UNIVERSIDADE ESTADUAL DO MARANHO - UEMA CENTRO DE ESTUDOS SUPERIORES DE CAXIAS- CESC DEPARTAMENTO DE QUIMICA E BIOLOGIA

TCNICAS MOLECULARES: ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

CAXIAS-MA/2012

JAILSON DA COSTA GASPAR KAREM DANIELLA LIMA CRUZ DA COSTA POLLYANE RAMALHO DE FREITAS RONNIELY DA SILVA DE MORAIS

TCNICAS MOLECULARES: ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

Relatrio apresentado professora Dr Claudene Barros como requisito parcial para a obteno de notas na disciplina Gentica Bsica do curso de Cincias Biolgicas Licenciatura do Centro de Estudos Superiores de Caxias-CESC/UEMA.

CAXIAS-MA/2012

SUMRIO 01 Introduo ...................................................................................................... 03 02 Material e Mtodo .......................................................................................... 06 2.1 Mtodos ........................................................................................................ 06 03 Resultado e Discusso .................................................................................. 07 3.1Resultado ....................................................................................................... 07 3.2 Discusso ..................................................................................................... 08 04 Concluso ...................................................................................................... 09

3 1. Introduo Inicialmente, a eletroforese era tcnica empregada para visualizao de protenas com suas diferenas de comprimento de fragmentos de aminocidos e cargas eltricas. Atualmente, o uso desta tcnica comum tambm para estudos com cidos nuclicos. Na visualizao de material gentico (cido

desoxirribonuclico e ribonuclico, DNA e RNA), utiliza-se comumente gel de agarose por apresentar porosidade irregular, funcionando assim como uma malha que separa o DNA, por diferena de tamanho, dos fragmentos menores que chegam mais rpido ao final da corrida eletrofortica. O DNA apresenta- se com carga negativa e, devido a esta caracterstica pode-se conduzi-lo de um plo com carga negativa para um plo com carga positiva (MARTINEZ & PAIVA, 2008). A eletroforese uma tcnica para separao, ou decomposio de molculas numa mistura sob influencia de um campo eltrico aplicado. As molculas dissolvidas num campo eltrico se movem ou migram a uma velocidade determinada por suas cargas, razo de massa. Por exemplo, se duas molculas tem as mesmas massa e forma, aquela com a carga final maior se mover mais rpido m direo a um eletrodo. (LODISH et al, 2002) A separao de pequenas molculas, como os aminocidos e os nucleotdeos, um dos muitos usos da eletroforese. Nesse caso, uma pequena poro da amostra depositada numa tira de filtro de papel ou qualquer outro substrato poroso, a qual ento embebida com uma soluo de conduo. Quando um campo eltrico aplicado nas extremidades do filtro, pequenas molculas dissolvidas na soluo de conduo se movem ao longo da tira numa velocidade correspondente magnitude de suas cargas. (LODISH, et al. 2002) Segundo (Baker, 2002) embora os gis possam ser corridos em papel, em acetato de celulose, em amido, ou outras em matrizes, a acrilamida e a agarose so os nicos gis utilizados pela maioria dos pesquisadores. Ambos so porosos, atuando como peneiras moleculares (quanto mais alta a percentagem de acrilamida ou agarose, menor o tamanho dos poros) e teoricamente, tanto um como outro podem ser usados para separar DNA, RNA ou protena. No entanto, a acrilamida em baixas concentraes muito flexvel e dificulta a manipulao, seu uso normalmente empregado em altas percentagens para analisar protenas e pequenos oligonucleotideos. Os gis de baixa percentagem de agarose so relativamente

4 1 rgidos e fceis de manipular, sendo usados para separa molculas grandes como DNA e o RNA, protenas e complexos proteicos muito grandes. O tipo de matriz que usada (agarose ou poliacrilamida) depende do tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar e visualizar. Devido diferena no tamanho dos poros dessas matrizes, utiliza-se normalmente o gel de agarose para a separao de fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000 pares de bases) e o gel de poliacrilamida para separao de fragmentos pequenos, de at 1kb. Alternativamente para a resoluo de fragmentos superiores a 1 kb pode-se utilizar a agarose com baixo ponto de fuso que um tipo de agarose derivada de sntese orgnica. Se houver a necessidade de separar fragmentos maiores do que 50 kb necessrio utilizar a eletroforese em campo pulsado, que consiste, simplificadamente, de um gel submetido a uma corrente eltrica que se alterna em direes perpendiculares(CORRA, E.M.& POSSIK, P.A). Apesar de ser mais efetivo para separar fragmentos pequenos, o gel de poliacrilamida apresenta algumas desvantagens. Entre elas, destaca-se o fato da poliacrilamida em soluo, isto , quando no polimerizada, ser neurotxica. Assim, a preparao do gel exige certa cautela. Alm disso, a preparao mais laboriosa, requerendo a mistura de componentes adicionais poliacrilamida para ajudar na polimerizao e mais tempo para que a polimerizao ocorra propriamente. J o gel de agarose feito apenas atravs da mistura de um tampo e agarose, no apresentando toxicidade. A polimerizao mais rpida e o gel pode ser reciclado aps o uso, isto , pode ser reutilizado na elaborao de outros gis. Alm disso, a eletroforese em gel de agarose pode ser usada como mtodo analtico ou preparativo, isto , quando o fragmento de DNA recuperado e purificado a partir do gel (CORRA, E.M & POSSIK, P.A). Entretanto, dependendo do mtodo utilizado para a visualizao do DNA, o gel de agarose pode ser desvantajoso. Frequentemente se utiliza a colorao com brometo de etdio (EtBr), uma substncia mutagnica. Em adio, para a visualizao do DNA corado com EtBr, necessria a utilizao de transiluminador de luz ultravioleta. Para a utilizao de tal aparelho e para o uso do brometo de etdio, necessrio o cuidado com a biossegurana no somente do manipulador, mas, de todos os que compartilham o uso do laboratrio ( CORRA, E.M & POSSIK, P.A).

5 O presente relatrio refere-se aula prtica sobre eletroforese em gel de agarose, realizada no laboratrio de Gentica e Biologia Molecular GENBIMOL, na Universidade Estadual do Maranho, com a finalidade de conhecer a tcnica eletrofortica, preparar um gel de agarose para observar amostras de DNA e visualizar as bandas emitidas atravs da luz Ultravioleta. Para analisar as

diferenas na migrao de cada amostra quando submetidas a esse processo, cujo objetivo obter a extrao do DNA.

6 3. Materiais e mtodos 3.1 Mtodos O DNA foi visto submetendo-o eletroforese submarina em gel de agarose a 1% e colorao com brometo de etdio, de acordo com o seguinte procedimento: Inicialmente adicionou-se a um frasco Erlenmeyer de 250 ml, 500g de agarose (alto ponto de fuso) e 50 ml de tampo TBE (1x). Em seguida levou-se ao forno micro-ondas, deixando cozinhar por aproximadamente 1 minuto, cuidando para no deixar o gel escapar para fora do frasco. Logo aps deixou-se esfriar a uma temperatura suportvel, em seguida adicionou-se 0,5 ul de brometo de etdio e derramou-se sobre o suporte. Aps solidificao do gel no suporte, retirou-se s espaadores e o pente, emergindo-se o gel no tampo da cuba (1x TBE). Aplicou-se cerca de 5 ul de cada amostra misturados com 3 ul de corante em cada cavidade do gel. Aplicou-se cerca de 30 v na fonte (amperagem 50 mA) e deixou correr de 30 minutos a 2 horas, dependendo do tamanho do fragmento amplificado. Na sequncia, foi visualizado sob luz ultravioleta.

7 4. Resultado e discusso 4.1 Resultados Nesta prtica observou-se uma amostra de DNA, sob tcnica eletrofortica, corada com brometo de etdio e visualizada na presena de luz UV. Onde podemos notar que o DNA ao ser submetido a eletroforese, migra diferentemente, formando um padro de bandas, as mesmas apresentaram-se com colorao vermelho alaranjado. Esta tcnica permite detectar a quantidade de DNA presente nas amostras, pois a intensidade de fluorescncia emitida indica concentrao de DNA presente, sendo assim quanto mais fragmentado o DNA apresentar-se mais rpido migrar formando um padro de bandas. Cinco amostras de DNA foram utilizadas em um meio eletrofortico (figura 1), as mesmas apresentaram um deslocamento diferenciado. Nos poos 3, 4 e 5 as amostras apresentaram-se fragmentadas, ocorrendo assim a migrao dessas amostras, demonstrando que estas amostras eram leves, quando comparadas as amostra do poo 1, pois a mesma permaneceu concentrada no local onde foi inserida, devido seu alto peso molecular. No ocorrendo migrao.

5 4 3 2 1

Figura 1. Gel de agarose corado com brometo de etdio, visualizado em um transluminador.

8 4.2 Discusso O princpio da eletroforese utilizada para separao de DNA, por exemplo, baseia-se no fato do DNA apresenta-se com carga negativa e, devido a esta caracterstica pode-se conduzi-lo de um plo com carga negativa para um plo com carga positiva (MARTINEZ & PAIVA, 2008). Assim, fragmentos de DNA podem ser separados pela aplicao de uma voltagem, ao termino do processo eletrofortico, o DNA estar mais prximo do polo positivo. Segundo (CORRA, E. M. & POSSIK, P.A). Durante a corrida o DNA sair do poo, penetrar no gel, migrando em direo ao plo positivo. Com isso os fragmentos sero separados de acordo com o tamanho. Os fragmentos menores migram mais rapidamente que os fragmentos maiores, pois eles apresentam maior facilidade de atravessar os poros da matriz de agarose em direo ao plo positivo. Enquanto que fragmentos de mesmo tamanho migram praticamente juntos. O mtodo mais usual para se visualizar o DNA em gis de agarose por colorao com brometo de etdeo (EtBr). Esse corante se intercala entre as bases dos cidos nuclicos e, na presena de luz Ultra Violeta, fluoresce em vermelho alaranjado. Com este mtodo pode-se detectar a quantidade de DNA, e a intensidade de fluorescncia emitida proporcional concentrao de DNA presente na amostra (CORRA, E.M. & POSSIK, P.A). Esse corante tambm utilizado para aumentar a densidade das amostras, impedindo que elas saiam dos poos. Contudo, a eletroforese em gel de agarose realizada para separar, identificar, analisar ou purificar os segmentos. Esta tcnica permite separar misturas de DNA que no podem ser separados por outros meios.

9 5. Concluso Atravs das tcnicas empregadas de eletroforese foi possvel obter como resultado perfis de fragmentos de DNA, para posteriores anlises, pois no gel de agarose o DNA emite um padro de bandas, tornando possvel a compreenso de que quanto mais degradado o DNA apresentar-se, mais migrar. Esta prtica foi de suma importncia para conhecimento dos materiais e mtodos necessrios na realizao da tcnica eletrofortica para obteno e purificao da extrao do DNA.

Referncias BARKER, K. Na bancada: manual de iniciao cientfica em laboratrios de pesquisas biomdicas- Porto Alegre: Artmed, 2002. CORRA, E. M. & POSSIK, P. A. Anlise de DNA por eletroforese. Disponvel em: www.ciencianews.com.br/siteDNA/testesgeneticos.pdf. Acesso em: 10/05/2012. LODISH, BERK, ZIPURSKY, MATSUDARA, BALTIMORE E DARNELL. Biologia celular e molecular. Revinter Ltda. 2002 MARTINEZ, E.R.M. & PAIVA, L. R. S. Eletroforese de cidos nucleicos: uma pratica para o ensino de gentica. Instituto de Biocincia, Botucatu, UNESP. So Paulo: 2008. Disponvel em: http://www.geneticanaescola.com.br/ano3vol1/9.pdf. Acesso em: 14/05/12.