pueden modificar el restado en esta practica.