Cultivo in vitro de hojas Violeta Africana (Saintpaulia ionantha) para la induccin a organognesis directa.

Mosquera D. Katherine1

Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales, Carrera de Ingeniera en Biotecnologa, Departamento de Ciencias de la Vida, Escuela Politcnica del Ejrcito, Sangolqu-Ecuador

RESUMEN En el presente trabajo se estudi el desarrollo de organognesis directa en violeta africana (Saintpaulia ionantha) para la obtencin de brotes. La metodologa utilizada durante este estudio consisti en tomar explantes de hoja de Saintpaulia ionantha, los cuales fueron desinfectados con una solucin al 1% de detergente ms tres gotas de Tween durante 20 minutos y una solucin de cloro al 0,5% ms 3 gotas de Tween durante 10 minutos. Para la siembra se utiliz medio MS enriquecido con: 0.8mg/L de tiamina, 0.2mg/L de KIN, 2mg/L de AIA, 20g/L de azcar y 7.5g/L de agar. Despus de una semana de incubacin en luz natural y a temperatura ambiente se observ la presencia de contaminacin fngica en uno de los frascos utilizados en este ensayo.

INTRODUCCIN Las plantas ornamentales han sido de inters para el hombre desde tiempos antiguos, para la ornamentacin de casas, parques y otros lugares; adems, de su valor ornamental estas plantas proporcionan bienestar social y psicolgico (Pereira, C. et al., 2004). La violeta africana (Saintpaulia ionantha) fue descubierta por el Barn Walter von Saint Paul-Illaire en Tanganyika (ahora Tanzania) en 1892, quien envi las semillas a su padre en Alemania, un botnico aficionado. Fue cultivada por primera vez como planta de interior y actualmente es una de las plantas de flor de interior ms populares (Pasqual, M. et al. 1996). Inicialmente se reproduca por semilla o, sobre todo, por esqueje foliar. Hoy la forma ms habitual de reproducirla es el cultivo in vitro de secciones de peciolo (Bianchini, F. & Pantano, A. 1991.). La obtencin de plantas cultivadas in vitro surge como una alternativa para la produccin a gran escala de material vegetal de alta calidad gentica y fitosanitaria en cortos periodo de tiempo, respondiendo de esta forma a las demandas de los productores (Pereira, C. et al., 2004). Estas plantas resultan libres de grmenes patgenos e incluso es posible eliminar virus endmicos (Garca, L. et al., 2002).

La regeneracin in vitro de plantas mediante organognesis directa es altamente deseable en los trabajos de micropropagacin y de conservacin de germoplasma. Mediante este proceso se da la formacin de brotes adventicios o de raz a partir de un explante de un rgano, los explantes ms utilizados para este procedimiento son partes de la plantas con rudimentos de yemas o potencial para produccin de meristemos adventicios,

este proceso no implica la formacin de callo (Roca, W. y Mroginski, L. 1993). El objetivo del presente trabajo fue inducir organognesis directa en explantes tomados de las hojas de violeta africana (Saintpaulia ionantha) utilizando medio MS enriquecido con ciertos reguladores de crecimiento, para la obtencin de brotes.

METODOLOGA Muestreo Como material experimental se utilizaron hojas (incluyendo el peciolo) de violeta africana (Saintpaulia ionantha), tomando en cuenta que las muestras presenten buen color y aspecto en general. Desinfeccin del explante Se lav las muestras con agua corriente para retirar todas las impurezas, frotando el haz y el envs con las manos. Posterior a esto se las sumergi en una solucin al 1% de detergente ms tres gotas de Tween 20 durante 20 minutos en agitacin. Se enjuag las muestras, dos veces con agua destilada y una con agua estril, se elimin el agua y se las sumergi en una solucin de cloro al 0,5% ms 3 gotas de Tween 20, durante 10 minutos ms en agitacin. Finalmente se procedi a realizar tres lavados con agua estril dentro de la cmara de siembra. Siembra e Incubacin Despus de realizados los tres lavados dentro de la cmara, se colocaron los instrumentos metlicos sobre la superficie, se aspergearon con etanol 90% y se flamearon. Se coloc la muestra sobre la superficie estril, despus de lo cual se procedi a realizar cortes pequeos en forma de cuadrado (>1cm), tomando en cuenta que se hayan eliminado tejidos necrosados. Los explantes fueron sembrados en frascos con medio MS ajustado a un pH de 5.75.8 y enriquecido con 0.8mg/L de tiamina, 0.2mg/L de KIN, 2mg/L de AIA, 20g/L de azcar y 7.5g/L de agar, en el primer recipiente se colocaron dos explantes con el haz en contacto con el medio y en el segundo recipiente se colocaron dos explantes con el envs en contacto con el medio. Se incub en luz natural y a temperatura ambiente durante una semana, despus de lo cual se observaron los resultados obtenidos.

RESULTADOS

Figura 1. La figura muestra: A) Ausencia total de contaminacin en el frasco en el que los explantes fueron colocados con el envs en contacto con el medio y B) Presencia de contaminacin fngica en el frasco en el que los explantes fueron colocados con el haz en contacto con el medio.

Tabla 1. La tabla muestra en cantidades la contaminacin que existi en los medios de cultivo y explantes de hojas de violeta africana (Saintpaulia ionantha), obteniendo como resultado contaminacin fngica en uno de los explantes que fueron colocados con el haz en contacto con el medio.

Contaminacin bacteriana (No. de explantes contaminados) Frasco 1 (envs en contacto con el medio) Frasco 2 (haz en contacto con el medio) 0 0

Contaminacin fngica (No. de explantes contaminados) 0 1

Tabla 2. La tabla muestra en porcentajes la contaminacin que existi en los medios de cultivo y explantes de hojas de violeta africana (Saintpaulia ionantha), obteniendo como resultado contaminacin fngica en el 50% de los explantes que fueron colocados con el haz en contacto con el medio. Contaminacin bacteriana (Porcentaje de contaminacin) Frasco 1 (envs en contacto con el medio) Frasco 2 (haz en contacto con el medio) 0% 0% Contaminacin fngica (Porcentaje de contaminacin) 0% 50%

DISCUSIN La contaminacin microbiana, principalmente por hongos es una de las limitantes en el xito del establecimiento asptico de los cultivos in vitro. La presencia de microorganismos contaminantes ocurre principalmente cuando la planta donante crece directamente en el campo y est expuesta a plagas, enfermedades, polvo y otros agentes, sin ningn tipo de control ambiental (Ramrez-Villalobos, M. y Salazar, E. 1997). Danby et al. (1994) y Alvarado, Y. (1998) citaron a los gneros Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, Curvularia y Fusarium como los microorganismos fungosos ms comnmente introducidos al cultivo de tejidos. Este tipo de contaminacin se favorece por las caractersticas anatmicas propias de la violeta africana (Saintpaulia ionantha) como la presencia de pelos en las hojas que impiden la penetracin de los desinfectantes lo cual dificulta la eliminacin de contaminantes como el polvo, bacterias, esporas de hongos y otros (Barker, P.et al., 1979) o puede deberse a tcnicas inadecuadas de trabajo del operador (Alvarado, Y. 1998). Estos resultados corroboraron el criterio de que para el establecimiento de material vegetal en condiciones in vitro se requiere de la existencia de un banco de donantes que garantice su calidad fitosanitaria (Jimnez, E. 1998), a pesar de ello cabe mencionar que no existi la presencia de contaminacin bacteriana en este ensayo. Tambin es importante citar que existi un 100% de viabilidad en los explantes, pero hay que tener en cuenta que a futuro puede presentarse ennegrecimiento del tejido y necrosis. Para evitar estos inconvenientes es recomendable disminuir la intensidad de luz, agregar antioxidantes al medio y al explante, subcultivar con frecuencia, incrementar las sales de calcio, reducir el nivel de nitrato en el medio y sumergir el explante en medio lquido por un da (Swartz, H. y Lindstrom, J. 1986).

CONCLUSIONES Se determin que la contaminacin fngica tuvo una incidencia del 25% en la induccin de organognesis directa utilizando explantes tomados de las hojas de violeta africana (Saintpaulia ionantha) y que los contaminantes fungosos predominaron sobre otros grupos microbianos. Los resultados obtenidos en este trabajo indican la necesidad de atender esta problemtica en el cultivo in vitro de plantas y de desarrollar estrategias para su control, como la utilizacin de muestras producidas en condiciones in vitro.

BIBLIOGRAFA
1

Alvarado, Y. 1998. Contaminacin microbiana en el cultivo in vitro de plantas. En: Prez Ponce, J.N. (Ed), Propagacin y Mejora Gentica de Plantas por Biotecnologa. Instituto de Biotecnologa de las Plantas. Santa Clara, Cap 5 pp 81-104
2

Pereira, C. et al. 2004. Efeito de la concentracao salina da solucao nutritiva na aclimatacao de plantas micropropagadas de Violeta Africana (Saintpaulia ionnatha Wendl). Revista de Biologia e Cincias da Terra 4(2):44-49.
8

Baker, P. Fossard, R. y Bourne, R. 1979. Progress towards clonal propagation of Eucalyptus species by tissue culture techniques.
3

Ramrez-Villalobos, M. y Salazar, E. 1997. Establecimiento in vitro de segmentos nodales de guayabo (Psidium guajava L.). Rev. Fac. Agrom. (LUZ). 1997, 14: 497-506
9

Bianchini, F. y Pantano, A. 1991. Tudo verde, Gua de plantas e flores. Sao Paulo: Mehloramentos. 135 p.
4

Roca, W. Mroginski, L. 1993 Cultivo de Tejidos en la Agricultura Fundamentos y Aplicaciones. Colombia.

10

Garca, L. et al. 2002. Desarrollo de yemas adventicias en banano (Musa sp.) cv. Gran Enano (AAA). Biotecnologa Vegetal, 2: 4749.
5

Swartz, H. J. y Lindstrom, J.T. 1986. Small fruit and grape tissue culture from 1980 to 1985: Commercialization of the technique. 201-220 p.

Jimnez, E. 1998. Cultivo de pices y meristemos. Propagacin y mejora gentica de plantas por biotecnologa. Santa Clara.
6

Pasqual, M. et al. 1996. Enraizamiento de rotacoes de Violeta Africana (Saintpaulia ionnatha Weld): Efecio da incubacao em acido indolbutirico. Ciencia e Agrotecnologa, 20 (4):462-467.