CUANTIFICACIN DE LOS GRUPOS BACTERIANOS DE CINCO INOCULOS USADOS EN LA PRUEBA DE BIODEGRADABILIDAD ANAEROBIA

Ivn Moreno Andrade Coordinacin de Bioprocesos Ambientales, Instituto de Ingeniera, UNAM. C.U., Apdo. Postal 70-472 Coyoacn. Mxico D.F. CP.04510 FAX: +(52) 55 5616-2798, e-mail: ImorenoA@iingen.unam.mx Germn Buitrn Mndez* Coordinacin de Bioprocesos Ambientales, Instituto de Ingeniera, UNAM. C.U., Apdo. Postal 70-472 Coyoacn. Mxico D.F. CP.04510 FAX: +(52) 55 5616-2798. e-mail: gbm@pumas.iingen.unam.mx Direccin del autor principal: Coordinacin de Bioprocesos Ambientales, Instituto de Ingeniera, UNAM. C.U., Apdo. Postal 70-472 Coyoacn. 04510 Mxico, D.F. FAX: 56162798, e-mail gbm@pumas.iingen.unam.mx Ingeniero Qumico, UNAM (1987), Maestra y doctorado INSA-Toulouse, Francia (1990, 1993). Actualmente Investigador Titular y Coordinador de Bioprocesos Ambientales. RESUMEN Existen factores que se deben cuidar para la realizacin de las pruebas de biodegradabilidad anaerobia, los cuales son principalmente las condiciones fisicoqumicas, la cantidad de sustrato que se desea degradar, y la cantidad de inculo en la prueba. Los dos primeros factores pueden controlarse fcilmente, pero el inculo es un factor que presenta variaciones debido a su origen, lo que se traduce en una baja confiabilidad de los resultados de la prueba de biodegradabilidad. Por ello, es de suma importancia realizar una buena eleccin del inculo, para as obtener las mejores respuestas la prueba de biodegradabilidad anaerobia (PBA). Por lo anterior es importante conocer la composicin microbiolgica del inculo y conocer cual es el inculo apropiado para la realizacin de las pruebas. En este trabajo se estudiaron cinco inculos de distintos orgenes con objeto de determinar su influencia en los resultados de las pruebas de biodegradabilidad. Se determin la composicin microbiolgica de cada uno. En particular se cuantificaron los grupos de bacterias: fermentativas, acetognicas productoras obligadas de hidrogeno consumidoras de propionatos y butiratos, metanognicas hidrogenfilas y acetoclsticas y sulfato-reductoras, por medio de la tcnica de nmero ms probable (NMP). Se llevaron a cabo pruebas de biodegradabilidad anaerobia con dos tipos de sustrato, glucosa (fcilmente biodegradable) y fenol (difcil de degradar) para cada uno de los inculos evaluados. Los resultados mostraron que existen diferencias significativas en la composicin biolgica de los inculos y en la respuesta en la PBA debido al origen del inculo. El inculo proveniente de una planta de tratamiento anaerobia de la industria cervecera, fue el inculo con la mayor cantidad de bacterias por gramo de SSV, en los seis grupos microbianos, as mismo tuvo la mejor respuesta de para los dos sustratos evaluados en la prueba de biodegradabilidad anaerobia. Se concluye que existe una relacin entre la cantidad de bacterias y el resultado de la PBA. Palabras clave: NMP, inculo, biodegradabilidad, caracterizacin, actividad metanognica. INTRODUCCIN Los procesos de degradacin anaerobia son realizados por un consorcio de microorganismos que actan de una forma secuencial. Para que el proceso se realice adecuadamente debe existir una cantidad y actividad adecuada de todos los grupos bacterianos involucrados puesto que el producto de las reacciones de un grupo sirve de sustrato para el siguiente, as se mantiene un equilibrio en las velocidades de formacin y eliminacin de intermediarios evitando as su acumulacin. Los grupos que llevan a cabo estas reacciones son las bacterias fermentativas, acetognicas, metanognicas y sulfato-reductoras. Las bacterias fermentivas son las primeras en actuar despus de que se ha realizado la hidrlisis de polmeros presentes en el agua residual (carbonatos, protenas y lpidos) convirtindolos a compuestos de bajo peso molecular como

azcares, aminocidos, alcoholes, cidos carboxlicos y compuestos aromticos.. Las bacterias fermentativas transforman estos compuestos en cidos grasos voltiles (acetato, propionato, butirato, valerato), dixido de carbono, hidrgeno y clulas, mientras que los lpidos y los cidos grasos de cadena larga son convertidos en cidos grasos voltiles, a travs del mecanismo de -oxidacin (Saval y Noyola, 1996). Posteriormente el grupo de las bacterias acetognicas productoras obligadas de hidrgeno (OHPA) transforman los cidos grasos de cadena corta en acetato, dixido de carbono, e hidrgeno. El hidrogeno es un intermediario importante en los organismos acetognicos, este se produce durante la fermentacin de carbohidratos y otros sustratos, y en la subsecuente degradacin del cido propinico y otros AGVs de alto peso molecular. Las bacterias metanognicas acetoclsticas tienen como funcin el convertir el cido actico en biogs compuesto por metano y en menor proporcin por dixido de carbono y las metanognicas hidrogenfilas coexisten con las bacterias acetognicas pues catalizan la reaccin entre el hidrgeno producido por estas ltimas y el dixido de carbono para producir metano. Estas bacterias controlan el potencial de oxido reduccin (ORP) permitiendo a las bacterias acetognicas recuperar el NAD necesario para la produccin de acetato. Por ltimo otro grupo que se encuentra presente en los inculos anaerobios son la bacterias sulfato-reductoras, la importancia de este grupo depende da la presencia de sulfatos en el agua residual a tratar. Este grupo se caracteriza por su capacidad para reducir los sulfatos a sulfuro de hidrgeno. Algunas de estas bacterias realizan una relacin sintrfica con las OPHA (de igual forma que las bacterias metanognicas) para la obtencin de los precursores necesarios para llevar a cabo su metabolismo. As en presencia de sulfatos en el sustrato, las bacterias sulfatorreductoras sustituyen a las metanognicas. Las pruebas de biodegradabilidad anaerobia permiten evaluar la susceptibilidad de un efluente a ser tratado por esta va, as mismo se pueden conocer los tiempos de latencia, los posibles efectos inhibitorios y las mximas eficiencias de remocin esperadas durante el tratamiento del efluente (Moreno y Buitrn, 1997). Para obtener resultados confiables en las pruebas de biodegradabilidad anaerobia existen ciertos factores que se deben cuidar, entre ellos, se encuentran las condiciones fisicoqumicas (pH, temperatura, etc.), la composicin del medio, la cantidad de sustrato a degradar, y el inculo. Los tres primeros factores pueden ser fcilmente controlados, pero la cantidad de inculo es un factor que puede variar por su origen (Nyholm et al 1984) lo que va a repercutir en la poblacin de bacterias vivas (Thouand et al 1995) y la adaptacin de las bacterias al sustrato a degradar (Barkay y Pichard 1988, Thouand y Block 1993). El nmero de clulas usadas en la prueba va a determinar las tasas de biodegradabilidad (Simpkins y Alexander 1984), el tiempo de latencia (Chudoba et al 1992) y la probabilidad de que la degradacin del sustrato se realice en el tiempo de duracin de la prueba (Thouand et al 1995). Por lo cual es importante controlar la cantidad de las clulas, en especial de organismos degradadores presentes que se van a adicionar a la prueba (Nyholm 1991). Por lo anterior es importante conocer la cantidad de microorganismos presentes en un inculo, as la cuantificacin de estos microorganismos es una herramienta la cual puede ayudar a elegir el inculo con las mejores caractersticas para llevar a cabo una prueba de biodegradabilidad anaerobia. El objetivo de este trabajo fue estudiar cinco inculos de distintos orgenes con objeto de determinar su influencia en los resultados de las pruebas de biodegradabilidad. Se determin la composicin microbiolgica de cada uno. METODOLOGA Fuentes de inculo Se estudiaron cinco inculos de distintos orgenes (tabla 1). Cada inculo fue caracterizado con el fin de conocer las condiciones iniciales para cada inculo: La concentracin de slidos suspendidos totales (SST), concentracin de slidos suspendidos voltiles (SSV), concentracin de slidos suspendidos fijos (SSF) (de acuerdo a Standard Methods ,1992), actividad metanognica especfica (AME), ndice volumtrico de lodos (IVL), velocidad de sedimentacin (VS), anlisis granulomtrico y el potencial de oxido-reduccin (ORP).

Tabla 1.- Fuentes de inculo INCULO Planta de tratamiento anaerobia de la industria cervecera Planta de tratamiento anaerobia de una industria qumica Planta de tratamiento anaerobia municipal Estircol de vaca Planta de tratamiento de lodos activados municipal

CLAVE A B C D E

INFLUENTE Aguas residuales de la industria cervecera Aguas residuales de la produccin de cido tereftlico Aguas residuales de una universidad Agua residual municipal

Cuantificacin de bacterias anaerobias La cuantificacin de las bacterias anaerobias se llev a cabo utilizando la tcnica del nmero ms probable (NMP) descrita por Garca et. al. (1982), en la cual se contabiliza el nmero ms probable de bacterias existentes de cada uno de los grupos: fermentativas (F), acetognicas productoras obligadas de hidrogeno consumidoras de propionatos (OHPAp) y butiratos (OHPAb) metanognicas hidrogenfilas (MH) y acetoclsticas (MA) y sulfato-reductoras (SR). La preparacin de los medios, transferencia de sustratos y tcnicas de inoculacin realizadas dentro de una cmara anaerobia marca McCoy. Se realizaron 10 diluciones con 5 repeticiones por dilucin para cada uno de los grupos de cada inoculo. Los grupos F y SR se incuban durante una semana y los otros grupos se incuban de un mes a mes y medio. Al final de la incubacin se contabiliza el nmero de tubos de cada dilucin en donde existi crecimiento microbiano, la caracterstica distintiva de este crecimiento en el grupo F es un color lechoso en el medio, las SR debern mostrar un color negro por la formacin de FeS y el indicador positivo de los otros grupos es la produccin de metano, la cual es cuantificada por medio de un cromatgrafo de gases. Al tener estos resultados es posible realizar el clculo para determinar el nmero mas probable de bacterias existentes pos cada gramo de SSV. Prueba de biodegradabilidad anaerobia Cada prueba de biodegradabilidad anaerobia se llevo a cabo en botellas serolgicas de 160 ml de acuerdo con Shelton y Tiedje (1984). Se utiliz el medio de nutrientes segn Balch et al. (1979), y se adicion de resarzurina como indicador de contaminacin por oxgeno. Se elimin el oxgeno en las botellas purgndolas con nitrgeno para asegurar la obtencin de ambiente anaerobio. Posteriormente se esterilizo en autoclave para lograr la completa reduccin del medio. Se inocularon 10 ml de medio, mas la cantidad de sustrato y lodo necesario para cada prueba, completando el volumen requerido con agua reducida. La inoculacin se realiz en una cmara anaerobia McCoy en condiciones de anaerobiosis. La incubacin se llev a cabo a temperatura controlada de 35C, con agitacin a 120 rpm por medio de un agitador orbital. La cuantificacin del biogs producido se realiz con un transductor de presin. La produccin terica de metano se calcul empleando la ecuacin de Tarvin y Brusswell (Birch et al. 1989). Cada prueba se realiz por duplicado. Adicionalmente por cada prueba con distinto inculo se corrieron botellas nicamente con medio y la cantidad de biomasa necesaria, con el fin de conocer la produccin endgena de metano (estas pruebas son llamadas blancos). La cuantificacin del carbono remanente se realizo por medio del anlisis del carbono orgnico total al inicio y final de la prueba con un analizador de carbono orgnico total (Shimatzu TOC 5000). Los resultados se expresan como produccin neta de metano (valores promedio), es decir restando la produccin de metano en el blanco. Los resultados obtenidos de la da la curva de produccin de biogs en la prueba de biodegradabilidad anaerobia fueron el tiempo de latencia, Tl(10) el cual es definido como el tiempo necesario para obtener el 10% de la degradacin del sustrato probado y el porcentaje de biodegradabilidad el cual es calculado por medio de la frmula 1.

% Biod =
donde: %Biodeg = % de biodegradabilidad CT = produccin de CH4 terico CE = produccin de CH4 experimental

CE 100 CT

frmula 1

RESULTADOS Caracterizacin de los inculos La caracterizacin de los inculos mostr diferencias para cada uno de los parmetros determinados, sobresaliendo las diferencias encontradas en la actividad metanognica especfica inicial (tabla 1). La caracterizacin mostr que el inculo con un mayor nmero de SSV y mayor actividad metanognica especfica fue el inculo A Tabla 1.- Caracterizacin de inculos de distintos orgenes INCULO SST (g/l) SSF (g/l) SSV( g/l) IVL (ml/gSSV) VS (m/h) ORP AME (gCH4/gSSV.d) Granulometra (%): <.6 mm >.6 -<.42 mm >.42-<.149 mm >.149 mm A 25.2 11.4 13.8 82.51 8.77 -312 0.48 20.32 11.37 23.49 44.73 B 32.7 15.3 17.4 43.23 1.019 -232.1 0.42 20.47 21.33 28.87 29.36 C 121.8 74.32 47.48 13.95 0.76 -258.7 0.34 33.2 22.3 17.9 26.6 D 28.4 17.06 11.34 ----4.6 0.14 --------E 3.8 0.82 2.98 98.4 11.4 -204.6 0.23 4.7 12.45 36.72 48.13

Cuantificacin de bacterias anaerobias La cuantificacin de bacterias anaerobias por medio de la prueba de NMP demostr que existen diferencias en la composicin microbiolgica entre cada uno de los grupos de los inculos (figura 1). Existe una mayor cantidad de bacterias por gramo de SSV en los grupos del inculo A que en los dems inculos, lo que concuerda con los resultados de la AME mostrado en la tabla 1. La menor cantidad de cantidad de bacterias por grupo fue el de las sulfato-reductoras debido a que las reacciones de sulfato-reduccin en los inculos evaluados no se presentaban, ya que estas reacciones tienden a competir con las metanognicas cuando existen sustratos propios para ellas.
14

bacterias / gSSV (log)

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 F OPHAp

OPHAb

MA

MH

SR

Grupos
Fig. 1.- Resultados de la prueba de NMP.

Prueba de biodegradabilidad anaerobia Se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de biodegradabilidad para la glucosa para cada uno de los inculos evaluados. De igual manera, los tiempos de latencia observados tuvieron una gran variabilidad. El inculo A present los mejores resultados en el porcentaje de biodegradabilidad y el menor tiempo de latencia (tabla 2). Tabla 2.- Resultados de la prueba de biodegradabilidad anaerobia con dos sustratos glucosa y fenol (50 mg/L) y distintos inculos (50 mgSSV/L) INCULO % biodegradabilidad Tasa de reaccin T(10) latencia (mmol/h) (h) GLUCOSA A B C D E FENOL (154 h) 100 0.14 78.9 0.12 95.2 0.9 55.5 0.07 35.0 0.1 (650 h) 0.007 0.001 0.004 0.00 0.003 0.001 0.002 0.001 0.005 0.002 70.8 2.4 310 8.4 2.3 0.8 --150 12.6 1.1 0.11 0.61 0.08 0.99 0.18 0.36 0.06 0.11 0.02 1.7 0.3 3. 5 0.36 5.6 0.8 3.9 0.12 8.5 0.82

A 56.8 1.04 B 18.5 0.84 C 21.5 0.92 D 7.4 0.52 E 16.0 0.73 a.- No se lleg al 10% de degradacin

El inculo A present los mejores resultados en el porcentaje de biodegradabilidad y el menor tiempo de latencia debido a el mayor nmero de bacterias por gramo de SSV. Se puede observar en la figura 2 las curvas de produccin de metano para un sustrato fcilmente biodegradable (glucosa) en donde el inculo C present el segundo mejor porcentaje de biodegradabilidad debido a la presencia de un mayor nmero de bacterias metanognicas que los inculos B, D y E, ya que stas producen una mayor cantidad de metano.
0.7 0.6 milimoles de CH4 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 20 40 60 80 100 tiempo (h) 120 140 160

Fig. 2.- Resultados de la prueba de biodegradabilidad anaerobia. Sustrato = Glucosa (50 mg/L), Biomasa (50 mg SSV /L), So/Xo=1.

Sin embargo, el tiempo de latencia fue mayor a los inculos B y E, debido a la menor cantidad de bacterias fermentativas las cuales dan una pauta al inicio de la degradacin del sustrato. As mismo, el inculo E tuvo un corto tiempo de latencia por la alta presencia de bacterias fermentativas, aunque el porcentaje de biodegradabilidad fue menor que los otros inculos por la baja cantidad de bacterias metanognicas. La figura 3 muestra las curvas de produccin de metano para un sustrato difcil de degradar (fenol), en donde se que el inculo A tuvo la mejor respuesta en cuanto al porcentaje de biodegradabilidad y el menor tiempo de latencia, se aprecian que los resultados concuerdan con los obtenidos con la glucosa, a excepcin en el porcentaje de biodegradabilidad del inculo D que fue el menor para el fenol, esto se puede deber a que los sustratos a los que este inculo esta expuestos por su origen hacen que el fenol tenga una inhibicin mayor en la produccin de metano.
1 0.9 milimoles de CH4 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 100 200 300 400 tiempo (h) 500 600
A D B E C

Fig. 2.- Resultados de la prueba de biodegradabilidad anaerobia. Sustrato = Fenol (50 mg/L), Biomasa (50 mg SSV /L), So/Xo=1. Las diferencias que se presentan en los resultados de la prueba de biodegradabilidad anaerobia son debidas al la cantidad de SSV y al origen del inculo, ya que de este ltimo depende la composicin microbiologica del inculo, por lo cual se debe elegir correctamente el inculo al realizar la prueba de biodegradabilidad anaerobia. CONCLUSIONES Existen diferencias significativas en la composicin microbiolgica de los inculos anaerobios debido a su origen. El inculo de una planta de tratamiento anaerobia de una industria cervecera present la mayor cantidad de bacterias por gramo de SSV. Los mejores resultados de biodegradabilidad se obtuvieron tambin con este inculo. Se comprob que existe una relacin entre la cantidad de bacterias empleadas y el porcentaje de biodegradabilidad obtenido en la prueba, independientemente de si el sustrato estudiado es txico o fcilmente biodegradable. Los resultados muestran la gran variabilidad en los resultados que se pueden obtener utilizando inculos de distintos orgenes, incluso para un sustrato fcilmente biodegradable como lo es la glucosa. Debido a ello se debe poner mayor nfasis en la interpretacin de los resultados de la PBA y enfocar esfuerzos para su estandarizacin. Agradecimientos: Ivn Moreno Andrade agradece a CONACYT y DGEP por la beca otorgada. Se agradece el apoyo financiero proporcionado por la DGAPA-UNAM (PAPIIT IN 112800) para la realizacin de este proyecto.

REFERENCIAS
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