Hidratose Humana Brasil

MINISTRIO DA SADE
Hidatidose Humana no Brasil
Secretaria de Vigilncia em Sade/MS
BRASLIA-DF 2011
Apresentao Introduo 7
Caractersticas Morfolgicas e Ciclos Biolgicos dos Agentes Etiolgicos Sintomatologia 16
10 10
Mtodos Morfolgicos para o Diagnstico da Hidatidose Humana Mtodos Diagnstico da Hidatidose Humana Procedimento para teste imunolgico Leitura e interpretao dos resultados Divulgao dos resultados 27 Obteno, e Transporte de Soro Sanguneo Condies para a coleta 28 28 21 22 27
17 Imunolgicos
Morfomtricos para
Conservao
Coleta com seringa e agulha descartveis Coleta com sistema a vcuo 30
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Material para preparar e armazenar o soro Separao e armazenamento de soro 31
30
Acondicionamento das amostras para transporte Biossegurana Referncias 37 Solues para o diagnstico Anexo A Anexo B 41 48 41 34
31
Ficha de notificao para o imunodiagnstico da hidatidose Anexo C 49
48
Formulrio para envio de material biolgico por transporte areo 49 Anexo D 50 50
Normas da organizao e funcionamento do Sistema Nacional de Laboratrios de Sade Pblica Sislab Coordenao-Geral de Laboratrios de Sade Pblica CGLAB Relao dos Laboratrios Centrais de Sade Pblica Lacen Anexo E Glossrio 53 60 52 53
MINISTRIO DA SADE Fundao Oswaldo Cruz
Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

BRASLIA-DF 2011
2011 Ministrio da Sade. Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens dessa obra da rea tcnica. A coleo institucional do Ministrio da Sade pode ser acessada, na ntegra, na Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade: http://www.saude.gov.br/bvs. Tiragem: 1 edio 2011 5.000 exemplares Elaborao, distribuio e informaes: MINISTRIO DA SADE Secretaria de Vigilancia em Sade Departamento de Vigilancia Epidemiolgica Coordenao-Geral de Laboratrios de Sade Pblica Ncleo de Comunicao SCS Quadra 04, Bloco A, Edifcio Principal, 3 andar, Braslia/DF. CEP: 70.304-000 E-mail: svs@saude.gov.br Endereo eletronico: www.saude.gov.br/svs Coordenao geral: Rosangela Rodrigues-Silva Elaborao: Fundao Oswaldo Cruz. Laboratrio de Helmintos Parasitos de Vertebrados. Servio de Referncia Nacional em Hidatidose. Rosangela Rodrigues-Silva Fernanda Barbosa de Almeida Jos Roberto Machado-Silva Colaborao: Aline Kelen Vesely Reis Lucas de Andrade Barros Nilton Guiotti Siqueira Reviso tcnica: Jos Mauro Peralta Produo editorial Coordenao: Ncleo de Comunicao/GAB/SVS Capa: NJOBS Comunicao (Eduardo Grisoni) Projeto grfco: NJOBS Comunicao (Eduardo Grisoni) Diagramao: NJOBS Comunicao (Marlia Assis) Reviso: NJOBS Comunicao (Ana Cristina Vilela, Fernanda Gomes e Lizandra Deusdar Felipe) Normalizao: NJOBS Comunicao (Ana Cristina Vilela, Fernanda Gomes e Lizandra Deusdar Felipe) Normalizao: Mrcia Cristina Tomaz de Aquino Editora MS Impresso no Brasil / Printed in Brazil Ficha Catalogrfica _________________________________________________________________________________________________________________________________ Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilancia em Sade. Hidatidose humana no Brasil : manual de procedimentos tcnicos para o diagnstico parasitolgico e imunolgico / Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilancia em Sade; Fundao Oswaldo Cruz. Laboratrio de Helmintos Parasitos de Vertebrados. Servio de Referncia Nacional em Hidatidose Braslia: Ministrio da Sade, 2011. 63 p. : il. (Srie A. Normas e Manuais Tcnicos) ISBN 978-85-334-1832-5 1. Doenas parasitrias. 2. Diagnstico. 3. Biossegurana. I. Ttulo. II. Srie. CDU 616.993 _________________________________________________________________________________________________________________________________ Catalogao na fonte Coordenao-Geral de Documentao e Informao Editora MS OS 2011/0063 Ttulos para indexao: Em ingls: Human hydatid disease in Brazil: technical manual of procedures for the parasitological and immunological diagnosis Em espanhol: Human hidatdico enfermedad en Brasil: manual tcnico de los procedimientos para el diagnstico parasitolgico y inmunolgico
Sumrio
Apresentao l 5 Introduo l 7 Caractersticas Morfolgicas e Ciclos Biolgicos dos Agentes Etiolgicos l 10 Sintomatologia l 16 Mtodos Morfolgicos e Morfomtricos para o Diagnstico da Hidatidose Humana l 17 Mtodos Imunolgicos para Diagnstico da Hidatidose Humana l 21 Obteno, Conservao e Transporte de Soro Sanguneo l 28 Biossegurana l 34 Referncias l 37 Anexo A Solues para o diagnstico l 41 Anexo B Ficha de notificao para o imunodiagnstico da hidatidose l 48 Anexo C Formulrio para envio de material biolgico por transporte areo l 49 Anexo D Normas de organizao e funcionamento do Sistema Nacional de Laboratrios de Sade Pblica Sislab l 50 Anexo E Relao dos Laboratrios Centrais de Sade Pblica Lacen l 53 Glossrio l 60
Apresentao
Este Manual tem como objetivo fornecer aos tcnicos de laboratrio, de nveis mdio e superior, e aos demais profissionais da Sade informaes relativas obteno, conservao, transporte, recebimento e manuseio de amostras biolgicas utilizadas para investigao parasitolgica e imunolgica de doenas causadas por Echinococcus. So destacadas as metodologias laboratoriais atualmente disponveis para o diagnstico da Hidatidose e itens bsicos como biossegurana, mas de conhecimento necessrio para o manuseio de material biolgico. Essas metodologias contam com a utilizao de soro sanguneo e material biolgico, obtidos nas cirurgias, para o diagnstico diferencial de espcies da referida enfermidade. Como o Servio de Referncia Nacional em Hidatidose SRNH encontra-se em fase de estruturao, nossa inteno que este manual seja utilizado pelos diversos profissionais dos servios de sade pblica, principalmente dos Laboratrios Centrais de Sade Pblica Lacen localizados nas capitais das unidades Federativas do Brasil. O objetivo orientar acerca dos procedimentos a serem realizados com o material coletado ou recebido pelos Lacens nas reas endmicas de Hidatidose. Busca-se a padronizao com os protocolos de investigao do SRNH para que os resultados sejam obtidos com melhor qualidade e maior fidedignidade.
Introduo
As infeces parasitrias tm grande importncia na avaliao da sade pblica em pases em desenvolvimento como o Brasil, devido s suas altas prevalncias. Como no Pas so encontradas reas altamente desenvolvidas em contraste com outras bastante pobres, a prevalncia e o espectro parasitrio variam muito. Pode-se dizer que essa variao se deve a diversos fatores observados em diferentes reas como as socioeconmicas, educacionais, sanitrias e ambientais. A Hidatidose, infeco parasitria que acomete o homem e algumas espcies de animais, possui como agentes etiolgicos helmintos da classe Eucestoda, do gnero Echinococcus (RUDOLPHI, 1801). A Organizao Mundial da Sade OMS reconhece quatro espcies do gnero Echinococcus: Echinococcus granulosus (BATSCH, 1786); Echinococcus multilocularis (LEUCKART, 1863); Echinococcus oligarthrus (DIESING, 1863); e Echinococcus vogeli (RAUSCH; BERNSTEIN, 1972). Alm dessas, a utilizao de ferramentas moleculares permitiu a caracterizao de outras espcies: Echinococcus equinus (WILLIAMS; SWEATMAN, 1963) e Echinococcus ortleppi (LOPEZ-NEYRA; SOLER PLANAS, 1943). Recentemente, uma nova espcie Echinococcus shiquicus (XIAO et al., 2005) foi descrita na China em raposas tibetanas. A importncia epidemiolgica de cada uma das espcies est diretamente relacionada sua distribuio geogrfica especfica. Na Amrica do Sul, a Hidatidose uma infeco parasitria de grande relevncia tanto em animais quanto em humanos, considerando-se que a prevalncia maior do que em outras partes do mundo e que os prejuzos econmicos em funo da sua morbidade geram grandes gastos com cirurgias e tratamentos mdicos. Os casos de Hidatidose Humana por E. granulosus so muito mais comuns do que pelas outras espcies e ocorrem na Argentina, Bolvia, Chile, Colmbia, Equador, Peru, Uruguai, Venezuela e na regio Sul do Brasil (Figura 1). A infeco ocorre,
preferencialmente, nas regies com maior densidade de criao de gado. Pelo emprego de tcnicas de biologia molecular, sabe-se da existncia de variedades intraespecficas (linhagens ou cepas) em E. granulosus no Rio Grande do Sul.
Figura 1- Distribuio geogrfica da Hidatidose Humana por Echinococcus granulosus na Amrica do Sul e no Brasil
E. vogeli um dos responsveis pela forma policstica da doena, tambm denominada Hidatidose Neotropical por ter ocorrncia quase exclusiva em reas tropicais. Os casos humanos ocorreram no Panam, Colmbia, Equador, Venezuela e Peru. No Brasil, houve relato de casos nas regies Norte, Centro-Oeste e Sudeste (Figura 2). A infeco humana por E. oligarthrus, que tambm desenvolve uma larva policstica, rara no Brasil, visto que foram confirmados apenas dois casos. Os pacientes eram da regio Norte.
Fonte: (ROMANI, 1995)
Figura 2 - Distribuio geogrfica da Hidatidose Humana por Echinococcus vogeli na Amrica do Sul e no Brasil
Fonte: (Adaptado de RODRIGUES-SILVA et al., 2002)
Caractersticas Morfolgicas e Ciclos Biolgicos dos Agentes Etiolgicos

Os vermes adultos das espcies de Echinococcus medem de 3,9mm a 6,0mm, com o corpo dividido em esclex globoso, com quatro ventosas e um rostro armado de duas fileiras de ganchos; colo, ou regio proglotognica, delgado e curto; e estrbilo formado por trs ou quatro proglotes, das quais apenas a ltima denominada grvida, por conter o tero repleto de ovos (Figura 3).
Figura 3 - Desenho esquemtico das espcies do gnero Echinococcus A) Echinococcus vogeli; B) Echinococcus granulosus
Fonte: (SERVIO DE REFERNCIA NACIONAL EM HIDATIDOSE, IOC, FIOCRUZ)
A forma larvria (cisto hidtico, Figura 4), vulgarmente chamada de vescula aquosa ou bolha dgua, apresenta-se como uma esfera cheia de lquido transparente.
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Externamente, composta pelas membranas adventcia, anista e germinativa. A membrana adventcia uma reao tecidual do rgo parasitado presena da larva. A membrana anista constituda de escleroprotenas e funciona como uma barreira entre a adventcia e a germinativa. Esta, de natureza celular, responsvel por secretar o lquido hidtico e de sua parede interna brotam as vesculas prolgeras com os protoesclices (Figura 4). Essas vesculas podem estar aderidas parede por um pedculo ou se soltar e ficar livres no lquido hidtico, compondo a areia hidtica. O cisto hidtico de E. granulosus tipicamente unilocular, enquanto o de E. vogeli policstico (proliferao endgena e exgena das vesculas).
Figura 4 - Esquema do cisto hidtico de Echinococcus sp.
Fonte: (ILUSTRAO DE BRUNO ESCHENAZI, SERVIO DE PRODUO E TRATAMENTO DE IMAGEM, IOC, FIOCRUZ)
As espcies mais comuns de Echinococcus no Brasil apresentam semelhanas e diferenas no ciclo biolgico (Figuras 5 e 6). No ciclo biolgico do E. granulosus, o
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hospedeiro definitivo (o que tem o verme adulto) o co, tanto o que toma conta do gado quanto o co domstico, que se infecta ao se alimentar de vsceras dos bovinos (hospedeiro intermedirio) contaminadas pelos cistos hidticos. Para E. vogeli (Figura 6), o hospedeiro definitivo o co selvagem (Speothos venaticus) (Figura 7) ou o co domstico, e o hospedeiro intermedirio, a paca (Cuniculus paca) (Figura 8) ou a cutia (Dasyprocta aguti) (Figura 9). As vsceras da paca, caada pelo homem, contendo cistos so normalmente desprezadas. O co domstico, por ser companheiro habitual de caadores ou do povo da floresta, termina, habitualmente, por ingeri-las.
Figura 5 - Ciclo biolgico de Echinococcus granulosus
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Figura 6 - Ciclo biolgico de Echinococcus vogeli
Figura 7 - Speothos venaticus
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Figura 8 - Cuniculus paca
Figura 9 - Dasyprocta aguti
Fonte: (SERVIO DE REFERNCIA NACIONAL EM HIDATIDOSE, IOC, FIOCRUZ).
Nos ces, as larvas se transformam em vermes adultos, que se fixam nas vilosidades do intestino delgado. As progltides grvidas, contendo vrias centenas de ovos, se rompem e os ovos so eliminados com as fezes do animal (Figura 10). Os ovos contendo a oncosfera (ou embrio hexacanto) so ingeridos
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pelos hospedeiros intermedirios, atravs do alimento contaminado. Quando a oncosfera liberada no intestino delgado dos hospedeiros intermedirios, ela atravessa as paredes do intestino, penetra nos vasos sanguneos e linfticos e se fixa em rgos como fgado e pulmo, dando incio formao do cisto hidtico. O homem, que hospedeiro acidental, s se contamina a partir do ambiente ou quando em contato direto com ovos do Echinococcus.
Figura 10 - Ovo de Echinococcus sp.
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Sintomatologia
Em geral, as manifestaes clnicas da hidatidose se relacionam com o estado fsico do cisto, a integridade de suas membranas, a sua localizao anatmica e seu tamanho. A apresentao clnica derivada dos sinais de compresso de rgos pelo grande volume que os cistos uniloculares podem atingir. A hidatidose uma parasitose cuja sintomatologia se manifesta tardiamente devido ao crescimento lento dos cistos. Enquanto estes forem pequenos, a infeco assintomtica. Geralmente, esse crescimento causa deformao nos rgos e alteraes em suas funes. Quando a localizao heptica, ocorre dor abdominal ( direita, junto s costelas), massas palpveis, ictercia e hepatomegalia. Em casos de localizao pulmonar, a tosse, dor torcica, hemoptise e dispneia so os sintomas mais frequentes. Os casos de localizao ssea produzem destruio das trabculas, necrose e fratura espontnea. O prognstico se agrava quando a localizao do cisto ocorre em rgos vitais como sistema nervoso, corao e rins. O rompimento do cisto hidtico facilita a liberao de material antignico, causando uma reao alrgica sistmica, severa e rpida, que pode terminar em choque anafiltico. Na Hidatidose Policstica Humana HPH, os pacientes tambm permanecem assintomticos at que os cistos atinjam um volume que produza compresso de estruturas dos rgos afetados ou circunvizinhos, ou se tornem palpveis. O fgado tambm o rgo mais atingido, com frequente queixa de dor no hipocndrio direito e ictercia. Os casos mais graves apresentam sinais de insuficincia heptica e, alm da ictercia, apresentam hipoalbuminemia grave, levando ascite e ao edema de membros inferiores. Os policistos pulmonares provocam sintomas ao comprimirem estruturas anatmicas ou fistulizarem para a rvore traqueobrnquica. As queixas mais comuns so dispneia, dor torcica, tosse e hemoptise. Os pacientes tambm podem informar a presena de massas abdominais. Na localizao mesentrica, pode ocorrer massa palpvel em qualquer quadrante abdominal, mvel ou fixa.
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Mtodos Morfolgicos e Morfomtricos para o Diagnstico da Hidatidose Humana

A palavra morfometria formada pelo radical grego morph, que significa forma, associado ao radical grego metriks, ou do latim metricu, que significa ato de medir ou processo de estabelecer dimenses. Embora o termo tenha aplicao ampla na cincia, o sentido em biomedicina, em ltima anlise, seria a atividade de medir estruturas anatmicas. Esse mtodo tem por funo tornar mais objetivas e precisas a coleta, a apresentao e a anlise dos resultados obtidos em pesquisas e na rotina de laboratrio, permitindo, ainda, relacionar as diferentes estruturas anatmicas com suas funes. No protoesclex h dois tipos de ganchos: os da fileira superior, que so maiores (grandes ganchos) e possuem uma guarda arredondada e robusta; e os da fileira inferior, que so menores (pequenos ganchos) e com guarda achatada (Figura 11).
Figura 11 - Caractersticas do pequeno e do grande ganchos rostelares de Echinococcus granulosus (A) e Echinococcus vogeli (B), analisados por Contraste Interferencial de Normaski DIC em microscopia de campo claro, sendo 1 cm = 0,005 mm
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A identificao do Echinococcus sp. realizada por meio das medidas dos ganchos rostelares (morfometria). Estes, normalmente encontrados livres no interior dos cistos, so formados por um cabo, uma guarda e uma lmina, possuindo uma polpa central amorfa. Os ganchos do E. granulosus tm comprimento de 19mm a 23mm; os de E. oligarthrus, de 26mm a 33mm; e os de E. vogeli, de 33mm a 41m. Outro aspecto de importncia refere-se forma do gancho: os de E. vogeli tm a lmina curva e mais longa que o cabo (dois teros do total). Procedimento para anlise morfolgica e morfomtrica zzAspirar, durante o procedimento cirrgico, o lquido encontrado no interior das vesculas, o que deve ser feito com o auxlio de uma seringa. zzEstocar o material em frasco limpo, na proporo de uma parte do lquido para duas partes de lcool a 70% (Anexo I, 1.1), para preservao em temperatura ambiente. zzColocar 1ml do material estocado em microtubos. zzCentrifugar a 1.000rpm (rotaes por minuto) por cinco minutos. zzDesprezar o sobrenadante. zzAdicionar ao sedimento 1ml de lcool etlico absoluto (etanol a 100%). zzCentrifugar a 1.000rpm por cinco minutos. zzDesprezar o sobrenadante. zzAdicionar ao sedimento 1ml de salicilato de metila. zzCentrifugar a 1.000rpm por cinco minutos. zzDesprezar o sobrenadante. zzAdicionar ao sedimento 500ml de Blsamo do Canad e 500ml de salicilato de metila. Misturar at o concentrado ficar homogneo (cerca de trs minutos). zzUtilizar lminas de tamanho 2,5cm X 7,5cm, emergidas em lcool comercial (92,8%), para limpeza e, posteriormente, secar com gaze. z zRotular, em uma das extremidades da lmina, as referncias do material correspondente.
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Colocar o material processado na lmina sobre uma superfcie nivelada, com ajuda de uma pipeta, a fim de procurar, nesse sedimento, os protoesclices preservados (sem colorao). zzPressionar levemente a lamnula sobre o material, a fim de que os ganchos possam ser espalhados e no danificados. zzObservao: ter ateno ao pressionar a lamnula sobre o material para que ela no se quebre e para que no haja derramamento do material a ser analisado. zzFazer a anlise morfomtrica com o auxlio de uma ocular graduada; essa ocular possui uma rgua e, quando colocada no microscpio, permite a realizao de algumas medidas do material. zzBasear a morfometria nos seguintes caracteres: rea, permetro, largura e comprimento total dos grandes e pequenos ganchos (Figura 12). zzCalibrar previamente o equipamento para a anlise morfomtrica; essa calibrao feita por uma lmina, que, na compra do microscpio, precisa ser adquirida. A primeira calibrao realizada pelo tcnico que instala o microscpio. Ele ensina o procedimento ao responsvel pelo equipamento no laboratrio para sua realizao, quando necessrio. zzManter apenas um nico examinador como o responsvel por processar o material, at o trmino da anlise. zzAvaliar os dados por meio da anlise estatstica descritiva, na qual se calculam a mdia e o desvio padro dos dados obtidos. Esses clculos geralmente so feitos por programas de estatstica para computadores existentes no mercado. Observao: as lminas de preparao permanente tambm podem ser analisadas em um microscpio de campo claro com uma cmara digital acoplada. As imagens obtidas podero ser processadas por um programa de anlise digital de imagens. Trata-se de um programa de computador que, quando calibrado, permite a realizao de medidas do material estudado. Essas medidas so feitas por intermdio de um miniprograma (macro) previamente construdo, informando ao computador quais as medidas relevantes que se quer estudar.
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Figura 12 - Esquema dos caracteres analisados na morfometria dos ganchos rostelares de Echinococcus granulosus
Fonte: (adaptado de ALMEIDA et al., 2007)
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Mtodos Imunolgicos para Diagnstico da Hidatidose Humana

A necessidade do diagnstico laboratorial para auxiliar na confirmao ou na formulao de um diagnstico presuntivo da doena fez com que os mtodos no morfolgicos fossem precocemente desenvolvidos. A Hidatidose Humana uma das poucas infeces parasitrias em que o diagnstico laboratorial bsico principalmente o imunolgico. O imunodiagnstico, baseado na deteco de anticorpos circulantes contra os antgenos do cisto hidtico, de grande importncia no diagnstico da Hidatidose e complementa o diagnstico clnico em pacientes que apresentam manifestaes ou imagens desse cisto. Quando, clinicamente, o paciente encaminhado para cirurgia, o diagnstico morfolgico realizado pelas medidas dos ganchos rostelares, por meio da coleta do lquido hidtico (Figura 12). Existem mtodos sorolgicos para o diagnstico complementar da Hidatidose, quais sejam: ensaio imunoenzimtico ELISA, Imunoblotting e reao em cadeia de polimerase PCR. Nos ltimos anos, tm-se realizado grandes esforos na avaliao e padronizao dos testes imunodiagnsticos e dos antgenos neles empregados. Recentemente, est sendo utilizado o mtodo de Imunoblotting para o imunodiagnstico da hidatidose humana. O Imunoblotting permite observar a reao dos anticorpos presentes no soro de um paciente frente a protenas antignicas do lquido hidtico. As protenas so separadas por eletroforese e depois transferidas a uma membrana de nitrocelulose. A membrana , ento, incubada com o soro teste e, logo depois, com anticorpo de cabra anti-IgG humana, marcado com uma enzima. Se o soro possuir anticorpos, ao se agregar um substrato cromgeno adequado ocorrer a formao de produto insolvel, que precipita, formando bandas nas zonas de protenas antignicas.
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Procedimento para teste imunolgico

Etapa I Separao das protenas do antgeno por eletroforese em gel de poliacrilamida, contendo Dodecil Sulfato de Sdio (SDS-Page). A separao das protenas, componentes antignicos, por SDS-Page realizada empregando-se um sistema descontnuo em gel de separao e em gel de empacotamento. Dever ser usado um sistema vertical apropriado para realizar a separao das protenas. Antgeno O antgeno total do lquido hidtico de ovino (ATLH-O), liofilizado, ressuspendido em tampo Tris/HCl 0,05M; pH 8,0 (Anexo I, 2.1) em concentrao de 50mg/ml e centrifugado a 12.000rpm, por uma hora, a 4C. O sobrenadante conservado abaixo de menos -20C at o momento do uso. Tratamento do antgeno O ATLH-O diludo, volume a volume, com uma soluo de tratamento da amostra (Anexo I, 2.2). O antgeno incubado a 100C, por cinco minutos, em banho-maria. Logo aps, adicionado um corante marcador de corrida (Anexo I, 2.3) na proporo de 1ml por cada 30ml de amostra. Preparao do gel de separao ou de corrida
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Retirar da geladeira os reagentes para a preparao do gel (soluo de poliacrilamida, tampo do gel de empacotamento, tampo do gel de separao, soluo de persulfato de amnio a 10%, soluo de dodecil sulfato de sdio a 10% e N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine Temed), a fim de que eles atinjam a temperatura ambiente (Anexo I, 2.4 -2.8).
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Usar duas placas de vidro de 73mm de altura por 102mm de largura e 1mm de espessura, e dois espaadores de plstico de 0,75mm de espessura. zzObservao: os volumes que foram descritos no anexo referem-se ao tamanho das placas mencionado acima. zzLimpar as placas de vidro com lcool e sec-las. zzMontar as placas, colocando os espaadores entre elas. zzFazer o teste com gua destilada para confirmar se o sistema no est vazando. zzPreparar o gel na concentrao de 15%, segundo o Anexo I 2.10., sempre deixando o Temed e o persulfato de amnia por ltimo. zzAplicar, com o auxlio de uma seringa, 3,5ml da soluo do gel no espao formado entre as placas e, imediatamente depois, completar com gua destilada para formar uma superfcie linear. zzDeixar polimerizar, temperatura ambiente, por uma hora.
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Aplicao do gel de empacotamento Eliminar a gua destilada da parte superior do gel, secando bem com papel de filtro. zzMarcar a altura do gel inferior com caneta de marcador permanente. zzPreparar o gel de empacotamento segundo o Anexo I, 2.10. zzColocar o gel de empacotamento sobre o gel de separao e, imediatamente depois, inserir o pente, deixando um espao entre sua base inferior e o gel de separao. zzMarcar os locais de aplicao com caneta de marcador permanente. zzDeixar polimerizar temperatura ambiente, por 40 minutos.
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Preparao da eletroforese Retirar o pente e lavar as cavidades com tampo Tris-Glicina-SDS (tampo de corrida) (Anexo I, 2.9). zzAplicar, na cavidade do gel de empacotamento, 200ml de suspenso do antgeno.
zz Secretaria de Vigilncia em Sade/MS
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Observao: devido presena de protenas do hospedeiro, os lotes de antgeno devero ser titulados, a fim de que se possa obter a diluio ideal. zzColocar, aps a aplicao do antgeno, o padro de peso molecular pr-corado. zzAdicionar aproximadamente 200ml de tampo de corrida no recipiente superior e 300ml do mesmo tampo no recipiente inferior da cuba (sempre cobrindo o fio de condutividade) para iniciar a corrida eletrofortica. Deixar agitando (magneto no interior) e observar se no est vazando. zzObservao: o tampo de corrida do recipiente superior no pode ser reutilizado. J o tampo que colocado no recipiente inferior da cuba pode ser reaproveitado por, no mximo, quatro vezes.
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Corrida eletrofortica Conectar os terminais eltricos da cuba na fonte de eletroforese, que efetuada a 10mA por gel e 200V. zzPrestar ateno no corante marcador de corrida. zzObservao: quando o complexo SDS-protenas entra uniformemente no gel de separao, ou de corrida, a corrente aumentada para 20mA por gel. zzDesconectar o sistema quando o corante marcador de corrida alcanar a base do gel de separao.
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Etapa II Transferncia de protenas do gel de poliacrilamida para a membrana de nitrocelulose. As protenas so transferidas eletroforeticamente do gel para a membrana de nitrocelulose com poros de 0,22mm, em um recipiente de eletroforese. Preparao da transferncia
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Em um recipiente contendo tampo de transferncia (Anexo I, 3.1), o gel colocado sobre uma membrana de nitrocelulose, que, juntos,so acomodados entre duas folhas de papel de filtro embebidas no mesmo tampo.
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O conjunto do gel membrana de nitrocelulose e papel de filtro colocado entre duas esponjas de 3mm de espessura e posto em uma pea plstica com perfuraes em ambos os lados. zzEm seguida, esse conjunto se encaixa em uma cmara de transferncia, com o gel colocado para o lado do catodo e a membrana de nitrocelulose para o lado do anodo. Observao: mergulhar as esponjas, os papis de filtro e o papel de nitrocelulose em tampo de transferncia em uma vasilha pelo menos 20 minutos antes de ser feita a transferncia.
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Eletrotransferncia A eletrotransferncia efetuada a uma corrente de 133V e 397mA por hora, sendo que a cuba de gelo dever ser trocada aps 30 minutos do incio da transferncia, a fim de que a temperatura no ultrapasse 20C. zzFinalizada a eletrotransferncia, retirar a membrana de nitrocelulose e lavar com gua destilada, por cinco minutos, sob agitao. zzColocar a membrana de nitrocelulose em uma placa de Petri com a soluo de Ponceau (Anexo I, 3.4). zzDepois de visualizar as bandas coradas pelo Ponceau, lavar a membrana de nitrocelulose com gua destilada para descolorir, retirar o excesso de gua, coloc-la sobre um papel de filtro na prpria placa de Petri e deixar secar livre de poeira.
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Etapa III Reao Imunoenzimtica zzUtilizar placas de plstico divididas em compartimentos. zzMolhar a membrana com gua destilada e, com a ajuda de um bisturi e de uma lmina, cortar tiras de aproximadamente 3mm de espessura, numerando-as na parte inferior.
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Colocar as tiras de nitrocelulose contendo o antgeno hidtico nos compartimentos das placas. zzLavar as tiras com TBS+Tween (TBS-T) (Anexo I, 4.1), a cada cinco minutos, totalizando trs lavagens. zzIncubar as tiras com TBS-T contendo 5% de leite desnatado Molico (TBSTL) (Anexo I, 4.2), por 30 minutos, temperatura ambiente, sob agitao. zzAspirar o contedo de cada canaleta. zzLavar as tiras com TBS-T, a cada cinco minutos, totalizando trs lavagens. zzAspirar o contedo de cada canaleta e colocar os soros controle positivo e negativo e o soro teste na diluio de 1:100 em TBS-TL e incubar por uma hora. zzObservao: todos os soros que sero utilizados como controles positivos e negativos foram selecionados entre os arquivados no perodo de 19901996, no Laboratrio de Helmintos Parasitos de Vertebrados IOC/Fiocruz, e hoje esto sob os cuidados da Soroteca do Servio de Referncia Nacional em Hidatidose. Os soros controle negativos so de indivduos de rea no endmica para hidatidose e os soros controle positivos so de pacientes com exames de imagens, que j realizaram cirurgia para retirada do cisto e possuem exames parasitolgicos positivos. zzAspirar o contedo de cada canaleta. zzLavar as tiras com TBS-T, a cada cinco minutos, totalizando trs lavagens. zzAspirar o contedo de cada canaleta. zzAdicionar a soluo de anti-IgG humano marcado com fosfatase alcalina na diluio de 1:3.000 em TBS-TL e incubar por uma hora. zzLavar as tiras com TBS-T, a cada cinco minutos, totalizando trs lavagens. zzPassar as tiras de nitrocelulose para uma placa livre de detergente.
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Lavar uma vez com gua destilada, por cinco minutos. zzRevelar a reao adicionando uma soluo contendo NBT+BCIP diludo 1:100 no tampo substrato (Anexo I, 4.5). zzEsperar de cinco a oito minutos, verificando se a colorao do controle positivo, e interromper a reao para aspirar o lquido.
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Lavar as fitas com gua destilada por mais cinco minutos. zzDeixar secar as tiras, temperatura ambiente, em local escuro. zzObservao: as alquotas de soros controle, bem como de antgeno hidtico, sero fornecidas pelo Servio de Referncia Nacional em Hidatidose, Instituto Oswaldo Cruz Fiocruz, Rio de Janeiro-RJ.
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Leitura e interpretao dos resultados

Consiste em visualizar, nas tiras de nitrocelulose, a presena ou ausncia de bandas precipitadas. Em caso de presena das bandas, anotar suas respectivas massas relativas Mr expressas em unidades de kilodaltons kDa.
Divulgao dos resultados

O critrio de positividade para o diagnstico da hidatidose humana est condicionado ao reconhecimento de um ou mais peptdeos antignicos de Mr entre 21 e 31kDa por anticorpos presentes no soro do paciente.
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Obteno, Conservao e Transporte de Soro Sanguneo

Soro sanguneo o material solicitado para o exame imunolgico da hidatidose humana, o qual se obtm do sangue venoso.
Condies para a coleta

O que necessrio para a coleta de sangue? zzsala bem iluminada e ventilada; zzpia; zzcadeira reta com braadeira regulvel ou maca; zzgarrote; zzalgodo hidrfilo; zzlcool iodado a 1% ou lcool etlico a 70%; zzagulha e seringa descartveis ou sistema a vcuo: suporte, tubo e agulha descartveis; zzpina; zzetiquetas para identificao de amostras; zzlpis e/ou canetas de marcador permanente; zzrecipiente de boca larga, com parede rgida e tampa, contendo hipoclorito de sdio a 2%; zzavental e mscara; zzluvas descartveis; zztubos de 5ml com tampa rosquevel e com borracha de vedao; e zzestantes para tubos.
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O que deve ser feito antes da coleta da amostra de sangue? Verifique se a ficha de notificao foi preenchida corretamente (Anexo II); identifique os tubos para colocao da amostra; e escreva na etiqueta os dados do paciente, tais como nome, nmero do registro, data de nascimento, sexo, data da coleta, nmero ou cdigo de registro da amostra e o nome da instituio solicitante.
Coleta com seringa e agulha descartveis

Como fazer coleta de sangue com seringa e agulha descartveis? Coloque a agulha na seringa sem retirar a capa protetora. No toque na parte inferior da agulha. zzMovimente o mbolo e pressione-o para retirar o ar. zzAjuste o garrote e escolha a veia. zzFaa a antissepsia do local da coleta com algodo umedecido em lcool a 70% ou lcool iodado a 1%. No toque mais no local desinfetado. zzRetire a capa da agulha e faa a puno. zzSolte o garrote assim que o sangue comear a fluir na seringa. zzColete aproximadamente 10ml de sangue. Em crianas, colete de 2ml a 5ml. zzSepare a agulha da seringa com o auxlio de uma pina, descarte a agulha em recipiente de boca larga, paredes rgidas e tampa, contendo hipoclorito de sdio a 2%. zzOriente o paciente a pressionar com algodo a parte puncionada, mantendo o brao estendido, sem dobr-lo. zzTransfira o sangue para um tubo de ensaio sem anticoagulante, escorra delicadamente o sangue pela parede do tubo. Esse procedimento evita a hemlise da amostra; descarte a seringa no mesmo recipiente de descarte da agulha.
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Coleta com sistema a vcuo

Como proceder quando a coleta feita com sistema a vcuo? zzRosqueie a agulha no adaptador (canho). No remova a capa protetora de plstico da agulha. zzAjuste o garrote e escolha a veia. zzFaa a antissepsia do local da coleta com algodo umedecido em lcool a 70% ou lcool iodado a 1%. No toque mais no local desinfetado. zzRemova o protetor plstico da agulha e faa a puno. zzIntroduza o tubo no suporte, pressionando-o at o limite. zzSolte o garrote assim que o sangue comear a fluir no tubo. zzSepare a agulha do suporte com o auxlio de uma pina. Descarte a agulha em recipiente de boca larga, paredes rgidas e tampa, contendo hipoclorito de sdio a 2%. zzOriente o paciente a pressionar com algodo a parte puncionada, mantendo o brao estendido, sem dobr-lo.
Material para preparar e armazenar o soro

Qual o material necessrio para preparar e armazenar o soro? zztubos de 5ml com tampa rosquevel e com borracha de vedao; zzpipeta Pasteur ou pipeta automtica de 0,5ml a 1,0ml; zzetiquetas; zzcaneta de marcador permanente; zzestante para tubos; zzcentrfuga; refrigerador (4C a 8C); zzcongelador (-20C); zzavental e mscara; zzluvas descartveis; e zzrecipiente de boca larga, com parede rgida e tampa, contendo hipoclorito de sdio a 2%.
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Separao e armazenamento de soro

Como proceder com a amostra de sangue coletada? Deixe a amostra em temperatura ambiente at a retrao do cogulo. A amostra pode ficar em temperatura ambiente por trs horas, no mximo. Aps este perodo o sangue pode hemolisar. Como conservar a amostra antes da separao do soro? Aps a retrao do cogulo, o material pode permanecer no refrigerador temperatura de 4C a 8C, por 12 horas no mximo, a fim de evitar hemlise. Como separar e armazenar o soro? Aps a retrao do cogulo, pode-se separar o soro de duas maneiras: espontnea ou mecnica. 1. Separao espontnea zzAspire e transfira cuidadosamente o soro para um tubo limpo, previamente identificado; use uma pipeta Pasteur ou automtica. zzCuidado: no toque o cogulo para que as clulas no se misturem com o soro. zzGuarde no refrigerador por 72 horas, no mximo, ou em congelador a -20C, at o envio ao laboratrio. 2. Separao mecnica zzCentrifugue o sangue por 10 minutos, a 1.500rpm. zzRetire o tubo, aps a completa parada da centrfuga. zzAspire, transfira cuidadosamente e guarde o soro at o envio ao laboratrio, conforme descrito na separao espontnea.
Acondicionamento das amostras para transporte

Qual o material necessrio para o transporte de amostras? zzsacos plsticos; zzembalagem de envio de material biolgico;
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gelo reciclvel ou comum; zzfita adesiva; e zzetiqueta, envelope, caneta de marcador permanente e/ou lpis.
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Quais os cuidados com o transporte de material biolgico? zzComunique o envio das amostras ao destinatrio, com a data e o horrio de chegada previstos. zzAcondicione as amostras na embalagem de envio de material biolgico (Embalagem 650 Substncias Biolgicas Categoria B). zzA embalagem consistir de trs componentes: recipiente primrio, embalagem secundria e embalagem externa rgida; os recipientes primrios devem ser acondicionados em embalagens secundrias, de tal modo que, sob as condies normais de transporte, no possam ser quebrados, perfurados ou vazar o seu contedo para a embalagem secundria; embalagens secundrias devem ser acomodadas na embalagem externa, com material acolchoado apropriado; qualquer vazamento do contedo no poder comprometer a integridade do material acolchoado ou a embalagem externa. zzAs embalagens devem ser preparadas da seguinte forma: a) O recipiente primrio deve ser prova de vazamento e no pode conter mais do que um litro. b) A embalagem secundria deve ser prova de vazamento. c) Se vrios recipientes primrios frgeis forem colocados em uma nica embalagem secundria, eles devem ser acondicionados individualmente ou separados, de forma a evitar que haja contato entre eles. d) O material absorvente deve ser colocado entre o recipiente primrio e a embalagem secundria; o material absorvente deve ser em quantidade suficiente para absorver o contedo dos recipientes primrios, de forma que, havendo qualquer vazamento de substncia lquida, esta no ir comprometer a integridade do material absorvente ou da embalagem externa.
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e) O recipiente primrio, ou a embalagem secundria, deve ser capaz de absorver, sem vazamento, uma presso interna de 95kPa, em uma variao de temperatura de -40C a +55C. zzGelo ou gelo seco, quando usados, devem ser colocados do lado de fora da embalagem secundria, na embalagem externa. Suportes interiores devem ser providenciados para segurar a embalagem secundria na posio original, aps a dissipao do gelo ou do gelo seco. No caso do uso de gelo comum, a embalagem externa deve ser prova de vazamento. No caso do uso de gelo seco, a embalagem deve ser desenhada e construda de forma a permitir a liberao do gs dixido de carbono, prevenindo a criao de uma presso interna que possa romper a embalagem. O recipiente primrio e a embalagem secundria devem manter sua integridade temperatura do refrigerante usado, assim como s temperaturas e presso resultantes, no caso da perda total ou em parte do material refrigerante. zzCole, na parte externa, em local especfico, uma etiqueta com o nome da instituio destinatria, endereo, nome do responsvel pelo recebimento, nome da instituio remetente, endereo, telefone, fax, horrio de envio e validade da embalagem. imprescindvel o envio da Declarao de Carga Perigosa (Anexo III).
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Biossegurana
Biossegurana um conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger a sade e a segurana das pessoas, durante seu trabalho, nos laboratrios onde so manipulados materiais biolgicos. Sendo assim, para cuidar de sua segurana, da segurana de seus colegas de trabalho e do meio ambiente, obedea aos procedimentos bsicos de biossegurana em laboratrios. Ateno! Todo cuidado pouco na manipulao de materiais biolgicos, tais como soro, sangue ou secrees, fluidos orgnicos, tecidos etc. Redobre suas precaues, pois esses materiais so potencialmente infectantes e muitas vezes esto contaminados com agentes etiolgicos diferentes daqueles que esto sendo pesquisados, ou ainda desconhecidos. Nunca pipete com a boca e jamais cheire placas de cultura. zzA inativao do soro em banho-maria, a 56C, por 30 minutos, no elimina o potencial infectante da amostra. zzUse sempre equipamento de proteo individual EPI: avental ou jaleco longo, de mangas compridas e punho retrtil, luvas descartveis, culos de proteo, pipetadores manuais ou automticos e, quando for o caso, protetor facial. zzEvite a formao e disperso de aerossis. Aerossis so micropartculas slidas e lquidas com dimenses aproximadas entre 0,1 e 50 micra que podem, caso contenham micro-organismos, permanecer em suspenso e plenamente viveis por vrias horas. A pipetagem, flambagem de alas, abertura de frascos e ampolas, manipulao de seringas, agulhas, lancetas, lminas e outros assemelhados podem gerar e propagar aerossis.
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Jamais reencape agulhas. Esse procedimento uma das principais causas da contaminao de profissionais de sade por micro-organismos existentes no sangue e em outros fluidos orgnicos, como o vrus da hepatite B e o HIV. Aps a coleta, deve-se descartar esse material diretamente em recipiente de paredes rgidas com tampa, contendo hipoclorito de sdio a 2%, em volume superior metade do recipiente. zzReduza ao mximo o manuseio de resduos, em especial os perfurocortantes. Descarte o rejeito perfurocortante diretamente em recipiente de paredes rgidas, contendo hipoclorito de sdio a 2%. Deixe em imerso total por, no mnimo, 24 horas e, em seguida, faa a autoclavao desse material. zzIdentifique e sinalize os principais riscos presentes em seu laboratrio. Produtos e reas que oferecem risco devem ser marcados com os devidos smbolos internacionais em etiquetas autoadesivas padro. zzVerifique sempre as condies de funcionamento dos equipamentos de proteo coletiva EPC: extintores de incndio, chuveiros de segurana, lava-olhos, pia para lavagem de mos, caixa de areia e cabine de segurana biolgica (classe II). zzPara descontaminao pessoal, de equipamentos e de superfcies fixas, utilize desinfetantes eficientes e adequados. Use sempre produtos registrados no Ministrio da Sade. No existe um desinfetante nico que atenda a todas as necessidades. fundamental conhecer os diversos agentes qumicos e sua compatibilidade de uso para evitar custos excessivos e utilizao inadequada. zzTenha muito cuidado com a manipulao e a estocagem de substncias qumicas. Leia com ateno as informaes contidas nos rtulos.
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Seja sempre consciente da importncia de suas aes na preservao da biossegurana em seu local de trabalho. zzLave as mos antes e depois de qualquer procedimento laboratorial. zzNunca pipete com a boca. zzDentro do laboratrio, no fume, no coma, no beba, no prepare refeies. zzQuando estiver usando luvas, no manuseie objetos de uso comum, como telefones, maanetas de portas e janelas, jornais, revistas etc. zzNo guarde alimentos ou bebidas em geladeiras e congeladores para armazenagem de material biolgico. zzVacine-se rotineiramente contra a hepatite B. Seguindo essas recomendaes, voc estar contribuindo para a diminuio de acidentes. Se acontecer um acidente de trabalho em seu laboratrio, notifique imediatamente a sua chefia.
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Referncias
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Anexo A
Solues para o diagnstico
1. Preparao de solues para anlise morfolgica 1.1. Soluo de lcool 70% lcool absoluto ....................................................................70ml H2O destilada .......................................................................30ml 2. Preparao de tampes e solues para anlise imunolgica 2.1 Tampo Tris/HCl 0,05M, pH 8,0 Tris 0,05M .......................................................................... 6,056g H2O destilada ............100ml qsp (quantidade suficiente para) Ajustar o pH com HCl concentrado. 2.2 Soluo de tratamento da amostra Tampo do gel de empacotamento.................................1,25ml SDS 4% ...........................................................2,0ml de SDS 10% Glicerol 20% ........................................................................1,0ml 2-Mercapto Etanol 10% .....................................................0,5ml H2O destilada ......................................................................5,0ml
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2.3 Soluo do corante marcador de corrida Azul de bromofenol.............................................................0,05g Glicerol.................................................................................... 8ml Tampo Tris (0,5M pH 8,0) .................................................. 1ml H2O destilada ......................................................................... 1ml Misturar o corante com a gua no vrtex (equipamento utilizado para homogeneizar solues). Adicionar o tampo Tris ainda no vrtex. Adicionar o glicerol e deixar dissolvendo sob agitao branda por aproximadamente trs horas. Fazer alquotas e estocar no freezer. 2.4 Soluo de poliacrilamida (30%T Acrilamida/2,7%C BIS Acrilamida) Acrilamida ............................................................................14,6g N-N-bis acrilamida ...............................................................0,4g H2O destilada ................................................................50ml qsp Pesar em tubo Falcon, dissolver em banho-maria, esperar esfriar e completar o volume. Embrulhar o tubo Falcon em papel alumnio e estocar a 4oC. Sempre manter este reagente no escuro. 2.5 Tampo do gel de empacotamento 0,5M, pH 6,8 Tris (0,05M)........................................................................... 6,0g H2O destilada ............................................................. 100ml qsp Ajustar o pH com HCl concentrado para 6,8. 2.6 Tampo do gel de separao ou de corrida 1,5M, pH 8,8 Tris (1,5M) ......................................................................... 18,15g H2O destilada ..............................................................100ml qsp Ajustar o pH com HCl concentrado para 8,8.
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2.7 Soluo de persulfato de amnio APS a 10% Persulfato de amnio................................................................1g H2O destilada .......................................................................10ml Fazer alquotas e estocar no freezer. 2.8 Soluo de dodecil sulfato de sdio SDS a 10% SDS ........................................................................................... 1g H2O destilada .......................................................................10ml Pesar em tubo Falcon, dissolver em banho-maria e estocar a 4oC. 2.9 Tampo de corrida (pH 8,3) Tris 0,025M.............................................................................3,0g Glicina 0,192M.....................................................................14,4g SDS 10% ................................................................................10ml H2O destilada .......................................................... 1.000ml qsp Ajustar pH com HCl para 8,3. 2.10 Frmula de concentrao dos gis de empacotamento e de separao a 15%
Frmula para Gel do SDS-PAGE
Gel separao 15% Acrilamida 30% T/2,7%C Tampo gel inferior ou de separao Tampo gel superior ou de empacotamento SDS 10% gua deionizada Temed Persulfato de Amnio 6,0ml 4,5ml ------120ml 1,5ml 4ml 60ml Gel empacotamento 4% 1,33ml ------2,5ml 100ml 6,1ml 10ml 100ml
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2.11 Corante para o gel (Coomasie blue) soluo estoque Coomassie blue R250 (1%) ......................................................1g H2O destilada ..............................................................100ml qsp Dissolver e filtrar em papel de filtro Whaterman 1. 2.12 Corante de uso para o gel (Coomasie blue) Soluo estoque.................................................................12,5ml Metanol .................................................................................50ml cido actico glacial ............................................................10ml H2O destilada ..............................................................100ml qsp Mergulhar o gel depois da corrida nessa soluo por 24 horas. A soluo pode ser reaproveitada. 2.13 Descorante de uso para o gel (Coomasie blue) Soluo A: Metanol (50%)......................................................................50ml cido actico glacial (10%) ................................................10ml H2O destilada .....................................................................100ml Adicionar aos poucos, por 30 minutos. Soluo B: Metanol (5%).......................................................................... 5ml cido actico glacial (7%) .................................................... 7ml H2O destilada .....................................................................100ml Adicionar aos poucos, realizando trs trocas a cada 15 minutos. Depois, colocar em cuba com gua destilada tampada. Esta soluo no pode ser reaproveitada.
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2.14 Soluo de secagem do gel Metanol (50%)......................................................................50ml Glicerol (0,5%) ...................................................................... 50l H2O destilada ..............................................................100ml qsp Deixar as folhas (duas) de papel celofane e o gel por 20 minutos sob agitao constante na soluo de secagem. Depois colocar uma folha, o gel e a outra folha sob placa de vidro. Tirar as bolhas e deixar secar. 3. Preparao de tampes e solues para a transferncia 3.1 Tampo de transferncia Tris 0,025M.............................................................................. 3g Glicina 0,192M.................................................................... 14,4g Metanol 10%.......................................................................200ml H2O destilada ...........................................................1.000ml qsp 3.2 Tampo Fosfato Salino PBS A-Monobsico NaH2PO4...................................0,2M .............................. 27,598g H2O destilada ...........................................................1.000ml qsp Estocar no freezer. B-Dibsico Na2HPO4 ...................................0,2M ............................. 53,614g H2O destilada ...........................................................1.000ml qsp Estocar no freezer. Misturar 14ml da soluo A + 36ml da soluo B + 8,75g de NaCl e completar o volume para 1.000ml com H2O destilada.
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3.3 TBS 8X Tris 0,02M .............................................................................4,84g NaCl 0,5M ......................................................................... 58,48g H2O destilada ..............................................................250ml qsp Conservar em freezer. O pH deve ser medido e ajustado para 7,5 (com HCl) na hora do preparo da soluo diluda. 3.4 Preparao do Ponceau Ponceau (50,1%) ....................................................................0,1g cido actico (5%) ................................................................ 5ml H2O destilada .....................................................................100ml 4. Preparao de solues para reao imunoenzimtica 4.1 TBS-T TBS 8X ...............................................................................13,8ml H2O destilada ..............................................................110ml qsp Tween 20 .............................................................................. 220l O pH da soluo deve ser ajustado antes do acrscimo do Tween 20. 4.2 TBS-TL TBS-T pH 7,5 .......................................................................22ml Leite molico ..........................................................................1,10g 4.3 Conjugado anti-IgG humano diludo a 1:3.000 em TBS-TL 4.4 Soros controle negativo e positivo e soro teste diludos a 1:100 em TBS-TL
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4.5 Soluo reveladora 4.5.1. Cloreto de Magnsio 0,1M Cloreto de Magnsio ........................................................ 2,013g H2O destilada ..............................................................110ml qsp Azida sdica ....................................................................... 0,01% 4.5.2 Tampo substrato Tris ..............................................................................................3g Cloreto de Magnsio 0,1M ..............................................12,5ml H2O destilada ..............................................................250ml qsp 4.5.3 NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride) BCIP (5-Bromo-4Chloro-3-Indolyphosphate p-Toluidine Salt) Soluo de NBT/BCIP de fonte comercial. O reagente final deve ser preparado de acordo com as recomendaes do fabricante. Observao: tudo tem que ser de vidro e livre de detergente. Armazenar o NBT/BCIP protegido da luz e em geladeira. 4.5.4 Revelao Tampo substrato .................................................................. 8ml NBT ........................................................................................ 80l BCIP ....................................................................................... 80l
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Anexo B
Ficha de Ficha de notificao para o imunodiagnstico da hidatidose notificao para o imunodiagnstico da hidatidose
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Anexo C
Formulrio para envio de material biolgico por transporte areo
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Anexo D
Normas da organizao e funcionamento do Sistema Nacional de Laboratrios de Sade Pblica Sislab
A Portaria no 1.172, de 15 de junho de 2004, do Ministrio da Sade MS, que substitui a Portaria no 1.399/99, regulamenta a NOB SUS 1/96 no que se refere s competncias da Unio, dos estados, municpios e do Distrito Federal na rea de Vigilncia em Sade, define a sistemtica de financiamento e d outras providncias. A Portaria MS no 2.031, de 23 de setembro de 2004, dispe sobre a organizao do Sistema Nacional de Laboratrios de Sade Pblica Sislab. O Sislab um conjunto de redes nacionais de laboratrios, organizado em sub-redes, por agravos ou programas, de forma hierarquizada por grau de complexidade das atividades relacionadas Vigilncia em Sade, compreendendo a Vigilncia Epidemiolgica, Vigilncia Ambiental em Sade, Vigilncia Sanitria e Assistncia Mdica. , portanto, constitudo pelas seguintes redes nacionais de laboratrios: zzRede Nacional de Laboratrios de Vigilncia Epidemiolgica; zzRede Nacional de Laboratrios de Vigilncia Ambiental em Sade; zzRede Nacional de Laboratrios de Vigilncia Sanitria; e zzRede Nacional de Laboratrios de Assistncia Mdica de Alta Complexidade. As sub-redes so estruturadas, observadas suas especificidades, de acordo com a seguinte classificao de unidades laboratoriais: zzCentros Colaboradores CC; zzLaboratrio de Referncia Nacional LRN; zzLaboratrio de Referncia Regional LRR; zzLaboratrio de Referncia Estadual LRE;
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Laboratrio de Referncia Municipal LRM; zzLaboratrios Locais LL; e zzLaboratrios de Fronteira LF. Em um pas continental como o Brasil, essa estruturao fundamental para que as aes e os servios laboratoriais executados pelos laboratrios de sade pblica sejam abrangentes, organizados, racionais e em consonncia com os princpios do SUS. As competncias dessas unidades laboratoriais esto estabelecidas na Portaria no 2.031/2004, anteriormente citada. Os laboratrios de referncia regional so unidades laboratoriais capacitadas a desenvolver atividades mais complexas, organizadas por agravos ou programas, que prestam apoio tcnico-operacional quelas unidades definidas para sua rea geogrfica de abrangncia. Essas duas unidades laboratoriais so oficialmente definidas pelo MS. Os laboratrios de referncia estadual so os Laboratrios Centrais de Sade Pblica Lacen, vinculados s secretarias estaduais de sade, com rea geogrfica de abrangncia estadual. Os laboratrios de referncia municipal so unidades laboratoriais vinculadas s secretarias municipais de sade, com rea geogrfica de abrangncia estadual. Os laboratrios locais so unidades laboratoriais que integram a rede estadual ou municipal de laboratrios de sade pblica. Os laboratrios de fronteira so unidades laboratoriais localizadas em regies limtrofes do Pas. No Captulo III da Portaria no 2.031/2004 definida a gesto do sistema. As Redes Nacionais de Laboratrios de Vigilncia Epidemiolgica e Ambiental em Sade tm como gestora nacional a Secretaria de Vigilncia em Sade, do Ministrio da Sade.
zz
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Coordenao-Geral de Laboratrios de Sade Pblica CGLAB

A Coordenao-Geral de Laboratrios de Sade Pblica, vinculada Secretaria de Vigilncia em Sade, responsvel por coordenar, normalizar e supervisionar as atividades tcnicas das Redes Nacionais de Laboratrios de Vigilncia Epidemiolgica e Ambiental em Sade. A CGLAB tem como metas promover, coordenar, apoiar e fomentar aes, objetivando a melhoria contnua dos servios prestados por essas redes. Nesse sentido, a elaborao de manuais tcnicos com a definio das metodologias, das orientaes e dos procedimentos que devem ser seguidos pelos laboratrios de grande importncia para a confiabilidade e a qualidade dos resultados e dos trabalhos por eles gerados, j que estes tm implicaes clnicoteraputicas e epidemiolgicas para o paciente e para a sociedade.
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Anexo E
Relao dos Laboratrios Centrais de Sade Pblica Lacen
Acre Laboratrio Central de Sade Pblica Dr. Djalma da Cunha Batista Av. Getlio Vargas, Travessa do Hemoacre, s/n CEP: 69900-614, Rio Branco-AC Tel.: (68) 3228-2720 Fax: (68) 3228-2720 E-mail: lacen.saude@acre.gov.br Alagoas Laboratrio Central de Sade Pblica Dr. Aristeu Lopes Av. Marechal Castelo Branco, 1.773, Jatica CEP: 57036-340, Macei-AL Tel.: (82) 3315-2702/2701 Fax: (82) 3315-2722 E-mail: coordenao@lacen.com.br / telma@lacen.com.br Amap Laboratrio Central de Sade Pblica Prof. Reinaldo Damasceno Rua Trancredo Neves, 1.118, So Lzaro CEP: 68900-010, Macap-AP Tel.: (96) 3212-6175/6165/6115 Fax: (96) 3212-6115 E-mail: diretoria@lacen.ap.gov.br
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Amazonas Laboratrio Central de Sade Pblica Rua Emlio Moreira, 510, Centro CEP: 69020-040, Manaus-AM Tel.: (92) 3622-2819/2129-4000 Fax: (92) 2129-4000 E-mail: lacenam@bol.com.br Bahia Instituio: Laboratrio Central de Sade Pblica Prof. Gonalo Moniz Endereo: Rua Waldemar Falco, 123, Brotas CEP: 40295-001, Salvador-BA Tel.: (71) 3376-1414/2299 Fax: (71) 3356-0139 E-mail: lacen.diretoria@saude.ba.gov.br Cear Laboratrio Central de Sade Pblica Av. Baro de Studart, 2.405, Aldeota CEP: 60120-002, Fortaleza-CE Tel.: (85) 3101-1472/1491 Fax: (85) 3101-1485 E-mail: ricardo@saude.ce.gov.br Distrito Federal Laboratrio Central de Sade Pblica SGAN, quadra 601, lotes O e P CEP: 70830-010, Braslia-DF Tel.: (61) 3325-5288/3316-9808 (Centro de Controle de Zoonoses) Fax: (61) 3321-9995 / 3326-5769 E-mail: gablacen@saude.df.gov.br
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Esprito Santo Laboratrio Central de Sade Pblica Av. Marechal Mascarenhas de Moraes, 2.025, Bento Ferreira CEP: 29052-121, Vitria-ES Tel.: (27) 3382-5046 Fax: (27) 3137-2404 E-mail: lacen@saude.es.gob.br Gois Laboratrio Central de Sade Pblica Dr. Giovanni Cysneiros Av. Contorno, 3.556, Jardim Bela Vista CEP: 74853-120, Goinia-GO Tel.: (62) 3201-8890/3888 Fax: (62) 3201-3888 E-mail: lacen@saude.go.gov.br / lacen.dirgeral@saude.go.gov.br Maranho Laboratrio Central de Sade Pblica Instituto Oswaldo Cruz Rua Afonso Pena, 198, Centro CEP: 65010-030, So Luis-MA Tel.: (98) 3232-3410/5356 Fax: (98) 3232-3410 ramais: 239 ou 237 E-mail: lacen@lacen.ma.gov.br Mato Grosso Laboratrio Central de Sade Pblica Rua Thogo da Silva Pereira, 63, Centro CEP: 78020-500, Cuiab-MT Tel.: (65) 3623-6404/3624-6095 Fax: (65) 3613-2697 E-mail: dirlacen@saude.mt.gov.br
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Mato Grosso do Sul Laboratrio Central de Sade Pblica Av. Senador Felinto Muller, 1.666, Ipiranga CEP: 79074-460, Campo Grande-MS Tel.: (67) 3345-1300/3346-4871 Fax: (67) 3345-1320 E-mail: lacendiretoria@net.ms.gov.br Minas Gerais Instituto Octvio Magalhes/Fundao Ezequiel Dias Rua Conde Pereira Carneiro, 80, Gameleira CEP: 30510-010, Belo Horizonte-MG Tel.: (31) 3371-9472/9461/9478 Fax: (31) 3371-9480/9478/9444 E-mail: iomlacen@funed.mg.gov.br Par Laboratrio Central de Sade Pblica Rodovia Augusto Montenegro, km 10 CEP: 66823-060, Belm-PA Tel.: (91) 3248-8299/1766 E-mail: lacen@sespa.pa.gov.br Paraba Laboratrio Central de Sade Pblica Av. Cruz das Armas, s/n, Cruz das Armas CEP: 58085-000, Joo Pessoa-PB Tel.: (83) 3218-5926/5922 Fax: (83) 3218-5923 E-mail: lacenpb@ig.com.br
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Paran Laboratrio Central do Estado Rua Sebastiana Santana Fraga, 1.001, Guatup CEP: 83060-500, So Jos dos Pinhais-PR Tel.: (41) 3299-3200/3218/3219 Fax: (41) 3299-3204 E-mail: lacen@pr.gov.br / diretorialacen@sesa.pr.gov.br Pernambuco Laboratrio Central de Sade Pblica Dr. Milton Bezerra Sobral Laboratrio de Endemias Labend Av. Conde da Boa Vista, 1.570, Boa Vista CEP: 50060-001, Recife-PE Tel.: (81) 3412-6416/6417 Fax: (81) 3412-6333 E-mail: lacen@saude.pe.gov.br Piau Laboratrio Central de Sade Pblica Dr. Costa Alvarenga Rua Dezenove de novembro, 1.945, Primavera CEP: 64002-570, Terezina-PI Tel.: (86) 3223-2484/3221-3551 Fax: (86) 3216-3651 E-mail: lacempi@veloxmail.com.br Rio de Janeiro Laboratrio Central de Sade Pblica Noel Nutels Rua do Resende, 118, Ftima CEP: 20231-092, Rio de Janeiro-RJ Tel.: (21) 2252-4000 Telefax: (21) 2232-5767/2470 E-mail: dptnnutels@saude.rj.gov.br
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Rio Grande do Norte Laboratrio Central de Sade Pblica Rua Cnego Monte, s/n, Quintas CEP: 59037-170, Nata-RN Tel.: (84) 3232-6191 Fax: (84) 3232-6195 E-mail: lacen@rn.ig.com.br / lacenrn@yahoo.com.br Rio Grande do Sul Laboratrio Central do Estado Av. Ipiranga, 5.400, Jardim Botnico CEP: 90610-000, Porto Alegre-RS Tel.: (51) 3288-4035/3352-0416 Fax: (51) 3288-4053 E-mail: lacen@fepps.rs.gov.br Rondnia Laboratrio Central de Sade Pblica Rua Anita Garibaldi, 4.130, Costa e Silva CEP: 78903-770, Porto Velho-RO Tel.: (69) 3216-5305/5300/5301/5302 Fax: (69) 3216-6149/6106 ou 3223-4890 ou 2339-6566 E-mail: direcao@lacen.ro.gov.br Roraima Laboratrio Central de Sade Pblica Av. Brigadeiro Eduardo Gomes, s/n, Novo Planalto CEP: 69305-650, Boa Vista-RR Tel.: (95) 3623-2996/1982/1221 Fax: (95) 3223-1976/1294 (Secretaria de Sade) E-mail: lacen@saude.rr.gov.br
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So Paulo Instituto Adolf Lutz Av. Dr. Arnaldo, 355, Cerqueira Csar CEP: 01246-902, So Paulo-SP Tel.: (11) 3068-2800/2802 Fax: (11) 3085-3505/3088-3041 E-mail: martais@ial.sp.gov.br Santa Catarina Laboratrio Central de Sade Pblica Av. Rio Branco, 172, fundos, Centro CEP: 88015-201, Florianpolis-SC Tel.: (48) 3251-7801/7800/7813/7817/7802 Fax: (48) 3251-7900 E-mail: lacen@saude.sc.gov.br Sergipe Instituto Parreiras Horta Rua Campo do Brito, 551, So Jos CEP: 49020-380, Aracaju-SE Tel.: (79) 3234-6000 Fax: (79) 3214-1863 E-mail: gpresi@hemolacen.se.gov.br Tocantins Laboratrio Central de Referncia em Sade Pblica 601 Sul, Av. LO 15, Conjunto 2, Lote 1, Planalto Diretor Sul CEP: 77054-970, Palmas-TO Tel.: (63) 3218-3237/3239/3223 Fax: (63) 3218-3220/3228 E-mail: lacen@saude.to.gov.br
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Glossrio
Anticorpos: ou imunoglobulinas, so glicoprotenas sintetizadas e excretadas por plasmcitos derivados dos linfcitos B, presentes no plasma, tecidos e secrees, que atacam protenas estranhas ao corpo, chamadas de antgenos, realizando, assim, a defesa do organismo (imunidade humoral). Antgeno: qualquer substncia que consiga induzir resposta imunolgica detectvel, quando introduzida no organismo de um animal. O que caracteriza o antgeno a presena de estruturas moleculares (eptopos) cujas superfcies sejam complementares s de stios determinados (partopos) existentes na superfcie de algum linfcito. Colo: existente nos cestides, um segmento delgado do corpo, entre o esclex e o estrbilo, em que ocorrem intensa multiplicao celular e formao contnua de novas proglotes. Diluio: adio de um solvente a um soluto ou mistura para decrescer a concentrao de um soluto ou composto. Dispneia: estado em que o paciente apresenta dificuldade respiratria por qualquer causa, acompanhada de sensao de opresso e mal-estar. Enzima: grupo de substncias orgnicas de natureza normalmente proteica, com atividade intra ou extracelular, que tem funes catalisadoras, catalisando reaes qumicas que, sem a sua presena, dificilmente aconteceriam. Isso conseguido a partir do aumento da velocidade das reaes qumicas, possibilitando o metabolismo dos seres vivos.
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Esclex: a cabea da tnia, regio anterior do corpo que adere parede intestinal atravs das ventosas e ganchos. Estrbilo: toda a cadeia de progltides da tnia. Helminto: termo geral e pouco preciso para designar metazorios que pertencem quase sempre aos filos Platyhelminthes e Nemathelminthes, ou tambm aos Acanthocephala, Pentastomida e Annelida. Em alguns casos, usado no mesmo sentido que verme; em outros, refere-se somente a vermes parasitos. Hemoptise: expectorao de sangue, devido hemorragia das vias respiratrias. Hidtide: forma larvria dos cestides do gnero Echinococcus, que se desenvolve, a partir da oncosfera, nos tecidos dos hospedeiros intermedirios, como uma vescula geralmente esfrica. Hospedeiro: organismo no qual o parasito vive. Hospedeiro definitivo: aquele no qual se desenvolve a fase adulta do parasito (sexuada). Hospedeiro intermedirio: aquele onde se desenvolve a fase assexuada, larvria ou juvenil do parasito. Imunoglobulinas: compreende a superfamlia de protenas, que, alm de anticorpos (Ig) circulantes no sangue e lquidos orgnicos, representa muitas molculas encontradas como marcadores ou receptores em membranas celulares. Infeco: contaminao ou invaso do corpo por um microrganismo parasito, que pode ser um agente patognico ou no. Oncosfera: embrio da tnia com seis ganchos.
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Prevalncia: nmero de casos de uma doena ou de pessoas atingidas por essa doena, bem como o de outros eventos mrbidos que ocorrem em uma populao determinada, durante um perodo definido, sem que se faam distines entre casos novos ou antigos. Proglote: cada um dos segmentos que formam o corpo ou estrbilo dos Cestoidea. Protoesclex: esclex formado por brotamento interno nas vesculas prolgeras da hidtide. Rostro: estrutura muscular e retrtil que suporta, em geral, uma coleo de acleos, movimentados para a fixao do parasito. Ventosas: estruturas musculares que se apresentam geralmente como depresses em forma de cpula ou taa, destinadas aderncia ou fixao dos parasitos. Vescula aquosa: pequeno saco contendo lquido.
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Ministrio da Sade Fundao Oswaldo Cruz Paulo Gadelha Valcler Rangel Fernandes Wim Degrave Mirna Teixeira Instituto Oswaldo Cruz Tania Arajo-Jorge Christian Niel Claude Pirmez Ricardo Loureno Elizabeth Rangel Hidatidose humana no Brasil. Manual de procedimentos tcnicos para o diagnstico parasitolgico e imunolgico. Rosangela Rodrigues-Silva Fomento: Programa de Desenvolvimento Tecnolgico em Sade Pblica PDTSP/Fio Equipe Tcnica Contedo Rosangela Rodrigues-Silva Servio de Referncia Nacional em Hidatidose, Laboratrio de Helmintos Parasitos de Vertebrados, Instituto Oswaldo Cruz, Fundao Oswaldo Cruz [rsilva@ioc.fiocruz.br] Fernanda Barbosa de Almeida Servio de Referncia Nacional em Hidatidose, Laboratrio de Helmintos Parasitos de Vertebrados, Instituto Oswaldo Cruz, Fundao Oswaldo Cruz [almeida@ioc.fiocruz.br] Jos Roberto Machado-Silva Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Faculdade de Cincias Mdicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro [machadosilva@pq.cnpq.br] Colaboradores Aline Kelen Vesely Reis Coordenao-Geral de Laboratrios de Sade Pblica, Secretaria de Vigilancia Sanitria, Ministrio da Sade [aline.reis@saude.gov.br] Lucas de Andrade Barros Servio de Referncia Nacional em Hidatidose, Laboratrio de Helmintos Parasitos de Vertebrados, Instituto Oswaldo Cruz, Fundao Oswaldo Cruz [labarros@ioc.fiocruz.br] Nilton Guiotti Siqueira Departamento de Cirurgia, Universidade Federal do Acre [ngs@ufac.br] Reviso Tcnica Jos Mauro Peralta Instituto de Microbiologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro [peralta@micro.ufrj.br]
63
ISBN 978-85-334-1832-5
Ouvidoria do SUS
136
Biblioteca Virtual em Sade do Ministrio da Sade
www.saude.gov.br/bvs
Secretaria de Vigilancia em Sade do Ministrio da Sade
www.saude.gov.br/svs

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MINISTRIO DA SADE

Hidatidose Humana no Brasil

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS

Caractersticas Morfolgicas e Ciclos Biolgicos dos Agentes Etiolgicos Sintomatologia 16

Coleta com seringa e agulha descartveis Coleta com sistema a vcuo 30

Material para preparar e armazenar o soro Separao e armazenamento de soro 31

Ficha de notificao para o imunodiagnstico da hidatidose Anexo C 49

Formulrio para envio de material biolgico por transporte areo 49 Anexo D 50 50

MINISTRIO DA SADE Fundao Oswaldo Cruz

Srie A. Normas e Manuais Tcnicos

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS

Hidatidose Humana no Brasil

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS

Hidatidose Humana no Brasil

Fonte: (ROMANI, 1995)

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS

Hidatidose Humana no Brasil

Fonte: (Adaptado de RODRIGUES-SILVA et al., 2002)

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS

Hidatidose Humana no Brasil

Caractersticas Morfolgicas e Ciclos Biolgicos dos Agentes Etiolgicos

Fonte: (SERVIO DE REFERNCIA NACIONAL EM HIDATIDOSE, IOC, FIOCRUZ)

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS

Hidatidose Humana no Brasil

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS

Hidatidose Humana no Brasil

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS

Hidatidose Humana no Brasil

Figura 6 - Ciclo biolgico de Echinococcus vogeli

Figura 7 - Speothos venaticus

Fonte: (SERVIO DE REFERNCIA NACIONAL EM HIDATIDOSE, IOC, FIOCRUZ)

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS

Hidatidose Humana no Brasil

Figura 8 - Cuniculus paca

Fonte: (SERVIO DE REFERNCIA NACIONAL EM HIDATIDOSE, IOC, FIOCRUZ)

Figura 9 - Dasyprocta aguti

Fonte: (SERVIO DE REFERNCIA NACIONAL EM HIDATIDOSE, IOC, FIOCRUZ).

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS

Hidatidose Humana no Brasil

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS

Hidatidose Humana no Brasil

Hidatidose Humana no Brasil

Mtodos Morfolgicos e Morfomtricos para o Diagnstico da Hidatidose Humana

Fonte: (SERVIO DE REFERNCIA NACIONAL EM HIDATIDOSE, IOC, FIOCRUZ)

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Hidatidose Humana no Brasil

Fonte: (adaptado de ALMEIDA et al., 2007)

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Hidatidose Humana no Brasil

Mtodos Imunolgicos para Diagnstico da Hidatidose Humana

Secretaria de Vigilncia em Sade/MS

Hidatidose Humana no Brasil

Procedimento para teste imunolgico

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