Instituto Politcnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas Prctica No.

13 Aislamiento de DNA plasmdico Alumnos: Lpez Vzquez Alfredo Abel Velzquez Montiel Isaac Aarn Seccin 3 Introduccin Muchas endonucleasas de restriccin hidrolizan el DNA de forma identada, lo que da lugar a fragmentos con regiones de cadena sencilla en sus extremos 5 y 3. Los fragmentos de DNA obtenido en la misma endonucleasa de restriccin a partir de molculas distintas presentan extremos de cadena sencilla complementarias que pueden asociarse por complementariedad y unirse covalentemente entre si con una DNAligasa. Cuando se combinan 2 fragmentos de DNA de origen distinto, el resultado es una molcula de DNA recombinante. Hay bacterias que tienen otras molculas de DNA pequeas y sper plegadas hasta pareces una pequea bolita denominadas plsmido. Estas proporcionan a la clula ventaja en cuanto a metabolismo se refiere sobre las que no la tienen. La electroforesis es una tcnica de separacin de molculas en una mezcla por aplicacin de un campo elctrico. Las molculas disueltas se desplazan o migran en un campo elctrico a una velocidad determinada por su relacin carga: masa. La electroforesis se puede llevar a cabo en gel de agarosa. La agarosa es un polmero lineal, extrado de algas marinas, en el cual las molculas de ADN de doble cadena migran de manera inversamente proporcional al logaritmo en base 10 de sus tamaos moleculares. El bromuro de etidio es una molcula plana, de tipo placa, que se puede introducir entre los pares de bases de la doble hlice: las molculas se visualizan de costado. Un agente intercalante es una sustancia, usualmente un catin aromtico plano, que se intercala entre los bases apiladas de una hebra doble de polinucletidos. Objetivos Obtener DNA plasmdico Caracterizar el DNA plasmdico mediante electroforesis en gel de agarosa. Anlisis de la tcnica Al aadir a la bacteria la solucin I (Glucosa-TrisEDTA) estamos preparando el medio con el cual mantenemos a la bacteria sin romperla, eliminar ++ ++ los iones Mg y Ca , y el EDTA funciona como agente intercalante. Se re suspende con un vortex para homogeneizar todo. Se incuba en hielo, ya que a esa temperatura opera ptimamente la bacteria, y despus se aade la solucin II (SDS 1%-NaOH 0.2 N) donde el SDS 1% rompe las membranas de la bacteria y el NaOH 0.2 N realiza una hidrolisis alcalina para quitar las impurezas y se centrifuga para empezar a separar, se mezcla suavemente para evitar romper el DNA plasmdico

que se encuentra sper enrollado y se incuba en hielo. Despues se le aade la solucin III (Acetato de potasio 5M, pH 4.8) el cual provoca que el DNA citosomal se precipite, una vez mas se mezcla cuidadosamente. Se centrifuga para precipitar completamente todas las impurezas y el DNA citosomal y el sobrenadante se recupera en otro tubo. Se aade la solucin IV (Isopropanol) la cual disminuye la constante dielctrica y precipita el DNA plasmdico. Se centrifuga y se deshecha el sobrenadante con lo cual solo queda en el tubo el DNA plasmdico y se aade la solucin V (Regulador tris-EDTA) y as queda listo para caracterizarse por medio de la electroforesis. Resultados

. Discusiones. Como el pozo encontrado en la posicin numero 10 no muestra alguna coloracin ms que una muy tenue mancha la cual corresponde a residuos de RNA que se encontraba en la muestra y esto nos indica que la muestra que se aplico RNasa A, la cual degrada RNA; pero resulta un tanto ilgico que slo se haya encontrado puros residuos de RNA, por lo tanto podemos suponer que no se aplico una muestra en este pozo; y que esa tenue mancha tal vez fue una contaminacin de los pozos que se encuentra a los lados; por lo tanto analizaremos el pozo en posicin 7. La 1er. mancha que encontramos en sentido descendente corresponde a la ubicada en el pozo; y esta no indica que existe la presencia de residuos de DNA; pero por su tamao no pudo pasar por los espacios de la agarosa, la 2da. Mancha es muy tenue; y nos indica la presencia del DNA plasmdico pero encontramo0s a la molcula en forma circular relajada pero por tener esta estructura no puede atravesar en los poros de la agarosa y su recorrido por esta es muy limitado; pero la mancha es muy tenue; as que podemos deducir que la cantidad de molculas con esta forma estructural es reducida. La 3er. mancha es mucho mas notoria, y nos demuestra que las molculas del DNA plasmdico tiene una estructura lineal, por lo tanto podr tener un mayor recorrido por la agarosa a comparacin de la forma circular relajada, la mancha es muy notoria lo cual nos indica que el tratamiento de esta muestra no se trato con el debido cuidado, por lo tanto la estructura original del DNA plasmtico que era circular, se dao y se volvi completamente lineal; la 4ta. mancha nos muestra aquellas molculas de DNA plasmdico que no sufrieron

dao en su estructura an mantienen la estructura superenrrollada , la cual se mover con una mayor facilidad entre la agarosa; la intensidad de la mancha es relativamente un intermedio entre la 2da. y la 3er. mancha descritas anteriormente; y nos demuestra que existi una cantidad considerable de molculas que no perdieron su estructura original. Y por ultimo la mancha final como ya lo mencionamos con anterioridad nos indica la presencia del RNA en nuestra muestra. Comparando con las manchas que se encuentran en el pozo 8, vemos que existe una similitud relativa en cuanto a resultados y ha como se ha llevado a cabo la obtencin del DNA plasmdico; la cual podemos decir que tuvimos un aproximado del 70-80% de eficiencia al realizar esta tcnica, ya que existi mayor cantidad de DNA plasmdico con estructura lineal en comparacin con el de estructura superenrrollada. Conclusiones. La obtencin del DNA plasmdico no fue totalmente exitosa. La electroforesis nos indic cmo se llevo a cabo la obtencin del DNA plasmdico. Una estructura superenrrollada tiene mayor facilidad de desplazamiento que una estructura circular relajada y una lineal en la agarosa