SECCIN 2.4.

BOVIDAE

CAPTULO 2.4.1.

ANAPLASMOSIS BOVINA

RESUMEN
Definicin de la enfermedad: La anaplasmosis bovina est causada por la infeccin con Anaplasma marginale. Se conoce desde hace tiempo una segunda especie A. centrale. No est claro si representa una verdadera especie separada. Anaplasma marginale es responsable de casi todos los brotes de la enfermedad clnica. Recientemente se ha informado de una tercera especie que infecta el ganado. Sin embargo, parece que la infeccin es poco frecuente y que A. phagocytophilum no causa la enfermedad clnica. El microorganismo se adscribe al gnero Anaplasma perteneciente a la familia Anaplasmataceae del orden Rickettsiales. Descripcin de la enfermedad: Los signos caractersticos de la anaplasmosis son la anemia y la ictericia, pero la enfermedad clnica solo se puede confirmar mediante identificacin del microorganismo. Una vez infectado, el ganado puede permanecer toda la vida como portador, y la identificacin de estos animales depende de la deteccin de anticuerpos especficos mediante pruebas serolgicas o del ADN de las rickettsias mediante tcnicas de amplificacin. Identificacin del agente: El examen microscpico de sangre o de frotis de rganos con tincin de Giemsa es el mtodo ms comn para identificar Anaplasma en animales con infeccin clnica. En estos frotis, A. marginale aparece dentro de los eritrocitos como cuerpos densos y redondeados de 0.31.0 m de dimetro, la mayor parte de ellos situados en la zona marginal del eritrocito o en su proximidad. Anaplasma centrale es aparentemente similar, pero la mayor parte de los microorganismos se sitan lejos del margen del eritrocito. Puede resultar difcil diferenciar entre A. marginale y A. centrale en un frotis teido, sobre todo, con bajos niveles de rickettsmia. En algunos pases existen colorantes comerciales que permiten una tincin rpida de Anaplasma. Es importante que los frotis se hagan bien y estn exentos de material extrao. Los frotis de material de ganado vivo deberan prepararse, con preferencia, de sangre obtenida de la vena yugular o de algn otro gran vaso. En el caso de diagnosis postmortem, los frotis deben proceder de rganos internos (incluyendo hgado, rin, corazn y pulmones) y de la sangre retenida en vasos perifricos. Esto ltimo es particularmente deseable si el estado de descomposicin, despus de la muerte, es avanzado. Pruebas serolgicas: Se ha demostrado que un enzimoinmunoensayo competitivo (C-ELISA) tiene buena sensibilidad en la deteccin de los animales portadores. Tambin pueden utilizarse las pruebas de aglutinacin en placa, el ELISA indirecto, el ELISA de punto, y la inmunofluorescencia indirecta. La prueba de fijacin del complemento ya no se considera segura para la certificacin de animales individuales debido a lo variable de su sensibilidad. La reaccin cruzada entre Anaplasma spp. puede complicar la interpretacin de las pruebas serolgicas. En general, el C-ELISA tiene la mayor especificidad, con una reaccin cruzada bien descrita solo entre A. marginale y A. centrale. Se han utilizado pruebas experimentales basadas en el cido nucleico, que son capaces de detectar la presencia de una infeccin moderada en el ganado portador y en las garrapatas que actan como vectores. Cuando se utilizan para el diagnstico las pruebas basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa, est justificada una cierta precaucin, ya que se necesita una

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reaccin combinada para identificar los portadores de bajo nivel y puede tener lugar una amplificacin inespecfica. Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: En varios pases se usan vacunas vivas para proteger el ganado contra la infeccin por A. marginale. La vacuna que contiene A. centrale es de uso ms amplio y confiere proteccin contra las cepas virulentas de A. marginale. Se dispone de una vacuna contra Anaplasma centrale en forma refrigerada y congelada. El control de calidad es muy importante, ya que pueden estar presentes en el ganado donante otros agentes transmisibles por la sangre que pueden contaminar las vacunas y tener una diseminacin amplia. Por esta razn, se recomienda la vacuna congelada, que permite un control de calidad posterior a la produccin, lo que limita el riesgo de contaminacin con otros patgenos. Las vacunas contra Anaplasma centrale no son completamente seguras. Una recomendacin prctica es limitar su uso, en la medida de lo posible, a terneros, pues la inmunidad inespecfica reducir el riesgo de algunas reacciones vacunales que pueden requerir un tratamiento con tetracicilina o imidocarb. La inmunidad parcial se desarrolla en 68 semanas y dura varios aos despus de una nica vacunacin.

A. INTRODUCCIN
Los brotes de anaplasmosis bovina se deben normalmente a la infeccin por Anaplasma marginale. Anaplasma centrale produce una anemia moderada, pero los brotes en el campo son muy raros. En algunos aislamientos de A. marginale se han descrito estructuras adicionales asociadas con los cuerpos de Anaplasma (19); aunque este parsito se ha denominado A. caudatum, no se considera como una especie separada. Recientemente se ha informado de que una tercera especie, A. phagocytophilum, infecta al ganado. No obstante, parece que la infeccin natural es poco frecuente y que A. phagocytophilum no es el causante de la enfermedad clnica (8, 20). Anaplasma marginale se presenta en la mayor parte de los pases tropicales y subtropicales, y en algunas regiones ms templadas. Anaplasma centrale se describi por vez primera vez en Sudfrica. Desde entonces el microorganismo ha sido importado en otros pases incluyendo Australia y algunos pases de Sudamrica, Sudeste asitico y Oriente Medio para ser utilizado como vacuna contra A. marginale. Las especies de Anaplasma se consideraron en principio como protozoos parsitos, pero la investigacin posterior revel que no posean atributos que justificaran esta descripcin. Desde la ltima revisin de su taxonoma aceptada en 2001 (9), la familia Anaplasmataceae (Orden Rickettsiales) consta ahora de cuatro gneros: Anaplasma, Ehrlichia, Neorickettsia y Wolbachia. El gnero Aegyptianella se mantiene dentro de la familia Anaplasmataceae como gnero incertae sedis. El gnero Anaplasma revisado comprende actualmente a Anaplasma marginale como la especie tpica. A. phagocytophilum (antes Ehrlichia phagocytophila, E. equi y el agente no clasificado de la ehrliquiosis granuloctica humana), A. platys, y A. bovis, Haemobartonella y Eperythrozoon se consideran en la actualidad ms prximos a los micoplasmas. Las especies de Anaplasma se trasmiten mecnica o biolgicamente por insectos vectores. Varias revisiones basadas en un estudio cuidadoso de experimentos de transmisin presentan una lista de hasta 19 garrapatas diferentes capaces de transmitir experimentalmente A. marginale (15, 21). Estas son: Argas persicus, Ornithodoros lahorensis, Boophilus annulatus, B. calcaratus, B. decoloratus, B. microplus, Dermacentor albipictus, D. andersoni, D. hunteri, D. occidentalis, D. variabilis, Hyalomma excavatum, H. rufipes, Ixodes ricinus, I. scapularis, Rhipicephalus bursa, R. evertsi, R. sanguineus y R. simus. Los autores concluyeron que algunos de estos resultados, como los de R. bursa, H. excavatum, y O. lahorensis no son muy convincentes y que las garrapatas identificadas como A. persicus eran probablemente A. sanchezi o A. radiatus. La transmisin intra o interespecfica es comn, incluso en las especies de Boophilus de un solo hospedador. Las garrapatas macho pueden ser particularmente importantes como vectores; pueden estar infectadas de forma permanente y servir como reservorio para la infeccin (17). La demostracin experimental de la implicacin de un vector no implica necesariamente que tenga un papel en la transmisin en condiciones de campo. Sin embargo, las especies de Boophilus son claramente vectores importantes de la anaplasmosis en pases tales como Australia o Sudfrica, y algunas especies de Dermacentor son vectores eficaces en los Estados Unidos de Amrica (EE.UU.). Otros artrpodos picadores muy diversos se han considerado como vectores mecnicos, particularmente en EE.UU. Se ha demostrado la transmisin experimental con ciertas especies de Tabanus (mosca del caballo) y con mosquitos del gnero Psorophora (15, 33). La importancia de los insectos picadores en la transmisin natural de la anaplasmosis parece variar mucho de una regin a otra. Anaplasma marginale puede transmitirse tambin con facilidad durante la vacunacin contra otras enfermedades, a menos que se utilice una aguja nueva

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o esterilizada para inyectar a cada animal. Se ha descrito una transmisin similar por medio de instrumentos quirrgicos no esterilizados. Los principales vectores de A. centrale parecen ser garrapatas de hospedadores mltiples, propias de frica, como R. rimus. No se ha demostrado que la garrapata comn de los bvidos (B. microplus) sea un vector. Esto es importante porque A. centrale se utiliza como vacuna en regiones infestadas por B. microplus.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
Los sntomas clnicos ms marcados de la anaplasmosis son anemia e ictericia, la ltima con aparicin tarda en la enfermedad. No se presenta hemoglobinemia ni hemoglobinuria, lo que puede ayudar al diagnstico diferencial entre anaplasmosis y babesiosis, que a menudo es endmica en las mismas regiones. No obstante, la enfermedad solo se puede confirmar mediante la identificacin del microorganismo causante.

1.

Identificacin del agente

Las muestras obtenidas a partir de ganado vivo deben incluir frotis finos de sangre y sangre recogida con anticoagulante. Los frotis finos de sangre, secados con aire, se mantienen de modo satisfactorio a temperatura ambiente por lo menos 1 semana. Las muestras de sangre con coagulante deberan mantenerse a 4C, a menos que se lleve al laboratorio en unas pocas horas. Esta muestra es til para preparar frotis frescos si los anteriores no fueran satisfactorios. Adems un cierto volumen pequeo de clulas y/o un recuento de eritrocitos puede ayudar a poner de manifiesto la implicacin de Anaplasma cuando en los frotis se detecta solo un nmero pequeo de parsitos, como puede ocurrir en la fase de recuperacin de la enfermedad. En contraste con Babesia bovis, Anaplasma no se acumula en los capilares, de modo que es apropiada la sangre de la yugular u otro gran vaso. Debido a la morfologa poco diferencial de Anaplasma, es esencial que los frotis estn bien preparados y libres de sustancias extraas, pues las partculas de los restos pueden confundir el diagnstico. Las extensiones gruesas de sangre, que se utilizan en el diagnstico de la babesiosis, no son apropiadas para el diagnstico de la anaplasmosis, porque Anaplasma es difcil de identificar una vez que se separa de los eritrocitos. Las muestras obtenidas de los animales muertos deben ser frotis finos, secados al aire, del hgado, rin, corazn y pulmones y de un vaso sanguneo perifrico. Este ltimo se recomienda, en particular, si hay un retraso notable antes del examen postmortem porque, en tales circunstancias, la contaminacin bacteriana en los frotis de los rganos puede conducir a una identificacin equvoca de Anaplasma. Los frotis de cerebro, que son tiles en el diagnostico de algunas formas de babesiosis, no tienen un valor directo en el diagnstico de la anaplasmosis, aunque deberan incluirse para el diagnstico diferencial cuando sea pertinente. Para la preparacin de los frotis se requiere la sangre de rganos, mejor que los tejidos de los rganos per se, porque el objetivo es ser capaz de examinar al microscopio los eritrocitos intactos para detectar la presencia de Anaplasma. Los frotis derivados de sangre de rganos se mantienen satisfactoriamente durante varios das a temperatura ambiente. Los frotis de sangre y de los rganos pueden teirse con colorante de Giemsa al 10% durante 30 minutos aproximadamente tras fijarse durante 1 minuto con metanol absoluto. Despus de la tincin, los frotis se lavan tres o cuatro veces con agua de grifo para eliminar el colorante adherido y luego se secan al aire. Las condiciones para la tincin de Giemsa varan de un laboratorio a otro. En varios pases se dispone de colorantes comerciales que proporcionan una tincin rpida de Anaplasma. Los frotis se examinan con 700 1.000 aumentos. En los frotis teidos con Giemsa, Anaplasma marginale aparece como cuerpos densos, redondeados y muy coloreados dentro de los eritrocitos, de aproximadamente 0,31,0 m de dimetro. La mayor parte de estos cuerpos se localizan en el margen del eritrocito o en su proximidad. Esta caracterstica diferencia A. marginale de A. centrale, presentando en este ltimo caso los microorganismos una localizacin ms centrada en el eritrocito. Sin embargo, sobre todo en niveles bajos de rickettsemia, puede resultar difcil la diferenciacin de estas dos especies en los frotis. El porcentaje de eritrocitos infectados vara segn la fase y la gravedad de la enfermedad. Con A. marginale pueden presentarse parasitemias mximas que superan el 50%. Durante los perodos de alta parasitemia, son comunes las infecciones mltiples de eritrocitos individuales. La infeccin se hace visible al microscopio en 26 semanas despus de la transmisin. Durante la enfermedad clnica, la parasitemia se duplica aproximadamente cada da hasta los 10 das, y luego decrece a una velocidad

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similar. Puede persistir durante algunas semanas una anemia muy fuerte despus de que los parsitos lleguen a ser virtualmente indetectables en los frotis. Despus de la recuperacin de la infeccin inicial, la mayor parte del ganado permanece con infeccin latente durante el resto de su vida. Un procedimiento costoso, pero en ocasiones justificable, para confirmar la infeccin, particularmente en ganado con infeccin latente, consiste en inocular sangre del animal sospechoso en un ternero esplenectomizado (sin bazo). Se inocula intravenosamente una cantidad (hasta 500 ml) de la sangre del donador con anticoagulante en el ternero esplenectomizado, y luego se examinan frotis de sangre al menos cada 23 das. Si el donador est infectado, se observar Anaplasma en los frotis del ternero esplenectomizado, por lo general, en 4 semanas, aunque este perodo puede prolongarse a 8 semanas. Se han desarrollado pruebas basadas en los cidos nuclicos para detectar A. marginale en el ganado portador (1113, 36). La sensibilidad analtica de los mtodos basados en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se ha estimado en 0,0001% de eritrocitos infectados, pero a este nivel solo se detectara una parte del ganado portador (11, 12). Se ha utilizado una tcnica PCR combinada que es sensible y potencialmente especfica para identificar al ganado portador de A. marginale (36). Esta tcnica es capaz de identificar niveles de menos de 30 eritrocitos infectados por ml de sangre, lo que equivale a una parasitemia de aproximadamente 0,000001%, que est muy por debajo de los niveles ms bajos en los portadores. No obstante, la PCR combinada plantea serios problemas de control de calidad para un uso rutinario (36). Los laboratorios que utilizan esta prueba deberan reconocer los problemas de especificidad debidos a amplificacin inespecfica. Un paso adicional, como el anlisis con enzimas de restriccin, la hibridacin tipo Southern, o la secuenciacin, puede confirmar la especificidad del fragmento amplificado en la PCR anidada. Por lo general, excepto con los animales que han sido tratados o se encuentran en una fase muy inicial de la infeccin (<14 das), el mtodo preferido para identificar los animales infectados es el enzimoinmunoensayo competitivo (C-ELISA) o la prueba de hemoaglutinacin en placa (CAT) (ver ms adelante).

2.

Pruebas serolgicas

Las infecciones por Anaplasma persisten normalmente durante toda la vida del animal. Sin embargo, excepto en pequeos recrudecimientos ocasionales, no se puede detectar fcilmente Anaplasma en frotis de sangre despus de un episodio de parasitemia. Por tanto, se han desarrollado varias pruebas serolgicas con objeto de detectar los animales con infeccin persistente. Una caracterstica del diagnstico serolgico de la anaplasmosis son los resultados tan variables que se han descrito por distintos laboratorios en muchas pruebas respecto a la sensibilidad y la especificidad. Esto se debe, al menos en parte, a la inadecuada evaluacin de las pruebas que usan un nmero significativo de animales positivos y negativos conocidos. En especial, hay que destacar que la capacidad de algunos ensayos para detectar infecciones conocidas de larga duracin raramente se ha enfocado de un modo adecuado. Una excepcin es la tcnica C-ELISA (ver ms adelante), que ha sido validada utilizando animales verdaderamente positivos y negativos, definidos mediante la PCR combinada (36) y la prueba de aglutinacin en placa, cuya especificidad y sensibilidad relativas se han evaluado comparativamente con las de C-ELISA (24). Por consiguiente, aunque la mayor parte de las pruebas descritas en esta seccin son tiles para obtener datos epidemiolgicos de una base amplia, se debe tener precaucin en lo que respecta a su uso para la certificacin de la enfermedad. El C-ELISA y la prueba de aglutinacin en placa se describen a continuacin de forma detallada. Debe advertirse que en las pruebas serolgicas existe un grado alto de reacciones cruzadas entre A. marginale y A. centrale. Aunque las especies patgenas se pueden identificar a veces con antgenos de la especie homloga o heterloga, en muchas ocasiones se obtienen resultados equvocos.

a)

Enzimoinmunoensayo competitivo
Una tcnica C-ELISA, que utiliza un antgeno recombinante denominado rMSP5 y un anticuerpo monoclonal (MAb) especfico para MSP5, ha resultado muy sensible y especfica para detectar animales infectados por Anaplasma (18, 27, 35, 37). Todas las cepas probadas de A. marginale, A. ovis y A. centrale, expresan el antgeno MSP5 e inducen anticuerpos contra el eptopo inmunodominante reconocido por el MAb especfico de MSP5. En un informe reciente se sugiere que los anticuerpos del ganado infectado experimentalmente con A. phagocytophilum darn positivo en la prueba C-ELISA (8). No obstante, en otro estudio no se pudo demostrar la existencia de reaccin cruzada, y los MAb usados en la prueba no reaccionaron con A. phagocytophilum MSP5 en ensayos de unin directa (35). As pues, se requiere incrementar la investigacin para resolver estos resultados contradictorios. La prueba result especfica al 100% utilizando 261 sueros negativos conocidos de una regin no endmica, detectando perfectamente el ganado infectado a los 16 das de la infeccin experimental por garrapata o por inoculacin de sangre. Adems, se demostr capaz de detectar el ganado que haba sido infectado experimentalmente 6 aos

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antes (18). En la deteccin del ganado con una infeccin persistente en una regin endmica de anaplasmosis, donde los verdaderos positivos o negativos se definieron mediante un procedimiento de PCR combinada, la C-ELISA con rMSP5 tuvo una sensibilidad del 96% y una especificidad del 95% (36). Un estudio independiente mediante la utilizacin de ELISA indirecto (I-ELISA) valid el uso de rMPS5 como antgeno de diagnstico (32), Sin embargo, los estudios iniciales sugieren que, en su formato actual, la tcnica del ELISA indirecto con rMPS5 es menos sensible que C-ELISA (32). Los resultados de la prueba C-ELISA con el rMSP5 se pueden obtener en menos de 2,5 horas. Una prueba comercializada1 contiene las instrucciones especficas. Sin embargo, se realiza en general del modo siguiente. Reactivos del equipo Una placa de microtitulacin con 96 pocillos recubiertos con el antgeno rMSP5, Una placa de adsorcin/transferencia con 96 pocillos recubiertos para la adsorcin de suero y reduccin de la unin de fondo, Conjugado MaAb/peroxidasa, 100 , Solucin de lavado y tampn preparado para la dilucin del conjugado, 10 , Substrato para usar y soluciones para detener las reacciones, Controles positivos y negativos i) ii) iii) iv) v) vi) vii) Procedimiento de la prueba Se aaden 70 l de suero sin diluir a la placa de adsorcin/transferencia recubierta y se incuba 30 minutos a temperatura ambiente. Se transfieren 50 l del suero adsorbido por pocillo a la placa recubierta de rMSP5 y se incuba 60 minutos a temperatura ambiente. Se elimina el suero y se lava dos veces la placa utilizando la solucin de lavado, diluida. Se aaden 50 l por pocillo del conjugado MAb/peroxidasa diluido a la placa recubierta de rMSP5, y se incuba 20 minutos a temperatura ambiente. Se elimina el conjugado MAb/peroxidasa diluido y se lava la placa cuatro veces utilizando la solucin de lavado diluida. Se aaden 50 l por pocillo, de la solucin de substrato, se cubre la placa con papel de aluminio, y se incuba 20 minutos a temperatura ambiente. Se aaden 50 l por pocillo de la solucin para detener las reacciones a la solucin de substrato que se encuentra en los pocillos y se golpea ligeramente por los lados de la placa para mezclar el contenido de los pocillos.

viii) Se leen las placas en el equipo de lectura a 620 nm. Validacin de la prueba

La densidad ptica media (OD) del control negativo debe estar entre 0,40 y 2,10. El porcentaje de inhibicin del control negativo debe ser 30%. Interpretacin de los resultados

El porcentaje de inhibicin se calcula del siguiente modo: 100 Sample OD de la muestra 100 OD media del control negativo = Porcentaje de inhibicin

Las muestras con <30% de inhibicin son negativas: Las muestras con 30% de inhibicin son positivas. La especificidad del C-ELISA MSP5 puede incrementarse utilizando un valor de corte del porcentaje de inhibicin ms alto (5); no obstante, no se ha evaluado a fondo el efecto que ese cambio pueda tener en la sensibilidad.

Entre los tintes comercializados se encuentran Camco-Quik y Diff-Quik, Baxter Scientific Products, McGaw Park, Illinois, EE.UU., y Hema 3 y Hema-Quik, Curtin-Matheson, Houston, Texas, EE.UU.

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b)

Prueba de aglutinacin en placa

La ventaja de la CAT es que es una tcnica sensible, que puede realizarse en el laboratorio o en el campo, y que proporciona el resultado en unos pocos minutos. Las reacciones inespecficas pueden ser un problema, y la subjetividad de la interpretacin de las reacciones en las pruebas puede tener como consecuencia una variacin en su interpretacin. Adems, el antgeno para la CAT, que es una suspensin de partculas de A. marginale, puede ser difcil de preparar y puede variar de un lote a otro y de un laboratorio a otro. Se infectan terneros esplenectomizados mediante la inoculacin intravenosa con sangre que contenga eritrocitos infectados por Anaplasma. Cuando la parasitemia excede el 50%, el animal se sangra, los eritrocitos infectados se lavan, se lisan, y las membranas de los eritrocitos y las partculas de Anaplasma se centrifugan. Los sedimentos se sonican, se lavan, y luego se resuspenden en una solucin de colorante para producir la solucin de antgeno. Un procedimiento con ligeras modificaciones del descrito originalmente (1, 2) es el siguiente: i) ii) Se comprueba, antes de su uso, que todos los componentes de la prueba estn a una temperatura de 2526C (esta temperatura constante es un factor crtico en la prueba). En cada crculo de la placa de ensayo (un plstico claro tipo perspex o una placa de cristal con crculos marcados de 18 mm de dimetro), se colocan juntos, pero sin tocarse, 10 l de factor de suero bovino (BSF), 10 l del suero de ensayo, y 5 l del antgeno CAT2. En cada placa se deben probar sueros negativos y dbilmente positivos. El BSF es el suero de un animal seleccionado con un alto nivel de conglutinina. Si se desconoce el nivel de conglutininas, se puede utilizar suero fresco de un animal que est libre de Anaplasma. Habitualmente la raza Jersey es adecuada. El BSF se debe guardar a 70C en pequeas alcuotas y, cada vez que se realizan las pruebas, se utiliza una alcuota fresca. La inclusin del BSF mejora la sensibilidad de la prueba. iii) iv) v) Se mezcla bien con una varilla de vidrio. Despus de mezclar cada prueba, se limpia la varilla de vidrio con un papel limpio para evitar la contaminacin cruzada. Se coloca la placa de prueba en una cmara hmeda y se agita a 100110 rpm durante 7 minutos. Se lee inmediatamente contra una luz. Una aglutinacin caracterstica del antgeno (valorada de +1 a +3) se considera un resultado positivo. Se considera que la prueba da un resultado negativo cuando no existe esa aglutinacin caracterstica.

c)

Prueba de fijacin de complemento

La prueba de fijacin del complemento se ha utilizado ampliamente durante muchos aos. Sin embargo, muestra una sensibilidad variable (entre el 20 y 60%), reflejando seguramente las diferencias entre las tcnicas de produccin de antgeno, y una pobre repetibilidad. Adems, se ha demostrado que es muy alta la proporcin de ganado portador que no se consigue detectar mediante la prueba de fijacin del complemento (5). Tampoco existe la certeza de que la prueba de FC sirva para identificar anticuerpos en animales con una infeccin grave si se aplica con anterioridad a otras pruebas (6, 24). Por consiguiente, la prueba de FC no se puede recomendar como ensayo fiable para detectar animales infectados.

d)

Pruebas ELISA adicionales

Se ha encontrado un mtodo I-ELISA, basado en el uso de un antgeno normal de eritrocitos (antgeno negativo) y de un antgeno de eritrocitos infectados por A. marginale (antgeno positivo), que es fiable para la deteccin de los sueros positivos frente a A. marginale (10). Aunque ms lento que las pruebas en las que se utiliza un solo antgeno, en esta prueba se eliminan los sueros con niveles de actividad inespecfica debidos a los iso-anticuerpos para los componentes de los eritrocitos normales. La prueba identific correctamente los 100 sueros positivos conocidos tomados de ganado bovino hasta pasados 3 aos de la infeccin, mientras que el 3% de los sueros negativos, el 2% de los sueros de Babesia bovis y el 4% de los sueros de B. bigemina dieron falsos resultados positivos. Tambin se ha descrito una prueba de enzimoinmunoensayo puntual (un DOT-ELISA). Comparado con el IELISA, el ELISA puntual tiene las posibles ventajas de ser rpido, barato y sencillo de aplicar. Se ha informado de que el ELISA puntual tiene una sensibilidad del 93% y una especificidad del 96% (25).

e)

Prueba de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos

Debido al nmero limitado de pruebas de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo (IFI) que puede realizar diariamente un operador, se suelen preferir otras pruebas serolgicas. La prueba IFI se realiza

En EE.UU. y Mxico la prueba se realiza con volmenes mayores de reactivos: antgeno (15 l), suero (30 l), y factor de suero bovino (30 l) en un tiempo de reaccin de 4 minutos (ver paso iv).

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como se describe para la babesiosis bovina en el captulo 2.4.2, excepto que para la preparacin de frotis de antgeno se utiliza sangre infectada por A. marginale. Un problema serio de esta prueba es la fluorescencia inespecfica. Es muy probable que el antgeno obtenido de la sangre recogida tan pronto como aparezca una parasitemia adecuada (510%) resulte idneo. La fluorescencia inespecfica debida a anticuerpos que se adhieren a los eritrocitos infectados puede reducirse lavando los eritrocitos en un tampn cido de glicina antes de preparar los frotis de antgeno (22). Los eritrocitos infectados se lavan dos veces en tampn de glicina 0,1 M (pH 3,0, centrifugado a 1.000 g durante 15 minutos a 4C) y luego una vez en PBS, pH 7,4.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

Se han utilizado varios procedimientos de inmunizacin para proteger al ganado bovino contra la anaplasmosis en los pases donde la enfermedad es endmica, pero ninguno es ideal (22). Se acaba de publicar una revisin de las vacunas y antgenos contra E. marginale (16). El uso de la especie menos patgena A. centrale, que proporciona una proteccin parcial cruzada frente a A. marginale, es el mtodo ms ampliamente aceptado, aunque no se utiliza en Amrica del Norte. Otro mtodo implica el uso de una cepa de A. marginale atenuada por pases en hospedadores no bovinos, como el ciervo o la oveja (34). En esta seccin, se describe la produccin de vacuna viva de A. centrale. Incluye la infeccin de un ternero esplenectomizado susceptible y el uso de su sangre como vacuna. Existen descripciones detalladas del procedimiento de produccin y se debe hacer referencia a estas publicaciones para detalles de los procedimientos que se resumen aqu (3, 7, 29). Las directrices para la produccin de vacunas se presentan en el captulo 1.1.8. Principios de produccin de vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en el captulo 1.1.8 son de carcter general y pueden completarse con requisitos nacionales y regionales. La vacuna para Anaplasma centrale puede suministrarse en forma congelada o refrigerada dependiendo de la demanda, las redes de transporte y la disponibilidad de servicios de nitrgeno lquido o de hielo seco. En la mayor parte de los casos, se recomienda la vacuna congelada, ya que permite un control de calidad de cada lote despus de la produccin. Sin embargo, es ms costosa de producir y ms difcil de transportar que la vacuna refrigerada. El riesgo de contaminacin hace que el control despus de la produccin sea esencial, pero puede ser prohibitivamente costoso.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Anaplasma centrale se aisl por primera vez en 1911 en Sudfrica y se ha utilizado como vacuna en Sudamrica, Australia, frica, Oriente Medio, y Sudeste Asitico. Solo suministra una proteccin parcial, pero adecuada, en regiones donde las cepas que provocan la enfermedad son de una virulencia moderada (como Australia) (4). En los trpicos hmedos, donde A. marginale parece ser un parsito muy virulento, la proteccin suministrada por A. centrale puede ser inadecuada para evitar la enfermedad en algunos animales. Normalmente, Anaplasma centrale causa infecciones benignas, especialmente en los terneros menores de 9 meses de edad. Se han descrito reacciones graves despus de la vacunacin cuando se inocula el ganado adulto.

b)

Preparacin y conservacin de los estabilizados

El material infeccioso se conserva fcilmente en nitrgeno lquido o en hielo seco como estabilizados congelados de la sangre infectada. Los crioconservantes recomendados son el dimetil sulfxido (DMSO) y la polivinilpirrolidona M.W., 40.000 (3), ya que permiten la administracin intravenosa del estabilizado despus de la descongelacin. En otra parte (23) se describe con detalle la tcnica de congelacin usando DMSO, pero, en resumen, se basa en lo siguiente: se recoge sangre infectada, se enfra a 4C, y se aade, lentamente y con agitacin, crioconservante fro (4 M DMSO en PBS) en una proporcin final sangre/conservante de 1:1, para dar una concentracin final de 2 M de DMSO. Todo el proceso de dilucin se realiza en un bao de hielo y la sangre diluida se distribuye en recipientes adecuados (por ejemplo, en crioviales de 5 ml), que se congelan lo antes posible en la fase de vapor de un contenedor de nitrgeno lquido.

c)

Validacin como vacuna

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La idoneidad de un aislamiento de A. centrale como vacuna se determina inoculando el ganado susceptible, observando las reacciones posteriores, y estimulando luego a los animales y a los controles susceptibles con una cepa virulenta local de A. marginale. Tanto la seguridad como la eficacia se pueden estimar observando las parasitemias en extensiones de sangre teida y el descenso volumtrico de las clulas empaquetadas de ganado vacuno durante la vacunacin y durante los perodos de reaccin estimulante. Se puede determinar la pureza del aislamiento, para posibles contaminantes presentes, mediante un estudio serolgico de sueros en parejas del ganado bovino utilizado en la prueba de seguridad (3, 30).

2.
a)

Mtodo de fabricacin
Produccin de la vacuna congelada
Se descongelan las cantidades del estabilizado congelado (510 ml) por inmersin de los viales en agua precalentada a 40C. El material descongelado se mantiene en hielo y se usa lo antes posible (en 30 minutos) para infectar un ternero susceptible esplenectomizado por inoculacin intravenosa. La parasitemia del ternero donante se analiza diariamente examinando extensiones de sangre teida de la yugular, y se recoge la sangre para produccin de la vacuna cuando se alcanza una parasitemia adecuada. El mnimo requerido para la produccin de la vacuna es una parasitemia de 1 x 108/ml (aproximadamente 2% de parasitemia en la sangre de la yugular). Si no se obtiene una parasitemia adecuada, puede ser necesario realizar un pase de la cepa mediante la subinoculacin de 100200 ml de sangre a un segundo ternero esplenectomizado. La sangre del donante se recoge mediante la canulacin asptica de la yugular o la cartida, utilizando heparina como anticoagulante (5 Unidades Internacionales [UI] de heparina/ml de sangre). En el laboratorio, la sangre parasitada se mezcla a 37C con un mismo volumen de glicerol 3M en PBS, suplementado con 5mM de glucosa (concentracin final de glicerol 1,5 M). La mezcla se equilibra a 37C durante 30 minutos y se distribuye en recipientes adecuados (por ejemplo, en crioviales de 5 ml). Los viales se enfran en la fase de vapor de nitrgeno lquido a una velocidad aproximada de 10C/minuto y, cuando estn congelados, se guardan en la fase lquida (3). En lugar de glicerol se puede utilizar DMSO como crioconservante. En este caso se lleva a cabo del mismo modo que para la preparacin del estabilizado (23, 28). Si se tiene que diluir la vacuna preparada en glicerol, el diluyente debe ser PBS con 1.5 M de glicerol y 5 mM de glucosa (14). Las vacunas crioconservadas con DMSO deben diluirse con un diluyente que contenga la misma concentracin de DMSO que la sangre original crioconservada (31).

b)

Produccin de la vacuna refrigerada

El material infeccioso para las vacunas refrigeradas se preparara como para las vacunas congeladas, pero debe ser procesado y utilizado lo antes despus de su recogida. La sangre infecciosa se puede diluir para lograr 1 107 parsitos por dosis de vacuna. Un diluyente adecuado es el 10% de suero bovino estril en una solucin de glucosa/solucin salina equilibrada que contenga las siguientes cantidades por litro: NaCl (7,00 g), MgCl2.6H2O (0,34 g), glucosa (1,00 g), Na2HPO4 (2,52 g), KH2PO4 (0,90 g), y NaHCO3 (0,52 g). Si no se dispone de diluyente, se debera utilizar como anticoagulante dextrosa citrato cido (20% [v/v]) o dextrosa citrato fosfato (20% [v/v]) para suministrar la glucosa necesaria para la supervivencia de los organismos.

c)

Utilizacin de la vacuna
En el caso de las vacunas congeladas, los viales se descongelan por inmersin en agua precalentada a entre 37C y 40C, y el contenido se mezcla con un diluyente adecuado hasta la dilucin requerida. Si se preparan las vacunas con glicerol, deben mantenerse fras y utilizarse antes de que transcurran 8 horas despus de la preparacin (3). Si se utiliza DMSO como crioconservante, las vacunas preparadas deben mantenerse en hielo y utilizarse en 1530 minutos (28). El modo ms comn de administracin de la vacuna es por va subcutnea. Las vacunas refrigeradas se deben mantener en fro y utilizarse dentro de los 47 das siguientes a su preparacin. La cepa de A. centrale que se usa en las vacunas es de virulencia reducida, pero no es del todo segura. En consecuencia, un consejo prctico es que se limite el uso de las vacunas a los terneros, en los que la

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Captulo 2.4.1. Anaplasmosis bovina

inmunidad inespecfica reducir el riesgo de reacciones debidas a la vacunacin. Cuando se tienen que vacunar animales de mayor edad, existe el riesgo de reacciones graves. Estas reacciones no son frecuentes, pero la presencia de animales de reproduccin valiosos o en estado de gravidez merece atencin, y deberan observarse a diario durante 3 semanas despus de la vacunacin. Los animales clnicamente enfermos deben tratarse con tetraciclina o imidocarb a las dosis recomendadas por los fabricantes. La inmunidad de proteccin se desarrolla en 68 semanas y por lo general persiste varios aos. A menudo se utilizan en paralelo las vacunas contra la anaplasmosis y la babesiosis, pero no es recomendable utilizar simultneamente otras vacunas (3).

3.
a)

Control interno
Origen y mantenimiento de los donantes de vacunas
Debe identificarse un grupo de terneros exentos de infeccin natural por Anaplasma y de otras enfermedades transmitidas por las garrapatas. Si no se dispone de ellos, puede ser necesario criar los terneros bajo condiciones libres de garrapatas con el propsito especfico de la produccin de vacunas. Los terneros deben mantenerse en condiciones tales que se evite su exposicin a las enfermedades infecciosas y a las garrapatas y a los insectos picadores. En ausencia de servicios adecuados, debe valorarse el riesgo de contaminacin con los agentes de enfermedades infecciosas que estn presentes en el pas concreto, y se deben comparar los beneficios derivados de la produccin local de vacunas frente a las posibles consecuencias adversas de difundir enfermedades (3).

b)

Ciruga
Para permitir el mximo rendimiento de obtencin de microorganismos para la produccin de vacunas, los terneros donantes deben ser esplenectomizados. Esto se lleva a cabo preferentemente en terneros jvenes con anestesia general.

c)

Seleccin de donantes de vacunas antes de la inoculacin

Los terneros donantes deben examinarse teniendo en cuenta todas las infecciones sanguneas con prevalencia en el pas productor de la vacuna, incluyendo Babesia, Anaplasma, Cowdria, Theileria y Trypanosoma. Esto se lleva a cabo mediante el examen rutinario de extensiones de sangre teidas despus de la esplenectoma, y preferiblemente tambin mediante la serologa. Cualquier ternero que muestre signos de infecciones naturales debe ser rechazado. Tambin debe confirmarse la ausencia de otros agentes infecciosos. Estos pueden incluir a los agentes de la leucosis enzotica bovina, la enfermedad de las mucosas, la rinotraqueitis bovina infecciosa, la fiebre efmera, la enfermedad de Akabane, la lengua azul, la glosopeda o fiebre aftosa y la peste bovina. Las pruebas dependern de las enfermedades prevalentes en el pas y de la disponibilidad de los ensayos, pero en ltimo trmino deberan contemplar la serologa de sueros pareados y, en algunos casos, el aislamiento del agente, y la deteccin del antgeno o del ADN/ARN (3, 28, 30).

d)

Observacin de parasitemias despus de la inoculacin

Es necesario determinar la concentracin de parsitos en la sangre recogida para las vacunas. Existen tcnicas cuidadosas para determinar el recuento de los parsitos (10) pero, en ausencia de estas, la concentracin de parsitos se puede calcular a partir del recuento de eritrocitos y de la parasitemia (porcentaje de eritrocitos infectados).

e)

Recoleccin de sangre para vacunas

Todo el equipo ha de esterilizarse antes de usarlo (por ejemplo, en autoclave). Una vez alcanzada la parasitemia deseada, la sangre se recoge con heparina utilizando tcnicas aspticas estrictas. Esto se realiza ms fcilmente si se seda al ternero y se usa un circuito cerrado de recoleccin. Se pueden extraer hasta 3 litros de sangre con niveles de infeccin elevados de un ternero de 6 meses. Si el ternero va a permanecer vivo, es adecuada la transfusin de una cantidad similar de sangre de un donante apropiado. Alternativamente, el ternero debe ser sacrificado inmediatamente despus de la extraccin de la sangre.

f)

Distribucin de las vacunas

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Captulo 2.4.1. Anaplasmosis bovina

Todo el proceso se realiza en un ambiente apropiado, como en una cabina de flujo laminar, utilizando tcnicas estriles estndar. El uso de un agitador mecnico o magntico asegura una buena mezcla de la sangre y del diluyente a travs de todo el proceso de distribucin.

4.

Control de lotes

En el caso de las vacunas refrigeradas, no se puede determinar la potencia, la seguridad y la esterilidad de los lotes de vacuna y, para las vacunas congeladas, las especificaciones dependen del pas concreto. Las siguientes indicaciones se aplican a las vacunas congeladas producidas en Australia.

a)

Esterilidad y ausencia de contaminantes

Se utilizan tcnicas estndar de esterilidad para cada lote de vacuna y diluyente (vase el captulo 1.1.9). La ausencia de contaminantes se determina mediante las pruebas serolgicas adecuadas en el ganado donante, inoculando los linfocitos de los donantes en ovejas y controlndolas despus por si aparece la infeccin vrica, as como inoculando el ganado y controlando su serologa por si aparecen agentes infecciosos que puedan contaminar la vacuna. El ganado inoculado durante la prueba de potencia (vase la seccin C.4.c) es adecuado para este fin. Dependiendo del pas de origen de la vacuna, estos agentes incluyen los microorganismos que causan la leucosis enzotica bovina, la rinotraquetis bovina infecciosa, la enfermedad de las mucosas, la fiebre efmera, la enfermedad de Akabane, el virus Aino, la lengua azul, la parainfluenza, la glosopeda o fiebre aftosa, la enfermedad nodular, la rabia, la fiebre del Valle del Rift, la peste bovina, la pleuroneumona bovina contagiosa, la enfermedad de Jembrana, la cowdriosis, las especies patgenas de Theileria y Tripanosoma spp., Brucella abortus, Coxiella y Leptospira (3, 28, 30).

b)

Seguridad
Las reacciones vacunales del ganado inoculado en la prueba de potencia (vase la seccin C.4.c) se observan mediante la medicin de la parasitemia y el descenso volumtrico en las clulas empaquetadas. Solo se ponen en circulacin para su uso los lotes con niveles de patogenicidad iguales o inferiores a un estndar predeterminado.

c)

Potencia
La vacuna se descongela y se diluye 1/5 con un diluyente adecuado (3). Una vez diluida, se incuba luego 8 horas a 4C, y se inoculan subcutneamente cinco cabezas de ganado con dosis de 2 ml. Los animales inoculados se observan para la presencia de infecciones examinando frotis de sangre teidos. Para que un lote sea aceptable, todos deberan estar infectados. Un lote que resulte infeccioso se recomienda para el uso a una dilucin 1/5 con diluyente isotnico.

d)

Duracin de la inmunidad
Despus de una inoculacin se logra inmunidad parcial, pero duradera. No existen pruebas de que la repeticin de la vacunacin tenga un efecto estimulante.

e)

Estabilidad
Cuando se almacena en nitrgeno lquido, la vacuna se puede mantener durante 5 aos. Una vez que se descongela, pierde rpidamente su potencia. La vacuna descongelada no puede congelarse de nuevo.

f)

Conservantes
No se aaden conservantes. En la fase de distribucin, se aade a la vacuna penicilina (500.000 UI/litro) y estreptomicina (370.000 UI/litro).

g)

Precauciones (riesgos)
La vacuna no es infecciosa para el hombre. Cuando el producto se almacena en nitrgeno lquido, se aplican las precauciones normales en cuanto a la conservacin, el transporte y el manejo del material ultracongelado.

5.
a)

Pruebas sobre el producto final

Inocuidad
Vase la seccin C.4.b

10

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b)

Potencia
Vase la seccin C.4.c

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