Clulas

PESQUISA

Tronco-Embrionrias
inhagens de clulas tronco embrionrias (clulas ES do ingls embryonic stem) so clulas no diferenciadas, derivadas do boto embrionrio de blastcistos, que tm como caracterstica principal pluripotncia (Evans e Kaufman, 1981; Martin, 1981) (Figura 1a, b). Ou seja, quando reintroduzidas em um blastocisto, as clulas ES possuem capacidade de retomar o desenvolvimento normal, colonizando diferentes tecidos do embrio, includa a linhagem germinativa. Somente aquelas linhagens de clulas ES capazes de colonizar a linhagem germinativa de um embrio so consideradas altamente pluripotentes. Quando cultivadas em condies especficas, as clulas ES podem ser mantidas em seu estado no diferenciado por mltiplas divises celulares. Por outro lado, essas clulas podem ser induzidas a iniciar um programa de diferenciao in vitro. Por exemplo, quando cultivadas em suspenso, as clulas ES formam espontaneamente agregados de clulas diferenciadas chamados corpos embriides (Ebs - do ingls, embryoid bodies), que simulam o desenvolvimento de um embrio pr-implantado. Atravs de anlises morfolgicas, imuno-histoqumicas e moleculares, encontrase uma grande variedade de linhagens embrionrias dentro dos EBs hematopotica, neuronal, endotelial, cardaca e muscular (Ling e Neben, 1997) (Figura 1c, d). Essas propriedades das clulas ES levaram ao seu uso como modelo in vitro de desenvolvimento embrionrio precoce. Nelas, podem ser estudados os mecanisFigura 1: Clulas ES. mos de diferenciao celular, o (A) Blastcisto de processo de iniciao da inaticamundongo. O asterisvao do cromossomo X, e os co indica o boto efeitos de substncias txicas e embrionrio. (B) Clulas biologicamente ativas no deES em cultura. As setas senvolvimento embrionrio in indicam grumos contenvitro. do dezenas de clulas ES. (C) Corpo Modelos animais para embriide. (D) Anlise doenas genticas histolgica de corpos humanas: embriides contendo diferentes estruturas e Nos ltimos anos, clulas ES tipos celulares: cavidade vem sendo utilizadas para procstica (cc); adipcitos duzir camundongos transgni(ad); msculo (m); fibras cos e modelos animais de dode colgeno (cl); enas genticas humanas. Escondrcitos (cd); precurses modelos animais so imsores sanguneos (os) portantes ferramentas para o

Clulas tronco-embrionrias e a gerao de modelos animais para doenas genticas humanas

Alexandre Kerkis

Professor visitante do Departamento de Biologia do Instituto de Biocincias USP.

Marina Soukoian

Professora visitante do Departamento de Biologia do Instituto de Biocincias USP.

Irina Kerkis

Professora visitante do Departamento de Biologia do Instituto de Biocincias USP.

Christian Merkel

Aluno de Mestrado do Programa Interunidades em Biotecnologia IPEM Butant ICB - USP.

Marco R. B. Mello

Aluno de Doutorado do Departamento de Reproduo Animal, Faculdade de Veterinria e Zootecnia - USP.

Lygia da Veiga Pereira

Professora Assistente do Departamento de Biologia do Instituto de Biocincias USP. lpereira@usp.br Fotos cedidas pelos autores

20

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 20 - maio/junho 2001

pela verso mutada do mesestudo das patologias associmo gene, construda no laadas com uma doena especboratrio (Figura 2). Dessa fica, alm de servirem como forma, so obtidas linhagens um sistema no qual podem de clulas ES geneticamente ser testadas, novas terapias. O modificadas. Essas so agrerecente desenvolvimento de gadas a mrulas de camuntcnicas de manipulao do dongos in vitro e, assim, ingenoma de camundongos faz corporadas ao embrio (Fido camundongo transgnico gura 3). Os camundongos o melhor sistema disponvel resultantes sero quimeras para o estudo de doenas geformadas de clulas do emnticas humanas (Capecchi, brio recipiente e das clulas 1989). ES recombinantes. Se essas A propagao pela linhaltimas colonizarem a linhagem germinativa de DNA migem germinativa dos animais croinjetado no proncleo de quimricos, a mutao ser ovos fertilizados de camunento transmitida s novas dongos foi descrita, pela priFigura 2: Recombinao homloga. Exons geraes de camundongos meira vez, em 1980 (Gordon esto representados por retngulos, ntrons (Figura 4). et al., 1980). Essa metodolopor linhas azuis. O vetor de recombinao A capacidade de modifigia faz com que vrias cpias homloga possui duas regies de homologia car regies especficas do do transgene injetado se inteao gene alvo (homol. 5 e 3). O pareamento genoma do camundongo por grem em tandem em um stio dessas regies com as regies homlogas do recombinao homloga peraleatrio no genoma e sejam lcus endgeno permite que duas mite a criao em potencial transmitidas de forma Menderecombinaes recprocas levem substituide camundongos com qualliana. Desde ento, a microino de um exon (cinza) pela cassete de quer gentipo desejado. O jeo pronuclear tem sido utiexpresso neo. A deteco do evento de vetor mais comumente usalizada gerao de modelos recombinao homloga feita por Southern do para recombinao hoanimais para vrias doenas blot de DNA genmico das colnias de mloga o chamado vetor genticas dominantes, incluclulas ES. Uma sonda externa regio de de substituio de seqnindo osteogenesis imperfecta homologia (barra verde) utilizada em DNA cia, que contm o gene de (Bonadio et al., 1990), atravs digerido com a enzima de restrio EcoRI resistncia neomicina (neo) da insero de um alelo muta(E). A substituio do exon por neo introduz flanqueado por seqncias do - o transgene - no genoma um stio de EcoRI no locus, gerando uma homlogas ao gene alvo (Cado camundongo. banda menor referente ao alelo mutado. pecchi, 1989) (Figura 2). AtraNo entanto, esse mtodo Uma colnia recombinante detectada (*) vs de dois eventos de reapresenta algumas limitaes. combinao recprocos, esse Por causa do stio aleatrio de tipo de vetor media a substiintegrao do transgene, este tuio das seqncias endpoder no estar sob o congenas de DNA pelas seqntrole de todos os elementos cias exgenas contidas no vetor (Fiem cis que controlam a expresso do veis a efeitos de dosagem gnica. gura 2). Assim, so criadas mutaes gene endgeno. Assim, a expresso em loci especficos do genoma do temporal e espacial do transgene no Manipulao do genoma camundongo. seguir o padro de expresso do do camundongo atravs gene endgeno. Alm disso, a introde clulas ES: Mutao condicional duo de um terceiro alelo - o transsistema CRE-loxP: gene mutante - cria uma situao Recentemente, a combinao do artificial no que diz respeito pro- cultivo de clulas ES e da recombinaOutro tipo de vetor desenvolvido poro entre os transcritos normais e o homloga resultou na criao de os mutantes. Enquanto uma pessoa um mtodo alternativo e mais preci- ainda mais recentemente utiliza o com uma doena gentica dominan- so para manipular o genoma do sistema de recombinao em bactrias CRE-loxP (Chambers, 1994). te possui um alelo normal e um camundongo. mutado, o camundongo transgnico As clulas ES podem ser modifi- Nesse microorganismo, duas seqnpossuir dois alelos endgenos nor- cadas geneticamente, em cultura, atra- cias especficas de 38 pb, denominamais e diversas cpias do alelo mu- vs da recombinao homloga, pro- das loxP, so reconhecidas pela protante (transgene). Essa proporo cesso que promove a substituio do tena CRE do bacterifago P1. Por pode ser crtica em doenas suscet- alelo normal de um gene especfico meio da recombinao entre duas
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 20 - maio/junho 2001 21

caras e podem ser usadas sequncias loxP, a protedurante um tempo limitana CRE promove a remodo, por j estarem em culo da seqncia de DNA tivo h a um perodo reladentre estas sequncias, tivamente longo. Assim, resultando em uma delepara a produo a longo o. prazo de animais transgO sistema CRE-loxP nicos fundamental a pode ser usado junto com obteno de novas linhaa recombinao homlogens de clulas ES. ga para se criarem mutaNs estabelecemos trs es no genoma do canovas linhagens de clumundongo (Chambers, las ES a partir do boto 1994). Nesse caso, o veembrionrio de blastcistor de recombinao contos de camundongos 129/ tm, alm da cassete de Sv (pelagem agouti): USPexpresso neo, duas se1, USP-2 e USP-3. Sua pluqncias loxP delimitanripotncia foi avaliada in do a regio a ser deletada vitro atravs de testes con(Figura 5). O primeiro vencionais. Eles incluram evento de recombinao a cariotipagem das cluhomloga introduzir as Figura 3: Sistema de recombinao CRElas, a atividade de fosfataseqncias loxP nos stiloxP. Seqncias loxP esto representadas por se alcalina e a capacidade os especficos do gene tringulos verdes. O primeiro evento de das clulas de formarem alvo. Um segundo evento recombinao homloga introduz os stios loxP EBs complexos. Essas trs de recombinao, mediaentre o exon a ser deletado. Em um segundo linhagens apresentaram do pela protena CRE, leevento, a expresso da protena CRE ir mediar caritipo 40, XY normal, var deleo a regio do a recombinao entre os dois stios loxP, alta atividade de fosfatase alelo recombinante flandeletando a seqncia entre eles. A expresso alcalina, e formaram EBs queada pelas seqncias de CRE pode ser controlada de forma que complexos, com diversos loxP. induza a recombinao somente em tecidos ou tipos celulares e cardiomiA recombinao meestgios de desenvolvimento especficos do citos pulsantes, demonsdiada por CRE pode ser camundongo trando um alto grau de feita ainda nas clulas ES diferenciao (Figuras 1 e em cultura, atravs da 6). Estas caractersticas inexpresso transiente de CRE que h nelas. Uma vantagem quando presentes desde a concep- dicam um alto nvel de pluripotncia desse sistema que, com ele, o gene o ou em todos os tecidos do ani- das novas linhagens de clulas ES USP-1, USP-2 e USP-3. neo no fica inserido no gene alvo. A mal. Foi avaliada a capacidade da lipresena de neo em ntrons de genes A combinao dessas estratgias pode introduzir seqncias que atra- de manipulao do genoma do ca- nhagem USP-1 de popular a linhapalhem o splicing correto do gene mundongo, quando realizadas em gem germinativa de animais quimalvo, ou que, de alguma ou outra clulas ES, permitem a criao de ricos. Atravs da agregao e do cocultivo das clulas USP-1 com mforma, diminuam o nvel de expres- linhagens de animais mutantes. rulas de animais CD-1 (pelagem branso do alelo mutado ou de genes na ca), foram gerados animais quimrisua proximidade. Esse tipo de efeito Estabelecimento de novas cos (Figura 3). O nvel de quimerisj foi descrito em alguns genes (Pelinhagens de clulas ES: mo, estimado a partir da colorao reira et al., 1997; Pereira et al., 1999). Alternativamente, o segundo Um parmetro crtico para uso de da pelagem dos animais, variou de 0 evento de recombinao pode ser clulas ES na gerao de modelos a 100%. Os animais mais compostos realizado in vivo. Dessa forma, con- animais a sua pluripotncia, que de clulas derivadas das clulas USPtrolando-se o padro temporal e o pode ser perdida durante o cultivo 1, de pelagem predominantemente espacial da expresso de CRE, pode- prolongado. O uso de linhagens en- agouti, foram cruzados com fmeas se controlar o perodo de desenvol- velhecidas dessas clulas pode levar CD-1. Como a pelagem agouti vimento e os tecidos onde a mutao a uma baixa freqncia de recombi- dominante sobre a pelagem branca ser induzida, o que chamamos de nao homloga e no colonizao dos animais CD-1, a pelagem agouti mutao condicional. Esse sistema da linhagem germinativa de animais da ninhada resultante demonstrou a utilizado quando se deseja estudar o quimricos (Nagy e Rossant, 1993). colonizao da linhagem germinatiefeito de mutaes que so letais Clulas ES murinas comerciais so va dos animais quimricos pela li22 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 20 - maio/junho 2001

nhagem de clulas ES USP-1 (Figura 4). Essa linhagem est, no momento, sendo utilizada para gerar um modelo animal para a sndrome de Marfan. Gerao de um modelo animal para a sndrome de Marfan: A sndrome de Marfan (SMF) a mais comum das doenas genticas do tecido conjuntivo. Herdada de forma autossmica dominante, essa sndrome tem uma incidncia de, aproximadamente, 1 em 10.000 indivduos (McKusick, 1955). O fentipo da SMF 100% penetrante, e suas manifestaes clnicas afetam primariamente trs reas: esqueltica (crescimento excessivo dos membros, hiperextensibilidade articular, escoliose e deformidades na regio anterior do trax); ocular (ectopia lentis, miopia e deslocamento da retina); e cardiovascular (dilatao da raz da aorta, disseco da aorta, prolapso da vlvula mitral e regurgitao mitral). A sobrevida de pacientes com a SMF de, aproximadamente, dois teros do normal - 40 anos na mdia. Em 90% dos casos, a morte causada por falha cardiovascular (McKusick, 1955). O diagnstico precoce seguido de interveno mdica leva a um prolongamento da sobrevida. A SMF causada por mutaes no gene FBN1. Esse gene codifica a fibrilina-1, componente estrutural mais abundante das microfibras na matriz extracelular. As microfibras esto largamente distribudas pelo organismo e se encontram associadas elastina nas fibras elsticas. Acredita-se que mutaes no gene FBN1 geram o fentipo da SMF atravs do modelo dominante-negativo (Dietz et al., 1993). Segundo esse modelo, protenas mutantes interagem com as fibrilinas normais, incorporando-se s microfibras e perturbando, assim, sua organizao e integridade. Ainda de acordo com esse modelo, os indivduos portadores de um alelo mutante com uma expresso de fibrilina-1 mais baixa podem apresentar um fentipo menos severo da doena devido prevalncia de fibrilinas normais produzidas a partir

do alelo normal (Pereira et al., 1997). A identificao de uma protena altamente homloga fibrilina-1, denominada fibrilina-2, levou classificao destas como uma nova famlia de protenas extracelulares: fibrilina1, produto do gene FBN1; e fibrilina2, produto do gene FBN2. Estudos dos padres de expresso desses dois genes durante a embriogenia mostram que estes so expressos de maneiras diferentes, tanto em termos de distribuio em tecidos quanto de estgios de desenvolvimento (Zhang et al., 1995). Em geral, mRNAs da fibrilina-2 aparecem mais cedo e se acumulam por um perodo mais curto de tempo do que os da fibrilina-1. Sntese de fibrilina-1 est relacionada com o perodo mais tardio da morfogenese e com o aparecimento de estruturas mais definidas.

Por outro lado, a sntese da fibrilina-2 coincide com etapas iniciais da morfogenese, em particular com o comeo da elastogenese. Logo, as microfibras morfologicamente homogneas so, na verdade, heterogneas, no que diz respeito sua composio por diferentes fibrilinas. Com base nesses resultados, foi proposto que as fibrilinas tm funes distintas, porm relacionadas, na fisiologia das microfibras. Segundo essa teoria, a fibrilina-1 prov principalmente suporte e fora, enquanto a fibrilina2 tem uma funo principal na regulao do processo inicial da formao da fibra elstica (Zhang et al., 1995). Para estudarmos a funo especfica de cada fibrilina na formao da fibra elstica e na manuteno da integridade de diversos tecidos, e os mecanismos de patognese envolvidos na SMF, criamos camundongos com diferentes mutaes no gene Fbn1, homlogo ao gene FBN1 humano, atravs da recombinao homloga em clulas ES (Figura 7). Linhagem mgD: D A primeira linhagem (mgDD) possui uma substituio dos exons 19-24 do gene Fbn1 por um cassete de expresso do gene da neomicina (neo) (Pereira et al., 1997) (Figura 7). Esta mutao levou produo de monmeros de fibrilina-1 com uma deleo interna, porm, devido presena de neo no ntron 18, com um nvel de expresso 10 vezes menor do que o do alelo normal. Assim, a mutao mgD representa uma combinao de uma mutao estrutural e hipomrfica. Em acordo com o modelo dominante-negativo, animais heterozigotos no apresentam nenhum fentipo, provavelmente devido ao excesso de fibrilinas normais em relao forma mutante. Por outro lado, animais homozigotos mgD/mgD morrem de complicaes cardiovasculares durante as duas primeiras semanas de vida ps-natal. A histopatologia da parede vascular desses animais extremamente similar quela de pacientes com SMF, com a mesma
23

Figura 4: Gerao de animais quimricos. Clulas ES derivadas de um animal agouti so cocultivadas com mrulas de um animal de pelagem branca. As clulas se integram ao embrio, e os animais resultantes so quimeras, compostas de clulas derivadas do embrio receptor e de clulas derivadas das clulas ES

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 20 - maio/junho 2001

Figura 5: Populao da linhagem germinativa das quimeras pelas clulas ES. Animais quimricos cruzados com fmeas CD-1 (pelagem branca) deram origem a uma ninhada de animais de pelagem agouti. Isso indica que a linhagem germinativa das quimeras foi populada pelas clulas ES e, assim, o gentipo dessas clulas foi transmitido prole

fragmentao das fibras elsticas. Mesmo assim, em tecidos no afetados, as fibras elsticas so morfologicamente normais. A concluso mais importante desse estudo foi a de que, mesmo na ausncia de fibrilina-1 normal, h formao da fibra elstica (Pereira et al., 1997). Assim, confirmamos a hiptese de que na verdade, a fibrilina2 expressa mais cedo, durante o desenvolvimento embrionrio, dirige o depsito de elastina na formao da fibra elstica, e que a fibrilina 1 teria um papel posterior na manuteno da integridade e no suporte dessas fibras. Linhagem mgR: O segundo alelo Fbn1 mutante (mgR) foi criado atravs da insero do gene neo entre os exons 18 e 19 (Pereira et al., 1999) (Figura 7). Apesar dessa insero no causar nenhuma perda de seqncia do gene Fbn1, ela leva a uma reduo de 5 vezes na expresso do alelo mutado.

Assim, o alelo mgR consiste em uma mutao hipomrfica que produz 20% de molculas de fibrilina1 normais. Como esperado, animais heterzigotos mgR/+ so normais. Em contraste, camundongos homozigotos mgR/mgR desenvolvem cifose severa e morrem abruptamente de falha do sistema cardiovascular at os trs meses de idade. Esses animais mutantes tambm apresentam hrnia de diafragma e ossos alongados, similar a pacientes com SMF. A anlise histopatolgica dos animais mgR/mgR revelou uma participao importante da resposta inflamatria na progresso das manifestaes vasculares da mutao (Pereira et al., 1999). Assim, esses estudos sugerem que a inibio dessa resposta em indivduos com a SMF pode retardar as manifestaes da doena no sistema cardiovascular. Fbn10: Finalmente, uma terceira mutao no gene Fbn1 foi gerada em nosso laboratrio nas clulas ES USP-1: um alelo nulo (Fbn10) (Figura 7). Para isso, o vetor de recombinao homloga foi construdo de maneira que promovesse uma substituio de parte do exon 1 do gene Fbn1 pelo gene reprter da fosfatase alcalina e pela cassete de expresso neo. Espera-se que a deleo do cdon de iniciao de traduo e da seqncia codificante do peptdeo sinal, presentes no exon 1, ir inviabilizar a traduo correta da fibrilina-1. Alm disso, a presena do gene reprter da fosfatase alcalina sob controle do promotor endgeno do gene Fbn1 facilitar a anlise da expresso temporal e espacial desse gene em animais heterozigotos. Perspectivas: Nos ltimos 10 anos, clulas ES de camundongo tornaram-se um poderoso instrumento de pesquisa. Nelas so estudados os mecanismos de diferenciao celular e os

Figura 7: Mutaes no gene Fbn1 geradas por recombinao homloga em clulas ES. A protena fibrilina est esquematizada. Regies em cinza correspondem quelas modificadas nos alelos mutantes. Exons 1, 17 a 28 do gene selvagem (Fbn1wt) esto representados. O alelo mgD consiste na substituio dos exons 18 a 24 pela cassete de expresso neo, o que leva produo de monmeros de fibrilina com uma deleo interna, porm em baixa quantidade. O alelo mgR uma insero dessa cassete no ntron 18 do gene Fbn1, resultando na baixa expresso de fibrilina normal a partir desse alelo. O alelo Fbn10 um alelo nulo do gene Fbn1. Nele, parte do exon 1, includo o cdon de incio de traduo (ATG) e a seqncia codificadora do peptdeo sinal, foi substituda pelo gene reprter da fosfatase alcalina humana (hFA) e a cassete de expresso neo. O gene hFA fica colocado sob controle do promotor do gene Fbn1 (seta)
24 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 20 - maio/junho 2001

Figura 6: Caracterizao da linhagem USP-1 de clulas ES. (A) Caritipo. (B) Anlise de atividade de fosfatase alcalina (FA). Grumos de clulas escuras indicam alta atividade de FA

eventos iniciais do desenvolvimento embrionrio, reproduzidos por essas clulas diferenciadas in vitro. As linhagens estabelecidas em nosso laboratrio esto sendo utilizadas tambm para o estudo in vitro do efeito de novas substncias nesse estgio de desenvolvimento. Alm disso, a capacidade de clulas ES de se diferenciarem em qualquer tipo de tecido representa um enorme potencial de aplicao mdica. Sob condies especficas, induzidas a se diferenciarem in vitro, em um tipo celular determinado, elas podero, no futuro, ser uma fonte ilimitada de tecidos para transplante no tratamento de doenas. Um passo importante nessa direo foi o estabelecimento de linhagens de clulas ES humanas (Thomson et al., 1998). Agora, experimentos realizados com clulas ES murinas podero ser repetidos e adaptados s linhagens humanas. Finalmente, estamos vivendo o momento histrico do final do seqenciamento do genoma humano. A anlise da primeira verso completa do genoma humano identificou, aproximadamente, 30.000 genes (Lander et al., 2001). Desses, uma grande proporo no tem funo conhecida. O grande desafio da era ps-genoma ser determinar a funo gnica. Uma estratgia poderosa para o estudo de funo gnica in vivo a gerao de

mutantes. No caso de genes humanos, modelos em camundongos so utilizados devido nossa capacidade de manipulao do genoma desse animal atravs da recombinao homloga em clulas ES. A implementao desse instrumental de pesquisa no Brasil permitir seu uso pelos diversos grupos envolvidos no estudo de funo gnica. REFERNCIAS Capecchi, M.R. (1989). The new mouse genetics: Altering the genome by gene targeting. Trends in Genetics, 5: 70-6. Chambers, C.A. (1994). TKOed: Lox, stock and barrel. BioEssays, 16: 865-8. Dietz, H.C., McIntosh, I., Sakai, L.Y., Corson, G.M., Chalberg, S.C., Pyeritz, R.E., and Francomano, C.A. (1993). Four novel FBN1 mutations: significance for mutant transcript level and EGF-like domain calcium binding in the pathogenesis of Marfan syndrome. Genomics, 17:468-75. Evans, M. and Kaufman, M. (1981). Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature, 292: 154- 6. Gordon, J.W., Scangos, G.A., Plotkin, D.J., Barbosa, J.A., e Ruddle, F.H. (1980). Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77: 7380-4

Lander, E.S., Linton, L.H., Birren, B., et al., (2001). Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 409:860-921. Ling, V. and Neben, S. (1997). In vitro differentiation of embryonic stem cells: immunophenotypic analysis of cultured embryoid bodies. J Cell Physiol., 171:104-5. Martin, G.R. (1981). Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78: 7634-8. McKusick, V. (1955). The cardiovascular aspects of Marfans syndrome: a heritable disorders of connective tissue. Circulation, 11:321-42. Nagy, A. and Rossant, J. (1993). Production of completely ES cell-derived fetuses. In: Gene Targeting. A Practical Approach (Joiner, A.L., ed.), IRL Press, Oxford, pp.147-180. Pereira, L., Andrikopoulos, K., Tian, J., Lee, S.Y., Keene, D.R., Ono, R., Reinhardt, D.P., Sakai, L.Y., Biery, N.J., Bunton, T., Dietz, H.C., Ramirez, F. (1997). Targetting of the gene encoding fibrillin-1 recapitulates the vascular aspect of Marfan syndrome. Nat. Genet., 17:218-22. Pereira, L., Lee, S.Y., Gayraud, B., Andrikopoulos, K., Shapiro, S.D., Bunton, T., Biery, N.J., Dietz, H.C. Sakai, L.Y., and Ramirez, F. (1999). Pathogenetic sequence for aneurysm revealed in mice underexpressing fibrillin-1. Pros.Natl.Acad.Sci. USA, 96:3819-23. Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro,S.S., Waknitz, M.A., Swiegiel, J.J., Marshall, V.S., Jones, J.M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 282:1145-7. Zhang, H., Apfelroth, S.D., Hu, W., Davis, E.C., Sanguineti, C., Bonadio, J., Mechan, R.P., and Ramirez, F. (1994). Structure and expression of fibrillin-2, a novel microfibrillar component preferentially located in elastic matrices. J. Cell Biol., 124: 85563. Zhang, H., Hu, W., and Ramirez, F. (1995) Developmental expression of fibrillin genes suggests heterogeneity of extracellular microfibrils. J. Cell Biol., 123:1165-76.
25

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 20 - maio/junho 2001