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CHROMATOGRAPHIE

Die Chromatographie ist ein analytisches Trennverfahren. Dabei wird die unterschiedliche Verteilung eines Stoffes zwischen einer ruhenden (stationären) Phase und einer sich bewegenden (mobilen) Phase ausgenützt. Die beiden Phasen dürfen nicht miteinander mischbar sein.

Die Ursprünge der modernen chromatographischen Verfahren liegen etwa 150 Jahre zurück. Das Phänomen der chromatographischen Trennung wurde erstmals 1834 von dem deutschen Wissenschaftler Runge beschrieben. Als Begründer der eigentlichen Chromatographie (griech. chroma = Farbe) gilt der Russe Tswett, der im Jahre 1906 als Erster die Begriffe Chromatogramm und chromatographische Analyse bei der Beschreibung eines Verfahrens zur Trennung der Blattfarbstoffe einführte. E. Stahl (1924–1986) hat der DC als analytischen Methode dann zum Durchbruch verholfen .

Ist die stationäre Phase in Form eines dünnen Films auf einem Träger fixiert, spricht man von Dünnschichtchromatographie. Liegt sie hingegen in gepackter Form in einer Säule vor, wird sie als Säulenchromatographie bezeichnet. Die mobile Phase kann flüssig (Flüssigkeitschromatographie), aber auch gasförmig (Gaschromatographie) sein.

DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE

Wie bereits erwähnt, befindet sich die stationäre Phase auf einem Träger. Diese Platte kann aus Glas, Kunststoff- oder Aluminiumfolie sein. Die am häufigsten verwendeten, stationären Phasen sind Kieselgel, Zellulose, Polyamid und Aluminiumoxid.

sind Kieselgel, Zellulose, Polyamid und Aluminiumoxid. Die Platten sind meist 10 bis 20cm lang, ihre Breite

Die Platten sind meist 10 bis 20cm lang, ihre Breite richtet sich nach der Anzahl der Proben und Standards. Falls kein geeignetes Laufmittel bekannt ist, müssen auf kleinen Platten einige Vorversuche gemacht werden. Zusätzlich wird die Trennung der Probe bei Verwendung verschiedener Lösungsmittel getestet. Hat man so ein geeignetes Laufmittel ( = mobile Phase) gefunden, wird die Platte zur Analyse vorbereitet.

ACHTUNG: DC-Platte seitlich anfassen, damit keine Fingerabdrücke auf der stationären Phase entstehen !!!!

Zuerst wird etwa einen Zentimeter vom unteren Rand der Platte ein feiner Strich mit einem Bleistift ( kein Kugelschreiber) gezogen. Nun werden mit jeweils neuen Kapillaren das Präparat (feste Substanzen z.B. in Diethylether oder Dichlormethan zu lösen!) und - in je einem Zentimeter Abstand – Vergleichssubstanz und Ausgangsverbindungen so aufgetragen , dass möglichst kleine Flecken entstehen.

Vor dem Auftragens wird in der Chromatogra phiekammer bereits das Laufmittel etwa 5mm hoch eingefüllt

Vor dem Auftragens wird in der Chromatographiekammer bereits das Laufmittel etwa 5mm hoch eingefüllt und die Kammer verschlossen. Das dient dazu, die Atmosphäre in der Kammer mit dem Dampf des Laufmittels bzw. Laufmittelgemisches zu sättigen. Anschließend wird die Platte in die Kammer gestellt.

Anschließend wird die Platte in die Kammer gestellt. Das Laufmittel wird nun von den Kapillarkräften in

Das Laufmittel wird nun von den Kapillarkräften in die Höhe gesaugt. Erreicht das Laufmittel (LM) die Probe oder einen der Standards, so werden deren Komponenten aufgenommen. Das LM bewegt sich natürlich weiter fort und die gelösten Stoffe wandern mit. Allerdings treten die Teilchen der Komponenten immer wieder mit der stationären Phase in Wechselwirkung. Diese Bindungen erfolgen, weil als stationäre Phase meist ein relativ polarer Stoff genommen wird. Ein polarer Stoff bildet, obwohl er nach außen hin elektrisch neutral ist, relativ starke Ladungen im Molekül. Polare Stoffe sind etwa Zellulose, Aluminiumoxid oder Kieselgel .Sie können als stationäre Phasen z.B. Alkohole oder organische Säuren, die Bestandteil der Probe sein können, binden. Unpolare Verbindungen sind zum Beispiel Alkane, die bei polaren, stationären Phasen als LM eingesetzt werden. Je nachdem wie stark polar die Komponenten einer aufzutrennenden Substanz sind, binden sie sich stärker oder schwächer an die stationäre Phase. Relativ unpolare Substanzen gehen also relativ selten Bindungen mit der stationären Phase ein und werden auch schnell wieder von dort durch das LM abgelöst. Solche Verbindungen wandern also fast mit der Geschwindigkeit des LM. Umgekehrt verhalten sich stark polare Stoffe. Sie gehen sehr oft starke Bindungen ein und werden auch nur äußerst langsam wieder abgelöst. Sie haben daher nur eine kleine Wandergeschwindigkeit.

Erreicht die LM-Front den oberen Rand der Platte (1cm Abstand sollte bleiben) wird die Platte aus der Kammer genommen. Nun wird möglichst schnell die Front angezeichnet und die Platte getrocknet, .z.B. durch warme Luft. Zur unspezifischen Sichtbarmachung wird häufig UV-Licht eingesetzt, da viele Substanzen dieses absorbieren. Enthält die stationäre Phase einen Fluoreszenz-Indikator ( z.B.Kieselgel 60 F 254 ), erscheinen diese Substanzen als dunkle Flecken. Ein spezifischer Nachweis ist durch

postchromatographische Reaktion möglich, wobei die notwendigen Reagenzien entweder aufgesprüht od. im Tauchverfahren aufgebracht werden, z.B. Ninhydrin zum Nachweis von Aminosäuren.

Sichtbarmachen im Iod-Trog : Iod mit Kieselgel verreiben, in Chromatographietrog füllen, DC-Platte nach dem Trocknen
Sichtbarmachen im Iod-Trog :
Iod mit Kieselgel verreiben, in Chromatographietrog füllen,
DC-Platte nach dem Trocknen hineinstellen.
Für Verbindungen mit Doppelbindungen.

R F -WERTE:

Eine erste Auswertung wird rein optisch durchgeführt, also etwa nach Farbintensität der Flecken und der ermittelten Laufstrecke. Dann wird die Entfernung zwischen Laufmittelfront und Startlinie sowie die Wanderungsstrecken jedes einzelnen Flecks gemessen. Daraus wird wie folgt der R F - Wert berechnet. Bleibt die Verbindung am Start, ist der R F -Wert = 0 , läuft die Substanz mit der Laufmittelfront mit, ist der R F -Wert = 1.

Substanz 1: Rf = 0 Substanz 3: Rf = 1
Substanz 1:
Rf = 0
Substanz 3:
Rf = 1

Die R F -Werte von Präparat- und Vergleichsflecken werden verglichen. R F -Werte sind abhängig von der Art des Stoffes, zudem gibt es aber weitere Faktoren, die sie beeinflussen. Dazu zählen die Art der stationären und mobilen Phasen, aber auch die Größe der einzelnen Teilchen, die Dicke der stationären Phase, Alter der Platten und weitere Größen.