Cultivo in vitro de meristemos

Castro W., Velsquez G.

ESCUELA POLITCNICA DEL EJRCITO Departamento de Ciencias de la Vida, Facultad de Biotecnologa Laboratorio de cultivo de tejidos vegetales
Sangolqu-Ecuador RESUMEN En el presente trabajo se estudi el cultivo in vitro de meristemos con el objetivo de obtener plantas libres de virus y otros patgenos. La metodologa utilizada durante este estudio consisti en tomar explantes (yemas apicales) de plantas de Iresine herbstii que fueron sometidos a una desinfeccin con una solucin al 1 % de detergente ms cinco gotas de Tween durante 10 minutos, despus se las lavo dos veces con agua destilad y una con agua estril, despus se coloc los explantes en una solucin de alcohol al 90% durante 1 minuto y una solucin de cloro al 2% ms tres gotas de Tween 20 durante 10 minutos ms. Para la siembra se lav los explantes tres veces con agua estril y se los cultivo en medio MS enriquecido con: 1 mg L-1 de KIN, 0,25 mg L-1 de AIA, 100 mg L-1 de mioinositol, 0,5 mg L-1 de tiamina, 2 mg L-1 de glicina, 30 g L-1 de azcar y 6,5 g L-1 de agar, pH ajustado a 5,2. Despus de dos semanas de incubacin en luz natural, a 20 C de temperatura y a 62% de humedad en el ambiente, se observ oxidacin 50,00 %, necrosis 8,33 % de los explantes, contaminacin 8,33 % y respuesta 16,66 % en otros.

INTRODUCCIN La Iresine herbstii es una planta ornamental muy popular debido al color de sus hojas purpura o verde y por sus flores blancas que crecen de manera rpida, otra de las caractersticas para que esta planta se encentre en muchos jardines es que en regiones con temperaturas anuales puede permanecer todo el ao sin presentar ningn problema (Pereira, 2007). Las plantas ornamentales han sido de gran estudio en los ltimas dcadas debido al gran poder de comercializacin que ellas tiene, por lo que la produccin industrial a gran masa de estas especies es de relevante importancia a nivel econmico y una de las

mejores formas para hacerlo es la biotecnologa por medio del cultivo in vitro. En la actualidad muchas plantas ornamentales como el geranio han sido de intensos estudio tanto en mejoramiento gentico como en su propagacin masiva (Alonso, 2002). En las yemas se encuentran un grupo de clulas que conforman los meristemos. La siembra in vitro de meristemos permite regenerar plantas libres de virus, por la gran asepsia que presentan estos explantes (Roca, W. Mroginski, L. 1993). Los meristemos no poseen tejido vascular, lo que los mantiene parcialmente aislados del resto de la planta. Dado que la mayora de

los virus y bacterias que son endopatgenos de las plantas, se movilizan por los haces vasculares, es por ello que se usa el cultivo in vitro de meristemos para la propagacin de plantas que tengan mayor oportunidad de estar libres de patgenos (Frank, S. & Robert, V. 2004) Es importante mencionar que el medio de cultivo que vaya a ser utilizado, debe ser rico en elementos minerales, en particular el potasio debe estar en un nivel alto para una mejor multiplicacin vegetativa, teniendo en cuenta estas consideraciones, una buena opcin es el medio de cultivo de Murashige y Skoog 1962, (MS), y algunos reguladores de crecimiento, en concentraciones apropiadas, para que cumpla todos los requerimientos de los meristemos y se encuentren en la capacidad de inducir al crecimiento de plantas libres de virus o cualquier contaminacin (Smith, R. 1992). El objetivo del presente trabajo fue cultivar in vitro meristemos de Iresine herbstii utilizando medio MS enriquecido con ciertos reguladores de crecimiento. METODOLOGA Muestreo Como material experimental se utilizaron explantes de tallo con yema de Iresine herbstii. Desinfeccin del explante Se lav las muestras con agua corriente para retirar todas las impurezas. Posterior a esto se las sumergi en una solucin al 1 % de detergente ms cinco gotas de Tween 20 durante 10 minutos en agitacin. Se enjuag las muestras, dos veces con agua destilada y

una con agua estril, se elimin el agua y se las sumergi en alcohol al 90% durante 1 minuto, sin realizar ningn enjuague se sumergi las muestras en una solucin de cloro al 2 % ms tres gotas de Tween 20, durante 10 minutos en agitacin. Finalmente se procedi a realizar tres lavados con agua estril dentro de la cmara de siembra. Siembra e Incubacin Despus de realizados los tres lavados dentro de la cmara, se colocaron los instrumentos metlicos sobre la superficie, se aspergearon con etanol 90% y se flamearon. Se coloc la muestra sobre la superficie estril y se quitaron las capas de tejidos hasta llegar al meristemo. Los explantes fueron sembrados en frascos con medio MS enriquecido con: 1 mg L-1 de KIN, 0,25 mg L-1 de AIA, 100 mg L-1 de mioinositol, 0,5 mg L-1 de tiamina, 2 mg L-1 de glicina, 30 g L-1 de azcar y 6,5 g L-1 de agar, pH ajustado a 5,2, en cada recipiente se coloc un explante. Se incub dos semanas en luz natural, a 20 C de temperatura y a 62% de humedad en el ambiente y se observo los resultados.

RESULTADOS

Figura 1: Imgenes de los resultados del cultivo in vitro de meristemos de Iresine herbstii en medio MS; A: explante oxidado; B: explante quemado; C: Respuesta de un explante.

Tabla 1: Resultados del cultivo in vitro de Iresine herbstii en medio MS.

Resultado en los explantes Oxidacin Quemados Respuesta Contaminados Necrosis Total

Nmero de medios 6 2 2 1 1 12

Porcentaje 50,00 % 16,66 % 16,66 % 8,33 % 8,33 % 100 %

En el presente ensayo se obtuvo el 16,66 % (tabla 1) de respuesta de explantes (figura 1 C) de los doce meristemos sembrados, siendo la oxidacin de estos uno de los principales inconvenientes con un 50,00 % de explantes como se muestra en la tabla 1 y figura 1 A, algunos otros inconvenientes menores fueron por necrosis y explantes quemados con el 8,33 % y 16,66 % respectivamente y se muestra un porcentaje bajo en la contaminacin con un 8,33 %.

DISCUSIN De manera general se puede decir que los meristemos apicales tienen ms probabilidad de estar libres de virus que los meristemos axilares los cuales se confirman en los resultados, y que si los meristemos provienen de una planta en plena actividad hay mayor probabilidad de obtener plantas libres de virus. Teniendo en cuenta lo citado anteriormente podemos mencionar que la contaminacin (fngica) observada en los resultados del presente estudio se debi a que algunos de los explantes de los cuales se extrajeron los meristemos fueron yemas axilares. La contaminacin bacteriana se present en un porcentaje bajo de explantes sembrados lo cual es muy importante ya que este es un factor limitante en el xito del establecimiento asptico de los cultivos in vitro. La presencia de microorganismos contaminantes ocurre principalmente cuando la planta donante crece directamente en el campo y est expuesta a plagas, enfermedades, polvo y otros agentes, sin ningn tipo de control ambiental (Ramrez-Villalobos, M. y Salazar, E. 1997). La oxidacin de los explantes es decir la generacin de sustancias de naturaleza fenlica, cuya oxidacin produce un oscurecimiento de los explantes se ve incrementado cundo en el medio existen una excesiva concentracin de reguladores de crecimiento (Quintero., et al, 2003). Otro de los motivos por los cuales existe la presencia de compuesto fenlicos se encuentra asociadas con tejidos somticos vegetales expuestos a situacin de estrs, como por ejemplo el dao fsico provocado durante el

aislamiento del explante de la planta madre. Los explantes jvenes de la angiospermas generalmente secretan al medio de cultivo polifenoles oxidados visibles como pigmentos marrones o negros (Olmos., et al, 2010). La necrosis y la oxidacin de los explantes tiene un porcentaje alto sobre todo al no incluir al medio de cultivo sustancias que los pueda contrarrestar como carbn activado al igual que el acido ctrico y el acido ascrbico respectivamente (Vega., et al, 2007). Los explantes quemados y necrosados presentes en el cultivo in vitro se deben principalmente por la utilizacin de alcohol y de cloro a concentraciones altas por largos periodos de tiempo lo cual es necesario estandarizar bien las concentraciones de estos dos mtodos de desinfeccin para bajar los porcentajes de estos resultados (Coba. 2009).

Estos resultados nos pueden llevar a afirmar que para el establecimiento de material vegetal en condiciones in vitro se requiere de la existencia de un banco de donantes que garantice su calidad fitosanitaria (Jimnez, E. 1998).

CONCLUSIONES Podemos concluir gracias a esto que se ha dado una gran mejora en los operadores al momento de sembrar los explantes ya que los resultados obtenidos en esta prctica son mucho mejores que prcticas anteriores donde se observ un alto porcentaje de contaminacin de 8,33 %.

Los resultados obtenidos en este trabajo indican la necesidad de estandarizar el cultivo in vitro de plantas que se desee investigar y de desarrollar estrategias para lograrlo de mejor manera, como la utilizacin de muestras producidas en condiciones in vitro, para as tener la completa seguridad de que los explantes utilizados nos garanticen la obtencin de plantas libres contaminantes.

El 16,66 % de respuesta en los meristemos de Iresine herbstii nos indica que la metodologa utilizada tanto para la desinfeccin como para la respuesta de los meristemos fue correcta saco en las concentraciones de alcohol y de cloro y los tiempos de exposicin de los explantes por los altos porcentajes en explantes quemados y necrosados de casi un 30,00 % entre los dos. Pereira, C. 2007. Plnatas y flores, Iresine herbstii . Consultado el 25 de junio del 2011 http://plantayflor.blogspot.com/2008/08/ire sine-herbstii-iresine-el-gnero.html Olmos, S. Luciani, G. & E, Galdeano. 2010. Mtodos de propagacin y propagacin de germoplasma. Biotecnologa y mejoramiento vegetal. 5, (1). Ramrez-Villalobos, M. & Salazar, E. 1997. Establecimiento in vitro de segmentos nodales de guayabo (Psidium guajava L.). Rev. Fac. Agrom. (LUZ). 1997, 14: 497-506 Roca, W. Mroginski, L. 1993 Cultivo de Tejidos en la Agricultura Fundamentos y Aplicaciones. Colombia. Sierra, R. 2002. El lamo tembln: bases para su cultivo, gestin y conservacin. Editorial Aedos. Primera Edicin. Espaa. Smith, R. 1992. Plant Tissue Culture, Techniques and Experiments. USA. Academic Press, Inc. Vega C., Bermejo J., Villegas G., Quezada G., Aguilar M., Conde E., 2007. propagacin masiva de Polylepis tomentella Weddell ssp. nana mediante tcnicas de cultivo in vitro

BIBLIOGRAFA Alonso, M. 2002. Biotecnologa aplicada a mejora de Pelargonium. Universidad Complutense de Madrid. Facultad de cc. Biolgicas. Bepartamento de Gentica. Coba, M. 2009. Rescate de Fragaria chiloensis var. Huachi especie de frutilla en peligro de extincin, a travs de la tcnica de cultivo in vitro utilizando meristemos y hojas. Escuela Politcnica del Ejrcito Departamento de Ciencias de la Vida Ingeniera en Biotecnologa. Frank, S. & V, Robert. 2004. Las Plantas Vasculares: Forma y Funcin. Consultado el 25 de junio del 2011. http://www.biologia.edu.ar/botanica/tema1 5/15-1vasculares.htm Jimenez, E. 1998. Cultivo de pices y meristemos. Propagacin y mejora gentica de plantas por biotecnologa. Santa Clara. Moutia, M. & Dookun, A. 1999. Evaluation of surface sterilization and hot water treatment on bacterial contaminants in bud culture of sugarcane. Expl. Agric. 35: 265274.